Summary
שבץ מוחי הוא בעיה גלובלית עם אפשרויות טיפול מינימליות וללא טיפול קליני נוכחי לחידוש רקמת המוח האבודה. כאן אנו מתארים שיטות ליצירת שבץ פוטותרומבוטי מדויק בקליפת המוח המוטורית של מכרסמים והזרקה מאוחרת יותר של ביו-חומרים הידרוג'ל כדי לחקור את השפעתם על התחדשות רקמות לאחר שבץ.
Abstract
שבץ מוחי הוא הגורם המוביל לנכות וסיבת המוות החמישית המובילה בארצות הברית. כ -87% מכל השבץ הם שבץ איסכמי ומוגדרים כחסימה פתאומית של כלי המספק דם למוח. בתוך דקות מהחסימה, תאים מתחילים למות וכתוצאה מכך נזק בלתי הפיך לרקמות. הטיפולים הטיפוליים הנוכחיים מתמקדים בהסרת קרישי דם או תמה כדי לאפשר את הרפוי ולמנוע נזק מוחי חמור יותר. למרות פלסטיות מוחית חולפת עשויה להציל חלק מהרקמה הפגועה לאורך זמן, חלקים משמעותיים מהחולים נותרים עם ליקויים נוירולוגיים שלעולם לא ייפתרו. קיים מחסור באפשרויות טיפוליות לטיפול וגירעונות נוירולוגיים הנגרמים על ידי שבץ מוחי, תוך הדגשת הצורך לפתח אסטרטגיות חדשות לטיפול באוכלוסיית המטופלים הגדלה. ביו-חומרים להזרקה מתוכננים כעת כדי לשפר את פלסטיות המוח ולשפר את התיקון אנדוגני באמצעות משלוח של סוכנים פעילים או תאי גזע. שיטה אחת לבדיקת גישות אלה היא להשתמש במודל שבץ מכרסמים, להזריק את הביו-חומרים לליבת השבץ ולהעריך תיקון. לדעת את המיקום המדויק של ליבת השבץ הוא הכרחי לטיפול מדויק לאחר שבץ, ולכן, מודל שבץ התוצאה מיקום שבץ צפוי עדיף כדי למנוע את הצורך בהדמיה לפני הזרקה. הפרוטוקול הבא יכסה כיצד לגרום לשבץ פוטותרומבוטי, כיצד להזריק הידרוג'ל בצורה מבוקרת ומדויקת, וכיצד לחלץ ולהקרין את המוח תוך שמירה על שלמות הביו-חומרים. בנוסף, נוה להדגיש כיצד אותם חומרים הידרוג'ל יכולים לשמש לאספקה משותפת של תאי גזע. פרוטוקול זה יכול להיות כללי לשימוש של ביו-חומרים אחרים להזרקה לתוך ליבת השבץ.
Introduction
שבץ מוחי הוא הגורם המוביל לנכות וסיבת המוות החמישית המובילה בארצות הברית. כ -87% מכלל השבץ הם איסכמיים, בעוד שרוב 13% הנותרים הם דימומים2. שבץ איסכמי מוגדר כחסימת זרימת הדם בעורק לרקמה שמסביב. חסם זה גורם למחסור בחמצן ונמק לאחר מכן שמוביל לעתים קרובות לנכות קבועה בחולים ששרדו. אמנם חלה ירידה בשיעור התמותה משבץ3, שכיחותו צפויה לגדול ל -3.4 מיליון אנשים עד 20304. עלייה זו בניצולים נכים ונטל כלכלי כתוצאה מכך הובילו לדחיפה למחקר שבץ המתמקד במנגנונים של תיקון עצבי. לאחר שבץ יש תקופה דלקתית שמובילה להיווצרות צלקת המונעת את הרחבת האזור הנמקי. האזור המקיף את הליבה הנמקית מכונה "peri-infarct" ויש ראיות חזקות לכך שהפלסטיות באזור זה, הכוללת אנגיוגנזה מוגברת, נוירוגנזה ונבט אקסוני, קשורה ישירות להתאוששות הנצפית במודלים של בעלי חיים ובני אדם5. מכיוון שאין מודלים במבחנה שיכולים לשכפל כראוי את האינטראקציות המורכבות לאחר שבץ, מודלים של בעלי חיים חיוניים לחקר שבץ.
ישנם מספר דגמי vivo שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שבץ איסכמי. אחד המודלים הנפוצים ביותר המשמשים בעכברים הוא חסימה בעורק המוחי האמצעי, או MCAo, באמצעות דיסטלי או פרוקסימלי (באמצעות חוט תוך עורקי) אוחסם. המודל הפרוקסימלי, הידוע גם בשם MCAo חוט (fMCAo), בדרך כלל גורם שבץ איסכמי גדול המקיפים בכל מקום בין 5% ל 50% של חצי הכדור המוחי, תלוי במספר גורמים6. בדגמים אלה, תפר או חוט מתקדם מעורק הראשי הפנימי לבסיס העורק המוחי האמצעי (MCA) ונשמר במקום לפרק זמן מסוים. שיטה זו לחסימה, אשר ניתן נעשה זמני או קבוע, מייצר אוטם כי הוא מרוכז בסטריאטום עשוי או לא יכול להיות כרוך יתר על המידה קליפת המוח6. גודל הקו המתקבל משתנה מאוד, וטכניקות הדמיה, כגון דופלר לייזר, נדרשות כדי לאשר את האפקטיביות של ההליך בכל עכבר. חסימת חוט תוך-עורקי או תוך-זוהר הנמשכת יותר מ-30 דקות מייצרת משיכות בקצה הגדול יותר של טווח הגודל. כמה חוקרים התמקדו בזמני החסימה קצרים יותר של חוטים, הדורשים מיקוד ניסיוני משמעותי ואימותמעבדה 7. מודלים של Filament MCAo בעכברים עוקבים אחר שלבים דומים של מוות תאי, התקדמות איסכמית, ויצירת אזור אוטם פרי כפי שניתן לראות במקרים של שבץ אנושי; עם זאת, השבץ הגדול יותר דומה יותר למצב המחלה של אוטם מוחי ממאיר, שהם פחות נפוצים, פחות ניתן לטיפול שבץ אנושי6. בינתיים, חסם MCA דיסטלי דורש ניתוח מעורב יותר וכת craniectomy. במודל זה, החלק הדיסטלי של MCA העובר לאורך פני השטח של המוח הוא חסם ישירות עם עניבת תפר או צרוב. בווריאציות מסוימות של הטכניקה, עורקי העורק הראשי חסומים באופן חד-צדדי או חולף-דו-צדדי. היתרון של MCAo דיסטלי הוא שהוא מייצר שבץ מבוסס קליפת המוח כי הוא פחות משתנה בגודל מאשר מודל חוט. עם זאת, המודל הדיסטלי מייצר תפוקה התנהגותית ירודה יותר עקב טרנספר של העורק הראשי החיצוני (ECA), שהוא גם דאגה עם fMCAo6.
