Summary
Slagtilfælde er et globalt problem med minimale behandlingsmuligheder og ingen nuværende klinisk behandling for regenerering af det tabte hjernevæv. Her beskriver vi metoder til at skabe præcise fotothrombotic slagtilfælde i den motoriske cortex af gnavere og efterfølgende injektion af hydrogel biomaterialer til at studere deres virkninger på væv regenerering efter slagtilfælde.
Abstract
Stroke er den hyppigste årsag til handicap og den femtestørste dødsårsag i USA. Ca. 87% af alle slagtilfælde er iskæmiske slagtilfælde og defineres som den pludselige blokering af et fartøj, der leverer blod til hjernen. Få minutter efter blokeringen begynder cellerne at dø og resultere i uoprettelige vævsskader. Nuværende terapeutiske behandlinger fokuserer på fjernelse af blodpropper eller lysis for at give mulighed for reperfusion og forhindre mere alvorlige hjerneskader. Selv om forbigående hjernen plasticitet kan redde nogle af de beskadigede væv over tid, betydelige fraktioner af patienter er tilbage med neurologiske underskud, der aldrig vil løse. Der er mangel på terapeutiske muligheder for at behandle neurologiske underskud forårsaget af slagtilfælde, understreger behovet for at udvikle nye strategier til behandling af denne voksende patientpopulation. Injicerbare biomaterialer er i øjeblikket ved at blive designet til at forbedre hjernens plasticitet og forbedre endogene reparation gennem levering af aktive stoffer eller stamceller. En metode til at teste disse tilgange er at udnytte en gnaver slagtilfælde model, injicere biomaterialet i slagtilfælde kerne, og vurdere reparation. Kendskab til den præcise placering af slagtilfælde kerne er bydende nødvendigt for den nøjagtige behandling efter slagtilfælde, derfor, et slagtilfælde model, der resulterer i en forudsigelig slagtilfælde placering er at foretrække at undgå behovet for billeddannelse før injektion. Følgende protokol vil dække, hvordan man fremkalder et fotothrombotisk slagtilfælde, hvordan man injicerer en hydrogel på en kontrolleret og præcis måde, og hvordan man ekstraherer og kryosection hjernen samtidig med at biomaterialet forbliver intakt. Derudover vil vi fremhæve, hvordan de samme hydrogelmaterialer kan bruges til samlevering af stamceller. Denne protokol kan generaliseres til brug af andre injicerbare biomaterialer i slagtilfældekernen.
Introduction
Stroke er den hyppigste årsag til handicap og den femte hyppigste dødsårsag i USA1. Ca. 87% af alle slagtilfælde er iskæmiske, mens størstedelen af de resterende 13% er hæmoragiske2. En iskæmisk slagtilfælde er defineret som blokering af blodgennemstrømningen i en arterie til det omgivende væv. Denne okklusion resulterer i iltmangel og efterfølgende nekrose, der ofte fører til permanent handicap hos overlevende patienter. Mens der har været et fald i dødeligheden af slagtilfælde3, forventes dens udbredelse at stige til 3,4 millioner mennesker i 20304. Denne stigning i handicappede overlevende og deraf følgende økonomiske byrde har ført til et skub til slagtilfælde forskning, der fokuserer på mekanismer for neural reparation. Efter slagtilfælde er der en inflammatorisk periode, der fører til dannelsen af et ar, der forhindrer den nekrotiske region i at udvide sig. Regionen omkring den nekrotiske kerne kaldes "peri-infarct", og der er et stærkt bevis for, at plasticiteten i denne region, som omfatter øget angiogenese, neurogenese og axonal spiring, er direkte forbundet med den observerede genopretning i dyremodeller og mennesker5. Da der ikke er nogen in vitro-modeller, der korrekt kan replikere de komplekse interaktioner efter slagtilfælde, er dyremodeller afgørende for slagtilfældeforskning.
Der er flere in vivo modeller, der kan bruges til at producere iskæmisk slagtilfælde. En af de mest almindelige modeller, der anvendes i mus er midten cerebral arterie okklusion, eller MCAo, gennem distale eller proksimale (via intra-arteriel glødetråd) okklusion. Den proksimale model, også kendt som glødetråd MCAo (fMCAo), typisk resulterer i store iskæmiske slagtilfælde, der omfatter overalt fra 5% til 50% af hjernehalvdelen, afhængig af antallet af faktorer6. I disse modeller, en sutur eller glødetråd er avanceret fra den indre halspulsåren i bunden af den midterste cerebral arterie (MCA) og holdes på plads i en bestemt periode. Denne metode til okklusion, som kan gøres midlertidig eller permanent, producerer en infarkt, der er centreret i striatum og måske eller måske ikke indebærer overlying cortex6. Den resulterende slagtilfælde størrelse er meget variabel, og billeddannelse teknikker, såsom laser doppler, er forpligtet til at bekræfte effektiviteten af proceduren i hver mus. Intra-arteriel eller intra-luminal glødetråd okklusion, der varer mere end 30 minutter producerer slagtilfælde i den større ende af størrelsesområdet. Nogle efterforskere har fokuseret på kortere glødetråd okklusion gange, som kræver betydelige eksperimentelle fokus og lab validering7. Filament MCAo modeller i mus følger lignende stadier af celledød, iskæmisk progression, og dannelsen af en peri-infarct region som set i human slagtilfælde tilfælde; men de større slagtilfælde ligner mere sygdomstilstanden af ondartede cerebrale infarkter, som er mindre almindelige, mindre behandlelige menneskelige slagtilfælde6. I mellemtiden, distale MCA okklusion kræver en mere involveret kirurgi og craniectomy. I denne model, den distale del af MCA, der løber langs overfladen af hjernen er direkte okkluderet med en sutur slips eller cauterization. I nogle variationer af teknikken er halspulsårerne ensidigt eller forbigående bilateralt okkluderet. En fordel ved den distale MCAo er, at det producerer en kortikale-baseret slagtilfælde, der er mindre variabel i størrelse end glødetråd model. Men den distale model producerer dårligere adfærdsmæssige output på grund af transection af den eksterne halspulsåren (ECA), som også er et problem med fMCAo6.
