Summary
Schlaganfall ist ein globales Problem mit minimalen Behandlungsmöglichkeiten und keiner aktuellen klinischen Therapie zur Regeneration des verlorenen Hirngewebes. Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung eines präzisen photothrombotischen Schlaganfalls im motorischen Kortex von Nagetieren und der anschließenden Injektion von Hydrogel-Biomaterialien, um ihre Auswirkungen auf die Geweberegeneration nach einem Schlaganfall zu untersuchen.
Abstract
Schlaganfall ist die Hauptursache für Behinderung und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Etwa 87% aller Schlaganfälle sind ischämische Schlaganfälle und werden als plötzliche Blockade eines Gefäßes definiert, das das Gehirn mit Blut versorgt. Innerhalb weniger Minuten nach der Blockade beginnen die Zellen zu sterben und führen zu irreparablen Gewebeschäden. Aktuelle therapeutische Behandlungen konzentrieren sich auf die Entfernung oder Lyse von Gerinnseln, um die Reperfusion zu ermöglichen und schwerere Hirnschäden zu verhindern. Obwohl die vorübergehende Plastizität des Gehirns im Laufe der Zeit einen Teil des beschädigten Gewebes retten kann, bleiben signifikante Teile der Patienten mit neurologischen Defiziten zurück, die sich nie auflösen werden. Es fehlt an therapeutischen Optionen zur Behandlung neurologischer Defizite, die durch Einen Schlaganfall verursacht werden, was die Notwendigkeit unterstreicht, neue Strategien zur Behandlung dieser wachsenden Patientenpopulation zu entwickeln. Injizierbare Biomaterialien werden derzeit entwickelt, um die Plastizität des Gehirns zu verbessern und die endogene Reparatur durch die Abgabe von Wirkstoffen oder Stammzellen zu verbessern. Eine Methode, um diese Ansätze zu testen, besteht darin, ein Nagetierschlagmodell zu verwenden, das Biomaterial in den Schlaganfallkern zu injizieren und die Reparatur zu bewerten. Die genaue Lage des Schlaganfallkerns zu kennen, ist für die genaue Behandlung nach dem Schlaganfall unerlässlich, daher ist ein Schlaganfallmodell, das zu einem vorhersagbaren Schlaganfallort führt, vorzuziehen, um die Notwendigkeit einer Bildgebung vor der Injektion zu vermeiden. Das folgende Protokoll behandelt, wie man einen photothrombotischen Schlaganfall induziert, wie man ein Hydrogel kontrolliert und präzise injiziert und wie man das Gehirn extrahiert und kryosektioniert, während das Biomaterial intakt bleibt. Darüber hinaus werden wir aufzeigen, wie dieselben Hydrogelmaterialien für die Co-Delivery von Stammzellen verwendet werden können. Dieses Protokoll kann auf die Verwendung anderer injizierbarer Biomaterialien in den Schlaganfallkern verallgemeinert werden.
Introduction
Schlaganfall ist die Hauptursache für Behinderung und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten1. Ungefähr 87% aller Schlaganfälle sind ischämisch, während eine Mehrheit der restlichen 13% hämorrhagischist 2. Ein ischämischer Schlaganfall ist definiert als die Blockade des Blutflusses in einer Arterie zum umgebenden Gewebe. Dieser Verschluss führt zu Sauerstoffmangel und anschließender Nekrose, die bei überlebenden Patienten oft zu dauerhaften Behinderungen führt. Während die Sterblichkeitsrate von Schlaganfall3zurückgegangen ist, wird erwartet, dass seine Prävalenz bis 2030 auf 3,4 Millionen Menschen ansteigen wird4. Diese Zunahme behinderter Überlebender und die daraus resultierende wirtschaftliche Belastung haben zu einem Vorstoß für die Schlaganfallforschung geführt, die sich auf Mechanismen der neuronalen Reparatur konzentriert. Nach dem Schlaganfall kommt es zu einer entzündlichen Periode, die zur Bildung einer Narbe führt, die verhindert, dass sich die nekrotische Region ausdehnt. Die Region, die den nekrotischen Kern umgibt, wird als "Periinfarkt" bezeichnet, und es gibt starke Hinweise darauf, dass die Plastizität in dieser Region, die eine erhöhte Angiogenese, Neurogenese und axonale Keimung umfasst, direkt mit der beobachteten Erholung bei Tiermodellen und Menschen zusammenhängt5. Da es keine In-vitro-Modelle gibt, die die komplexen Wechselwirkungen nach einem Schlaganfall richtig replizieren können, sind Tiermodelle für die Schlaganfallforschung unerlässlich.
Es gibt mehrere In-vivo-Modelle, die verwendet werden können, um einen ischämischen Schlaganfall zu erzeugen. Eines der häufigsten Modelle, die bei Mäusen verwendet werden, ist der Verschluss der mittleren Hirnarterie oder MCAo durch distalen oder proximalen (über intraarteriale Filamente) Verschluss. Das proximale Modell, auch bekannt als Filament MCAo (fMCAo), führt typischerweise zu großen ischämischen Schlaganfällen, die zwischen 5% und 50% der gehirnförmigen Hemisphäre umfassen, abhängig von der Anzahl der Faktoren6. In diesen Modellen wird eine Naht oder ein Filament von der Arteria carotis interna in die Basis der mittleren Hirnarterie (MCA) vorgeschoben und für einen bestimmten Zeitraum an Ort und Stelle gehalten. Diese Methode zur Okklusion, die vorübergehend oder dauerhaft gemacht werden kann, erzeugt einen Infarkt, der im Striatum zentriert ist und einen darüber liegenden Kortex beinhalten kann oder auch nicht6. Die resultierende Schlaggröße ist sehr variabel, und bildgebende Verfahren wie Laserdoppler sind erforderlich, um die Wirksamkeit des Verfahrens in jeder Maus zu bestätigen. Intraarterieller oder intralumnaler Filamentverschluss, der länger als 30 Minuten dauert, erzeugt Schläge am größeren Ende des Größenbereichs. Einige Forscher haben sich auf kürzere Filamentverschlusszeiten konzentriert, die einen erheblichen experimentellen Fokus und eine Laborvalidierung erfordern7. Filament-MCAo-Modelle bei Mäusen folgen ähnlichen Stadien des Zelltods, der ischämischen Progression und der Bildung einer Periinfarktregion, wie sie bei menschlichen Schlaganfallfällen beobachtet werden; Die größeren Schlaganfälle ähneln jedoch eher dem Krankheitszustand von bösartigen Hirninfarkten, die seltenere, weniger behandelbare menschliche Schlaganfälle sind6. In der Zwischenzeit erfordert der distale MCA-Verschluss eine aufwendigere Operation und Kraniektomie. In diesem Modell wird der distale Teil des MCA, der entlang der Oberfläche des Gehirns verläuft, direkt mit einer Nahtbindung oder Kauterisation verschlossen. In einigen Variationen der Technik sind die Halsschlagadern einseitig oder vorübergehend-bilateral verschlossen. Ein Vorteil des distalen MCAo besteht darin, dass er einen kortikalen Schlag erzeugt, dessen Größe weniger variabel ist als das Filamentmodell. Das distale Modell erzeugt jedoch aufgrund der Transektion der äußeren Halsschlagader (ECA) eine schlechtere Verhaltensleistung, was auch bei fMCAo 6 ein Problemdarstellt.