מודל שבץ חלופי הידוע כפחות פולשני הוא מודל הפוטו-טרומבוטי (PT). מודל PT תוצאות מיקום מוגדר היטב של איסכמיה והוא קשור לשיעור הישרדות גבוה8. הטכניקה מסתמכת על צבע רגיש לאור מוזרק תוך-איפריטונית המאפשר חמצון פוטו-וסקולרי פשוט על ידי הקרנת הרקמה הרצויה עם אור או לייזר9. עם עירור, נוצרים רדיקלים חמצן הגורמים נזק אנדותל, אשר מפעיל צבירה טסיות דם היווצרות קריש באזור מוקרן8,9. השליטה ההדוקה על גודל ומיקום שבץ, כמו גם רבייה גבוהה של מודל PT, עושה את זה אידיאלי עבור לימוד ביו חומרים. בעוד דיוק מתאפשר באמצעות לייזר וקואורדינטות סטריאוטקסיות, ישנם כמה חסרונות שעשויים להפוך את המודל הזה פחות אידיאלי עבור מחקרים מעטים. שלא כמו דגם fMCAo, לא ניתן לשחזר את מודל קו ה-PT. לכן, חומרים לחקירת סוכנים neuroprotective ספציפיים לנזקים לאחר reperfusion או המנגנונים הבאים reperfusion לא יהיה שימושי כאן8. בנוסף, בשל העלבון המיקרווסקולרי של מודל PT, פנומברה איסכמית קטנה יחסית נראית. במקום זאת, בצקת vasogenic המקומי מתרחשת, וזה לא אופייני לשבץ אנושי, מה שהופך את המודל הזה לא רצוי עבור מחקרי סמים פרה קליניים התמקד באזור peri-אוטם6,8.
המטרה הכוללת של אסטרטגיות ביו-חומרים בשבץ היא לספק סוכנים ביו-אקטיביים או לשמש כמטריצה חוץ-תאית תחליף לצמיחת רקמת המוח. אסטרטגיה אחת שנחקור באמצעות השיטות שלנו היא לספק הידרוג'ל ישירות לתוך ליבת השבץ, בניגוד לרקמת peri-אוטם שבו טיפולים רבים בתא הנוכחי מועברים10. הרציונל לגישה זו הוא כי משלוח לתוך הרקמה הנמקית שנמצאה בליבה תימנע משיבוש הרקמה הבריאה או המתאוששת שמסביב. אנו מניחים דיפוזיה של כל סוכנים פעילים הכלולים בתוך biomaterial יוכל להגיע peri-אוטם מן הליבה, במיוחד מאז אנו מוצאים כי משלוח של biomaterials הידרוג'ל מפחית את עובי צלקת גליה11. זה חשוב מאז אזור אוטם פרי הוכח להפגין neuroplasticity לאחר שבץ, מה שהופך אותו למטרה אטרקטיבית. יתר על כן, משלוח של מטריצה פונדקאית לליבת השבץ יכול להיות טעון עם אנגיוגניים12 או neurogenic13 גורמים כדי להנחות את היווצרות של רקמה חדשה, כמו גם תאים עבור המסירה14. משלוח תאים משופר מאוד באמצעות מטריצה מכיוון שהוא מגן על תאים מפני כוחות ההזרקה הקשים והסביבה המקומית הקיימת במהלך המסירה, כמו גם מעודד בידול וחריטה15.
אלה biomaterials טיפולי להזרקה יש רלוונטיות קלינית ביישומי שבץ, כמו אין כרגע טיפולים רפואיים הממריצים התאוששות עצבית לאחר שבץ. המעגלים העצביים הבסיסיים המעורבים בהתאוששות נמצאים ברקמת המוח הסמוכה לליבת השבץ16, בעוד שליבת השבץ עצמה נטולת רקמה עצבית בת קיימא. אנו צופים כי אספקת biomaterial לתוך ליבת שבץ נמק יש פוטנציאל לעורר את הרקמה הסמוכה לקראת תהליכים רגנרטיביים באמצעות מספר מנגנונים שהוזכרו קודם לכן, כולל שחרור מחסן של גורמי גדילה13, גירוי של רקמה בצמיחה וקידום של התפתחות רקמת המוחמתאוששת 11,12, שינוי של תגובות חיסוניות17, ואספקה של טיפולים שמקורם בתאי גזע14, 18. עם זאת, כדי ללמוד ביעילות את האפשרות של יישומים אלה, שיטה עקבית לשחזור עבור גרימת שבץ והזרקת ביו חומרים. מודל קו PT משתמש בטכניקות המציעות שליטה מדויקת על הכיוון והמיקום של הקו. לייזר המחובר למכשיר הסטריאוטקסי מנחה כיוונים, ומשאבות המחוברות למכשירים הסטריאוטקסיים שולטות בקצב ההזרקה של החומר ללא צורך בצורות נוספות של הדמיה. לכן, בחרנו לתאר את השיטות לביצוע שבץ PT בקליפת המוח המוטורית של עכברים ולהזרקת ביו-חומרים לליבת השבץ. כאן, אנו משתמשים הידרוג'ל חלקיקים מיקרו-נקבוביים (MAP) כמו biomaterial להזרקה ללא תאים הוסיף או גורמי גדילה. בנוסף, אנו מסבירים כיצד לאחזר בהצלחה את המוח עם ביו-חומרים שלמים, ואנו דנים בתוצאות אימונוכימיה המשמשות לניתוח תוצאת השבץ עם ובלי הזרקה של ביו-חומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים נערכו בהתאם ל-IUCAC באוניברסיטת דיוק ובאוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס. 8 עד 12 שבועות זכר C57Bl / 6J עכברים שימשו במחקר זה. בעלי החיים שוכנו בטמפרטורה מבוקרת (22 ± 2 °C (2 °F), עם תקופת מחזור של 12 שעות בהירות-כהות וגישה למזון גלולה ומים עד ליביטום. משכך משכך ונהלי ירידה מתוארים כמאושרים על ידי IUCAC אך עשויים להיות שונים מפרוטוקולים המשמשים במעבדות אחרות.
