Summary
Aquí se presenta un protocolo para evaluar cuantitativamente la inyección de un material a través de un sistema de jeringa-aguja utilizando un equipo de pruebas mecánicas estándar.
Abstract
Los biomateriales inyectables son cada vez más populares para la administración mínimamente invasiva de fármacos y células. Estos materiales son típicamente más viscosos que las inyecciones acuosas tradicionales y pueden ser semisólidos, por lo tanto, su inyección no se puede asumir. Este protocolo describe un método para evaluar objetivamente la inyección de estos materiales utilizando un probador mecánico estándar. El émbolo de la jeringa es comprimido por la cruz a una velocidad establecida, y se mide la fuerza. El valor de fuerza máxima o meseta se puede utilizar para la comparación entre muestras o a un límite de fuerza absoluta. Este protocolo se puede utilizar con cualquier material, y cualquier jeringa y tamaño de aguja o geometría. Los resultados obtenidos se pueden utilizar para tomar decisiones sobre formulaciones, jeringas y tamaños de agujas al principio del proceso traslacional. Además, se pueden cuantificar los efectos de la alteración de las formulaciones en la inyecbilidad, y se determina el tiempo óptimo para inyectar materiales que cambian temporalmente. Este método también es adecuado como una forma reproducible de examinar los efectos de la inyección en un material, para estudiar fenómenos como la auto-curación y prensado de filtros o estudiar los efectos de la inyección en las células. Este protocolo es más rápido y más directamente aplicable a la inyecbilidad que la reología rotacional, y requiere un procesamiento posterior mínimo para obtener valores clave para comparaciones directas.
Introduction
Los biomateriales a menudo se estudian y se utilizan como andamios para la regeneración de tejidos a base de células y depósitos para la administración dirigida y sostenida de terapias1. Dentro de este campo, los biomateriales inyectables están creciendo en popularidad ya que son mínimamente invasivos, lo que reduce el riesgo de infección, dolor y cicatrices asociadas con la implantación2. Además, debido a que generalmente se aplican como fluidos, se ajustan perfectamente a los defectos tisulares, y los fármacos y células pueden mezclarse en ellos inmediatamente antes de la aplicación3,4,5. Como tal, mientras que los biomateriales inyectables pueden ser fabricados como jeringas precargadas, a menudo son preparados por los médicos directamente antes de la aplicación. Por ejemplo, los cementos comienzan a establecerse una vez que se mezclan las fases de polvo y líquido, por lo que no se pueden almacenar durante largos períodos antes de su uso6. La caracterización de estos materiales depende por el tiempo y está inextricablemente ligada a su preparación.
Los biomateriales inyectables comunes incluyen cementos de calcio, metacrilato de polimetil, bioglasses y varios hidrogeles poliméricos3,7. A diferencia de las inyecciones tradicionales de drogas, que tienen las mismas propiedades reológicas que el agua, estos biomateriales inyectables son típicamente más viscosos, no newtonianos, pueden tener algún carácter elástico, y también pueden cambiar con el tiempo. Por lo tanto, la inyección de estos materiales no se puede asumir, pero debe evaluarse experimentalmente. Mediante la cuantificación de la fuerza necesaria para la inyección y la correlación con la facilidad de inyección, las primeras decisiones sobre qué formulaciones de biomateriales, jeringa y tamaños de aguja para llevar adelante pueden tomarse al principio del proceso de desarrollo8. Tales experimentos también pueden cuantificar los efectos del cambio de formulaciones en la inyección9.