En alternativ slagtilfælde model, der er kendt for at være mindre invasiv er photothrombotic (PT) model. PT-modellen resulterer i en veldefineret placering af iskæmi og er forbundet med en høj overlevelsesrate8. Teknikken er afhængig af et lysfølsomt farvestof injiceres intraperitoneally, der giver mulighed for intravaskulær fotooxidation blot ved at bestråle det ønskede væv med en lys eller laser9. Ved excitation dannes iltradikaler, der forårsager endotelskader, som aktiverer blodpladeaggregation og blodpropdannelse i det bestrålede område8,9. Den stramme kontrol over slagtilfælde størrelse og placering, samt høj reproducerbarhed af PT-modellen, gør den ideel til at studere biomaterialer. Mens præcision er muliggjort ved hjælp af en laser og stereotaxiske koordinater, der er nogle ulemper, der kan gøre denne model mindre ideel til få undersøgelser. I modsætning til fMCAo-modellen kan PT-stregmodellen ikke reperfused. Derfor ville materialer til undersøgelse af neuroprotektive midler, der er specifikke for skader efter reperfusion eller mekanismerne efter reperfusion, ikke være nyttige her8. Derudover ses relativt lille iskæmisk penumbra på grund af PT-modellens mikrovaskulære fornærmelse. I stedet opstår lokale vasogene ødem, hvilket er ukarakteristisk for human slagtilfælde, hvilket gør denne model uønsket for prækliniske lægemiddelundersøgelser med fokus på det peri-infarct område6,8.
Det overordnede mål med biomateriale strategier i slagtilfælde er at enten levere bioaktive midler eller til at fungere som en surrogat ekstracellulær matrix for hjernevæv vækst. En strategi, som vi vil udforske ved hjælp af vores metoder, er at levere hydrogel direkte ind i slagtilfældekernen i modsætning til peri-infarktvævet, hvor mange nuværende celleterapier leveres10. Begrundelsen for denne tilgang er, at levering i det nekrotiske væv, der findes i kernen, vil undgå at forstyrre det omgivende sunde eller genoprettende væv. Vi antager, at diffusion af alle aktive stoffer, der indgår i biomaterialet, vil være i stand til at nå peri-infarct fra kernen, især da vi finder ud af, at levering af hydrogel biomaterialer reducerer tykkelsen af glial ar11. Dette er vigtigt, da peri-infarct regionen har vist sig at udvise neuroplasticitet efter slagtilfælde, hvilket gør det til et attraktivt mål. Desuden kan levering af en surrogatmatrix til stregkernen indlæses med angiogen12 eller neurogene13 faktorer til at guide dannelsen af nyt væv samt celler til levering14. Celle levering er stærkt forbedret ved hjælp af en matrix, fordi det beskytter celler fra de barske injektion kræfter og lokale miljø til stede under fødslen, samt tilskynder differentiering og indpodning15.
Disse injicerbare terapeutiske biomaterialer har klinisk relevans i slagtilfælde applikationer, da der i øjeblikket ikke er nogen medicinske behandlinger, der stimulerer neuronal genopretning efter slagtilfælde. De underliggende neurale kredsløb involveret i nyttiggørelse ligger i hjernevæv, der støder op tilslagtilfældekernen 16, mens selve slagtilfældekernen er blottet for levedygtigt neuralt væv. Vi forventer, at levere et biomateriale i nekrotiske slagtilfælde kerne har potentiale til at stimulere det tilstødende væv mod regenerative processer gennem en række mekanismer tidligere nævnt, herunder depot frigivelse af vækstfaktorer13,stimulering af væv in-vækst og fremme af inddrive hjernevæv udvikling11,12, ændring af immunrespons17, og levering af stamcelle-afledte terapeutiske14, 18. For effektivt at undersøge muligheden for disse anvendelser er der imidlertid behov for en konsekvent og reproducerbar metode til fremstilling af slagtilfælde og injektion af biomaterialer. PT-stregmodellen bruger teknikker, der giver præcis kontrol over slagtilfældets retning og placering. En laser, der er fastgjort til den stereotaxiske enhed, styrer retninger, og pumper, der er fastgjort til de stereotaxiske enheder, styrer materialets injektionshastighed uden behov for yderligere former for billeddannelse. Derfor har vi valgt at beskrive metoderne til at udføre et PT-slagtilfælde i musenes motoriske cortexer og til injektion af biomaterialer i slagkernen. Her bruger vi mikroporøse annealed partikel (MAP) hydrogels som biomateriale til injektion uden tilsatte celler eller vækstfaktorer. Derudover forklarer vi, hvordan man med succes kan hente hjernen med intakt biomateriale, og vi diskuterer immunkemi assays bruges til at analysere slagtilfælde resultatet med og uden injektion af biomaterialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene blev udført i overensstemmelse med IUCAC på Duke University og University of California Los Angeles. Der blev anvendt 8 til 12 uger gamle C57Bl/6J-mus fra hannen i denne undersøgelse. Dyrene blev opstaldet under kontrolleret temperatur (22 ± 2 °C), med en 12 timers lys-mørk cyklus periode og adgang til pelleted mad og vand ad libitum. Analgesi- og sedationsprotokoller beskrives som godkendt af IUCAC, men kan afvige fra protokoller, der anvendes i andre laboratorier.