Ein alternatives Schlaganfallmodell, das dafür bekannt ist, weniger invasiv zu sein, ist das photothrombotische (PT) Modell. Das PT-Modell führt zu einem klar definierten Ort der Ischämie und ist mit einer hohen Überlebensrate assoziiert8. Die Technik beruht auf einem lichtempfindlichen Farbstoff, der intraperitoneal injiziert wird und die intravaskuläre Photooxidation einfach durch Bestrahlung des gewünschten Gewebes mit einem Licht oder Laserermöglicht 9. Bei Anregung bilden sich Sauerstoffradikale, die Endothelschäden verursachen, die die Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung im bestrahlten Bereich aktivieren8,9. Die strenge Kontrolle über Hubgröße und -position sowie die hohe Reproduzierbarkeit des PT-Modells machen es ideal für die Untersuchung von Biomaterialien. Während Präzision durch einen Laser und stereotaktische Koordinaten ermöglicht wird, gibt es einige Nachteile, die dieses Modell für wenige Studien weniger ideal machen können. Im Gegensatz zum fMCAo-Modell kann das PT-Hubmodell nicht reperfundiert werden. Daher wären Materialien zur Untersuchung neuroprotektiver Wirkstoffe, die spezifisch für Schäden nach Reperfusion oder die Mechanismen nach reperfusion sind, hier nicht sinnvoll8. Darüber hinaus wird aufgrund der mikrovaskulären Beleidigung des PT-Modells eine relativ kleine ischämische Penumbra gesehen. Stattdessen tritt ein lokales vasogenes Ödem auf, das für den menschlichen Schlaganfall untypisch ist, was dieses Modell für präklinische Arzneimittelstudien, die sich auf den Periinfarktbereichkonzentrieren,unerwünscht macht6,8.
Das übergeordnete Ziel von Biomaterialstrategien bei Schlaganfällen ist es, entweder bioaktive Wirkstoffe zu liefern oder als surrogatartige extrazelluläre Matrix für das Wachstum von Hirngewebe zu fungieren. Eine Strategie, die wir mit unseren Methoden untersuchen werden, besteht darin, Hydrogel direkt in den Schlaganfallkern zu liefern, im Gegensatz zum periinfarkten Gewebe, in dem viele aktuelle Zelltherapien verabreicht werden10. Die Begründung für diesen Ansatz ist, dass die Abgabe in das nekrotische Gewebe im Kern die Störung des umgebenden gesunden oder sich erholenden Gewebes vermeidet. Wir gehen davon aus, dass die Diffusion aller im Biomaterial enthaltenen Wirkstoffe in der Lage sein wird, den Periinfarkt vom Kern aus zu erreichen, zumal wir feststellen, dass die Abgabe von Hydrogel-Biomaterialien die Dicke der Glianarbe reduziert11. Dies ist wichtig, da gezeigt wurde, dass die Periinfarktregion nach einem Schlaganfall Neuroplastizität aufweist, was sie zu einem attraktiven Ziel macht. Darüber hinaus kann die Abgabe einer Surrogatmatrix an den Schlaganfallkern mit angiogenen12 oder neurogenen13 Faktoren beladen werden, um die Bildung von neuem Gewebe zu steuern, sowie Zellen für die Abgabe14. Die Zellabgabe wird durch die Verwendung einer Matrix erheblich verbessert, da sie die Zellen vor den harten Injektionskräften und der lokalen Umgebung schützt, die während der Entbindung vorhanden sind, sowie die Differenzierung und Transplantation fördert15.
Diese injizierbaren therapeutischen Biomaterialien haben klinische Relevanz bei Schlaganfallanwendungen, da es derzeit keine medizinischen Therapien gibt, die die neuronale Erholung nach einem Schlaganfall stimulieren. Die zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise, die an der Genesung beteiligt sind, liegen im Hirngewebe, das an den Schlaganfallkern16angrenzt, während der Schlaganfallkern selbst frei von lebensfähigem Nervengewebe ist. Wir gehen davon aus, dass die Abgabe eines Biomaterials in den nekrotischen Schlaganfallkern das Potenzial hat, das angrenzende Gewebe durch eine Reihe von zuvor erwähnten Mechanismen zu regenerativen Prozessen zu stimulieren, darunter die Depotfreisetzung von Wachstumsfaktoren13,die Stimulation des Gewebewachstums und die Förderung der Wiederherstellung der Entwicklung von Hirngewebe11,12, Veränderung der Immunantwort17und die Abgabe von aus Stammzellen abgeleitetenTherapeutika 14. 18. Um jedoch die Möglichkeit dieser Anwendungen effektiv zu untersuchen, ist eine konsistente und reproduzierbare Methode zur Induktion von Schlaganfällen und zur Injektion von Biomaterialien erforderlich. Das PT-Hubmodell verwendet Techniken, die eine präzise Kontrolle über die Ausrichtung und Position des Hubs bieten. Ein am stereotaktischen Gerät befestigter Laser führt die Ausrichtung, und an den stereotaktischen Geräten angebrachte Pumpen steuern die Injektionsrate des Materials, ohne dass zusätzliche Formen der Bildgebung erforderlich sind. Daher haben wir uns entschieden, die Methoden zur Durchführung eines PT-Schlaganfalls in den motorischen Kortexen von Mäusen und zur Injektion von Biomaterialien in den Schlaganfallkern zu beschreiben. Hier verwenden wir mikroporöse geglühte Partikel (MAP) Hydrogele als Biomaterial für die Injektion ohne Zusatz von Zellen oder Wachstumsfaktoren. Darüber hinaus erklären wir, wie man das Gehirn mit intaktem Biomaterial erfolgreich abrufen kann, und wir diskutieren immunchemische Assays, die zur Analyse des Schlaganfallergebnisses mit und ohne Injektion von Biomaterialien verwendet werden.
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Protocol
Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit IUCAC an der Duke University und der University of California Los Angeles durchgeführt. 8 bis 12 Wochen alte männliche C57Bl/6J-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 °C) mit einer 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklusperiode und Zugang zu pelletiertem Futter und Wasser ad libitum untergebracht. Analgesie- und Sedierungsprotokolle werden als von der IUCAC genehmigt beschrieben, können sich jedoch von den in anderen Labors verwendeten Protokollen unterscheiden.