בעלי חיים עלולים להיות מורדמים בטרם עת אם הם חווים חוסר מנוחה מוגזם, קול (המציין כאב בלתי נשלט), טראומה עצמית, ירידה או לקויה בניידות, סימנים פיזיים של זיהום עורי, אובדן תיאבון ו/או ירידה במשקל העולה על 10%-15% כתוצאה מניתוח ההישרדות. אין תופעות לוואי צפויות מהזרקת הג'ל, שכן הוא מורכב מפולימר טבעי בתוך המוח. יש לעקוב אחר בעלי חיים מדי יום, כולל סופי שבוע וחגים, ולנצנץ מחדש כל יומיים. מחקרים מהמעבדה שלנו ואחרים לא מצאו ליקויים בטיפוח, אובדן משקל גוף או סימנים/תסמינים של גמילה או מתח כרוני בעכברים לאחר שבץ קליפתי או תת-קורטיקלי קטן אלה. אם בעלי חיים מראים סימנים של זיהום מקומי בפצע ראש, יש להרדים. כמו כן, יש לעקוב אחר בעלי חיים אחר טיפוח לקוי, מצב פצעים וראיות ללחימה בין בעלי חיים (פצעי גב). אם יש ראיות של לחימה או dehiscence הפצע, בעלי חיים יש לטפל תחילה לאחר יצירת קשר עם הווטרינרים. זה כרוך לעתים קרובות אנטיביוטיקה במים ו /או יישום אנטיביוטיקה מקומית. אם אמצעים אלה אינם מצליחים לייצר ריפוי, יש להמתת חסד בבעלי חיים.
1. הכנת חומרים ומכשירים
- הכן צבע פוטוטרומבוטי לפני הניתוח. שוקלים 15 מ"ג של רוז בנגל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל.
אזהרה: רוז בנגל עלולה לגרום לנזק/גירוי חמור בעיניים.- להמיס את רוז בנגל ב 1.5 מ"ל של PBS מסונן סטרילי 1x כדי להפוך את ריכוז העבודה של 10 מ"ג / מ"ל.
- מערבולת את הצינור עד שאין גושים גלויים, המציין את הצבע נמס לחלוטין, ולאחר מכן לכסות בנייר כסף עד לשימוש נוסף.
הערה: כמות הצבע הנדרשת תלויה במספר העכברים. צבע מוזרק IP תוך-איפריטוני בריכוז של 10 μL/g, למשל, 200 μL עבור עכבר 20 גרם.
- הפעל את כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף העכבר במהלך הרדמה (37 °C (37 °C).
- הכן מספריים אוטומטיים, מלקחיים, כותנה, משחת עיניים וטרינר, דבק כירורגי, או חומר תבר, סמן כירורגי כחול או שחור, אלכוהול סטרילי ומגבוני יוד בטא. הכן מקדחת עצם עם ראשי מקדחה מעוקרים.
- הפעל את עיקור החרוזים ל 160 °C (50 °F) כדי לאפשר עיקור של מכשירים בין ניתוח עכברים. הניחו בצד צינור חרוטי 50 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית או 1x PBS לשימוש מאוחר יותר בשמירה על אזור פעולה hydrated.
- חבר את הלייזר למכשיר הסטריאוטקסי. מרכיב משקפי בטיחות בלייזר, מדוד את עוצמת הלייזר (mW).
אזהרה: יש להשתמש במשקפי בטיחות בלייזר בכל פעם שהלייזר מופעל בהליך.- התאם את הזרם בקונסולת הלייזר, בהתאם להוראות ייצור הלייזר, עד שפלט כוח הלייזר יקרא 10 mW, והגדר את הזרם כערך מקדים בקונסולת מסך הבית. לאחר מכן התאם את הזרם שוב כדי להקים ערכה מוקדמת נוספת שבה כוח יציאת הלייזר קורא 40 mW. עכשיו לכבות את הלייזר עד לשימוש נוסף.
הערה: 10 mW ישמש לכוון את הלייזר לפני השימוש.
- התאם את הזרם בקונסולת הלייזר, בהתאם להוראות ייצור הלייזר, עד שפלט כוח הלייזר יקרא 10 mW, והגדר את הזרם כערך מקדים בקונסולת מסך הבית. לאחר מכן התאם את הזרם שוב כדי להקים ערכה מוקדמת נוספת שבה כוח יציאת הלייזר קורא 40 mW. עכשיו לכבות את הלייזר עד לשימוש נוסף.
- הכן כלוב נקי לעכברים לאחר הניתוח. לאחר מכן, מניחים את העכבר בתא האינדוקציה עם ריכוז איזופלוראן של 4% כדי להנשים אותו עד שהתנועה הספונטנית מפסיקה ונימתה מגיעה לקצב איטי ויציב.
- לאחר השינה, לשקול את העכבר כדי לקבוע כמה צבע רוז בנגלי להזריק. לאחר מכן, העבר ואבטח את העכבר למכשיר סטריאוטקסי עם ריכוז איזופלוראן תחזוקה של 1.5%.
הערה: הגדלת ריכוזי איזופלוראן יכולה להרחיב את כלי הדם ולמנוע איסור מספיק או שבץ בגודל עקבי בין עכברים. - יש למרוח משחת עיניים של וטרינר על שתי העיניים.
הערה: צפה בנשימה וטמפרטורה לאורך כל ההליך וצבוט בהונות מדי פעם כדי להבטיח שהעכבר לא ירגיש דבר.
2. שבץ פוטוטרומבוטי דגם9
- גילחו את הפרווה מראשו של העכבר והכנו את האזור באופן אספטי באמצעות מגבון אלכוהול ואחריו מגבון יוד בטא. חזור שלוש פעמים.
הערה: במידת הצורך, השתמש לנגב אלכוהול נוסף בסוף כדי לנקות את כל יוד בטא כפי שהוא גורם לגירוי בעור אשר מוביל את העכברים לגרד את הגולגולת שלהם לאחר הניתוח. - באמצעות מספריים פעולה קטנה, לעשות נתק לרוחב בין האוזניים לעיניים, על 1-2 ס"מ. לעשות זאת על ידי משיכת העור כלפי מעלה עם מלקחיים כדי ליצור אוהל, חיתוך פעם אחת כלפי מטה, ולאחר מכן החדרת המספריים לתוך הפתח ויצירת חתך רציף בקו האמצע.
- להפריד את העור ולחץ קלות על העצמות הקודקודיות עם המלקחיים כדי לאתר את bregma. סמן את ברגמה עם נקודה באמצעות הסמן הכירורגי.
הערה: תנועת שבר העצם מדגישה את הגבול הקדמי של העצמות הקודקודיות. ברגמה היא נקודת המרכז שבה נפגשים שברי העצמות הקדמיים והקודקודיים(איור 1A). - מרכיב משקפי בטיחות בלייזר, הזז את הלייזר מעל גולגולת העכבר, תקן את המכשיר הסטריאוטקסי בזווית של 90°. בחר את 10 mW להגדיר מראש ולהדליק את הלייזר.