Dyr kan aflives for tidligt, hvis de oplever overdreven rastløshed, vokalisering (hvilket indikerer ukontrollabel smerte), selvtraume, nedsat eller nedsat mobilitet, fysiske tegn på dermal infektion, appetitløshed og / eller vægttab på mere end 10% -15% som et resultat af overlevelsesoperationen. Der er ingen forventede bivirkninger fra injektion af gelen, da det er en sammensat af en naturligt forekommende polymer i hjernen. Dyr bør overvåges dagligt, herunder weekender og helligdage, og vejes hver anden dag. Undersøgelser fra vores laboratorium og andres har ikke fundet nogen underskud i grooming, tab af kropsvægt eller tegn / symptomer på tilbagetrækning eller kronisk stress hos mus efter disse små kortikale eller subkortikale slagtilfælde. Hvis dyr udviser tegn på lokal sårinfektion i hovedet, bør de aflives. Dyr bør også overvåges for dårlig pleje, sår tilstand, og tegn på kampe mellem dyr (ryg sår). Hvis der er tegn på kamp eller sårdedelagthed, skal dyrene først behandles efter at have kontaktet dyrlægerne. Dette indebærer ofte antibiotika i vandet og / eller lokal aktuel antibiotisk anvendelse. Hvis disse foranstaltninger ikke producerer helbredelse, bør dyr eutagoniseres.
1. Udarbejdelse af materialer og instrumenter
- Forbered fotothrombotic farvestof forud for operationen. Afvej 15 mg Rose Bengal i et 2 mL mikrocentrifugerør.
FORSIGTIG: Rose Bengal kan forårsage alvorlige øjenskader/ irritation.- Rose Bengalen opløses i 1,5 mL sterilt filtreret 1x PBS for at lave en arbejdskoncentration på 10 mg/mL.
- Vortex røret, indtil ingen klumper er synlige, hvilket indikerer farvestoffet er helt opløst, derefter dække i folie indtil videre brug.
BEMÆRK: Mængden af farvestof, der kræves, afhænger af antallet af mus. Farvestof injiceres intraperitoneally IP i en koncentration på 10 μL/g, f.eks. 200 μL for en 20 g mus.
- Tænd for varmepuden for at opretholde musens kropstemperatur under anæstesi (37 °C).
- Forbered autoklavet saks, sammenkrøpper, bomuld, dyrlægeøjesalve, kirurgisk lim eller suturmateriale, en blå eller sort kirurgisk markør og steril alkohol og beta-jodservietter. Forbered knogleboremaskine med steriliserede borehoveder.
- Tænd perlesteriliseringen til 160 °C for at muliggøre sterilisering af instrumenter mellem muskirurgi. Sæt et 50 mL konisk rør sterilt saltvand eller 1x PBS-opløsning til side til senere brug ved vedligeholdelse af et hydreret operationsområde.
- Sæt laseren på den stereotaxiske enhed. Brug lasersikkerhedsbriller, måle kraften i laser (mW).
FORSIGTIG: Brug lasersikkerhedsbriller, når laseren er tændt under proceduren.- Juster strømmen på laserkonsollen i 10 mW efter laserfremstillingsvejledningen, indtil lasereffekten lyder på 10 mW, og angiv strømmen som et forudindstillet på startskærmkonsollen. Juster derefter strømmen igen for at oprette et andet forudindstillet sæt, hvor laserudgangseffekten lyder 40 mW. Sluk nu for laseren, indtil den er yderligere brugt.
BEMÆRK: De 10 mW vil blive brugt til at orientere laseren før brug.
- Juster strømmen på laserkonsollen i 10 mW efter laserfremstillingsvejledningen, indtil lasereffekten lyder på 10 mW, og angiv strømmen som et forudindstillet på startskærmkonsollen. Juster derefter strømmen igen for at oprette et andet forudindstillet sæt, hvor laserudgangseffekten lyder 40 mW. Sluk nu for laseren, indtil den er yderligere brugt.
- Forbered et rent bur til mus efter operationen. Derefter placere musen i induktionskammeret med en isoflurane koncentration på 4% for at bedøve den, indtil spontan bevægelse stopper, og dens vejrtrækning kommer til en langsom, stabil hastighed.
- Når du sover, vejer musen for at bestemme, hvor meget Rose Bengal farvestof at injicere. Overfør derefter og fastgør musen til den stereotaxiske enhed med en vedligeholdelse isoflurane koncentration på 1,5%.
BEMÆRK: Stigende isoflurankoncentrationer kan udvide fartøjer og forhindre tilstrækkelig okklusion eller konsekvent størrelse slagtilfælde mellem mus. - Påfør dyrlæge øje salve til begge øjne.
BEMÆRK: Se vejrtrækning og temperatur under hele proceduren, og knib tæerne en gang imellem for at sikre, at musen ikke kan mærke noget.
2. Fotothrombotic slagtilfælde model9
- Barber pelsen af musens hoved og aseptisk forberede området ved hjælp af en alkohol tørre efterfulgt af en beta jod tørre. Gentag tre gange.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en ekstra spritstørn i slutningen for at rense al beta-jod, da det forårsager hudirritation, hvilket får musene til at kløe deres kranie efter operationen. - Ved hjælp af lille operationssaks, lav et sideværts snit mellem ørerne til øjnene, ca. 1-2 cm. Gør dette ved at trække huden opad med sammentrækninger for at skabe et telt, skære en gang nedad, derefter indsætte saksen i åbningen og skabe et kontinuerligt midterlinje snit.
- Adskil huden og tryk let på parietal knoglerne med sammenkrerne for at finde bregma. Marker bregma med en prik ved hjælp af den kirurgiske markør.
