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Biology

स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क को हाइड्रोजेल बायोमटेरियल मचान का इंजेक्शन

Published: October 1, 2020 doi: 10.3791/61450
Automatic Translation
1, 2, 1,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Neurology, University of California Los Angeles, 3Department of Neurology, Duke University, 4Department of Dermatology, Duke University

Summary

स्ट्रोक न्यूनतम उपचार विकल्प और खो मस्तिष्क ऊतक पुनर्जीवित करने के लिए कोई वर्तमान नैदानिक चिकित्सा के साथ एक वैश्विक मुद्दा है। यहां हम कृंतक के मोटर कॉर्टेक्स में सटीक फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक बनाने के तरीकों का वर्णन करते हैं और स्ट्रोक के बाद ऊतक पुनर्जनन पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए हाइड्रोजेल बायोमैटेरियल्स के बाद इंजेक्शन।

Abstract

स्ट्रोक विकलांगता का प्रमुख कारण है और संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत का पांचवां प्रमुख कारण है । सभी स्ट्रोक के लगभग 87% इस्कीमिक स्ट्रोक हैं और मस्तिष्क को रक्त की आपूर्ति करने वाले पोत की अचानक रुकावट के रूप में परिभाषित किए जाते हैं। रुकावट के कुछ ही मिनटों के भीतर, कोशिकाएं मरने लगती हैं और परिणामस्वरूप अपूरणीय ऊतक क्षति होती है। वर्तमान चिकित्सीय उपचार थक्का हटाने या लाइसिस पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ईंधन के लिए अनुमति देते हैं और अधिक गंभीर मस्तिष्क क्षति को रोकने के लिए। हालांकि क्षणिक मस्तिष्क प्लास्टिसिटी समय के साथ क्षतिग्रस्त ऊतक के कुछ उबार सकता है, रोगियों के महत्वपूर्ण अंश न्यूरोलॉजिकल घाटे है कि हल कभी नहीं होगा के साथ छोड़ दिया जाता है । स्ट्रोक के कारण न्यूरोलॉजिकल घाटे का इलाज करने के लिए चिकित्सीय विकल्पों की कमी है, इस बढ़ती रोगी आबादी के इलाज के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता पर जोर दिया गया है। इंजेक्शन बायोमैटेरियल्स वर्तमान में मस्तिष्क प्लास्टिसिटी को बढ़ाने और सक्रिय एजेंटों या स्टेम सेल के वितरण के माध्यम से अंतर्जात मरम्मत में सुधार करने के लिए डिजाइन किया जा रहा है । इन दृष्टिकोणों का परीक्षण करने के लिए एक विधि कृंतक स्ट्रोक मॉडल का उपयोग करना, स्ट्रोक कोर में बायोमटेरियल इंजेक्ट करना और मरम्मत का आकलन करना है। स्ट्रोक कोर के सटीक स्थान को जानना स्ट्रोक के बाद सटीक उपचार के लिए जरूरी है, इसलिए, एक स्ट्रोक मॉडल जिसके परिणामस्वरूप अनुमानित स्ट्रोक स्थान इंजेक्शन से पहले इमेजिंग की आवश्यकता से बचने के लिए बेहतर है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक को कैसे प्रेरित किया जाए, नियंत्रित और सटीक तरीके से हाइड्रोगेल को कैसे इंजेक्ट किया जाए, और बायोमैटेरियल को बरकरार रखते हुए मस्तिष्क को कैसे निकाला और क्रायोसेक्शन किया जाए। इसके अलावा, हम इस बात पर प्रकाश डालेंगे कि स्टेम सेल के सह-वितरण के लिए इन हाइड्रोगेल सामग्रियों का उपयोग कैसे किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को स्ट्रोक कोर में अन्य इंजेक्शन बायोमैटेरियल्स के उपयोग के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।

Introduction

स्ट्रोक विकलांगता का प्रमुख कारण है और संयुक्त राज्य अमेरिका1में मौत का पांचवां प्रमुख कारण है । सभी स्ट्रोक के लगभग 87% इस्कीमिक हैं, जबकि शेष 13% में से अधिकांशरक्तस्रावी 2हैं। एक इस्कीमिक स्ट्रोक को आसपास के ऊतकों के लिए एक धमनी में रक्त प्रवाह की रुकावट के रूप में परिभाषित किया गया है। इस ऑक्सक्लूजन के परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की कमी और बाद में परिगलन होता है जो अक्सर जीवित रोगियों में स्थायी विकलांगता की ओर जाता है। जहां स्ट्रोक3की मृत्यु दर में कमी आई है , वहीं 20304तक इसकी व्यापकता बढ़कर 34 लाख लोगों तक बढ़ने की संभावना है . विकलांग बचे और परिणामी आर्थिक बोझ में यह वृद्धि स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक धक्का है कि तंत्रिका की मरंमत के तंत्र पर केंद्रित करने के लिए नेतृत्व किया गया है । स्ट्रोक के बाद एक भड़काऊ अवधि होती है जो एक निशान के गठन की ओर ले जाती है जो परिगलित क्षेत्र को विस्तार से रोकती है। परिगलित कोर के आसपास के क्षेत्र को "पेरी-इनफार्ट" कहा जाता है और इस बात का एक मजबूत सबूत है कि इस क्षेत्र में प्लास्टिसिटी, जिसमें एंजियोजेनेसिस, न्यूरोजेनेसिस और एक्सोनल स्प्राउटिंग शामिल हैं, सीधे पशु मॉडल और मनुष्य5में मनाया वसूली से जुड़ा हुआ है। चूंकि कोई इन विट्रो मॉडल नहीं है जो स्ट्रोक के बाद जटिल बातचीत को ठीक से दोहरा सकता है, इसलिए स्ट्रोक अनुसंधान के लिए पशु मॉडल आवश्यक हैं।