- כוונן את ציר ה-x וה-y של הלייזר עד שהוא יהיה ישירות מעל ברגמה. אפס את ה- x וה- y בקונסולת התצוגה הדיגיטלית ולאחר מכן הזז את הלייזר 1.8 מ"מ משמאל לברזמה. עכשיו תביא את הלייזר קרוב ככל האפשר לגולגולת מבלי לתת לו לגעת בגולגולת.
- הזז את הלייזר ל 2.2 מ"מ שמאלה של bregma כדי להבטיח כי הוא יכול לנוע ללא כל מכשולים. כבה את הלייזר.
- הזריקו את הכמות המתאימה של צבע רוז בנגלי תוך-פריתוני (IP) באמצעות מחט חד פעמית של 29 G. מיד להתחיל שעון זמן במשך 7 דקות כדי לאפשר צבע להסתובב באופן שיטתי. בחר את ערכת המקדים עבור 40 mW מבלי להפעיל את הלייזר.
הערה: לאחר נוח עם ההליך, הצבע יכול להיות מוזרק לפני הכנה aseptic של העכבר וסיים לפני 7 דקות נגמרו כדי לחסוך זמן. - הפעל את הלייזר (40 mW) כאשר שעון התזמן של 7 דקות מתפוצץ, תוך כדי מרכיב משקפי בטיחות לייזר, והגדר שעון זמן של 10 דקות.
- לאחר 10 דקות, להזיז את הלייזר ל 2.2 מ"מ שמאלה של bregma מבלי לכבות אותו, ולהגדיר עוד 10 דקות שעון זמן.
- לאחר שעון התזמן השני של 10 דקות הלך, לשנות את הלייזר בחזרה ל 10 mW ולהזיז את הלייזר ל 2.0 מ"מ שמאלה של ברגמה. סמן את הנקודה הזאת עם הסמן הכירורגי. אז תכבה את הלייזר.
- הרם את הלייזר ופתח אותו מזווית 90° כך שניתן יהיה להזיז אותו מהעכבר. בשלב זה, להחיל את תמיסת מלח סטרילית או PBS עם כותנה אם האזור הכירורגי יבש.
- קודחים בפרצים קטנים בסימן 2.0 מ"מ בניצב לפני השטח של הגולגולת.
הערה: היזהר לקדוח לאט כדי למנוע קידוח עמוק מדי ופגע במוח. תהיה ירידה קלה / שינוי בהתנגדות לאחר המקדחה עברה דרך הגולגולת, וקידוח עלול לגרום לדימום.- השתמש כותנה לספוג כל עודף דם. זה אופייני לראות קצת דם מעורקים שנפצעו בגולגולת לאחר הקידוח – דם מוגזם פירושו המקדחה פגעה במוח. במקרה כזה, הקלט את מזהה העכבר והמשיך הלאה.
- הנח ניגוב קטן ליד העכבר. באמצעות המלקחיים, למשוך את העור קרוב זה לזה כדי להתכונן להדבקה.
הערה: ניתן לעשות כאן תפירה במקום זאת. תפירה בדרך כלל דורשת רק 3 תפרים.- באמצעות המלקחיים, לתפוס את שני הצדדים של העור ולמשוך אותם יחד ומעלה. יש למרוח טיפות גדולות של דבק כירורגי בסוף הקצה על המגבון לפני השימוש בעכבר.
- החל את הדבק הכירורגי במשורה להחזיק את העור יחד עם מלקחיים במשך 10s. המשך עד שלא יהיו פתחים גלויים.
הערה: הדבק יוצא במהירות – אין לסחוט את הבקבוק. הימנע הדבקת העור לגולגולת או מקבל דבק בעין.
- לאחר הדבקה, או תפירה, למקם את העכבר בכלוב החדש כדי להתאושש מן ההרדמה. זה לוקח 5-10 דקות עבור החיה להתאושש, וזה עוזר לנוח חצי מהכלוב על כרית חימום.
3. פעולת שבץ מזויף
- בצע את כל ההליכים באופן זהה לפעולה המתוארת לעיל בסעיף 2 למעט להזריק 1x PBS או מלוחים במקום צבע רוז בנגלי.
4. הזרקת הידרוג'ל או ביו-חומרים אחרים
- בצע את ההזרקה של ביו-חומרים בזמן המוגדר על ידי המשתמש. בניסוי זה זריקות בוצעו בין 5 ל 7 ימים לאחר שבץ. 2 - 6 μL של הידרוג'ל מוזרקים (מוגדר על ידי המשתמש).
- הפעל את כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף העכבר במהלך הרדמה (37 °C (37 °C).
- הכן מספריים אוטומטיים, מלקחיים, כותנה, משחת עיניים וטרינר, חומר דבק כירורגי או תיל, אלכוהול סטרילי ומגבוני יוד בטא. הכן את מקדחת העצם עם ראשי מקדחה סטריליים ומזרקי המילטון מזכוכית 25 μL עם מחטי מתכת 30 גרם.
- הפעל את עיקור החרוזים ל 160 °C (70 °F) כדי לאפשר עיקור של מכשירים בין עכברים.
- חבר את משאבות ההזרקה למכשיר הסטריאוטקסי. הגדר את קצב הזרימה ל- 1 μL/min והגדר את עוצמת הקול ל- 4 μL.
- הכן כלוב נקי לעכברים לאחר הניתוח.
- מניחים את העכבר בתא האינדוקציה עם ריכוז איזופלוראן של 4% כדי להנשים אותו עד שהתנועה הספונטנית מפסיקה ונימתה מגיעה לקצב איטי ויציב.
- לאחר השינה, העבר ואבטח את העכבר למכשיר הסטריאוטקסי עם ריכוז איזופלוראן תחזוקה של 1.5%.
- יש למרוח את משחת העין של הווטרינר על שתי העיניים.
- לגלח כל פרווה כי ייתכן שגודל מחדש של ראשו של העכבר, ובכגון אספטי על ידי שימוש מנגב אלכוהול ואחריו מגבון יוד בטא. חזור שלוש פעמים.
הערה: במידת הצורך, השתמש לנגב אלכוהול נוסף בסוף כדי לנקות את כל יוד בטא כפי שהוא גורם לגירוי בעור ומוביל את העכברים לגרד את הגולגולת שלהם לאחר הניתוח.
- באמצעות המספריים הקטנים ו/או המלקחיים, פתחו מחדש את העור מעל המוח. השתמש כותנה עם תמיסת מלח סטרילית או PBS כדי לנקות את כל פסולת מהגולגולת. עיגול לבן-צהוב (הקו, איור 1B)וחור הבר מהמקדחה יהיו גלויים. אם הרקמה המתה אינה נראית לעין, סביר להניח שלא התרחש שבץ. אם חור הבר אינו מרוכז מעל הקו, יש לקדוח מחדש כדי למרכז אותו.