BEMÆRK: Knoglefragment bevægelse fremhæver den forreste kant af parietal knogler. Bregma er det midtpunkt, hvor de forreste og parietale knoglefragmenter mødes (Figur 1A). - Iført lasersikkerhedsbriller skal du flytte laseren hen over musens kranie og fastgøre den stereotaxiske enhed i en 90°-vinkel. Vælg den 10 mW pre-set og tænde laseren.
- Juster laserens x- og y-akse, indtil den er direkte over bregmaen. Nulstil x og y på den digitale skærmkonsol, og flyt derefter laseren 1,8 mm til venstre for bregmaen. Nu bringe laseren så tæt på kraniet som muligt uden at lade det røre kraniet.
- Flyt laseren til 2,2 mm til venstre for bregmaen for at sikre, at den kan bevæge sig uden forhindringer. Sluk for laseren.
- Indsprøjt den passende mængde Rose Bengal farvestof intraperitoneally (IP) ved hjælp af en engangs 29 G nål. Start straks en timer i 7 minutter for at tillade farvestof at cirkulere systemisk. Vælg forudsættet til 40 mW uden at tænde for laseren.
BEMÆRK: Når farvestoffet er fortroligt med proceduren, kan det injiceres før aseptisk forberedelse af musen og færdig, før de 7 min er overstået for at spare tid. - Tænd laseren (40 mW), når 7 min timeren slukker, mens du bærer laser sikkerhedsbriller, og sæt en 10 min timer.
- Efter 10 min skal du flytte laseren til 2,2 mm til venstre for bregmaen uden at slukke den og indstille yderligere 10 min timer.
- Når den anden 10 min timer er gået ud, ændre laseren tilbage til 10 mW og flytte laseren til 2,0 mm tilbage af bregma. Marker dette sted med den kirurgiske markør. Sluk derefter for laseren.
- Løft laseren og lås den op fra 90°-vinklen, så den kan flyttes væk fra musen. På dette tidspunkt skal du anvende den sterile saltvand eller PBS med bomuld, hvis det kirurgiske område er tørt.
- Bor i små byger ved 2,0 mm mærket vinkelret på overfladen af kraniet.
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at bore langsomt for at undgå at bore for dybt og ramme hjernen. Der vil være et lille fald / ændring i modstand, når boret er gået gennem kraniet, og boring kan forårsage blødning.- Brug bomuld til at absorbere overskydende blod. Det er typisk at se noget blod fra nicked arterier i kraniet efter boring – overdreven blod betyder boret ramte hjernen. Hvis dette sker, skal du registrere muse-id'et og gå videre.
- Placer en lille tørre ved siden af musen. Brug sammentrækningerne, træk huden tæt sammen for at forberede limning.
BEMÆRK: Suturing kan gøres her i stedet. Suturing kræver typisk kun 3 suturer.- Brug sammentrækningerne, tag fat i de to sider af huden og træk dem sammen og opad. Dup alle store dråber kirurgisk lim i slutningen af spidsen på kluden, før du anvender på musen.
- Påfør den kirurgiske lim sparsomt og hold huden sammen med sammenkrumper i 10 s. Fortsæt, indtil der ikke er synlige åbninger.
BEMÆRK: Limen kommer hurtigt ud – klem ikke flasken. Undgå at lime huden til kraniet eller få lim i øjet.
- Efter limning, eller suturering, placere musen i det nye bur for at komme sig efter anæstesi. Det tager 5-10 minutter for dyret at komme sig, og det hjælper med at hvile halvdelen af buret på en varmepude.
3. Sham slagtilfælde operation
- Udfør alle procedurer, der er identiske med den operation, der er beskrevet ovenfor i afsnit 2, undtagen 1x PBS eller saltvand i stedet for Rose Bengal farvestof.
4. Injektion af hydrogel eller andre biomaterialer
- Udfør injektion af biomaterialer på et brugerdefineret tidspunkt. I dette forsøg blev der udført injektioner mellem 5- og 7 dage efter slagtilfælde. 2 - 6 μL hydrogel injiceres (brugerdefinerede).
- Tænd for varmepuden for at opretholde musens kropstemperatur under anæstesi (37 °C).
- Forbered autoklavet saks, sammenkrøpper, bomuld, dyrlægeøjesalve, kirurgisk lim eller suturmateriale og steril alkohol og beta-jodservietter. Bered knogleboret med sterile borehoveder og 25 μL glas Hamilton sprøjter med metal 30 G nåle.
- Tænd perlesteriliseringen til 160 °C for at muliggøre sterilisering af instrumenter mellem mus.
- Sæt injektionspumperne på stereotaxisk enheden. Indstil strømningshastighed til 1 μL/min og indstil volumen til 4 μL.
- Forbered et rent bur til musene efter operationen.
- Placer musen i induktionskammeret med en isofluranekoncentration på 4% for at bedøve den, indtil spontan bevægelse stopper, og dens vejrtrækning kommer til en langsom, stabil hastighed.
- Når du har sovet, overføres og fastgør musen til den stereotaxiske enhed med en vedligeholdelse isoflurane koncentration på 1,5%.
- Påfør dyrlægeøjesalt på begge øjne.
- Barber enhver pels, der kan have gengroet af musens hoved, og aseptisk forberede området ved hjælp af en alkohol tørre efterfulgt af en beta jod tørre. Gentag tre gange.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en ekstra spritstørn i slutningen for at rense al beta-jod, da det forårsager hudirritation og får musene til at kløe deres kranie efter operationen.
- Brug den lille saks og / eller sammentvingere, genåbne huden over hjernen. Brug bomuld med steril saltvand eller PBS til at rense snavs fra kraniet. En hvid-gul cirkel (stregen, figur 1B) og boret fra boret vil være synlige. Hvis det døde væv ikke er synligt, sandsynligvis ikke slagtilfælde opstod. Hvis burrhullet ikke er centreret over stregen, skal du bore igen for at centrere det.