Existen varios métodos para evaluar las propiedades de los materiales inyectables. La reología rotacional se utiliza a menudo para evaluar la viscosidad, el comportamiento no newtoniano, la recuperación posterior al cizallamiento, el tiempo de ajuste y otras propiedades de estos materiales10,11,12. Si bien este tipo de prueba es útil para establecer propiedades fundamentales de los materiales, estas propiedades no se correlacionan directamente con la capacidad de inyección. Para una jeringa y aguja de fluido y cilíndrico newtoniano, la fuerza de inyección se puede estimar a partir de una forma de la ecuación 4-Poiseuille13:
Cuando F es la fuerza necesaria para la inyección (N), Rs es el radio interno de la jeringa (m), Rn es el radio interno de la aguja (m), L es la longitud de la aguja (m), Q es el caudal de fluido (m3 s-1), η es la viscosidad dinámica (Pa.s) y Ff es la fuerza de fricción entre el émbolo y la pared del barril (N). Por lo tanto, si la viscosidad se mide a través de la reología rotacional, se conocen las dimensiones de la jeringa y la aguja y se estima el caudal, se puede estimar la fuerza de inyección. Sin embargo, esta ecuación no tiene en cuenta el extremo cónico de la jeringa ni ninguna otra geometría, como las salidas fuera del centro, y Ffdebe estimarse o encontrarse experimentalmente mediante pruebas mecánicas. Además, los biomateriales no suelen ser newtonianos, pero exhiben propiedades reológicas complejas. Para un fluido de adelgazamiento simple, la ecuación se convierte en14:
Donde n es el índice de potencia (-) y K es el índice de consistencia (Pa.sn) de la expresión Ostwald de Waele: , donde está la tasa 
de 
cizallamiento (s-1). La complejidad aumenta enormemente para los materiales cuyas propiedades reológicas no pueden caracterizarse por dos valores, y particularmente para materiales dependientes del tiempo, como el establecimiento de cementos. Además, si las propiedades del material dependen de la cizalladura, el material debe probarse a la velocidad de cizallamiento esperada en la aguja, que puede superar con creces el rango de un reómetro rotacional15.
Otro método cuantitativo para medir la inyección consiste en conectar sensores de presión y desplazamiento a una jeringa mientras se realiza una inyección, ya sea a mano o utilizando una bomba de jeringa. Este equipo es relativamente barato, sin embargo, requiere que los usuarios generen scripts y curvas de calibración para convertir en datos de fuerza16. Además, una bomba de jeringa puede no poseer suficiente par para comprimir el émbolo a una velocidad precisa si se requieren fuerzas altas para extruir materiales viscosos o semisólidos. Alternativamente, la utilización de estos sensores al inyectar a mano puede ser útil, ya que se pueden utilizar en un escenario clínico real, durante los procedimientos clínicos17. Sin embargo, esto tomará mucho más tiempo y puede introducir sesgo de usuario, y, por lo tanto, necesitará un mayor número de repeticiones con diferentes usuarios para obtener resultados confiables. Por lo tanto, esto puede ser más apropiado para los materiales que están más abajo de la tubería traslacional, o los productos que ya están en uso clínico.
En este protocolo, se utiliza un probador mecánico para comprimir el émbolo a una velocidad determinada y medir la fuerza necesaria para hacerlo. Este tipo de probador mecánico es común en laboratorios de materiales y se ha utilizado para cuantificar la inyecbilidad de diversos biomateriales18,19,20,21,22,23,24. Esta prueba se puede utilizar con cualquier tamaño y geometría de jeringa y aguja, que contiene cualquier material. Además, en el caso de biomateriales que se hacen inmediatamente antes del uso, el procedimiento de formulación exacta que se utilizaría en la clínica o cirugía se puede seguir antes de la prueba. Otra ventaja de este procedimiento es que es relativamente rápido; una vez configurado el probador mecánico, se pueden estudiar decenas de muestras en una hora, dependiendo de la velocidad de extrusión y el volumen de la jeringa. Esto contrasta con la reología rotacional, que normalmente toma al menos 5 – 10 minutos por prueba, además de tiempo de carga, equilibrio y limpieza. El uso de un probador mecánico produce una tasa de extrusión fiable por igual sobre el émbolo, que es particularmente ventajoso para formulaciones viscosas o aquellas con propiedades dependientes del tiempo. Después de las pruebas, se requiere un postprocesamiento mínimo de los datos para extraer valores importantes para las comparaciones objetivas.
Protocol
1. Preparación de muestras
- Prepare la muestra y cárguelo en la jeringa.
- Para simular una jeringa precargada, prepare la muestra con antelación, cárguelo en la jeringa y coloque la aguja. Almacenar según sea necesario, hasta las pruebas. Esto puede ser adecuado para hidrogeles y materiales que no cambian con el tiempo.