- כוון את משאבת ההזרקה מעל העכבר ונעל ב-90°. נקו את המזרק בעזרת תמיסת מלח סטרילית או PBS לפני טעינת חומר.
- לאחר ניקוי, לפרק את מזרק הזכוכית, כך שאין מחט. גב לטעון את המזרק באמצעות 25 μL פיפטה תזוזה חיובית עם 10 μL של הידרוג'ל (או ביו-חומרים אחרים כאן עם או בלי תאים).
- באמצעות בוכנה מזרק, לדחוף את הג'ל כל הדרך לחזית המזרק. לאחר מכן, להרכיב מחדש את המזרק ולהמשיך לדחוף עד הג'ל מפריש באופן ניכר מן המחט.
- מניחים את המזרק על המשאבה. ייתכן שיהיה צורך להתאים את החלק האחורי של המשאבה כך שהמזרק יתאים. בצע זאת על-ידי התאמת קצב הזרימה ל- 30 μL/min, בחר משיכה או הזרק בהתאם לכיוון הדרוש לה כדי להזיז ולאחר מכן הקש Start. הכה עצור כאשר החלק האחורי של המשאבה נמצא במיקום הנכון.
- בורג בגב המשאבה כך שהמזרק יהיה מאובטח. אם בוצעו התאמות בעבר, ודא שקצב הזרימה מוגדר בחזרה ל- 1 μL/min ומוגדר להזרקה.
- הזז את המשאבה בכיוון x ו- y כדי לכוון אותה מעל החור. הזז את המשאבה כלפי מטה בכיוון z עד המחט של המזרק נוגע בחלק העליון של החור.
- אפס את ה- z במסוף התצוגה הדיגיטלית. לאחר מכן, הזז את המזרק למטה בכיוון z 0.750 מ"מ. אם המזרק מתכופף או שיש התנגדות, הגולגולת החלימה או לא נקדחה לחלוטין וצריך לקדוח אותה מחדש.
- לחץ על התחל על קונסולת המשאבה כדי להזריק 4 - 6 μL של הידרוג'ל בקצב של 1 μL / min.
- הגדר שעון עצר של 5 דקות כאשר המשאבה מפסיקה להזריק כדי לאפשר לג'ל להתחיל לקשר.
- לאחר 5 דקות, לאט למשוך את המזרק על ידי הפיכת z nob. צפה כדי לראות אם חומר כלשהו נשלף בטעות או דולף מהחור. פתח את המשאבה והרחק אותה מהעכבר כאשר המחט רחוקה מספיק מהגולגולת.
- באמצעות מלקחיים, דבק כירורגי או תפרים, לסגור את העור מעל הראש. הנח את העכבר בכלוב הנקי והתבונן בהתאוששותו. זה צריך לקחת בערך 5 - 10 דקות עבור העכבר להתאושש מהרדמה.
5. זלוף ואיסוף דוגמאות
- להרסים את העכבר באמצעות איזופלוריין.
- תקן את החיה בתנוחת עלון ופתח את חלל הבטן עם חתך חציוני. לחלופין, להדק את אבי העורקים הבטן היורדת להשתמש פחות קבוע PBS.
- חותכים את הסרעפת ולהזיז את הצדדים של כלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל החזה. מכניסים צינורית זלוף לחדר השמאלי וחותכים פתח באטריום הימני. התחל לטבול לאט עם 10-20 מ"ל של PBS או עד הנוזל פועל חצי ברור.
- לאחר ברור, לעבור 4% PFA עבור 10 - 20 מ"ל נוספים. ביטול ההצמדה של הזרועות מאפשר להם להתכווץ כאשר ה-PFA מחדיר. ברגע שהם יפסיקו לזוז, חכה לעוד 30.
- לערוף את ראש החיה ולמשוך בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת. באמצעות מלקחיים קהים ודקים, הסר בזהירות את חלקי הגולגולת כדי לחשוף את המוח. יש לנקוט טיפול מיוחד בעת הסרת הגולגולת מעל אתר השבץ. מספריים כירורגיים קטנים יכולים לשמש כאן כדי לעזור לחתוך את הגולגולת. האתגר הגדול ביותר הוא ג'ל להיתקע בגולגולת ולצאת מהמוח כשהגולגולת מוסרת.
- לאחר שהמוח מנותק, יש למקם ב-10 – 15 מ"ל של 4% PFA בן לילה (לא יותר מ-24 שעות).
- העבר את המוח מ- PFA ל 30% סוכרוז למחרת. המוח מוכן לקריוזקציה ברגע שהוא שוקע לתחתית (בערך 2 - 3 ימים). ניתן גם להשאיר אותו לאחסון בשלב זה.
6. קריוזקציה והכתמת
- תוציא את המוח מסורוז ותניח על מגלשת זכוכית. חותכים חלק קטן מהחלק האחורי של המוח עם סכין גילוח כדי ליצור חלק שטוח שיותקן על צ'אק.
- מניחים גוש של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) על הצ'אק, ולאחר מכן מניחים את המוח, צד שטוח כלפי מטה, על הצ'אק ב- OCT. מניחים את הדגימה הזו על קרח יבש עד להקפאה או בהקפאה על הבלוק המקפיא.
הערה: ניתן להוסיף OCT כדי להקיף את המוח באופן מלא כדי לסייע במניעת הפרדת החומר מהמוח במהלך החתך.
- מניחים גוש של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) על הצ'אק, ולאחר מכן מניחים את המוח, צד שטוח כלפי מטה, על הצ'אק ב- OCT. מניחים את הדגימה הזו על קרח יבש עד להקפאה או בהקפאה על הבלוק המקפיא.
- חותכים את המוח באופן סדרתי על cryostat ב -20 °C ב 30 מיקרומטר קטעים בעובי 30 מיקרומטר על פני 10 שקופיות מצופות ג'לטין. יש לדאוג בעת חתך להבטיח לא לאבד את הידרוג'ל. אם החלק הזה קשה, הניחו קצת OCT בחלק העליון של המוח מעל הג'ל(איור 3). יש לאחסן ב-80 °C (70°F) עד לשימוש נוסף.
- מוציאים שקופיות מ-80 מעלות ומניחים על מגש כתמים כדי לאפשר להם להתייבש. שקופיות שלא הוקפאו אך רק בחתך יכולות להיות מוכתמות באופן מיידי.
- באמצעות עט הידרופובי, ציירו עיגול סביב פרוסות המוח בשקופית. לאחר יבש, rehydrate פרוסות המוח עם PBS מסונן 1x ומניחים על שייקר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. זה לוקח בערך 1 מ"ל של חוצץ לכל שקופית עם 9 - 12 מקטעי מוח.