Tiere können vorzeitig eingeschläfert werden, wenn sie übermäßige Unruhe, Vokalisation (was auf unkontrollierbare Schmerzen hinweist), Selbsttrauma, verminderte oder beeinträchtigte Mobilität, körperliche Anzeichen einer Hautinfektion, Appetitlosigkeit und / oder Gewichtsverlust von mehr als 10% -15% als Ergebnis der Überlebensoperation erfahren. Es gibt keine erwarteten nachteiligen Auswirkungen durch die Injektion des Gels, da es aus einem natürlich vorkommenden Polymer im Gehirn besteht. Die Tiere sollten täglich, auch an Wochenenden und Feiertagen, überwacht und jeden zweiten Tag neu gewichtet werden. Studien aus unserem Labor und anderen haben bei Mäusen nach diesen kleinen kortikalen oder subkortikalen Schlaganfällen keine Defizite in der Körperpflege, beim Verlust des Körpergewichts oder an Anzeichen/Symptomen eines Entzugs oder chronischen Stresses gefunden. Wenn Tiere Anzeichen einer lokalen Kopfwundeninfektion aufweisen, sollten sie eingeschläfert werden. Tiere sollten auch auf schlechte Pflege, Wundzustand und Anzeichen von Kämpfen zwischen Tieren (Rückenwunden) überwacht werden. Wenn es Anzeichen von Kampf oder Wunddehiszenz gibt, sollten die Tiere zuerst nach Kontaktaufnahme mit den Tierärzten behandelt werden. Dies beinhaltet oft Antibiotika im Wasser und / oder lokale topische Antibiotika-Anwendung. Wenn diese Maßnahmen keine Heilung bewirken, sollten Tiere eingeschläfert werden.
1. Vorbereitung von Materialien und Instrumenten
- Bereiten Sie vor der Operation einen photothrombotischen Farbstoff vor. 15 mg Rose Bengal in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen einwiegen.
VORSICHT: Rose Bengal kann schwere Augenschäden / Reizungen verursachen.- Lösen Sie die Rose Bengal in 1,5 ml steriler, filtrierter 1x PBS auf, um eine Arbeitskonzentration von 10 mg / ml zu erhalten.
- Wirbeln Sie das Röhrchen, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind, was darauf hinweist, dass sich der Farbstoff vollständig aufgelöst hat, und bedecken Sie es dann bis zur weiteren Verwendung mit Folie.
HINWEIS: Die Menge des erforderlichen Farbstoffs hängt von der Anzahl der Mäuse ab. Farbstoff wird intraperitoneal IP in einer Konzentration von 10 μL/g injiziert, z. B. 200 μL für eine 20 g Maus.
- Schalten Sie das Heizkissen ein, um die Körpertemperatur der Maus während der Narkose (37 °C) aufrechtzuerhalten.
- Bereiten Sie autoklavierte Scheren, Pinzetten, Baumwolle, Augensalben, chirurgischen Klebstoff oder Nahtmaterial, einen blauen oder schwarzen chirurgischen Marker sowie sterile Alkohol- und Beta-Jodtücher vor. Knochenbohrer mit sterilisierten Bohrerköpfen vorbereiten.
- Schalten Sie die Perlensterilisation auf 160 ° C ein, um die Sterilisation von Instrumenten zwischen mäusechirurgischen Eingriffen zu ermöglichen. Legen Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit steriler Kochsalzlösung oder 1x PBS-Lösung für die spätere Verwendung bei der Aufrechterhaltung eines hydratisierten Operationsbereichs beiseite.
- Befestigen Sie den Laser am stereotaktischen Gerät. Messen Sie mit einer Laserschutzbrille die Leistung des Lasers (mW).
ACHTUNG: Verwenden Sie eine Laserschutzbrille, wenn der Laser während des Eingriffs eingeschaltet wird.- Passen Sie den Strom auf der Laserkonsole gemäß den Anweisungen zur Laserherstellung an, bis die Laserleistung 10 mW anzeigt, und stellen Sie den Strom als voreingestellt auf der Startbildschirmkonsole ein. Passen Sie dann den Strom erneut an, um eine weitere Voreinstellung zu erstellen, bei der die Laserausgangsleistung 40 mW beträgt. Schalten Sie nun den Laser bis zur weiteren Verwendung aus.
HINWEIS: Die 10 mW werden verwendet, um den Laser vor dem Gebrauch auszurichten.
- Passen Sie den Strom auf der Laserkonsole gemäß den Anweisungen zur Laserherstellung an, bis die Laserleistung 10 mW anzeigt, und stellen Sie den Strom als voreingestellt auf der Startbildschirmkonsole ein. Passen Sie dann den Strom erneut an, um eine weitere Voreinstellung zu erstellen, bei der die Laserausgangsleistung 40 mW beträgt. Schalten Sie nun den Laser bis zur weiteren Verwendung aus.
- Bereiten Sie nach der Operation einen sauberen Käfig für Mäuse vor. Legen Sie dann die Maus mit einer Isoflurankonzentration von 4% in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung aufhört und ihre Atmung zu einer langsamen, gleichmäßigen Rate kommt.
- Sobald Sie eingeschlafen sind, wiegen Sie die Maus, um zu bestimmen, wie viel Rose Bengal Farbstoff injiziert werden soll. Übertragen und sichern Sie dann die Maus auf das stereotaktische Gerät mit einer Isoflurankonzentration von 1,5%.
HINWEIS: Eine Erhöhung der Isoflurankonzentrationen kann die Gefäße erweitern und eine ausreichende Okklusion oder gleichmäßig große Schlaganfälle zwischen Mäusen verhindern. - Tragen Sie veterinärztliche Augensalbe auf beide Augen auf.
HINWEIS: Beobachten Sie die Atmung und Temperatur während des gesamten Eingriffs und drücken Sie gelegentlich die Zehen ein, um sicherzustellen, dass die Maus nichts fühlen kann.
2. Photothrombotischer Schlaganfall Modell9
- Rasieren Sie das Fell vom Kopf der Maus und bereiten Sie den Bereich aseptisch vor, indem Sie ein Alkoholtuch verwenden, gefolgt von einem Beta-Jod-Tuch. Dreimal wiederholen.
HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf ein zusätzliches Alkoholtuch am Ende, um das gesamte Beta-Jod zu reinigen, da es Hautreizungen verursacht, die dazu führen, dass die Mäuse nach der Operation ihren Schädel jucken. - Machen Sie mit einer kleinen Operationsschere einen seitlichen Schnitt zwischen den Ohren zu den Augen, etwa 1-2 cm. Tun Sie dies, indem Sie die Haut mit einer Pinzette nach oben ziehen, um ein Zelt zu schaffen, einmal nach unten schneiden, dann die Schere in die Öffnung einführen und einen durchgehenden Mittellinienschnitt erzeugen.
- Trennen Sie die Haut und drücken Sie leicht mit der Pinzette auf die Parietalknochen, um das Bregma zu lokalisieren. Markieren Sie das Bregma mit einem Punkt mit dem chirurgischen Marker.
HINWEIS: Die Bewegung des Knochenfragments hebt den frontalen Rand der Parietalknochen hervor. Das Bregma ist der Mittelpunkt, an dem sich die frontalen und parietalen Knochenfragmente treffen (Abbildung 1A). - Bewegen Sie den Laser mit einer Laserschutzbrille über den Schädel der Maus und fixieren Sie das stereotaktische Gerät in einem Winkel von 90 °. Wählen Sie die 10 mW voreingestellten und schalten Sie den Laser ein.
