Summary
此处介绍的是使用标准机械测试设备通过注射器针系统定量评估材料的注射性的协议。
Abstract
注射生物材料在药物和细胞的微创递送中越来越受欢迎。这些材料通常比传统的水性注射更粘稠，而且可能是半固体的，因此，不能假定其注射性。该协议描述了一种使用标准机械测试仪客观地评估这些材料的可注射性的方法。注射器柱塞由交叉头以设定速率压缩，并测量力。然后，最大值或高原力值可用于比较样本或绝对力极限。此协议可与任何材料以及任何注射器和针头尺寸或几何体一起使用。所得结果可用于在转化过程早期决定配方、注射器和针头尺寸。此外，改变配方对注射性的影响可以量化，并确定注射时间变化材料的最佳时间。这种方法也适合作为一种可重复的方法来检查注射对材料的影响，研究诸如自我修复和过滤压榨或研究注射对细胞的影响等现象。与旋转流变学相比，此协议更快、更直接地适用于可注射性，并且需要最少的后期处理来获取用于直接比较的关键值。
Introduction
生物材料经常被研究，并用作脚手架的细胞为基础的组织再生和仓库，为有针对性的，持续提供治疗1。在这个领域，注射生物材料越来越受欢迎，因为它们是微创，这降低了感染，疼痛和疤痕的风险与植入2。此外，由于它们通常作为液体应用，它们完全符合组织缺陷，药物和细胞可能在应用前立即混合到3、4、5中。因此，虽然可注射生物材料可以作为预装注射器制造，但它们通常是由临床医生在应用前直接准备的。例如，一旦混合了粉末和液体相，水泥开始设置，因此在使用 6 之前不能长时间储存。因此，这些材料的特性取决于时间，并且与它们的制备有着千丝万缕的联系。
常见的可注射生物材料包括钙水泥、聚甲基甲基丙烯酸酯、生物玻璃和各种聚合物水凝胶3、7。与传统的药物注射不同，这些药物具有与水的相同流变特性，这些注射生物材料通常更粘稠，非牛顿，可能有一些弹性特性，而且可能随着时间的推移而变化。因此，不能假定这些材料的可注射性，而必须进行实验性评估。通过量化注射所需的力，并关联注射的易用性，可以在早期的发育过程中提前决定要推进的生物材料配方、注射器和针头尺寸。这些实验还可以量化改变配方对注射性9的影响。
有几种方法可以评估可注射材料的特性。旋转流变法通常用于评估粘度、非牛顿行为、剪切后恢复、设置时间等材料的特性10、11、12。虽然这种类型的测试可用于确定材料的基本属性，但这些属性不直接与可注射性相关。对于牛顿流体和圆柱注射器和针头，可根据哈根-波塞苏耶方程13的形式估计注射力：
其中F是注射所需的力 （N），R s是内部注射器半径 （m），R n是内部针半径 （m），L 是针长 （m），Q 是流体流速 （m3 s -1），η是动态粘度 （Pa.s），F f是柱塞和桶壁 （N） 之间的摩擦力。因此，如果通过旋转流变测量粘度，则知道注射器和针头的尺寸和流速，则可以估计注射力。但是，此方程不考虑注射器或任何其他几何的圆锥端，如中心外插座，Ff 必须通过机械测试进行实验估计或发现。此外，生物材料通常不是牛顿，而是表现出复杂的流变特性。对于一个简单的剪切变薄流体，方程变为14：
其中 n 是功率索引 （-） 和 K 是 Ostwald de Waele 表达式中的一致性索引 （Pa.sn）： 
剪切率 
（s-1）在哪里。对于流变特性不能以两个值为特征的材料，尤其是与时间相关的材料（如设置水泥），其复杂性大大增加。此外，如果材料属性与剪切相关，则必须以针头中预期的剪切速率测试材料，该速度可能远远超过旋转流变仪15 的范围。
另一种测量注射的定量方法包括用手或使用注射器泵在执行注射时将压力和位移传感器连接到注射器。然而，这种设备相对便宜，需要用户生成脚本和校准曲线，以转换为生效数据16。此外，如果需要高力来挤出粘性或半固体材料，注射器泵可能没有足够的扭矩以精确速率压缩柱塞。或者，在手动注射时使用这些传感器可能很有用，因为它们可以在临床手术17期间用于真正的临床场景。但是，这需要更长的时间，并可能引入用户偏见，因此，将需要与不同的用户进行更多的重复，以获得可靠的结果。因此，这可能更适用于在转化管道下的材料，或已经在临床使用的产品。