NOTA: Por ejemplo, para preparar soluciones de 2% de alginato, disolver 2 g de sal sódica de ácido algónico en 100 ml de agua desionizada, revolviendo a temperatura ambiente. Aspirar la solución en jeringas de 5 ml y conservar durante 24 horas a temperatura ambiente. - Alternativamente, para simular una inyección formulada directamente antes de la aplicación, preparar la muestra de la misma manera que se haría en la clínica, permitiendo cualquier tiempo de ajuste. Cargue la jeringa y coloque la aguja. Esto puede ser adecuado para cementos y materiales cuyas propiedades cambian con el tiempo.
NOTA: Por ejemplo, para preparar cemento de sulfato de calcio, mezcle manualmente 4 g de sulfato de calcio hemihidrato en 5 ml de agua desionizada con una espátula durante 1 min. Retire el émbolo de la jeringa y cargue el cemento en el barril de la jeringa con la espátula. Comience las pruebas mecánicas después de 4 min.
ADVERTENCIA: Las agujas representan un riesgo para la seguridad, usan agujas contundentes si es posible. Si el material contiene células u otros materiales biológicos, se debe tener especial cuidado para prevenir lesiones por objetos punzantes.
- Para simular una jeringa precargada, prepare la muestra con antelación, cárguelo en la jeringa y coloque la aguja. Almacenar según sea necesario, hasta las pruebas. Esto puede ser adecuado para hidrogeles y materiales que no cambian con el tiempo.
2. Configure el probador mecánico
- Fije las placas planas (para las pruebas de compresión) al probador mecánico.
- Equipar manualmente el probador mecánico con una célula de carga con una carga máxima de 200 N.
NOTA: Se puede utilizar una célula de carga más grande, siempre que tenga suficiente precisión en el rango de 1 – 200 N. Las muestras que son más viscosas y no están destinadas a ser inyectadas a mano pueden requerir una célula de carga más grande. - Separe las placas, utilizando los botones de control manual, para permitir suficiente espacio para la aguja, la jeringa y el émbolo (alrededor de 30 cm serán suficientes).
- Cree un protocolo de prueba.
- Abra el asistente de prueba y establezca el tipo de prueba en compresión uniaxial.
- Establezca la precarga. Este es el valor de fuerza medido en el que comenzará la prueba. 0.5 N es suficiente.
- Ajuste la velocidad de precarga a 5 mm/min. Esta es la velocidad a la que la cruz se moverá hacia abajo hasta que se encuentre con la precarga.
- Establezca la carga en el control de desplazamiento y seleccione una velocidad de prueba adecuada. 1 mm/s es una velocidad adecuada para una jeringa estándar de 5 ml.
- Establezca un límite de fuerza superior para detener la prueba, por ejemplo, 200 N. Esto es principalmente por razones de seguridad. El ensayo también puede detenerse automáticamente en un desplazamiento determinado, por ejemplo, la longitud de la jeringa.
3. Configure el sistema de sujeción
- Fije dos conjuntos de abrazaderas a dos soportes, con agarres lo suficientemente grandes como para enconzar de forma segura la jeringa elegida.
- Coloque las empuñaduras entre la cruz y la placa base, con suficiente espacio debajo de las empuñaduras para la jeringa y la aguja.
- Alinee los centros de los dos pinzamientos y alinee estos con el centro de la cruz.
NOTA: La alineación de las pinzas entre sí y el centro de la cruz puede tardar algún tiempo y una iteración en lograrse, pero es importante adquirir datos de alta calidad. - Asegúrese de que las abrazaderas estén firmemente aseguradas para que no haya movimiento en las abrazaderas cuando se aplique una fuerza descendente.
- Coloque un plato en la placa inferior para recoger el material extruido.
4. Ejecute el protocolo de inyección
- Inserte la jeringa en las empuñaduras de la abrazadera y ciérrelas. Las empuñaduras deben mantener la jeringa en su lugar, pero permitir que se mueva hacia arriba y hacia abajo sin resistencia.
- Asegúrese de que la jeringa y el émbolo sean perpendiculares a la cruz. Esto garantiza que sólo se medirá la compresión uniaxial del material.