- Orient injektionspumpen over musen, og lås ved 90°. Rengør sprøjten med steril saltvand eller PBS-opløsning før tilbagelæsningsmateriale.
- Når glassprøjten er ren, skal du skille glassprøjten ad, så der ikke er nogen nål. Lad sprøjten igen med en 25 μL positiv forskydningspipette med 10 μL hydrogel (eller andet biomateriale her med eller uden celler).
- Brug sprøjtestemplet skubbes helt til forsiden af sprøjten. Derefter samles sprøjten igen og fortsætter med at skubbe, indtil gelen synligt udstråler fra nålen.
- Placer sprøjten på pumpen. Bagsiden af pumpen skal muligvis justeres, så sprøjten passer. Gør dette ved at justere strømningshastighed til 30 μL/min, vælge Tilbagetrækning eller Indsprøjt afhængigt af den retning, den skal bevæge sig i, og tryk derefter på Start. Tryk Stop, når bagsiden af pumpen er på det rigtige sted.
- Skru bagsiden af pumpen, så sprøjten er sikker. Hvis der tidligere er foretaget justeringer, skal du sørge for, at strømningshastigheden er sat tilbage til 1 μL/min og er indstillet til at injicere.
- Flyt pumpen i x og y retning til at orientere den over hullet. Flyt pumpen ned i z-retningen, indtil kanylen på sprøjten rører toppen af hullet.
- Nulstil z'en på den digitale skærmkonsol. Flyt derefter sprøjten ned i z-retningen 0,750 mm. Hvis sprøjten bøjer, eller der er modstand, kraniet enten helet eller ikke var helt boret igennem og skal bores igen.
- Tryk på Start på pumpekonsollen for at injicere 4 - 6 μL af hydrogelen med en hastighed på 1 μL/min.
- Indstil en 5 min timer, når pumpen holder op med at injicere for at gøre det muligt for gelen at begynde crosslinking.
- Efter 5 min, langsomt trække op sprøjten ved at dreje z nob. Hold øje med, om noget materiale ved et uheld trækkes eller lækker fra hullet. Lås pumpen op og flyt den væk fra musen, når nålen er langt nok væk fra kraniet.
- Ved hjælp af sammenkrumper, kirurgisk lim, eller suturer, lukke huden over hovedet. Placer musen i det rene bur og observere dens opsving. Det bør tage omkring 5 – 10 minutter for musen at komme sig efter anæstesi.
5. Perfusion og prøveindsamling
- Bedøve musen ved hjælp af isoflurane.
- Fastgør dyret i liggende stilling og åbn bughulen med et medianskåret. Eventuelt klemme den faldende abdominal aorta til at bruge mindre fiksativ og PBS.
- Skær membranen op og flyt op ad siderne af brystkassen for at åbne brysthulen. Sæt en perfusion kanyle i venstre ventrikel og skære en åbning i højre atrium. Begynd langsomt at gennemgå med 10-20 mL PBS, eller indtil væsken løber semi-klar.
- Når det er klart, skal du skifte til 4% PFA for yderligere 10 - 20 mL. Unpinning armene giver dem mulighed for at indgå kontrakt som PFA infunderes. Når de holder op med at bevæge sig, vent på yderligere 30 s.
- Halshugge dyret og træk huden tilbage for at afsløre kraniet. Brug stumpe, tynde sammenkrulninger, fjern forsigtigt kraniestykkerne for at udsætte hjernen. Der skal udvises særlig omhu, når kraniet fjernes over slagtilfældestedet. Lille kirurgisk saks kan bruges her til at hjælpe med at skære kraniet væk. Den største udfordring er gel sidder fast til kraniet og kommer ud af hjernen som kraniet er fjernet.
- Når hjernen er løsrevet, placeres i 10 – 15 mL af 4% PFA natten over (ikke længere end 24 timer).
- Flyt hjernen fra PFA til 30% saccharose den følgende dag. Hjernen er klar til kryosection, når den synker til bunden (ca. 2 – 3 dage). Det kan også overlades til opbevaring på dette tidspunkt.
6. Kryosektion og farvning
- Tag hjernen ud af saccharose og sted på en glasrutschebane. Skær en lille del af bagsiden af hjernen af med et barberblad for at skabe en flad del, der skal monteres på en chuck.
- Placer en klat af Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) på chuck, og derefter placere hjernen, flad side ned, på chuck i OKT. Placer denne prøve på tøris, indtil frosset eller i kryostat på fryseblokken.
BEMÆRK: OCT kan tilføjes fuldt ud at omfatte hjernen for at forhindre materialet i at adskille sig fra hjernen under afsnit.
- Placer en klat af Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) på chuck, og derefter placere hjernen, flad side ned, på chuck i OKT. Placer denne prøve på tøris, indtil frosset eller i kryostat på fryseblokken.
- Skær hjernen serielt på en kryostat ved -20 °C ved 30 μm tykke sektioner på tværs af 10 gelatinebelagte dias. Vær forsigtig, når du sektionerer for ikke at miste hydrogelen. Hvis denne del er vanskelig, placere nogle OLT på toppen af hjernen over gelen(Figur 3). Opbevares ved -80 °C, indtil den er videre.
- Tag rutsjebaner ud af -80 °C, og læg dem på en farvningsbakke, så de kan tørre. Dias, der ikke er frosset, men bare opdelt, kan også farves med det samme.
- Brug en hydrofob pen, tegne en cirkel omkring hjernen skiver på diaset. Når det er tørt, skal du rehydrere hjerneskiverne med 1x filtreret PBS og placeres på en shaker ved stuetemperatur i 15 min. Dette tager omkring 1 mL buffer per dias med 9 - 12 hjerne sektioner.