- לשטוף את השקופיות עם PBS מסונן 1x במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לחזור שלוש פעמים.
- לחסום שקופיות במשך 30 דקות עד שעה עם סרום חמור 10% ב 0.01% PBS-Triton X בטמפרטורת החדר על רקדנית הבטן. פעולה זו אורכת כ- 200 μL לכל שקופית.
- יש לדגור על הנוגדן העיקרי בסרום חמור 10% עם 0.01% PBS-Triton X למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר. בדוק נוגדנים ראשוניים תחילה כדי לקבוע ריכוזים נכונים. כאן GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (איור 4) שימשו.
- לשטוף שקופיות עם PBS מסונן 1x למחרת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לחזור שלוש פעמים.
- דגירה עם נוגדן משני בסרום חמור 10% ב 0.01% PBS-Triton X ו DAPI עבור 2 שעות על שייקר המעבדה בטמפרטורת החדר. 1:1,000 שימש עבור כל המשניות ו DAPI.
- לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות עם PBS מסונן 1x.
- אפשר לחלקים להתייבש בטמפרטורת החדר בחושך. זה יכול לקחת 20 דקות עד 4 שעות; מיקום השקופיות במתכנת יכול להאיץ את התהליך.
- ייבש שקופיות בריכוזים עולים של אלכוהול (דקה אחת לכל פתרון) של 50%, 70%, 95%, 100% ו-100%.
- דה שומן באמבט הראשון של קסילן במשך 1 דקות, ולאחר מכן אמבטיה שנייה של קסילן במשך 5 דקות.
- מוציאים במהירות את השקופיות אחד אחד ומוסיפים מדיום הרכבה בזמן שחלקי המוח רטובים עם קסילן. מוסיפים במהירות כיסוי זכוכית למעלה. השתמש בתלוש כיסוי באורך ובעובי הנכונים הדרושים לשקופית ולמיקרוסקופ המשמשים להדמיה, בהתאמה.
- להיפטר מכל בועות מתחת כיסוי על ידי לחיצה בעדינות עם קצה pipette בתנועה כלפי חוץ ממרכז השקופית. אפשר ל- DPX להתייבש למשך 4 שעות עד לילה בחושך בטמפרטורת החדר.
- השתמש בסכין גילוח כדי לגרד כל מדיום הרכבה מיובש שנשפך על השקופיות. נגב שקופיות עם מנקה עדשות. כעת ניתן לדמיין שקופיות באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות.
הערה: מומלץ לאחסן שקופית בחושך או ב 4 °C (7 °F) עד סיום ההדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת שיטה זו הייתה להדגים כיצד להזריק ביו-חומרים למוח לאחר שבץ. דגם פוטוטרומבוטי עם בנגל ורדים ולייזר 520 ננומטר שימש לכיוון מבוקר של נגע השבץ הן בגודל והן במיקום. חמישה ימים לאחר שבץ ניתן היה לדמיין את האוטם במהלך הניתוח (איור 1B) ועל ידי TTC והשקופיות המוכתמות ב- IHC(איור 2). עלייה בקוטר הלייזר עם עדשה 2x מובילה לעלייה חזותית בנגע השבץ שהשתרע על פני 2.5 מ"מ לעומת מקטע יחיד של 1 מ"מ עם הלייזר בלבד (איור 2). תמותה במהלך ניתוח עם מודל PT לעתים רחוקות התרחשה, פחות מ 1%, בשל ההליך זעיר פולשני. גם המוות לאחר הניתוח היה נמוך ונראה אצל פחות מ-5% מהעכברים.
מיקרו-חלקיקי הידרוג'ל מבוססי חומצה היאלורונית (HMPs) הוזרקו חמישה ימים לאחר השבץ(איור 3). חין HMPs לאחר הזרקה לתוך נגע שבץ כדי ליצור חלקיקים microannealed (MAP) עם פיגום נקבובי המאפשר העברת תאים לתוך ליבת שבץ (איור 4). עשרה ימים לאחר הזרקת עכברים היו perfused עם 4% PFA והמוח שלהם חולצו, הונחו 4% PFA לילה, ולאחר מכן ב 30% סוכרוז במשך יומיים לפני שהם הוקפאו וקטעו עבור IHC כתמים וניתוח.
עבודה קודמת במעבדה שלנו הדגימה את הזרקת הידרוג'ל MAP לתוך נגע שבץ חמישה ימים לאחר שבץ26. הזרקת הידרוג'לים היאלורוניים התואמים את המודולוס של קליפת המוח הובילה לירידה משמעותית באסטרוציטים תגובתיים בתוך אוטם פרי וכן בתוך ג'ל MAP. יתר על כן, מיקרוגליה שהיו גם בתוך הידרוג'ל ביטא סמני M2 בעד תיקון. זה מצביע על כך שהידרוג'ל MAP יכול להפחית את תגובתיות האסטרוציטים ביומיים בלבד לאחר הזריקות ולקדם סביבה אנטי דלקתית יותר עם אסטרוציטים ומיקרוגליה תומכי התאוששות (איור 5).