NOTA: Se debe utilizar una jeringa vacía para comprobar los pasos 4.1 y 4.2. - Baje la placa superior a una posición justo encima del émbolo, utilizando los botones de movimiento manual.
NOTA: Es posible seleccionar una'posición de inicio'en el protocolo del probador mecánico, de modo que la posición original por encima del émbolo se alcance automáticamente y sea consistente durante las pruebas. - Cero la fuerza medida haciendo clic en 'Fuerza cero'.
- Ejecute el protocolo de prueba pulsando 'Ejecutar'.
ADVERTENCIA: El experimentador siempre debe estar presente para observar cada ensayo, y listo para activar la parada de emergencia en caso de un percance. - Elevar las placas a una altura suficiente, utilizando los botones de movimiento manual, de modo que se pueda extraer la jeringa.
- Repita el paso 4 para cada muestra.
NOTA: En este punto, la jeringa y la muestra extruida se pueden descartar si no se requiere ningún análisis adicional, pero se puede mantener para examinar el prensado del filtro, la autorreparación, los efectos en las células, etc.
5. Recopilación de datos
- Guarde los datos de cada prueba en un formato desde el que se pueda generar una tabla de valores de fuerza y desplazamiento (.txt, .xls .xlsx).
- Trazar los resultados de cada ensayo, con desplazamiento en el eje X y fuerza en el eje Y.
- Lea la fuerza máxima (si existe) y la fuerza de meseta de los gráficos.
Representative Results
La configuración del probador mecánico y del sistema de sujeción se muestra en la Figura 1A. Este protocolo genera una tabla y un gráfico de fuerza frente al desplazamiento para cada muestra probada. Una curva de desplazamiento de fuerza típica consta de tres secciones(Figura 1B):un gradiente inicial, ya que el émbolo supera la fricción del barril y el material se acelera, una fuerza máxima y una meseta, ya que el material se extruye en un estado estable.
Sin embargo, sólo existe un máximo distinto cuando la fuerza de la meseta es menor que la fuerza necesaria para acelerar el émbolo. Como tal, los picos sólo se ven para muestras insóteces que pasan a través de agujas anchas. Para muestras viscosas que pasan a través de un orificio más estrecho, la fuerza necesaria para inyectar la muestra a velocidad constante es mayor que la fuerza necesaria para superar la fricción en el barril y acelerar el material, y no se ve ningún pico distinto (Figura 1C). Para muestras altamente viscosas o agujas muy estrechas, la fuerza necesaria para extruir el material puede ser tan grande que la jeringa se abrocha y falla, a menudo con muy poca extrusión del material (Figura 1D). Si el material que se está inyectando contiene partículas o está en proceso de ajuste, como cemento, prensado de filtro (expulsión preferencial de la fase líquida) o ajuste a granel, lo que conduce a una inyección incompleta (Figura 1E).
Figura 1: Curvas de muestra generadas por este protocolo. (A) Configuración del probador mecánico para este protocolo. (B) Curva típica de fuerza-extrusión. (C) Curva de fuerza-extrusión sin pico máximo distinto. (D) Curva de extrusión de fuerza para fallo de jeringa. (E) Curva de fuerza-extrusión para un cemento de ajuste. Esta figura está adaptada de Robinson et al.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Las pruebas mecánicas son quizás la forma más sencilla y fiable de cuantificar la capacidad de inyección. Una ventaja clave de este protocolo es que no se requiere ningún equipo especial, aparte del probador mecánico, que es común en los laboratorios de materiales. Este protocolo es altamente versátil; se puede utilizar cualquier material, calibre de aguja y tamaño de jeringa, siempre que la jeringa pueda ser acomoda por las abrazaderas. Esto se ha verificado en este protocolo para jeringas de hasta 10 ml. Además, el material se puede preparar exactamente como lo haría para la aplicación del mundo real25. Por último, este procedimiento es muy rápido, tardando sólo unos minutos por muestra, permitiendo que decenas de muestras se procesen por hora.