- Stellen Sie die x- und y-Achse des Lasers so lange ein, bis er sich direkt über dem Bregma befindet. Setzen Sie das x und y auf der digitalen Anzeigekonsole zurück und bewegen Sie dann den Laser 1,8 mm links vom Bregma. Bringen Sie nun den Laser so nah wie möglich an den Schädel heran, ohne dass er den Schädel berührt.
- Bewegen Sie den Laser auf 2,2 mm links vom Bregma, um sicherzustellen, dass er sich ohne Hindernisse bewegen kann. Schalten Sie den Laser aus.
- Injizieren Sie die entsprechende Menge Rose Bengal Farbstoff intraperitoneal (IP) mit einer Einwegnadel von 29 G. Starten Sie sofort einen Timer für 7 minuten, damit der Farbstoff systemisch zirkulieren kann. Wählen Sie die Voreinstellung für 40 mW, ohne den Laser einzuschalten.
HINWEIS: Sobald Sie mit dem Verfahren vertraut sind, kann der Farbstoff vor der aseptischen Vorbereitung der Maus injiziert und vor Ablauf der 7 Minuten beendet werden, um Zeit zu sparen. - Schalten Sie den Laser (40 mW) ein, wenn der 7-Minuten-Timer losgeht, während Sie eine Laserschutzbrille tragen, und stellen Sie einen 10-Minuten-Timer ein.
- Bewegen Sie den Laser nach 10 Minuten auf 2,2 mm links vom Bregma, ohne ihn auszuschalten, und stellen Sie einen weiteren 10-Minuten-Timer ein.
- Sobald der zweite 10-Minuten-Timer losgegangen ist, schalten Sie den Laser wieder auf 10 mW und bewegen Sie den Laser auf 2,0 mm links vom Bregma. Markieren Sie diese Stelle mit dem chirurgischen Marker. Schalten Sie dann den Laser aus.
- Heben Sie den Laser an und entriegeln Sie ihn aus dem 90°-Winkel, damit er von der Maus wegbewegt werden kann. Tragen Sie an dieser Stelle die sterile Kochsalzlösung oder PBS mit Baumwolle auf, wenn der Operationsbereich trocken ist.
- Bohren Sie in kleinen Ausbrüchen an der 2,0-mm-Markierung senkrecht zur Schädeloberfläche.
HINWEIS: Achten Sie darauf, langsam zu bohren, um zu vermeiden, zu tief zu bohren und das Gehirn zu treffen. Es wird einen leichten Abfall / eine Änderung des Widerstands geben, sobald der Bohrer durch den Schädel gegangen ist, und das Bohren kann Blutungen verursachen.- Verwenden Sie Baumwolle, um überschüssiges Blut zu absorbieren. Es ist typisch, nach dem Bohren etwas Blut aus eingekerbten Arterien im Schädel zu sehen - übermäßiges Blut bedeutet, dass der Bohrer das Gehirn getroffen hat. Notieren Sie sich in diesem Fall die Mauskennung und fahren Sie fort.
- Legen Sie einen kleinen Wisch neben die Maus. Ziehen Sie die Haut mit der Pinzette eng zusammen, um sich auf das Kleben vorzubereiten.
HINWEIS: Das Nähen kann stattdessen hier erfolgen. Das Nähen erfordert in der Regel nur 3 Nähte.- Greifen Sie mit der Pinzette die beiden Seiten der Haut und ziehen Sie sie zusammen und nach oben. Tupfen Sie alle großen Tropfen chirurgischen Klebstoffs am Ende der Spitze auf dem Tuch ab, bevor Sie sie auf die Maus auftragen.
- Tragen Sie den OP-Kleber sparsam auf und halten Sie die Haut mit einer Pinzette 10 s lang zusammen. Fahren Sie fort, bis keine Öffnungen mehr sichtbar sind.
HINWEIS: Der Kleber kommt schnell heraus – drücken Sie die Flasche nicht zusammen. Vermeiden Sie es, die Haut an den Schädel zu kleben oder Klebstoff in das Auge zu bekommen.
- Legen Sie die Maus nach dem Kleben oder Nähen in den neuen Käfig, um sich von der Anästhesie zu erholen. Es dauert 5-10 Minuten, bis sich das Tier erholt hat, und es hilft, die Hälfte des Käfigs auf einem Heizkissen zu ruhen.
3. Scheinhub-Operation
- Führen Sie alle Verfahren identisch mit der oben in Abschnitt 2 beschriebenen Operation durch, mit Ausnahme der Injektion von 1x PBS oder Kochsalzlösung anstelle von Rose Bengal Farbstoff.
4. Injektion von Hydrogel oder anderen Biomaterialien
- Führen Sie die Injektion von Biomaterialien zu einem benutzerdefinierten Zeitpunkt durch. In diesem Experiment wurden Injektionen zwischen 5 und 7 Tagen nach dem Schlaganfall durchgeführt. 2 - 6 μL Hydrogel werden injiziert (benutzerdefiniert).
- Schalten Sie das Heizkissen ein, um die Körpertemperatur der Maus während der Narkose (37 °C) aufrechtzuerhalten.
- Bereiten Sie autoklavierte Scheren, Pinzetten, Baumwolle, Augensalben, chirurgischen Klebstoff oder Nahtmaterial sowie sterile Alkohol- und Beta-Jodtücher vor. Bereiten Sie den Knochenbohrer mit sterilen Bohrerköpfen und die 25 μL Hamilton Glasspritzen mit Metall 30 G Nadeln vor.
- Schalten Sie die Perlensterilisation auf 160 °C ein, um die Sterilisation von Instrumenten zwischen Mäusen zu ermöglichen.
- Befestigen Sie die Einspritzpumpen am stereotaktischen Gerät. Stellen Sie die Durchflussrate auf 1 μL/min und das Volumen auf 4 μL ein.
- Bereiten Sie nach der Operation einen sauberen Käfig für die Mäuse vor.
- Legen Sie die Maus mit einer Isoflurankonzentration von 4% in die Induktionskammer, um sie zu betäuben, bis die spontane Bewegung aufhört und ihre Atmung zu einer langsamen, stetigen Rate kommt.
- Übertragen und befestigen Sie die Maus im Schlaf mit einer Isoflurankonzentration von 1,5% auf das stereotaktische Gerät.
- Tragen Sie die Augensalbe des Tierarztes auf beide Augen auf.
- Rasieren Sie alle Felle, die möglicherweise vom Kopf der Maus nachgewachsen sind, und bereiten Sie den Bereich aseptisch vor, indem Sie ein Alkoholtuch verwenden, gefolgt von einem Beta-Jod-Tuch. Dreimal wiederholen.
HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf ein zusätzliches Alkoholtuch am Ende, um das gesamte Beta-Jod zu reinigen, da es Hautreizungen verursacht und die Mäuse nach der Operation zum Jucken des Schädels bringt.