איור 1: ייצוג סכמטי של ברגמה ולוקליזציה של שבץ. (א)האונות הקודקודיות נפגשות בחלק העליון כדי ליצור את הברגמה. מיקום הלייזר היה מרוכז 2.0 מ"מ משמאל ברגמה. (B)התאמה חזותית של שבץ וחור בר נראו 5 ימים לאחר השבץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קטעים קורונליים המשתרעים על פני האוטם. (A)מקטעי IHC סדרתיים של המוח 5 ימים לאחר שבץ, שבץ עם לייזר בלבד (למעלה) ו 2x עדשה (למטה). הפרוסות היו בעובי 30 מיקרומטר כאשר כל קטע במרחק של 300 מיקרומטר מהסעיף הקודם. (B)כתם IHC מוגדל, 500 מיקרומטר קנה מידה-בר. גרעינים (DAPI) מוצגים בכחול, אסטרוציטים (GFAP+) באדום ומיקרוגליאלי (Iba1+) בהגדלה ירוקה פי 4. (C)חלקים של המוח מוכתמים עם TTC כדי לדמיין את נפח הנגע 5 ימים לאחר שבץ, קטעים בעובי 1 מ"מ עם סרגל קנה מידה של 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזרקה והדמיה של ביו-חומרים. (א)חזותי של הזרקת ג'ל במהלך הניתוח. (B)ניתן לדמיין את הג'ל בעין בעת הסרת הגולגולת. (C)לאחר שהוקפא והותקן, הג'ל נראה במוח בעת החתך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כתמי שבץ אימונוהיסטוכימיה רק בהשוואה לשבץ מוחי עם הידרוג'לים. (א)סכמטי של מוחות קריאוזיקציה בעובי 30 מיקרומטר. מספר מקטעים באמצע נבחרו לניתוח תמונה. (B)שבץ בלבד, כתמי אימונוהיסטוכימיה (IHC) 15 יום לאחר השבץ. תאי אסטרוציטים (GFAP+) מוצגים באדום, מיקרוגליה (Iba1+) הם ירוקים, וכלי דם (GLUT1+) הם לבנים. שבץ + מצב הידרוג'ל, IHC 10d לאחר הזרקה, 15 ימים לאחר שבץ. תאי אסטרוציטים (GFAP+) מוצגים באדום, מיקרוגליה (Iba1+) הם ירוקים, חומר הידרוג'ל הוא לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השפעות של הידרוג'ל חלקיקים מיקרו-נקבוביים על אסטרוציטים מגיבים ומיקרוגליה לאחר שבץ. (A)שרטוט של ציר זמן ניסיוני שבו החץ מסמל את יום הקו, + מסמל את יום ההזרקה, ו- x מסמל נקודת זמן של הקרבה וניתוח. (B)סכמטי של הגדרת ניתוח המציג היכן מקטעים צולמו ונותחו. (C)תמונות IHC המציגות תגובתיות אסטרוציטים באמצעות pERK, S100b, GFAP. (ד)כימות של אחוז pERK / GFAP של אסטרוציטים שהיו תגובתיים מאוד. (ה)כימות של S100b / GFAP אחוז של אסטרוציטים שהיו תגובתיים מאוד. (ו)תמונות IHC של תגובתיות מיקרוגליה באמצעות מכתמים CD11b, Arg1 ו- iNOS. (G)כימות של iNOS / Dapi לקביעת פנוטיפ פרו דלקתי מיקרוגליאלי. (H)כימות של Arg1 / Dapi לקביעת פנוטיפ פרו-תיקון מיקרוגליאלי. סרגל קנה המידה = 100 מיקרומטר. ניתוח סטטיסטי נעשה במנסרה GraphPad. * הנתונים המצוינים נותחו באמצעות בדיקת Tukey לאחר הוק ומרווח ביטחון של 95% עם P<0.05. ערכי p בודדים ציינו T-test. נתון זה משתנה מנציג26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מדגימים מודל שבץ קבוע שניתן לשחזור בקלות, זעיר פולשני ומתארים כיצד להזריק ביו-חומרים לאוטם חמישה ימים לאחר השבץ. השימוש בצבע פוטותרומבוטי רוז בנגל ולייזר קולימיציה של 520 ננומטר המחובר למכשיר הסטריאוטקסי מעניק לנו את היכולת למקם את השבץ בקליפת המוח המוטורית של העכבר בדיוק משופר. חמישה ימים לאחר השבץ, המיקום של האוטם נראה בעין במרכז ההקרנה, 2.0 מ"מ בינוני-לרוחב ברגמה. הידרוג'ל מוזרק באופן מדויק לתוך ליבת השבץ באמצעות משאבות מזרק. התמותה במהלך הניתוח ולאחר שבץ במודל זה נעדרת כמעט לחלוטין, כאשר רק קומץ עכברים מתים לאחר הניתוח עקב סיבוכים מרדימים. למרות היתרונות של שימוש בשבץ PT עבור יישומים ביו-חומרים, ישנן מספר מגבלות ביולוגיות וקשיים טכניים שיש לטפל בהם.
במונחים של מגבלות ביולוגיות, PT הוא מודל לא שבץ המציע את האפשרות עבור reperfusion מוחי, תהליך שיכול להתרחש באופן ספונטני בשבץ אנושי או בתגובה אחזור קריש אנדווסקולרי / תמותה. בנוסף, בניגוד למודל MCAo המחקה את האטיולוגיה של רוב השבץ האנושי על ידי סתימת כלי מוחי גדול, PT פוגע בזרימת הדם דרך כלי דם קטנים רבים. קושי טכני בהזרקת ביו-חומרים הידרוג'ל הוא נטייתם לדבוק במזרק במהלך הניתוח או בגולגולת במהלך עקירות. עיצוב הידרוג'ל שנשאר כנוזל במהלך הזרקה ולאחר מכן ג'לים במקום יכול לטפל בבעיה הראשונה; עם זאת, מניעת הג'ל מלהידבק dura mater הוא לעתים קרובות בלתי נמנע מאז אתר ההזרקה וליבה שבץ שוכנים על פני השטח של המוח. זה יכול להקשות על חילוץ רקמת המוח תוך שמירה על הביו-חומרים שלמים. ככזה, יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת הסרת חתיכות גולגולת מהמוח כדי להבטיח כי dura mater לא להרים עם הגולגולת לעקור את הג'ל בשוגג. המוחות הקריוזקציה דורשים גם מיומנות טכנית מכיוון שגם תהליך הטיפול וגם מעבר הלהב יכולים לנתק בקלות את הג'ל מהרקמה הסובבת אותו, ובכך להגביל את איסוף הנתונים בנוגע לחדירת תאים. ניתוק מחמיר כאשר החומר אינו משולב באופן מלא עם הרקמה. הכנת המדגם עם OCT יוצרת מעטפת חיזוק המסייעת למזער את הפרדת החומר במהלך החיתוך.