Para las muestras que dan curvas típicas, se pueden extraer dos valores: la fuerza máxima y las curvas de fuerza de meseta. La fuerza máxima es posiblemente más objetiva y se puede extraer computacionalmente de la tabla de datos para cada muestra. Por el contrario, la fuerza de la meseta puede ser más representativa, ya que esta será la fuerza experimentada durante la mayor cantidad de tiempo y, como promedio, se ve menos afectada por curvas con grandes fluctuaciones. Estas fluctuaciones pueden ser causadas por burbujas de aire o partículas en el material causando cambios intermitentes a medida que se extruyen, o por una baja precisión del instrumento para mediciones de fuerza pequeña. Sin embargo, es notable que, para muchas muestras, no hay un pico de fuerza máximo, por lo que el valor máximo y de meseta son los mismos. Se pueden realizar comparaciones objetivas entre fuerzas de inyección siempre que se utilice un valor coherente.
Los datos obtenidos se pueden utilizar de varias maneras. Los valores de fuerza de inyección pueden compararse con la facilidad de inyección, para establecer qué formulaciones, jeringas y tamaños de aguja son viables para la traducción8. Alternativamente, la comparación entre muestras permite la cuantificación de cambios en las formulaciones en la inyecbilidad. Por ejemplo, en los cementos, cambiar la viscosidad de la fase líquida, la distribución del tamaño de partícula y añadir aditivos como el citrato para alterar las propiedades coloidales, puede tener grandes cambios en la inyección9. Estas pruebas también pueden informar al protocolo de formulación de cementos, por ejemplo, el tiempo de mezcla, el tiempo de carga y el tiempo de aplicación, para un rendimiento óptimo de inyección y post-inyección. Además, este método se puede utilizar para probar la viabilidad inicial de nuevos bioenergitos para la impresión 3D.
Este protocolo se puede modificar de varias maneras. El sistema de abrazadera puede sustituirse por una construcción impresa en 3D a medida para sujetar la jeringa, lo que puede facilitar la seguridad de que la jeringa y el émbolo sean perpendiculares a la cruz, y que la jeringa se mantenga firme. La aguja se puede sustituir con una cánula o cualquier dispositivo que extruya el material por compresión de un émbolo y puede ser de cualquier tamaño y geometría. Con el fin de aumentar la fidelidad de los resultados, la punta de la aguja se puede colocar en un tejido o hidrogel, con el fin de simular con mayor precisión la inyección clínica. Sin embargo, esto añade más complejidades al protocolo, ya que la composición de tejido/gel y la profundidad de la aguja deben mantenerse constantes. Además, este protocolo utiliza la extrusión controlada por desplazamiento, para medir la fuerza necesaria para inyectar a la velocidad especificada. Alternativamente, se puede especificar la fuerza de inyección y la cantidad de extrusión se puede medir contra el tiempo. Esto puede ser útil para materiales con propiedades dependientes del tiempo, como cementos. Por ejemplo, mediante el uso de una correlación entre la fuerza de inyección y la facilidad de inyección para seleccionar una fuerza8,este protocolo se puede utilizar para establecer si todo el volumen de cemento se puede inyectar con esta velocidad antes de la configuración. Por último, este protocolo se puede combinar fácilmente con otros experimentos, con el fin de probar el efecto de la inyección en las propiedades del material y examinar fenómenos como el prensado del filtro y la autorreparación, o el efecto de la inyección en las células.
La principal limitación de este protocolo es que se requiere un probador mecánico universal. Aunque estos son comunes en los laboratorios de pruebas de materiales, son caros de comprar si el usuario no puede acceder a uno. Además, el probador mecánico proporciona compresión uniaxial a una fuerza establecida o velocidad de desplazamiento, mientras que la fuerza aplicada y la velocidad de inyección pueden variar a lo largo de la inyección a mano. Este protocolo también no es adecuado para replicar algunas inyecciones del mundo real, como inyecciones en tejidos complejos en el teatro, o la inyección en diferentes ángulos. Para cuantificar la fuerza de inyección en la clínica, los transductores de fuerza y desplazamiento pueden ser un mejor método.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la EPSRC CDT for Formulation Engineering en la Escuela de Ingeniería Química de la Universidad de Birmingham, Reino Unido, la referencia de Grant EP/L015153/1, y el Royal Centre for Defence Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
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