- Vask diasene med 1x filtreret PBS i 5 min ved stuetemperatur, gentag tre gange.
- Blok dias i 30 min til en time med 10% æsel serum i 0,01% PBS-Triton X ved stuetemperatur på maven danser. Dette tager omkring 200 μL pr dias.
- Inkuber det primære antistof i 10% æselserum med 0,01% PBS-Triton X natten over ved 4 °C på en shaker. Test primære antistoffer først for at bestemme korrekte koncentrationer. Her blev GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Figur 4) brugt.
- Vask dias med 1x filtreret PBS den følgende dag i 5 min ved stuetemperatur, gentag tre gange.
- Inkuberes med sekundært antistof i 10% æselserum i 0,01% PBS-Triton X og DAPI i 2 timer på laboratorie shakeren ved stuetemperatur. 1:1.000 blev brugt til alle sekundærer og DAPI.
- Vask rutsjebanerne i 5 min med 1x filtreret PBS.
- Lad sektioner tørre ved stuetemperatur i mørke. Dette kan tage 20 min til 4 timer; hvis du placerer diasene i en ekssikkator, kan det fremskynde processen.
- Dehydrere glider i stigende koncentrationer af alkohol (1 min pr. opløsning) på 50%, 70%, 95%, 100% og 100%.
- De-fedt i første bad af xylen i 1 min, derefter andet bad af xylen i 5 min.
- Tag hurtigt lysbillederne ud en efter en og tilføj monteringsmedium, mens hjernesektionerne er våde med xylen. Tilsæt hurtigt et glascoverlip på toppen. Brug et cover slip, der er af korrekt længde og tykkelse, der er nødvendig for henholdsvis dias og mikroskop, der bruges til billeddannelse.
- Slip af med eventuelle bobler under dækslerne ved at trykke forsigtigt med en pipettespids i en udadgående bevægelse fra midten af diaset. Lad DPX tørre i 4 timer til natten i mørke ved stuetemperatur.
- Brug et barberblad til at skrabe ethvert tørret monteringsmedium af, der spildes på rutsjebanerne. Tør ned dias med linse renere. Slides kan nu afbildes med fluorescensmikroskopi.
BEMÆRK: Det er bedst at gemme dias i mørke eller ved 4 °C, indtil billeddannelsen er færdig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne metode var at demonstrere, hvordan man injicerer biomaterialer i hjernen efter slagtilfælde. En fotothrombotic model med rose bengal og en 520 nm laser blev brugt til kontrolleret orientering af slagtilfælde læsion i både størrelse og placering. Fem dage efter slagtilfælde infarkt kunne visualiseres under operationen (Figur 1B) og ved TTC og billeddannelse IHC farvede dias (Figur 2). En stigning i laserdiameteren med en 2x linse fører til en visuel stigning i slaglæsionen, der strakte sig over 2,5 mm mod en enkelt 1 mm sektion med kun laseren (Figur 2). Dødelighed under operationen med PT-modellen opstod sjældent, mindre end 1%, på grund af den minimalt invasive procedure. Døden efter operationen var også lav og set hos mindre end 5% af musene.
Hyaluronsyrebaserede hydrogelmikropartikler (HHMPs) blev injiceret fem dage efter slagtilfælde (Figur 3). HMPs anneal efter injektion i slagtilfælde læsion til at danne mikroannealed partikler (MAP) med en porøs stillads, der gjorde det muligt for celle migration i slagtilfælde kerne (Figur 4). Ti dage efter injektion mus blev perfunderet med 4% PFA og deres hjerner blev ekstraheret, placeret i 4% PFA natten over, og derefter i 30% saccharose i to dage, før de blev frosset og sektionsopdelt til IHC farvning og analyse.
Tidligere arbejde i vores laboratorium demonstreret injektion af MAP hydrogels i slagtilfælde læsion fem dage efter slagtilfælde26. Injektion af hyaluroniske hydrogeler, der matcher cortexens modulus, førte til et betydeligt fald i de reaktive astrocytter i peri-infarkten såvel som inde i MAP-gelen. Desuden udtrykte mikroglia, der også var inden for hydrogelen, M2-markører, der var for reparation. Dette tyder på, at MAP hydrogel kan reducere astrocyt reaktivitet på blot to dage efter injektioner og til at fremme en mere anti-inflammatorisk miljø med pro-recovery astrocytter og mikroglia (Figur 5).