לפני הזרקת ביו-חומרים, אנו ממליצים לייעל את גודל השבץ הרצוי בהתאם לזן המכרסמים ולהגדרת המעבדה. אוטם קטן או גדול יותר יכול להתבצע על ידי התאמת שלושה פרמטרים עיקריים: עוצמת פלט לייזר, הגדלת קרן וזמן הקרנה. גורמים אחרים שהוכחו גם להשפיע על גודל שבץ כוללים ריכוז של איזופלוראן19 ואת כמות הזמן הצבע מותר להסתובב לפני הקרנה. לגבי עוצמת תפוקת הלייזר (הספק/שטח או mW/ס"מ2),מצאנו כי כוח לייזר של 10 מ"ו היה מספיק כדי לייצר אוטם קטן עם קוטר אופקי מעט קטן יותר מזה של קרן הלייזר. כוח לייזר גבוה יותר הניב אוטמים רחבים יותר אך עמוקים משמעותית (נתונים שלא הוצגו) בשל קרן הלייזר בעל פרופיל הקרנה גאוסי. על ידי הגדלת העוצמה, נקודת המרכז של קרינה מקסימלית יכולה לחדור עמוק יותר מעבר לגולגולת, כמו גם לגרום לעלייה קלה בחדירה לגודל הספוט של הלייזר. מודלים אחרים של שבץ דיללו את הגולגולת על ידי ליטושה לפני החלת אור או לייזר על מנת להגביר את חדירת האור ואת יכולת הרבייה הבאה של קרישה תוך שמירה על עוצמת לייזר נמוכה יותר20; עם זאת, זה יכול לגרום לדימום בגולגולת ולוקח כמות לא מבוטלת של זמן במהלך הניתוח ומיומנות לשלוט מבלי לפגוע בטעות במוח בתהליך. בדומה לעוצמה, הגדלת קוטר קרן הלייזר גם גדל גודל אוטם; עם זאת, עוצמת הלייזר וקוטר הקרן אינם משתנים באופן ליניארי ביחס זה לזה אלא עוקבים אחר המשוואה, צפיפות הכוח = כוח הלייזר (w)/ πr2, היכן נמצא רדיוס הקרן. במונחים של זמן הקרנה, מצאנו כי מינימום של 10 דקות היה צורך להניב שבץ רבייה. כדי להגדיל את הקוטר האופקי של האוטם תוך שמירה על קבוע העומק האנכי, החלנו את הלייזר על מיקומים סמוכים במשך 10 דקות כל אחד, ברצף. כדי להתמודד עם ההשפעה של ריכוז איזופלוראן וזמן זרימת הדם של rose bengal, מצאנו כי 1.5% ריכוז איזופלוראן ו 7 דקות של זרימת הדם לאחר הזרקת IP הביא היווצרות עקבית של שבץ. חמשת הפרמטרים האלה היו מותאמים לשימוש הספציפי שלנו. נדרשנו לשבץ גדול מספיק כדי לגרום לשינויים התנהגותיים אך לא להפריע לאזור התת-חדרי, שם התכוונו לחקור את ההשפעה של החומר שלנו על תאי האב העצבי. בנוסף לגודל השבץ, היינו צריכים גם לקבוע את נפח הג'ל האופטימלי להזרקה. לכל הפחות, היינו צריכים מספיק ג'ל כדי למלא לחלוטין את חלל השבץ מכיוון שמצאנו כי פערים בין ג'ל לרקמה שמסביב הובילו לתוצאות דומות לקבוצות הביקורת שלנו, בעוד שמגע בין ג'ל לרקמה הביא לפחות אסטרוציטים תגובתיים וחדירה תאית מוגברת. הגענו לגבול נמוך יותר של 4-6 μL של ג'ל, אשר לא ייצר תופעות לוואי לאחר מוזרק (נתונים שלא פורסמו).
לגבי הערכת תוצאת השבץ ישנן מספר אפשרויות מעבר להכתמת IHC, כגון הדמיית תהודה מגנטית, בדיקות התנהגותיות, ניתוח היסתולוגי, ו- TTC (2,3,5-טריפנילטטרזוליום כלוריד). מומלץ מאוד להשתמש TTC עבור אופטימיזציה ראשונית של שבץ בשל קלות השימוש שלה ותוצאות מיידיות. בדיקות התנהגותיות קודמות במעבדה שלנו בחנו את בדיקת הגליל / משימת ההקמה הספונטנית, מבחן ההליכה ברשת, ובדיקת הפסטה12,21. יש לציין כי בדיקות rotarod לא הראו ירידה משמעותית בתוצאות ההתנהגותיות לאחר שיטת שבץ PT יושם (נתונים לא הראו). לכן, בדיקות התנהגותיות צריכות להעריך משימות מורכבות מאוד הדורשות קלט קליפת המוח משמעותי.
כאן הדגמנו את הטכניקה של הזרקת הידרוג'ל לאחר שבץ ללא אספקת גורמי גדילה או תאים. עם זאת, הידרוג'לים שימשו גם להשתלת תאים, כמו גם אספקת תרופות וגורמי גדילה, ועשויים להתברר כמשאב בעל ערך הן ללימוד ביולוגיה לאחר שבץ וחקירת שיטות טיפול חדשות. בהקשר של שבץ, המעבדה שלנו הזריקה הידרוג'לים חומצה היאלורונית לא נקבוביים encapsulating המושרה תאי גזע פלוריפוטנטים שמקורם בתאי גזעעצביים 14,18 בריכוזים הנעים בין 25,000 תאים / μL ל 50,000 תאים / μL של ג'ל. השימוש בהידרוג'ל הביא לעלייה בכדאיות ובבידול התאים. מעבדות אחרות דיווחו גם על בידול תאים והתחדשות רקמות מוגברת בתגובה הידרוג'לים המשמשים להשתלת תאי גזע לאחר שבץ 22-24. בנוסף, הזרקנו הידרוג'ל עם גורמי גדילה לאחר שבץ שמובילים להתחדשות רקמות ושיפור התנהגותי לאחר שבץ13,14. במונחים של עיצוב חומר, הזרקה היא תכונה חשובה המשמשת כדי למזער פולשניות; לכן, הידרוג'ל צריך להיות מנוסח כמו סול-ג'ל (נוזלי-למוצק), דילול גניסה (G' > G" בתנאים סטטיים; G" > G' במהלך הזרימה), או ג'לים פרטניים המורכבים מאבני בניין שקוטרן נמוך מהקוטר הפנימי של מחט12,25,26. לאחר מכן יש לבצע אופטימיזציה כדי לבדוק דיפוזיה של תרופות או גורמי גדילה, כדאיות התא תחת מגוון של ריכוזי תאים, תנאי ג'ל, ופרמטרים הזרקה, כגון מהירות, מד מחט, עומק הזרקה, יום הזרקה ביחס כאשר שבץ הושרה. לדוגמה, יום הזרקת החומר נע בין יום אחד לאחר שבץ, ארוך ככל שלושה שבועות לאחר שבץ27,28. כאן, אנו מדווחים חמישה ימים אך הזריקו בעבר שבעה ימים לאחר שבץ בעת השתלת תאים. ימים אלה נבחרו על סמך ציר הזמן של התגובה הדלקתית, כמו גם את פעילות השיא של אנגיוגנזה ו neurogenesis נראה שבוע לאחר שבץ5,29,30,31. אפיון נפח צריך להתבצע גם בכל נקודת זמן הזרקה, כמו נפח השבץ יקטן עם הזמן עקב ניוון. בהתחשב בכך פרמטרים אלה ממוטבים לפני ההזרקה, השיטות כאן מספיקות כדי להנחות משתמשים להזריק ביו חומרים עם תוספת של תאים ו /או גורמי גדילה ותרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי TS הוא מייסד טמפו תרפיוטיקס, המבקשת למסחר הידרוג'לים MAP.
Acknowledgments
אנו אוהבים להכיר המכונים הלאומיים לבריאות ואת המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ למימון (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