वीवो मॉडल में कई ऐसे हैं जिनका उपयोग इस्कीमिक स्ट्रोक का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। चूहों में उपयोग किए जाने वाले सबसे आम मॉडलों में से एक मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्यूज़न, या एमसीएओ है, डिस्टल या समीपस्थ (अंतर-धमनी फिलामेंट के माध्यम से) ऑक्लूजन के माध्यम से। समीपस्थ मॉडल, जिसे फिलामेंट एमसीएओ (एफएमएओ) के रूप में भी जाना जाता है, आमतौर पर बड़े इस्कीमिक स्ट्रोक का परिणाम होता है जो सेरेब्रल गोलार्द्ध के 5% से 50% तक कहीं भी शामिल होते हैं,जो 6कारकों की संख्या पर निर्भर करते हैं। इन मॉडलों में, एक सीवन या फिलामेंट को आंतरिक कैरोटिड धमनी से मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के आधार में उन्नत किया जाता है और एक विशिष्ट अवधि के लिए जगह में रखा जाता है। ऑक्सक्लूज़न के लिए यह विधि, जिसे अस्थायी या स्थायी बनाया जा सकता है, एक इनफारेक्ट का उत्पादन करता है जो स्ट्राटम में केंद्रित है और इसमें ओवरलिंग कॉर्टेक्स6शामिल हो सकता है या नहीं हो सकता है। परिणामस्वरूप स्ट्रोक का आकार अत्यधिक परिवर्तनशील है, और लेजर डॉप्लर जैसी इमेजिंग तकनीकों को प्रत्येक माउस में प्रक्रिया की प्रभावशीलता की पुष्टि करने की आवश्यकता होती है। इंट्रा-धमनी या इंट्रा-ल्यूमिनल फिलामेंट ऑक्लसियन जो 30 मिनट से अधिक रहता है, आकार सीमा के बड़े अंत में स्ट्रोक पैदा करता है। कुछ जांचकर्ताओं ने छोटे फिलामेंट ऑक्क्यूशन टाइम्स पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसके लिए पर्याप्त प्रायोगिक फोकस और लैब सत्यापन7की आवश्यकता होती है। चूहों में फिलामेंट एमसीएओ मॉडल सेल मृत्यु, इस्कीमिक प्रगति और मानव स्ट्रोक के मामलों में देखे गए पेरी-इनफाक्ट क्षेत्र के गठन के समान चरणों का पालन करते हैं; हालांकि, बड़ा स्ट्रोक अधिक बारीकी से घातक मस्तिष्क इंफार्क्शन, जो कम आम हैं, कम इलाज मानव स्ट्रोक6की रोग राज्य के समान . इस बीच, डिस्टल एमसीए ऑक्सीक्लूशन के लिए अधिक शामिल सर्जरी और क्रैनेक्टॉमी की आवश्यकता होती है। इस मॉडल में, मस्तिष्क की सतह के साथ चलने वाले एमसीए का डिस्टल हिस्सा सीधे सीवन टाई या कॉटराइजेशन के साथ होता है। तकनीक के कुछ रूपों में, कैरोटिड धमनियों को एकतरफा या क्षणिक-द्विपक्षीय रूप से ऑक्सीलेड किया जाता है। डिस्टल एमसीएओ का एक लाभ यह है कि यह एक कॉर्टिकल-आधारित स्ट्रोक पैदा करता है जो फिलामेंट मॉडल की तुलना में आकार में कम चरता है। हालांकि, डिस्टल मॉडल बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) के ट्रांसेक्शन के कारण खराब व्यवहार उत्पादन का उत्पादन करता है, जो एफएमएओ6के साथ भी चिंता का विषय है।