在此协议中，机械测试仪用于以设定的速率压缩柱塞，并测量所需的力。这种类型的机械测试仪在材料实验室中很常见，已用于量化各种生物材料的注射性18，19，20，21，22，23，24。此测试可用于任何尺寸和几何的注射器和针头，包含任何材料。此外，对于在使用前立即制作的生物材料，可以在测试前遵循诊所或手术中使用的确切配方程序。此过程的另一个优点是，它相对较快;一旦机械测试仪被设置，几十个样品可以在一小时内研究，这取决于挤出速度和注射器体积。这与旋转流变学不同，旋转流变学通常每次测试至少需要 5 ~ 10 分钟，外加装载、平衡和清洁时间。使用机械测试仪可比柱塞产生可靠的挤出率，这尤其适用于粘性配方或具有时间相关特性的配方。测试之后，需要最少的数据后处理，以提取重要值进行客观比较。
Protocol
1. 样品制备
- 准备样品并装入注射器。
- 要模拟预装注射器，请提前准备样品，将其装入注射器并连接针头。存储到要求，直到测试。这可能适用于水凝胶和不会随着时间而变化的材料。
注：例如，要准备2%的藻酸溶液，在100 mL的去离子水中溶解2克藻酸钠盐，在室温下搅拌。将溶液吸入 5 mL 注射器中，并在室温下储存 24 小时。 - 或者，为了模拟在应用前直接配制的注射，请像在诊所中那样准备样品，允许任何设置时间。装入注射器并连接针头。这可能适用于水泥和其属性会随着时间而变化的材料。
注：例如，要准备硫酸钙水泥，将4克硫酸钙半水合液用铲子将4克硫酸钙混合到5 mL的去离子水中，用铲子搅拌1分钟。从注射器上取下柱塞，用铲子将水泥装入注射器筒。4 分钟后开始机械测试。
注意：针头存在安全风险，如有可能，请使用钝针。如果材料含有细胞或其他生物材料，应格外小心，以防止锐利伤害。
- 要模拟预装注射器，请提前准备样品，将其装入注射器并连接针头。存储到要求，直到测试。这可能适用于水凝胶和不会随着时间而变化的材料。
2. 设置机械测试仪
- 将平板（用于压缩测试）连接到机械测试仪。
- 手动为机械测试仪配备最大负载为 200 N 的负载单元。
注：如果负载单元在 1 ~ 200 N 范围内具有足够的精度，则可以使用较大的称重器。更粘稠且不打算用手注射的样品可能需要更大的称重电池。 - 使用手动控制按钮分离板，以便为针头、注射器和柱塞留出足够的空间（大约 30 厘米就足够了）。
- 创建测试协议。
- 打开测试向导，将测试类型设置为单轴压缩。
- 设置 预加载。这是开始测试的测量力值。0.5 N 就足够了。
- 将 预装速度设置为 5 mm/min。这是横头向下移动的速度，直到它遇到预加载。
- 将装载 设置为位移控制 并选择适当的测试速度。1 mm/s 是标准 5 mL 注射器的合适速度。
- 设置 停止测试 的上限，例如 200 N。这主要是为了安全考虑。测试也可以在给定位移时自动停止，例如注射器的长度。
3. 设置夹紧系统
- 将两套夹子连接到两个支架上，其手柄足够大，可牢固地固定所选注射器。
- 将手柄放在横头和底板之间，在夹点下方有足够的空间用于注射器和针头。
- 将两个手柄的中心排队，然后用横头的中心来设置这些夹点。
注：夹紧夹紧点彼此对齐，交叉头中心可能需要一些时间和迭代才能实现，但获得高质量数据非常重要。 - 确保夹具牢固固定，以便施加向下力时夹具中没有移动。
- 将盘子放在底板上，以收集挤压材料。
4. 运行可注射性协议
- 将注射器插入夹紧器并关闭它们。握把应将注射器固定在位位，但允许注射器在没有阻力的情况下上下移动。
- 确保注射器和柱塞垂直于十字头。这可确保仅测量材料的单轴压缩。
注：应使用空注射器检查步骤 4.1 和 4.2。 - 使用手动移动按钮将顶板降到柱塞正上方的位置。
注：在机械测试程序协议中选择"启动位置"是可能的，这样柱塞上方的原始位置会自动到达，并且在整个测试过程中是一致的。 - 单击"零力"将测量力归零。
- 按"运行"运行，运行测试协议。
注意：实验者应始终在场观察每个试验，并准备在发生事故时激活紧急停止。 - 使用手动移动按钮将板举到足够高，以便可以取出注射器。
- 对每个样本重复步骤 4。
注：此时，如果不需要进一步分析，可以丢弃注射器和挤出样品，但可以保留，以便检查过滤器的压榨、自我修复、对细胞的影响等。
5. 数据收集
- 以可生成力和位移值表的格式保存每个试验中的数据（.txt、.xls.xlsx）。
- 绘制每个试验的结果，在 x 轴上位移，在 y 轴上使用力。
- 从图形中读取最大力（如果存在）和高原力。
Representative Results