Figur 1: Skematisk repræsentation af bregma og lokalisering af slagtilfælde. (A) Parietallapperne mødes øverst for at danne bregmaen. Laserplaceringen var centreret 2,0 mm tilbage af bregmaen. (B) Visuel kropsbygning af slagtilfælde og burr hul blev set 5 dage efter slagtilfælde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Koronar sektioner, der spænder over infarkten. (A) Serielle IHC dele af hjernen 5 dage efter slagtilfælde, slagtilfælde med laser kun (top) og 2x linse (nederst). Skiverne var 30 μm tykke med hver sektion 300 μm væk fra den foregående sektion. (B) Forstørret IHC-plet, 500 μm skalastang. Kerner (DAPI) vises med blå, astrocytter (GFAP+) i rødt og mikroglial (Iba1+) i grøn 4x forstørrelse. (C) Dele af hjerner farves med TTC for at visualisere læsion volumen 5 dage efter slagtilfælde, 1 mm tykke sektioner med 1 cm scalebar. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Injektion og visualisering af biomateriale. (A) Visuel af gel injektion under operationen. (B) Gelen kan visualiseres med øjet, når kraniet fjernes. (C) Gelen var synlig i hjernen under indsnitningen, når den var frosset og monteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Immunohistochemistry pletter af slagtilfælde kun sammenlignet med slagtilfælde med hydrogels. (A) Skematisk af kryosektionerede hjerner 30 μm tyk. Flere sektioner i midten blev valgt til billedanalyse. (B) Kun slagtilfælde, immunohistochemistry (IHC) pletter 15 dage efter slagtilfælde. Astrocytter (GFAP+) celler vises i rød, mikroglia (Iba1+) er grønne, og fartøjer (GLUT1+) er hvide. Slagtilfælde + Hydrogel tilstand, IHC 10d efter injektion, 15 dage efter slagtilfælde. Astrocytter (GFAP +) celler er vist i rød, mikroglia (Iba1 +) er grønne, hydrogel materiale er hvidt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Virkninger af mikroporøse udgløde partikelhydroler på reaktive astrocytter og mikroglia efter slagtilfælde. (A) Skematisk for eksperimentel tidslinje, hvor pilen betyder slagdag, + betyder injektionsdag, og x betyder offer- og analysetidspunktpunkt. (B) Skematisk analyseopsætning, der viser, hvor sektioner blev afbildet og analyseret. (C) IHC billeder, der viser astrocyt reaktivitet gennem pERK, S100b, GFAP. (D) Kvantificering af pERK/GFAP procent af astrocytter, der var meget reaktive. (E) Kvantificering af S100b/GFAP procent af astrocytter, der var meget reaktive. (F) IHC billeder af mikroglia reaktivitet gennem CD11b, Arg1, og iNOS farvning. (G) Kvantificering af iNOS/Dapi til bestemmelse af mikroglial proinflammatorisk fænotype. (H) Kvantificering af Arg1/Dapi til bestemmelse af mikroglial proreparationsnnotype. Alle skala bar = 100 μm. Statistisk analyse blev udført i GraphPad Prism. * angivne data blev analyseret ved hjælp af Tukey post-hoc test og en 95% konfidens interval med P<0,05. Individuelle p-værdier angivet T-test. Dette tal ændres fra ref.26. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstrerer vi en let reproducerbar, minimalt invasiv, permanent slagtilfælde model og beskrive, hvordan man injicerer et biomateriale i infarkt fem dage efter slagtilfælde. Brugen af fotothrombotic farvestof Rose Bengal og en 520 nm kolieret laser tilsluttet den stereotaxiske enhed giver os mulighed for at placere slagtilfælde på motoren cortex af musen med forbedret præcision. Fem dage efter slagtilfælde er infarktens placering synlig for øjet i midten af bestråling, 2,0 mm medio-lateral til bregmaen. Hydrogel sprøjtes derefter nøjagtigt ind i slagkernen ved hjælp af sprøjtepumper. Dødelighed under operationen og efter slagtilfælde i denne model er næsten fraværende, med kun en håndfuld mus dør efter operationen på grund af anæstesiologiske komplikationer. På trods af fordelene ved at anvende PT-slagtilfælde til biomaterialeanvendelser er der flere biologiske begrænsninger og tekniske vanskeligheder, der bør løses.
Med hensyn til biologiske begrænsninger er PT en ikke en slagtilfældemodel, der giver mulighed for cerebral reperfusion, en proces, der kan forekomme spontant i menneskelige slagtilfælde eller som reaktion på endovaskulær indhentning / lysis. Derudover, i modsætning til MCAo model, der efterligner ætiologi af de fleste menneskelige slagtilfælde ved occluding en større cerebral fartøj, PT forringer blodgennemstrømningen gennem mange mindre fartøjer. En teknisk vanskelighed ved at injicere hydrogel biomaterialer er deres tendens til at klæbe til sprøjten under operationen eller til kraniet under ekstraktioner. Design af en hydrogel, der forbliver som en væske under injektion og derefter geler in situ kan løse det første problem; Det er dog ofte uundgåeligt at forhindre gelen i at klæbe til dura-materen, da injektionsstedet og slagtilfældekernen ligger på overfladen af hjernen. Dette kan gøre det vanskeligt at udtrække hjernevævet og samtidig holde biomaterialet intakt. Som sådan skal der udvises særlig omhu, når du fjerner kraniestykker fra hjernen for at sikre, at dura materen ikke løfter med kraniet og utilsigtet fjerner gelen. Kryosectioning hjerner kræver også teknisk dygtighed, fordi både håndteringsprocessen og klinge transection nemt kan løsne gel fra det omgivende væv, og dermed begrænse dataindsamlingen vedrørende celle infiltration. Løsrivelse forværres, når materialet ikke er fuldt integreret med vævet. Forberedelse af prøven med OCT skaber en forstærkningsskal, der hjælper med at minimere materialeadskillelse under skæring.