एक वैकल्पिक स्ट्रोक मॉडल है कि कम आक्रामक होने के लिए जाना जाता है फोटोथ्रोम्बोटिक (पीटी) मॉडल है । पीटी मॉडल इस्केमिया के एक अच्छी तरह से परिभाषित स्थान में परिणाम है और एक उच्च जीवित रहने की दर8के साथ जुड़ा हुआ है । यह तकनीक एक फोटोसेंसिटिव डाई पर निर्भर करती है जो इंट्रापेरिटोली इंजेक्ट की जाती है जो केवल एक प्रकाश या लेजर9के साथ वांछित ऊतक को विकिरणित करके इंट्रावैस्कुलर फोटो-ऑक्सीकरण के लिए अनुमति देती है। उत्तेजन पर, ऑक्सीजन कण बनते हैं जो एंडोथेलियल क्षति का कारण बनते हैं, जो विकिरणित क्षेत्र8, 9में प्लेटलेट एकत्रीकरण और थक्कागठनको सक्रिय करता है। स्ट्रोक के आकार और स्थान पर तंग नियंत्रण, साथ ही पीटी मॉडल की उच्च प्रजनन क्षमता, इसे बायोमैटेरियल्स का अध्ययन करने के लिए आदर्श बनाती है। जबकि सटीक एक लेजर और स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक का उपयोग करके संभव बनाया जाता है, कुछ नुकसान हैं जो इस मॉडल को कुछ अध्ययनों के लिए कम आदर्श बना सकते हैं। एफएमएओ मॉडल के विपरीत, पीटी स्ट्रोक मॉडल को फिर से तैयार नहीं किया जा सकता है। इसलिए , अनुर्फूधन के बाद नुकसान के लिए विशिष्ट न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों की जांच के लिए सामग्री या रिफ्यूजन के बाद तंत्र यहां उपयोगी नहीं होगा8. इसके अतिरिक्त, पीटी मॉडल के माइक्रोवैस्कुलर अपमान के कारण, अपेक्षाकृत छोटे इस्कीमिक पेनुम्ब्रा देखा जाता है। इसके बजाय, स्थानीय वासोजेनिक एडिमा होता है, जो मानव स्ट्रोक के लिए अस्वाभाविक है, जिससे इस मॉडल को प्रीक्लिनिकल दवा अध्ययनों के लिए अवांछनीय बना दिया गया हैजोपेरी-इनफार्क क्षेत्र6,8पर केंद्रित है।

स्ट्रोक में जैव सामग्री रणनीतियों का समग्र लक्ष्य या तो बायोएक्टिव एजेंटों को वितरित करना या मस्तिष्क के ऊतकों के विकास के लिए सरोगेट एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के रूप में कार्य करना है। एक रणनीति है कि हम अपने तरीकों का उपयोग कर का पता लगाने के लिए सीधे स्ट्रोक कोर में हाइड्रोगेल उद्धार है, के रूप में पेरी-infarct ऊतक जहां कई वर्तमान सेल चिकित्सा10दिया जाता है के खिलाफ है । इस दृष्टिकोण के लिए तर्क यह है कि कोर में पाए जाने वाले परिगलित ऊतक में डिलीवरी आसपास के स्वस्थ या ठीक ऊतक को बाधित करने से बचना होगा। हम मानते हैं कि बायोमटेरियल के भीतर शामिल किसी भी सक्रिय एजेंटों का प्रसार कोर से पेरी-इनफारेक्ट तक पहुंचने में सक्षम होगा, खासकर जब से हम पाते हैं कि हाइड्रोगेल बायोमैटेरियल्स की डिलीवरी ग्लियल निशान11की मोटाई को कम करती है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि पेरी-इनफार्ट क्षेत्र को स्ट्रोक के बाद न्यूरोप्लास्टी प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है, जिससे यह एक आकर्षक लक्ष्य बन गया है। इसके अलावा, स्ट्रोक कोर के लिए एक सरोगेट मैट्रिक्स की डिलीवरी एंजियोजेनिक12 या न्यूरोजेनिक13 कारकों के साथ लोड किया जा सकता है नए ऊतक के गठन का मार्गदर्शन करने के लिए, साथ ही प्रसव14के लिए कोशिकाओं । मैट्रिक्स का उपयोग करके सेल डिलीवरी को बहुत बढ़ाया जाता है क्योंकि यह डिलीवरी के दौरान मौजूद कठोर इंजेक्शन बलों और स्थानीय वातावरण से कोशिकाओं की रक्षा करता है, साथ ही भेदभाव और एनग्रेक्शन15को प्रोत्साहित करता है।