- Öffnen Sie mit der kleinen Schere und / oder Pinzette die Haut über dem Gehirn wieder. Verwenden Sie Baumwolle mit steriler Kochsalzlösung oder PBS, um Ablagerungen vom Schädel zu entfernen. Ein weiß-gelber Kreis (der Strich, Abbildung 1B) und das Gratloch aus dem Bohrer sind sichtbar. Wenn das abgestorbene Gewebe nicht sichtbar ist, ist wahrscheinlich kein Schlaganfall aufgetreten. Wenn das Gratloch nicht über dem Hub zentriert ist, bohren Sie es erneut, um es zu zentrieren.
- Die Einspritzpumpe über der Maus ausrichten und bei 90° verriegeln. Reinigen Sie die Spritze mit steriler Kochsalzlösung oder PBS-Lösung, bevor Sie das Material zurückladen.
- Nach der Reinigung zerlegen Sie die Glasspritze, so dass keine Nadel vorhanden ist. Laden Sie die Spritze mit einer 25 μL-Verdrängerpipette mit den 10 μL Hydrogel (oder einem anderen Biomaterial hier mit oder ohne Zellen) zurück.
- Drücken Sie das Gel mit dem Spritzenkolben bis zur Vorderseite der Spritze. Setzen Sie dann die Spritze wieder zusammen und drücken Sie weiter, bis das Gel sichtbar aus der Nadel austritt.
- Legen Sie die Spritze auf die Pumpe. Die Rückseite der Pumpe muss möglicherweise so eingestellt werden, dass die Spritze passt. Stellen Sie dazu die Durchflussrate auf 30 μL/min ein, wählen Sie Entnahme oder Injektion je nach Bewegungsrichtung und drücken Sie dann Start. Drücken Sie Stop, wenn sich die Rückseite der Pumpe an der richtigen Stelle befindet.
- Schrauben Sie die Rückseite der Pumpe, damit die Spritze sicher ist. Wenn zuvor Anpassungen vorgenommen wurden, stellen Sie sicher, dass die Durchflussrate auf 1 μL/min zurückgesetzt und auf Injektion eingestellt ist.
- Bewegen Sie die Pumpe in x- und y-Richtung, um sie über das Loch zu richten. Bewegen Sie die Pumpe in z-Richtung nach unten, bis die Nadel der Spritze die Oberseite des Lochs berührt.
- Setzen Sie das z auf der Digitalanzeigekonsole zurück. Bewegen Sie dann die Spritze in z-Richtung 0,750 mm nach unten. Wenn sich die Spritze biegt oder Widerstand besteht, ist der Schädel entweder geheilt oder wurde nicht vollständig durchbohrt und muss erneut gebohrt werden.
- Drücken Sie Start auf der Pumpenkonsole, um 4 - 6 μL des Hydrogels mit einer Geschwindigkeit von 1 μL/min zu injizieren.
- Stellen Sie einen 5-Minuten-Timer ein, wenn die Pumpe die Injektion stoppt, damit das Gel mit der Vernetzung beginnen kann.
- Nach 5 Minuten ziehen Sie die Spritze langsam hoch, indem Sie das z nob drehen. Beobachten Sie, ob Material versehentlich aus dem Loch gezogen wird oder austritt. Entriegeln Sie die Pumpe und bewegen Sie sie von der Maus weg, wenn die Nadel weit genug vom Schädel entfernt ist.
- Schließen Sie mit einer Pinzette, chirurgischem Klebstoff oder Nähten die Haut über dem Kopf. Legen Sie die Maus in den sauberen Käfig und beobachten Sie ihre Genesung. Es sollte etwa 5 – 10 Minuten dauern, bis sich die Maus von der Narkose erholt hat.
5. Perfusion und Probenentnahme
- Betäuben Sie die Maus mit Isofluran.
- Fixieren Sie das Tier in Rückenlage und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem medianen Schnitt. Optional klemmen Sie die absteigende Bauchaorta ein, um weniger Fixiermittel und PBS zu verwenden.
- Schneiden Sie das Zwerchfell auf und bewegen Sie die Seiten des Brustkorbs nach oben, um die Brusthöhle zu öffnen. Führen Sie eine Perfusionskanüle in die linke Herzkammer ein und schneiden Sie eine Öffnung in den rechten Vorhof. Beginnen Sie langsam mit 10-20 ml PBS zu perfundieren oder bis die Flüssigkeit halbklar läuft.
- Sobald sie klar sind, wechseln Sie zu 4% PFA für weitere 10 - 20 ml. Das Lösen der Arme ermöglicht es ihnen, sich zusammenzuziehen, wenn die PFA eindringt. Sobald sie aufhören, sich zu bewegen, warten Sie auf weitere 30 s.
- Enthaupten Sie das Tier und ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie mit einer stumpfen, dünnen Pinzette vorsichtig die Schädelstücke, um das Gehirn freizulegen. Besondere Vorsicht ist geboten, wenn der Schädel oberhalb der Schlaganfallstelle entfernt wird. Kleine chirurgische Scheren können hier verwendet werden, um den Schädel wegzuschneiden. Die größte Herausforderung besteht darin, dass Gel am Schädel klebt und aus dem Gehirn austritt, wenn der Schädel entfernt wird.
- Sobald das Gehirn abgelöst ist, legen Sie 10 – 15 ml 4% PFA über Nacht (nicht länger als 24 h) ein.
- Bewegen Sie das Gehirn am nächsten Tag von PFA auf 30% Saccharose. Das Gehirn ist bereit für die Kryosektion, sobald es auf den Boden sinkt (ca. 2 – 3 Tage). Es kann an dieser Stelle auch zur Lagerung belassen werden.
6. Kryosektion und Färbung
- Nehmen Sie das Gehirn aus Saccharose und legen Sie es auf ein Glasobjektträger. Schneiden Sie einen kleinen Teil der Rückseite des Gehirns mit einer Rasierklinge ab, um einen flachen Teil zu erzeugen, der auf einem Chuck montiert werden kann.
- Legen Sie einen Klecks Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) auf das Spannfutter und legen Sie dann das Gehirn mit der flachen Seite nach unten auf das Spannfutter im OCT. Legen Sie diese Probe auf Trockeneis, bis sie eingefroren ist, oder in den Kryostaten auf dem Gefrierblock.
HINWEIS: OCT kann hinzugefügt werden, um das Gehirn vollständig zu umfassen, um zu verhindern, dass sich das Material während des Schneidens vom Gehirn trennt.
- Legen Sie einen Klecks Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) auf das Spannfutter und legen Sie dann das Gehirn mit der flachen Seite nach unten auf das Spannfutter im OCT. Legen Sie diese Probe auf Trockeneis, bis sie eingefroren ist, oder in den Kryostaten auf dem Gefrierblock.
- Schneiden Sie die Gehirne seriell auf einem Kryostaten bei -20 °C bei 30 μm dicken Abschnitten über 10 mit Gelatine beschichtete Objektträger. Achten Sie beim Schneiden darauf, dass das Hydrogel nicht verloren geht. Wenn dieser Teil schwierig ist, legen Sie etwas OCT auf die Oberseite des Gehirns über das Gel (Abbildung 3). Bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
- Die Objektträger aus den -80 °C nehmen und auf eine Färbeschale legen, damit sie trocknen können. Dias, die nicht eingefroren, sondern nur geschnitten wurden, können ebenfalls sofort gebeizt werden.
- Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis um die Gehirnschnitte auf dem Objektträger. Nach dem Trocknen rehydrieren Sie die Gehirnscheiben mit 1x gefiltertem PBS und legen Sie sie für 15 Minuten auf einen Shaker bei Raumtemperatur. Dies erfordert etwa 1 ml Puffer pro Objektträger mit 9 – 12 Hirnschnitten.
- Waschen Sie die Objektträger mit 1x gefiltertem PBS für 5 min bei Raumtemperatur, dreimal wiederholen.
- Blockrutschen für 30 min bis zu einer Stunde mit 10% Eselserum in 0,01% PBS-Triton X bei Raumtemperatur auf der Bauchtänzerin. Dies dauert etwa 200 μL pro Objektträger.
- Inkubieren Sie den primären Antikörper in 10% Eselserum mit 0,01% PBS-Triton X über Nacht bei 4°C auf einem Shaker. Testen Sie zuerst primäre Antikörper, um die richtigen Konzentrationen zu bestimmen. Hier wurden GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Abbildung 4) verwendet.
- Rutschen mit 1x gefiltertem PBS am Folgetag für 5 min bei Raumtemperatur waschen, dreimal wiederholen.
- Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern in 10% Eselserum in 0,01% PBS-Triton X und DAPI für 2 h auf dem Laborschüttler bei Raumtemperatur. 1:1.000 wurde für alle Secondaries und DAPI verwendet.
- Waschen Sie die Objektträger für 5 min mit 1x gefiltertem PBS.
- Lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Dies kann 20 Minuten bis 4 Stunden dauern; Das Platzieren der Dias in einem Exsikkator kann den Prozess beschleunigen.
- Dehydrate gleitet in aufsteigenden Alkoholkonzentrationen (1 min pro Lösung) von 50%, 70%, 95%, 100% und 100%.
- Entfetten Sie im ersten Bad Xylol für 1 min, dann zweites Bad Xylol für 5 min.
- Nehmen Sie die Dias schnell nacheinander heraus und fügen Sie ein Montagemedium hinzu, während die Gehirnabschnitte mit Xylol benetzt sind. Fügen Sie schnell einen Glasdeckglas hinzu. Verwenden Sie einen Abdeckzettel, der die richtige Länge und Dicke aufweist, die für den Objektträger bzw. das Mikroskop benötigt werden.
- Befreien Sie sich von Blasen unter dem Deckglas, indem Sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze in einer nach außen gerichteten Bewegung von der Mitte des Objektträgers aus drücken. Lassen Sie DPX 4 h bis über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge, um getrocknetes Montagemedium abzukratzen, das auf die Objektträger gelangt ist. Wischen Sie Die Dias mit dem Objektivreiniger ab. Objektträger können nun mit Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden.
HINWEIS: Es ist am besten, den Dia im Dunkeln oder bei 4 ° C zu lagern, bis die Bildgebung abgeschlossen ist.
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Representative Results
Ziel dieser Methode war es, zu demonstrieren, wie man nach einem Schlaganfall Biomaterialien in das Gehirn injizieren kann. Ein photothrombotisches Modell mit Rosenbengalen und einem 520-nm-Laser wurde zur kontrollierten Ausrichtung der Schlaganfallläsion in Größe und Ort verwendet. Fünf Tage nach dem Schlaganfall konnte der Infarkt während der Operation sichtbar gemacht werden (Abbildung 1B) und durch TTC und Bildgebung von IHC-gefärbten Objektträgern (Abbildung 2). Eine Zunahme des Laserdurchmessers mit einer 2-fachen Linse führte zu einer visuellen Zunahme der Hubläsion, die sich über 2,5 mm erstreckte, im Vergleich zu einem einzigen 1-mm-Schnitt nur mit dem Laser (Abbildung 2). Die Mortalität während der Operation mit dem PT-Modell trat aufgrund des minimal-invasiven Verfahrens selten auf, weniger als 1%. Der Tod nach der Operation war ebenfalls gering und wurde bei weniger als 5% der Mäuse beobachtet.
Hyaluronsäure-basierte Hydrogel-Mikropartikel (HMPs) wurden fünf Tage nach dem Schlaganfall injiziert (Abbildung 3). Die HMPs glühen nach Der Injektion in die Schlaganfallläsion zu mikroannenierten Partikeln (MAP) mit einem porösen Gerüst, das eine Zellmigration in den Schlaganfallkern ermöglichte (Abbildung 4). Zehn Tage nach der Injektion wurden Mäuse mit 4% PFA durchblutet und ihre Gehirne wurden extrahiert, über Nacht in 4% PFA und dann zwei Tage lang in 30% Saccharose gegeben, bevor sie eingefroren und für die IHC-Färbung und -Analyse geschnitten wurden.
Frühere Arbeiten in unserem Labor zeigten die Injektion von MAP-Hydrogelen in die Schlaganfallläsion fünf Tage nach dem Schlaganfall26. Die Injektion von Hyaluronhydrogelen, die dem Modul des Kortex entsprechen, führte zu einer signifikanten Abnahme der reaktiven Astrozyten innerhalb des Periinfarkts sowie im MAP-Gel. Darüber hinaus exprimierten Mikroglia, die sich ebenfalls im Hydrogel befanden, Pro-Repair-M2-Marker. Dies deutet darauf hin, dass MAP-Hydrogel die Astrozytenreaktivität in nur zwei Tagen nach Injektionen reduzieren und eine entzündungshemmendere Umgebung mit pro-recovery-Astrozyten und Mikroglia fördern kann (Abbildung 5).