机械测试仪和夹紧系统的设置如图 1A所示。该协议为每个测试样本生成一个力与位移的表和图形。典型的力位移曲线由三个部分组成（图1B）：初始梯度，因为柱塞克服了来自桶的摩擦，材料加速，力最大值，和一个高原，因为材料以稳定状态挤压。
但是，只有在高原力低于加速柱塞所需的力时，才存在明显的最大值。因此，只有通过宽针的抗视觉样品才能看到峰值。对于通过较窄孔的粘性样品，以恒定速度注入样品所需的力大于克服桶中的摩擦并加速材料所需的力，并且未看到明显的峰值（图 1C）。对于高粘性样品或非常窄的针头，挤压材料所需的力可能很大，以致注射器扣和失败，通常很少挤出材料（图1D）。如果正在注射的材料含有颗粒或正在进行设置，如水泥、滤芯压榨（优先驱逐液相）或散装设置，可能导致注塑不完整（图1E）。
图 1：此协议生成的样本曲线。（A） 为该协议设置机械测试仪。（B） 典型的力-挤出曲线。（C） 力-挤出曲线，无明显最大峰值。（D） 注射器失效的力挤压曲线。（E） 设置水泥的力挤压曲线。这个数字是根据罗宾逊等人8。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
机械测试也许是量化可注射性的最简单、最可靠的方法。该协议的一个关键优点是，除了机械测试仪（在材料实验室中很常见）以外的不需要特殊设备。该协议用途广泛;任何材料、针头计和注射器尺寸都可以使用，前提是注射器可以通过夹子容纳。此协议中已验证了高达 10 mL 的注射器。此外，材料可以完全按照实际应用25进行准备。最后，此过程非常快，每个样本最多需要几分钟时间，每小时可以处理几十个样品。
对于给出典型曲线的样本，可以提取两个值：最大力和高原力曲线。最大力可以说是更客观的，可以从每个样本的数据表中计算提取。相反，高原力可能更具代表性，因为这将是在最大时间中经历的力，而且，平均而言，受波动较大的曲线的影响较小。这些波动可能是由气泡或材料中的颗粒引起的，这些气泡或颗粒在挤出时会导致间歇性变化，或者由于仪器精度低导致小力测量。但是，值得注意的是，对于许多样本，没有最大力峰值，因此最大和高原值是相同的。只要使用一致的值，就可以对注入力进行客观比较。
获得的数据可以通过多种方式使用。注射力值可与注射的易用性进行比较，以确定哪些配方、注射器和针头尺寸适合翻译8。或者，比较样品可以量化注射性配方的变化。例如，在水泥中，改变液相的粘度、颗粒大小分布以及添加柠檬酸盐等添加剂来改变胶体特性，在注入性9中可能会有较大的变化。这些测试还可以为水泥的配方方案提供信息，例如混合时间、装载时间和应用时间，以实现最佳的注塑和注塑后性能。此外，该方法还可用于测试3D打印新生物油墨的初始可行性。
可以通过多种方式修改此协议。夹紧系统可以替换为定制的 3D 打印结构来固定注射器，这可以使确保注射器和柱塞垂直于十字头，并且注射器牢固地固定。针可以替换为一个管或使用任何设备，通过压缩柱塞挤出材料，可以是任何大小和几何形状。为了提高结果的保真度，针头可以放入组织或水凝胶中，以便更准确地模拟临床注射。然而，这增加了协议的复杂性，因为组织/凝胶组成和针头深度必须保持恒定。此外，该协议利用位移控制的挤出，以测量以指定速度注入所需的力。或者，可以指定喷射力，并且可以根据时间测量挤出量。对于具有时间相关属性的材料（如水泥），这可能很有用。例如，通过使用注入力和易注射性之间的相关性来选择力8，此协议可用于确定在设置之前是否可以以这种速度注入整个水泥体积。最后，本协议可以很容易地与其他实验相结合，以测试注射对材料性能的影响，并检查诸如滤芯压榨和自我修复等现象，或注射对细胞的影响。
该协议的主要限制是需要通用机械测试仪。虽然这些在材料测试实验室中很常见，但如果用户无法访问，则购买成本高昂。此外，机械测试仪以设定力或排量率提供单轴压缩，而施加的力和喷射速度可能因手动喷射而变化。该协议也不适合复制一些现实世界的注射，如注射到复杂的组织在剧院，或注射在不同的角度。要量化注射力在临床，力和位移传感器可能是一个更好的方法。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由英国伯明翰大学化学工程学院EPSRC CDT、格兰特参考EP/L015153/1和皇家国防医学中心资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
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