इन इंजेक्शन चिकित्सीय बायोमैटेरियल्स स्ट्रोक अनुप्रयोगों में नैदानिक प्रासंगिकता है, क्योंकि वर्तमान में कोई चिकित्सा उपचार नहीं है जो स्ट्रोक के बाद न्यूरोनल रिकवरी को प्रोत्साहित करते हैं। वसूली में शामिल अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट मस्तिष्क के ऊतकों में झूठ बोलते हैं जो स्ट्रोक कोर16से सटा हुआ है, जबकि स्ट्रोक कोर स्वयं व्यवहार्य तंत्रिका ऊतक से रहित है। हम आशा करते हैं कि गल-नाड़ुक स्ट्रोक कोर में बायोमटेरियल देने से पहले उल्लिखित कई तंत्रों के माध्यम से पुनर्योजी प्रक्रियाओं की ओर आसन्न ऊतक को उत्तेजित करने की क्षमता है, जिसमें विकास कारकों की डिपो रिलीज13,ऊतक की उत्तेजना और मस्तिष्क के ऊतकों के विकास को ठीक करने की पदोन्नति11,12,प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन17,और स्टेम सेल-व्युत्पन्न चिकित्सीय14कीडिलीवरी, 18. हालांकि, प्रभावी ढंग से इन अनुप्रयोगों की संभावना का अध्ययन करने के लिए, स्ट्रोक उत्प्रेरण और बायोमैटेरियल इंजेक्शन के लिए एक सुसंगत और प्रजनन विधि की जरूरत है । पीटी स्ट्रोक मॉडल तकनीकों का उपयोग करता है जो स्ट्रोक के अभिविन्यास और स्थान पर सटीक नियंत्रण प्रदान करते हैं। स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस से जुड़ा एक लेजर झुकाव को निर्देशित करता है, और स्टीरियोटैक्सिक उपकरणों से जुड़े पंप इमेजिंग के अतिरिक्त रूपों की आवश्यकता के बिना सामग्री की इंजेक्शन दर को नियंत्रित करते हैं। इसलिए, हमने चूहों के मोटर कॉर्टेक्स में पीटी स्ट्रोक प्रदर्शन करने और स्ट्रोक कोर में बायोमैटेरियल्स इंजेक्शन के लिए तरीकों का वर्णन करने के लिए चुना है। यहां, हम माइक्रोपोरस एनील्ड पार्टिकल (एमएपी) हाइड्रोगेल का उपयोग इंजेक्शन के लिए बायोमटेरियल के रूप में करते हैं जिसमें कोई अतिरिक्त कोशिकाएं या विकास कारक नहीं होते हैं। इसके अतिरिक्त, हम समझाते हैं कि मस्तिष्क को अक्षुण्ण बायोमैटेरियल के साथ सफलतापूर्वक कैसे पुनः प्राप्त किया जाए, और हम बायोमैटेरियल्स के इंजेक्शन के साथ और बिना स्ट्रोक के परिणाम का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोकेमिस्ट्री पर चर्चा करते हैं।

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Protocol

यह प्रयोग ड्यूक यूनिवर्सिटी और यूनिवर्सिटी ऑफ कैलिफोर्निया लॉस एंजेलिस में आईयूसीएसी के मुताबिक किए गए थे । इस अध्ययन में 8 से 12 सप्ताह पुराने पुरुष C57Bl/6J चूहों का इस्तेमाल किया गया । जानवरों को नियंत्रित तापमान (22 ± 2 डिग्री सेल्सियस) के तहत रखा गया था, जिसमें 12 घंटे का हल्का-अंधेरा चक्र अवधि और पेल्ड भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम तक पहुंच थी। एनाल्जेसिया और सेडलेशन प्रोटोकॉल को आईयूसीएसी द्वारा अनुमोदित बताया गया है लेकिन अन्य प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल से भिन्न हो सकता है।

पशुओं को समय से पहले इच्छामृत्यु हो सकती है यदि वे अत्यधिक बेचैनी, वोकलाइजेशन (बेकाबू दर्द का संकेत देते हैं), आत्म-आघात, कम या बिगड़ा गतिशीलता, डर्मल संक्रमण के शारीरिक संकेत, भूख की कमी और/या वजन घटाने से अधिक 10%-15% जीवित रहने की सर्जरी के परिणाम के रूप में । जेल के इंजेक्शन से कोई प्रत्याशित प्रतिकूल प्रभाव नहीं हैं, क्योंकि यह मस्तिष्क के भीतर स्वाभाविक रूप से होने वाले बहुलक से बना है। जानवरों को सप्ताहांत और छुट्टियों सहित दैनिक निगरानी की जानी चाहिए, और हर दूसरे दिन reweighed । हमारी प्रयोगशाला और दूसरों के अध्ययनों से इन छोटे कॉर्टिकल या उपकॉर्टिकल स्ट्रोक के बाद चूहों में ग्रूमिंग, शरीर के वजन की हानि या वापसी या पुराने तनाव के लक्षणों में कोई कमी नहीं मिली है । यदि जानवर स्थानीय सिर घाव संक्रमण के किसी भी संकेत का प्रदर्शन करते हैं तो उन्हें इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। जानवरों को खराब संवारने, घाव की स्थिति और जानवरों (पीठ के घावों) के बीच लड़ने के सबूत के लिए भी निगरानी की जानी चाहिए। यदि लड़ने या घाव की विहितता का सबूत है, तो पशुओं को पहले पशु चिकित्सकों से संपर्क करने के बाद इलाज किया जाना चाहिए। यह अक्सर पानी में एंटीबायोटिक और/या स्थानीय सामयिक एंटीबायोटिक आवेदन शामिल है । यदि ये उपाय उपचार का उत्पादन करने में विफल होते हैं, तो जानवरों को इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए।