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Bregmas und Lokalisierung des Schlaganfalls. (A) Die Parietallappen treffen sich oben, um das Bregma zu bilden. Die Laserplatzierung wurde 2,0 mm links vom Bregma zentriert. (B) Die visuelle Konformation von Schlag und Gratloch wurde 5 Tage nach dem Schlaganfall beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Koronale Abschnitte, die den Infarkt überspannen. (A) Serielle IHC-Abschnitte von Gehirnen 5 Tage nach Schlaganfall, Schlaganfall nur mit Laser (oben) und 2x Linse (unten). Die Scheiben waren 30 μm dick, wobei jeder Abschnitt 300 μm vom vorherigen Abschnitt entfernt war. (B) Vergrößerter IHC-Fleck, 500 μm Skalenbalken. Kerne (DAPI) sind blau dargestellt, Astrozyten (GFAP+) rot und Mikroglia (Iba1+) grün, 4-fach vergrößert. (C) Abschnitte von Gehirnen, die mit TTC gefärbt wurden, um das Läsionsvolumen 5 Tage nach dem Schlaganfall zu visualisieren, 1 mm dicke Abschnitte mit 1 cm Scalebar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Injektion und Visualisierung von Biomaterial. (A) Visuelle Der Gelinjektion während der Operation. (B) Das Gel könnte beim Entfernen des Schädels mit dem Auge sichtbar gemacht werden. (C) Einmal eingefroren und montiert, war das Gel während des Schneidens im Gehirn sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Immunhistochemische Färbungen von Schlaganfall nur im Vergleich zu Schlaganfall mit Hydrogelen. (A) Schematische Darstellung von kryosektionierten Gehirnen mit einer Dicke von 30 μm. Mehrere Abschnitte in der Mitte wurden für die Bildanalyse ausgewählt. (B) Nur Schlaganfall, immunhistochemische (IHC) Färbungen 15 Tage nach Schlaganfall. Astrozytenzellen (GFAP+) sind rot dargestellt, Mikroglia (Iba1+) sind grün und Gefäße (GLUT1+) sind weiß. Schlaganfall + Hydrogel-Zustand, IHC 10d nach der Injektion, 15 Tage nach schlaganfall. Astrozytenzellen (GFAP+) sind rot dargestellt, Mikroglia (Iba1+) sind grün, Hydrogelmaterial ist weiß. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Wirkungen von mikroporösen geglühten Partikelhydrogelen auf reaktive Astrozyten und Mikroglia nach Schlaganfall. (A) Schematische Darstellung der experimentellen Zeitleiste, wobei der Pfeil den Strichtag, + den Injektionstag und x den Opfer- und Analysezeitpunkt anzeigt. (B) Schematische Darstellung des Analyseaufbaus, aus dem hervorgeht, wo Schnitte abgebildet und analysiert wurden. (C) IHC-Bilder, die die Astrozytenreaktivität durch pERK, S100b, GFAP zeigen. (D) Quantifizierung des pERK/GFAP-Prozentsatzes der Astrozyten, die hochreaktiv waren. (E) Quantifizierung von S100b / GFAP-Prozent der Astrozyten, die hochreaktiv waren. (F) IHC-Bilder der Mikroglia-Reaktivität durch CD11b-, Arg1- und iNOS-Färbung. (G) Quantifizierung von iNOS/Dapi zur Bestimmung des mikroglialen proinflammatorischen Phänotyps. (H) Quantifizierung von Arg1/Dapi zur Bestimmung des mikroglialen Pro-Reparatur-Phänotyps. Alle Maßstabsbalken = 100 μm. Die statistische Analyse wurde in GraphPad Prism durchgeführt. * Die angegebenen Daten wurden mit einem Tukey-Post-hoc-Test und einem 95%-Konfidenzintervall mit P<0,05 analysiert. Einzelne p-Werte zeigten den T-Test an. Diese Zahl wurde von Referenz26 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier zeigen wir ein leicht reproduzierbares, minimalinvasives, permanentes Schlaganfallmodell und beschreiben, wie fünf Tage nach dem Schlaganfall ein Biomaterial in den Infarkt injiziert werden kann. Die Verwendung des photothrombotischen Farbstoffs Rose Bengal und eines 520 nm kollimierten Lasers, der mit dem stereotaktischen Gerät verbunden ist, gibt uns die Möglichkeit, den Schlag mit erhöhter Präzision am motorischen Kortex der Maus zu positionieren. Fünf Tage nach dem Schlaganfall ist die Lage des Infarkts durch das Auge im Zentrum der Bestrahlung sichtbar, 2,0 mm mediolateral zum Bregma. Hydrogel wird dann mit Spritzenpumpen präzise in den Hubkern injiziert. Die Mortalität während der Operation und nach einem Schlaganfall ist in diesem Modell praktisch nicht vorhanden, wobei nur eine Handvoll Mäuse nach der Operation aufgrund anästhesiologischer Komplikationen stirbt. Trotz der Vorteile der Verwendung des PT-Schlaganfalls für Biomaterialanwendungen gibt es mehrere biologische Einschränkungen und technische Schwierigkeiten, die angegangen werden sollten.
In Bezug auf biologische Einschränkungen ist PT kein Schlaganfallmodell, das die Option für eine zerebrale Reperfusion bietet, ein Prozess, der spontan bei menschlichen Schlaganfällen oder als Reaktion auf endovaskuläre Gerinnselentnahme / -lyse auftreten kann. Darüber hinaus beeinträchtigt PT im Gegensatz zum MCAo-Modell, das die Ätiologie der meisten menschlichen Schlaganfälle nachahmt, indem es ein großes Hirngefäß verschließt, den Blutfluss durch viele kleinere Gefäße. Eine technische Schwierigkeit bei der Injektion von Hydrogel-Biomaterialien ist ihre Tendenz, während der Operation an der Spritze oder während der Extraktion am Schädel zu haften. Die Entwicklung eines Hydrogels, das während der Injektion als Flüssigkeit verbleibt und dann Gele in situ ist, kann das erste Problem lösen. Zu verhindern, dass das Gel an der Dura mater haftet, ist jedoch oft unvermeidlich, da sich die Injektionsstelle und der Schlaganfallkern an der Oberfläche des Gehirns befinden. Dies kann es schwierig machen, das Hirngewebe zu extrahieren und gleichzeitig das Biomaterial intakt zu halten. Daher ist beim Entfernen von Schädelstücken aus dem Gehirn besondere Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass sich die Dura mater nicht mit dem Schädel hebt und das Gel unbeabsichtigt entwurzelt. Die Kryosektion von Gehirnen erfordert auch technische Fähigkeiten, da sowohl der Handhabungsprozess als auch die Klingentransektion das Gel leicht von seinem umgebenden Gewebe lösen können, wodurch die Datenerfassung in Bezug auf die Zellinfiltration eingeschränkt wird. Die Ablösung wird verstärkt, wenn das Material nicht vollständig in das Gewebe integriert ist. Bei der Vorbereitung der Probe mit OCT entsteht eine Verstärkungsschale, die dazu beiträgt, die Materialtrennung während des Schneidens zu minimieren.