Før injektion af biomaterialer anbefaler vi at optimere den ønskede slagstørrelse afhængigt af gnaverstamme og laboratorieopsætning. Mindre eller større infarkte kan foretages ved at justere tre hovedparametre: laser output intensitet, stråle forstørrelse, og bestråling tid. Andre faktorer, der også har vist sig at påvirke slagtilfælde størrelse omfatter koncentration af isoflurane19 og tid farvestoffet får lov til at cirkulere før bestråling. Med hensyn til laser output intensitet (magt / område eller mW / cm2),fandt vi, at en laser effekt på 10 mW var tilstrækkelig til at producere en lille infarkt med vandret diameter lidt mindre end laserstrålen. Højere laserkraft gav marginalt bredere, men væsentligt dybere infarcts (data ikke vist) på grund af laserstrålen har en gaussisk bestråling profil. Ved at øge intensiteten, kan midtpunktet for maksimal bestråling trænge dybere forbi kraniet, samt forårsage den lille stigning i spot størrelse penetration af laseren. Andre slagtilfælde modeller har tyndet kraniet ved at slibe det før påføring af lys eller laser for at øge lys penetration og efterfølgende reproducerbarhed af koagulation samtidig opretholde en lavere laser intensitet20; Dette kan dog forårsage blødning i kraniet og tager en hel del tid under operationen og dygtighed til at mestre uden at beskadige hjernen i processen ved et uheld. Svarende til intensiteten, øge laserstrålen diameter også øget infarkt størrelse; laserintensiteten og strålediameteren skaleres dog ikke lineært i forhold til hinanden, men følger ligningen, effekttæthed = lasereffekt (w)/ πr2, hvor er strålens radius. Med hensyn til bestrålingstid fandt vi, at der var behov for mindst 10 minutter for at give reproducerbare slag. For at øge infarktens vandrette diameter og samtidig holde den lodrette dybde konstant, anvendte vi laseren til tilstødende steder i 10 minutter hver, sekventielt. For at imødegå indflydelsen af isoflurane koncentration og cirkulation tid rose bengal, fandt vi, at 1,5% isoflurane koncentration og 7 min af cirkulation efter IP-injektion resulterede i konsekvent dannelse af slagtilfælde. Disse fem parametre blev optimeret til vores særlige brug. Vi krævede et stort nok slagtilfælde til at forårsage adfærdsændringer, men ikke forstyrre den subventrikulære zone, hvor vi havde til formål at studere effekten af vores materiale på neurale stamfaderceller. Ud over slagtilfældestørrelse havde vi også brug for at bestemme det optimale gelvolumen for at injicere. Som minimum havde vi brug for nok gel til helt at fylde slagtilfældehulrummet, fordi vi fandt ud af, at huller mellem gel og omgivende væv førte til lignende resultater som vores kontrolgrupper, mens kontakt mellem gel og væv resulterede i færre reaktive astrocytter og øget cellulær infiltration. Vi nåede frem til en lavere grænse på 4-6 μL gel, som ikke gav nogen bivirkninger efter injektion (ikke-offentliggjorte data).
Med hensyn til vurdering af slagtilfælde resultatet er der flere muligheder ud over IHC farvning, såsom magnetisk resonans imaging, adfærdsmæssige tests, histologisk analyse, og TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chlorid) farvning. Det anbefales stærkt at bruge TTC til foreløbig optimering af slagtilfælde på grund af dets brugervenlighed og umiddelbare resultater. Tidligere adfærdsmæssige test i vores laboratorium har set på Cylinder test / spontan forben opgave, gitter-walking test, og pasta test12,21. Det skal bemærkes, at rotarod test ikke viste betydelige fald i adfærdsmæssige resultater efter PT slagtilfælde metode blev gennemført (data ikke vist). Således bør adfærdsmæssige tests vurdere meget komplekse opgaver, der kræver betydelige kortikale input.
Her demonstrerede vi teknikken til injektion af hydrogeler efter slagtilfælde uden levering af vækstfaktorer eller celler. Men, hydrogels er også blevet udnyttet til celletransplantation, samt narkotika og vækstfaktor levering, og kan vise sig at være en værdifuld ressource for både at studere biologi efter slagtilfælde og undersøge nye metoder til terapi. I forbindelse med slagtilfælde har vores laboratorium injiceret ikke-porøs hyaluronsyrehydrometre, der indkapsler inducerede pluripotente stamcellebaserede neurale stamfaderceller14,18 i koncentrationer fra 25.000 celler / μL til 50.000 celler/μL gel. Brugen af en hydrogel resulterede i en stigning i celle levedygtighed og differentiering. Andre laboratorier har også rapporteret celledifferentiering og øget væv regenerering som reaktion på hydrogels bruges til at transplantere stamceller efter slagtilfælde 22-24. Derudover har vi injiceret hydrogels med vækstfaktorer efter slagtilfælde, der fører til vævsregenerering og adfærdsmæssig forbedring efter slagtilfælde13,14. Med hensyn til materialedesign er injecerbarhed en værdifuld funktion, der tjener til at minimere invasivitet; hydrogeler bør derfor formuleres som enten sol-geler (flydende til fast), forskydning udtynding (G' > G" under statiske forhold; G" > G« under flow) eller granulære geler bestående af byggesten , hvis diameter er mindre end den indvendige diameter af en nål12,25,26. Optimering bør derefter udføres for at teste diffusion af lægemidler eller vækstfaktorer, celle levedygtighed under en række cellekoncentrationer, gel betingelser, og injektion parametre, såsom hastighed, nål gauge, injektion dybde, og dag injektionsdagen i forhold til hvornår slagtilfælde blev induceret. For eksempel har dagen for materialeinjektion varieret fra en dag efter slagtilfælde til, så længe tre uger efter slagtilfælde27,28. Her rapporterer vi fem dage, men har tidligere injiceret syv dage efter slagtilfælde, når vi transplanterer celler. Disse dage blev valgt på grundlag af tidslinjen for det inflammatoriske respons samt den maksimale aktivitet af angiogenese og neurogenese set en uge efter slagtilfælde5,29,30,31. Volumenkarakterisering bør også udføres ved hvert injektionstidspunkt, da slagtilfældevolumenet vil falde over tid på grund af atrofi. I betragtning af at disse parametre er optimeret før injektion, metoderne her er tilstrækkelige til at guide brugerne til at injicere biomaterialer med tilsætning af celler og / eller vækstfaktorer og lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at TS er en grundlægger i Tempo Therapeutics, som søger at kommercialisere MAP hydrogels.
Acknowledgments
Vi kan godt lide at anerkende National Institutes of Health og National Institute of Neurologiske Lidelser og Stroke for finansiering (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