1. सामग्री और उपकरणों की तैयारी

  1. सर्जरी से पहले फोटोथ्रोम्बोटिक डाई तैयार करें। गुलाब बंगाल के 15 मिलीग्राम को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में तौलें।
    सावधानी: गुलाब बंगाल गंभीर आंख क्षति/जलन का कारण बन सकता है ।
    1. 10 मिलीग्राम/एमएल की कामकाजी एकाग्रता बनाने के लिए बाँझ फ़िल्टर 1x पीबीएस के 1.5 एमएल में गुलाब बंगाल को भंग करें।
    2. भंवर ट्यूब जब तक कोई झुरमुट दिखाई दे रहे हैं, डाई का संकेत पूरी तरह से भंग कर दिया है, तो आगे का उपयोग करने तक पन्नी में कवर ।
      नोट: आवश्यक डाई की मात्रा चूहों की संख्या पर निर्भर करेगी। डाई को 20 ग्राम माउस के लिए 10 माइक्रोन/जी, उदाहरण के लिए, 200 माइक्रोन की एकाग्रता पर इंट्रापेरिटेली आईपी इंजेक्ट किया जाता है।
  2. संज्ञाहरण (37 डिग्री सेल्सियस) के दौरान माउस शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड चालू करें।
  3. ऑटोक्लेव कैंची, संदंश, कपास, पशु चिकित्सक आंख मरहम, सर्जिकल गोंद, या सीवन सामग्री, एक नीले या काले सर्जिकल मार्कर, और बाँझ शराब और बीटा आयोडीन पोंछे तैयार करें। निष्फल ड्रिल बिट सिर के साथ अस्थि ड्रिल तैयार करें।
  4. चूहों की सर्जरी के बीच उपकरणों की नसबंदी के लिए अनुमति देने के लिए मनका नसबंदी को 160 डिग्री सेल्सियस तक चालू करें। एक हाइड्रेटेड ऑपरेशन क्षेत्र को बनाए रखने में बाद में उपयोग के लिए बाँझ नमकीन या 1x पीबीएस समाधान की एक 50 एमएल शंकु ट्यूब को अलग करें।
  5. लेजर को स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस से अटैच करें। लेजर सुरक्षा काले चश्मे पहने हुए, लेजर (mW) की शक्ति को मापने।
    सावधानी: जब भी प्रक्रिया में लेजर चालू हो तो लेजर सुरक्षा चश्मे का उपयोग करें।
    1. लेजर कंसोल पर वर्तमान को समायोजित करें, लेजर विनिर्माण निर्देशों का पालन करें, जब तक कि लेजर पावर आउटपुट 10 मिलियन तक नहीं पढ़ता, और वर्तमान को होम स्क्रीन कंसोल पर पूर्व-सेट के रूप में सेट न करें। फिर एक और पूर्व-सेट स्थापित करने के लिए वर्तमान को फिर से समायोजित करें जहां लेजर आउटपुट पावर 40 मिलियन पढ़ता है। अब आगे के उपयोग तक लेजर बंद कर दें।
      नोट: 10 mW का उपयोग करने से पहले लेजर उन्मुख करने के लिए किया जाएगा ।
  6. सर्जरी के बाद चूहों के लिए एक साफ पिंजरे तैयार करें। फिर, माउस को 4% की आइसोफ्लुरेन एकाग्रता के साथ इंडक्शन चैंबर में रखें ताकि इसे तब तक एनेस्थेटाइज किया जा सके जब तक कि सहज आंदोलन बंद न हो जाए और इसकी श्वास धीमी, स्थिर दर पर आ जाए।
  7. एक बार सो जाने के बाद, माउस का वजन यह निर्धारित करने के लिए कि गुलाब बंगाल को इंजेक्ट करने के लिए कितना डाई करें। फिर, माउस को 1.5% की रखरखाव आइसोफ्लारेन एकाग्रता के साथ स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस में स्थानांतरित और सुरक्षित करें।
    नोट: आइसोफ्लुन सांद्रता बढ़ाने से जहाजों को डिलेट किया जा सकता है और चूहों के बीच पर्याप्त ऑक्सीक्यूशन या लगातार आकार के स्ट्रोक को रोका जा सकता है।
  8. दोनों आंखों पर पशु चिकित्सक आंखों का मरहम लगाएं।
    नोट: प्रक्रिया के दौरान श्वास और तापमान देखें और यह सुनिश्चित करने के लिए कभी-कभी उंगलियों पर चुटकी लें कि माउस कुछ भी महसूस नहीं कर सकता है।

2. फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल9

  1. माउस के सिर से फर को शेव करें और बीटा आयोडीन वाइप के बाद अल्कोहल वाइप का उपयोग करके क्षेत्र तैयार करें। तीन बार दोहराएं।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो सभी बीटा आयोडीन को साफ करने के लिए अंत में एक अतिरिक्त अल्कोहल वाइप का उपयोग करें क्योंकि यह त्वचा की जलन का कारण बनता है जो चूहों को सर्जरी के बाद उनकी खोपड़ी में खुजली करता है।
  2. छोटे ऑपरेशन कैंची का उपयोग करके, कान ों से आंखों के बीच एक पार्श्व चीरा बनाएं, लगभग 1-2 सेमी। एक तम्बू बनाने के लिए त्वचा को ऊपर की ओर खींचकर, एक बार नीचे की ओर काटकर, फिर कैंची को खोलने में डालने और एक निरंतर मिडलाइन चीरा बनाकर करें।
  3. त्वचा को अलग करें और ब्रेग्मा का पता लगाने के लिए संदंश के साथ पार्श्व की हड्डियों पर हल्के से दबालें। सर्जिकल मार्कर का उपयोग कर एक डॉट के साथ ब्रेग्मा चिह्नित करें।
    नोट: हड्डी टुकड़ा आंदोलन पार्श्व हड्डियों की ललाट सीमा पर प्रकाश डाला गया । ब्रेग्मा वह केंद्र बिंदु है जिस पर ललाट और पार्श्व हड्डी के टुकड़े मिलते हैं(चित्रा 1A)।
  4. लेजर सुरक्षा चश्मे पहने हुए, माउस की खोपड़ी पर लेजर ले जाएँ, एक 90 ° कोण पर स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस फिक्सिंग। 10 एमडब्ल्यू प्री-सेट चुनें और लेजर चालू करें।
    1. लेजर के एक्स और वाई-एक्सिस को तब तक समायोजित करें जब तक कि यह सीधे ब्रेग्मा पर न हो जाए। डिजिटल डिस्प्ले कंसोल पर एक्स और वाई को रीसेट करें, और फिर ब्रेग्मा के लेजर 1.8 मिमी बाएं स्थानांतरित करें। अब लेजर के रूप में संभव के रूप में खोपड़ी के करीब लाने के लिए दे यह खोपड़ी को छूने के बिना संभव के रूप में ।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह किसी भी बाधाओं के बिना स्थानांतरित कर सकते हैं, ब्रेग्मा के 2.2 मिमी बाएं लेजर को ले जाएं। लेजर बंद कर दें।
  5. डिस्पोजेबल 29 जी सुई का उपयोग करके गुलाब बंगाल डाई इंट्रापेरिटेली (आईपी) की उचित मात्रा में इंजेक्ट करें। डाई को व्यवस्थित रूप से प्रसारित करने की अनुमति देने के लिए तुरंत 7 मिनट के लिए एक टाइमर शुरू करें। लेजर को चालू किए बिना 40 मिलियनW के लिए प्री-सेट का चयन करें।
    नोट: एक बार प्रक्रिया के साथ आराम से, डाई माउस की aseptic तैयारी से पहले इंजेक्शन किया जा सकता है और 7 मिनट से पहले समाप्त समय बचाने के लिए खत्म हो रहे हैं ।
  6. लेजर (40 mW) चालू करें जब 7 मिनट का टाइमर बंद हो जाता है, जबकि लेजर सुरक्षा चश्मे पहने हुए, और एक 10 मिनट टाइमर सेट करें।
    1. 10 मिनट के बाद, लेजर को बंद किए बिना ब्रेग्मा के 2.2 मिमी बाएं ले जाएं, और एक और 10 मिनट टाइमर सेट करें।
    2. एक बार दूसरा 10 मिनट टाइमर बंद हो गया है, लेजर वापस 10 mW को बदलने के लिए और 2.0 मिमी ब्रेग्मा के बाईं ओर लेजर ले जाएँ। सर्जिकल मार्कर के साथ इस स्थान को चिह्नित करें। इसके बाद लेजर बंद कर दें।
    3. लेजर उठाएं और इसे 90 डिग्री कोण से अनलॉक करें ताकि इसे माउस से दूर ले जाया जा सके। इस बिंदु पर, यदि सर्जिकल क्षेत्र शुष्क है तो कपास के साथ बाँझ नमकीन या पीबीएस लागू करें।
  7. खोपड़ी की सतह पर 2.0 मिमी निशान लंबवत पर छोटे फटने में ड्रिल करें।
    नोट: बहुत गहराई से ड्रिलिंग से बचने और मस्तिष्क को मारने के लिए धीरे-धीरे ड्रिल करने के लिए सावधान रहें। एक बार ड्रिल खोपड़ी के माध्यम से चला गया है प्रतिरोध में एक मामूली बूंद/परिवर्तन होगा, और ड्रिलिंग खून बह रहा है कारण हो सकता है ।
    1. किसी भी अतिरिक्त रक्त को अवशोषित करने के लिए कपास का उपयोग करें। ड्रिलिंग के बाद खोपड़ी में निकेड धमनियों से कुछ रक्त देखने के लिए विशिष्ट है - अत्यधिक रक्त का मतलब है ड्रिल बिट मस्तिष्क मारा। यदि ऐसा होता है, तो माउस पहचानकर्ता को रिकॉर्ड करें, और आगे बढ़ें।
  8. माउस के बगल में एक छोटा सा पोंछ रखें। संदंश का उपयोग करना, त्वचा को एक साथ बंद खींचें ताकि ग्लूइंग की तैयारी की जा सके।
    नोट: Suturing यहां के बजाय किया जा सकता है । टांके आम तौर पर केवल 3 टांके की आवश्यकता होती है।
    1. संदंश का उपयोग करके, त्वचा के दोनों किनारों को पकड़ें और उन्हें एक साथ और ऊपर की ओर खींचें। माउस पर लगाने से पहले पोंछ पर टिप के अंत में सर्जिकल गोंद की किसी भी बड़ी बूंदों को बंद कर दें।
    2. सर्जिकल गोंद को संयम से लागू करें और त्वचा को 10 एस के लिए संदंश के साथ एक साथ रखें। तब तक जारी रखें जब तक कि कोई दिखाई नहीं दे रहा है।
      नोट: गोंद जल्दी से बाहर आता है - बोतल निचोड़ नहीं है। खोपड़ी के लिए त्वचा चिपका या आंख में गोंद हो रही से बचें।
  9. ग्लूइंग, या टांका लगाने के बाद, माउस को एनेस्थीसिया से ठीक होने के लिए नए पिंजरे में रखें। यह जानवर को ठीक करने के लिए 5-10 मिनट लेता है, और यह एक हीटिंग पैड पर पिंजरे के आधे आराम करने में मदद करता है ।