Vor der Injektion von Biomaterialien empfehlen wir, die gewünschte Hubgröße in Abhängigkeit von Nagetierstamm und Laboraufbau zu optimieren. Kleinere oder größere Infarkte können durch Einstellen von drei Hauptparametern vorgenommen werden: Laserausgangsintensität, Strahlvergrößerung und Bestrahlungszeit. Andere Faktoren, von denen auch gezeigt wurde, dass sie die Schlaggröße beeinflussen, sind die Konzentration von Isofluran19 und die Zeit, die der Farbstoff vor der Bestrahlung zirkulieren darf. In Bezug auf die Laserleistungsintensität (Leistung/Fläche oder mW/cm2) fanden wir heraus, dass eine Laserleistung von 10 mW ausreichte, um einen kleinen Infarkt mit einem horizontalen Durchmesser zu erzeugen, der etwas kleiner war als der des Laserstrahls. Eine höhere Laserleistung ergab geringfügig breitere, aber wesentlich tiefere Infarkte (Daten nicht gezeigt), da der Laserstrahl ein Gauß-Bestrahlungsprofil aufwies. Durch die Erhöhung der Intensität kann der Mittelpunkt der maximalen Bestrahlungsstärke tiefer über den Schädel hinaus eindringen und die leichte Zunahme der Spotgrößendurchdringung des Lasers verursachen. Andere Schlaganfallmodelle haben den Schädel verdünnt, indem sie ihn vor dem Auftragen von Licht oder Laser geschliffen haben, um die Lichtdurchdringung und die anschließende Reproduzierbarkeit der Gerinnung zu erhöhen und gleichzeitig eine geringere Laserintensität beizubehalten20; Dies kann jedoch zu Blutungen im Schädel führen und dauert während der Operation und der Geschicklichkeit ziemlich lange, ohne dabei das Gehirn versehentlich zu schädigen. Ähnlich wie bei der Intensität erhöhte die Erhöhung des Laserstrahldurchmessers auch die Infarktgröße; Laserintensität und Strahldurchmesser skalieren jedoch nicht linear zueinander, sondern folgen der Gleichung Leistungsdichte = Laserleistung (w)/ πr2, wobei are der Radius des Strahls ist. In Bezug auf die Bestrahlungszeit stellten wir fest, dass mindestens 10 minuten erforderlich waren, um reproduzierbare Schläge zu erhalten. Um den horizontalen Durchmesser des Infarkts zu erhöhen und gleichzeitig die vertikale Tiefe konstant zu halten, haben wir den Laser für jeweils 10 Minuten nacheinander an benachbarten Stellen angebracht. Um den Einfluss der Isoflurankonzentration und der Zirkulationszeit von Rosenbengalen zu untersuchen, fanden wir heraus, dass 1,5% Isoflurankonzentration und 7 min Zirkulation nach IP-Injektion zu einer konsistenten Bildung von Schlaganfällen führten. Diese fünf Parameter wurden für unsere spezielle Anwendung optimiert. Wir benötigten einen Schlaganfall, der groß genug war, um Verhaltensänderungen zu verursachen, aber nicht in die subventrikuläre Zone einzugreifen, wo wir die Wirkung unseres Materials auf neuronale Vorläuferzellen untersuchen wollten. Neben der Hubgröße mussten wir auch das optimale Gelvolumen für die Injektion bestimmen. Zumindest brauchten wir genug Gel, um die Schlaganfallhöhle vollständig zu füllen, weil wir herausfanden, dass Lücken zwischen Gel und umgebendem Gewebe zu ähnlichen Ergebnissen führten wie unsere Kontrollgruppen, während der Kontakt zwischen Gel und Gewebe zu weniger reaktiven Astrozyten und erhöhter zellulärer Infiltration führte. Wir kamen zu einer unteren Grenze von 4-6 μL Gel, die nach der Injektion keine nachteiligen Auswirkungen hatte (unveröffentlichte Daten).
In Bezug auf die Beurteilung des Schlaganfallergebnisses gibt es mehrere Optionen, die über die IHC-Färbung hinausgehen, wie Magnetresonanztomographie, Verhaltenstests, histologische Analyse und TTC-Färbung (2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid). Es wird dringend empfohlen, TTC für die vorläufige Optimierung des Schlaganfalls aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit und sofortigen Ergebnisse zu verwenden. Frühere Verhaltenstests in unserem Labor haben sich mit dem Zylindertest / der spontanen Vordergliedmaßenaufgabe, dem Grid-Walking-Test und demPasta-Test 12,21befasst. Es sollte beachtet werden, dass Rotarod-Tests nach der Implementierung der PT-Schlaganfallmethode keine signifikante Abnahme der Verhaltensergebnisse zeigten (Daten nicht gezeigt). Daher sollten Verhaltenstests sehr komplexe Aufgaben bewerten, die einen signifikanten kortikalen Input erfordern.
Hier demonstrierten wir die Technik der Injektion von Hydrogelen nach einem Schlaganfall ohne die Abgabe von Wachstumsfaktoren oder Zellen. Hydrogele wurden jedoch auch für die Zelltransplantation sowie für die Verabreichung von Medikamenten und Wachstumsfaktoren eingesetzt und können sich als wertvolle Ressource sowohl für das Studium der Biologie nach einem Schlaganfall als auch für die Erforschung neuer Therapiemethoden erweisen. Im Zusammenhang mit einem Schlaganfall hat unser Labor nicht-poröse Hyaluronsäure-Hydrogele injiziert, die induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete neuronale Vorläuferzellen14,18 in Konzentrationen von 25.000 Zellen / μL bis 50.000 Zellen / μL Gel verkapseln. Die Verwendung eines Hydrogels führte zu einer Erhöhung der Zelllebensfähigkeit und -differenzierung. Andere Labore haben auch über Zelldifferenzierung und erhöhte Geweberegeneration als Reaktion auf Hydrogele berichtet, die zur Transplantation von Stammzellen nach Schlaganfall verwendet werden 22-24. Zusätzlich haben wir Hydrogele mit Wachstumsfaktoren nach Schlaganfall injiziert, die nach Schlaganfall zu Geweberegeneration und Verhaltensverbesserung führen13,14. In Bezug auf das Materialdesign ist die Injektionsfähigkeit ein wertvolles Merkmal, das dazu dient, die Invasivität zu minimieren. Daher sollten Hydrogele entweder als Sol-Gele (Flüssig-zu-Feststoff), Scherverdünnung (G' > G" unter statischen Bedingungen formuliert werden; G" > G' während des Flusses) oder körnige Gele, die aus Bausteinen bestehen, deren Durchmesser kleiner ist als der Innendurchmesser einer Nadel12,25,26. Die Optimierung sollte dann durchgeführt werden, um die Diffusion von Medikamenten oder Wachstumsfaktoren, die Zelllebensfähigkeit unter einer Reihe von Zellkonzentrationen, Gelbedingungen und Injektionsparametern wie Geschwindigkeit, Nadelmanometer, Injektionstiefe und Injektionstag im Verhältnis zum Zeitpunkt der Schlaganfallinduktion zu testen. Zum Beispiel reichte der Tag der Materialinjektion von einem Tag nach dem Schlaganfall bis zu drei Wochen nach dem Schlaganfall27,28. Hier berichten wir von fünf Tagen, haben aber zuvor sieben Tage nach einem Schlaganfall bei der Transplantation von Zellen injiziert. Diese Tage wurden auf der Grundlage der Zeitleiste der Entzündungsreaktion sowie der Spitzenaktivität der Angiogenese und Neurogenese ausgewählt, die eine Woche nach dem Schlaganfall beobachtet wurde5,29,30,31. Die Volumencharakterisierung sollte auch zu jedem Injektionszeitpunkt durchgeführt werden, da das Schlagvolumen aufgrund von Atrophie im Laufe der Zeit abnimmt. Da diese Parameter vor der Injektion optimiert werden, reichen die methoden hier aus, um die Anwender bei der Injektion von Biomaterialien unter Zusatz von Zellen und/oder Wachstumsfaktoren und Medikamenten zu unterstützen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass TS ein Gründer von Tempo Therapeutics ist, das MAP-Hydrogele kommerzialisieren will.
Acknowledgments
Wir danken den National Institutes of Health und dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke für die Finanzierung (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
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