3. शाम स्ट्रोक ऑपरेशन

  1. रोज बंगाल डाई के बजाय इंजेक्ट 1x पीबीएस या नमकीन को छोड़कर धारा 2 में ऊपर वर्णित ऑपरेशन के लिए सभी प्रक्रियाओं को समान रूप से करें।

4. हाइड्रोजेल या अन्य बायोमैटेरियल्स का इंजेक्शन

  1. उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित समय पर बायोमैटेरियल्स का इंजेक्शन करें। इस प्रयोग में इंजेक्शन 5 और 7 दिनों के बाद स्ट्रोक के बीच किया गया । 2 - हाइड्रोजेल के 6 माइक्रोन इंजेक्ट किए जाते हैं (उपयोगकर्ता-परिभाषित)।
    1. संज्ञाहरण (37 डिग्री सेल्सियस) के दौरान माउस शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड चालू करें।
    2. ऑटोक्लेव कैंची, संदंश, कपास, पशु चिकित्सक आंख मरहम, सर्जिकल गोंद या सीवन सामग्री, और बाँझ शराब और बीटा आयोडीन पोंछे तैयार करें। बाँझ ड्रिल बिट सिर और धातु 30 जी सुइयों के साथ 25 μL ग्लास हैमिल्टन सीरिंज के साथ हड्डी ड्रिल तैयार करें।
    3. चूहों के बीच उपकरणों की नसबंदी के लिए अनुमति देने के लिए मनका नसबंदी को 160 डिग्री सेल्सियस तक चालू करें।
    4. इंजेक्शन पंप को स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस से अटैच करें। प्रवाह दर को 1 μL/min पर सेट करें और वॉल्यूम को 4 माइक्रोन सेट करें।
    5. सर्जरी के बाद चूहों के लिए एक साफ पिंजरे तैयार करें।
  2. माउस को 4% की आइसोफ्लुरेन एकाग्रता के साथ इंडक्शन चैंबर में रखें ताकि इसे तब तक एनेस्थेटाइज किया जा सके जब तक कि सहज आंदोलन बंद न हो जाए और इसकी श्वास धीमी, स्थिर दर पर आ जाए।
    1. एक बार सो जाने के बाद, माउस को 1.5% की रखरखाव आइसोफ्लुनान एकाग्रता के साथ स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस में स्थानांतरित और सुरक्षित करें।
    2. दोनों आंखों पर पशु चिकित्सक आंखों का मरहम लगाएं।
    3. किसी भी फर को शेव करें जो माउस के सिर से फिर से बढ़ सकता है, और बीटा आयोडीन पोंछने के बाद अल्कोहल वाइप का उपयोग करके क्षेत्र तैयार करता है। तीन बार दोहराएं।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो सभी बीटा आयोडीन को साफ करने के लिए अंत में एक अतिरिक्त अल्कोहल वाइप का उपयोग करें क्योंकि यह त्वचा में जलन का कारण बनता है और सर्जरी के बाद चूहों को उनकी खोपड़ी खुजली की ओर ले जाता है।
  3. छोटी कैंची और/या संदंश का उपयोग करना, मस्तिष्क के ऊपर त्वचा को फिर से खोलना । खोपड़ी से किसी भी मलबे को साफ करने के लिए बाँझ नमकीन या पीबीएस के साथ कपास का उपयोग करें। एक सफेद-पीले सर्कल (स्ट्रोक, चित्रा 1B)और ड्रिल से बर्र होल दिखाई देगा। यदि मृत ऊतक दिखाई नहीं देता है, तो संभावना है कि कोई स्ट्रोक नहीं हुआ। यदि बर्र छेद स्ट्रोक के ऊपर केंद्रित नहीं है, तो इसे केंद्र में फिर से ड्रिल करें।
  4. माउस पर इंजेक्शन पंप उन्मुख और 90 डिग्री पर ताला। बैकलोडिंग सामग्री से पहले बाँझ नमकीन या पीबीएस समाधान के साथ सिरिंज को साफ करें।
    1. एक बार साफ होने के बाद कांच की सिरिंज को अलग कर लें ताकि सुई न लगे। हाइड्रोजेल के 10 माइक्रोन (या कोशिकाओं के बिना यहां अन्य बायोमटेरियल) के साथ 25 माइक्रोन सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके सिरिंज को बैकलोड करें।
    2. सिरिंज प्लंजर का उपयोग करके, जेल को सिरिंज के सामने सभी तरह से पुश करें। फिर, सिरिंज को फिर से इकट्ठा करें और तब तक जोर देते रहें जब तक कि जेल सुई से दिख न जाए।
  5. सिरिंज को पंप पर रखें। पंप के पीछे तो सिरिंज फिट बैठता है समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । 30 μL/min करने के लिए प्रवाह दर को समायोजित करके ऐसा करें, वापसी का चयन करें या दिशा यह स्थानांतरित करने की जरूरत के आधार पर सुई, और फिर शुरूप्रेस । जब पंप के पीछे सही स्थान पर है तो स्टॉप मारो।
    1. पंप के पीछे पेंच तो सिरिंज सुरक्षित है। यदि समायोजन पहले किए गए थे, सुनिश्चित करें कि प्रवाह दर 1 μL/min को वापस सेट है और इंजेक्शन के लिए सेट है ।
  6. छेद पर उन्मुख करने के लिए एक्स और वाई दिशा में पंप ले जाएँ। पंप को जेड दिशा में नीचे ले जाएं जब तक कि सिरिंज की सुई छेद के शीर्ष को छू न जाए।
  7. डिजिटल डिस्प्ले कंसोल पर जेड रीसेट करें। इसके बाद सिरिंज को जेड दिशा 0.750 एमएम में नीचे ले जाएं। यदि सिरिंज झुकता है या प्रतिरोध होता है, तो खोपड़ी या तो ठीक हो जाती है या पूरी तरह से ड्रिल नहीं की जाती थी और इसे फिर से ड्रिल करने की आवश्यकता होती है।
  8. 1 μL/मिनट की दर से हाइड्रोजेल के 4-6 माइक्रोन इंजेक्ट करने के लिए पंप कंसोल पर प्रेस स्टार्ट करें।
  9. एक 5 मिनट टाइमर सेट करें जब पंप जेल को क्रॉसलिंकिंग शुरू करने की अनुमति देने के लिए इंजेक्शन देना बंद कर देता है।
  10. 5 मिनट के बाद, धीरे-धीरे जेड नोब को मोड़कर सिरिंज को खींचें। यह देखने के लिए देखें कि क्या कोई सामग्री दुर्घटनापूर्वक खींची गई है या छेद से लीक हो रही है। पंप को अनलॉक करें और इसे माउस से दूर ले जाएं जब सुई खोपड़ी से काफी दूर है।
  11. संदंश, सर्जिकल गोंद, या टांके का उपयोग करना, सिर के ऊपर त्वचा को बंद करें। माउस को साफ पिंजरे में रखें और इसकी वसूली का निरीक्षण करें। संज्ञाहरण से उबरने के लिए माउस के लिए लगभग 5 - 10 मिनट का समय लेना चाहिए।

5. परफ्यूजन और नमूना संग्रह

  1. आइसोफ्लुनाणे का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें।
  2. रीढ़ की स्थिति में जानवर को ठीक करें और एक औसत कटौती के साथ पेट की गुहा खोलें। वैकल्पिक रूप से, कम फिक्सेटिव और पीबीएस का उपयोग करने के लिए उतरते उदर महाधमनी को दबाएं।
  3. डायाफ्राम को खोलें और छाती गुहा को खोलने के लिए रिब पिंजरे के किनारों को ऊपर ले जाएं। बाएं वेंट्रिकल में एक परफ्यूजन कैनुला डालें और दाएं एट्रियम में एक ओपनिंग काटें। पीबीएस के 10-20 मिलीएल के साथ धीरे-धीरे छिद्रित करना शुरू करें या जब तक तरल अर्ध-स्पष्ट नहीं हो जाता है।
  4. एक बार स्पष्ट होने के बाद, एक और 10 - 20 एमएल के लिए 4% पीएफए पर स्विच करें। हथियारों को अनपिन करने से उन्हें पीएफए के संचार के रूप में अनुबंध करने की अनुमति देता है । एक बार जब वे आगे बढ़ना बंद कर देते हैं, तो एक और 30 एस का इंतजार करें।
  5. जानवर को काटना और खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को वापस खींचें। कुंद, पतले संदंश का उपयोग करके, मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी के टुकड़ों को ध्यान से हटा दें। स्ट्रोक साइट के ऊपर खोपड़ी को हटाते समय विशेष सावधानी बरतने की आवश्यकता है। खोपड़ी को काटने में मदद करने के लिए यहां छोटी सर्जिकल कैंची का उपयोग किया जा सकता है। सबसे बड़ी चुनौती जेल खोपड़ी के लिए अटक रही है और खोपड़ी के रूप में मस्तिष्क से बाहर आ रहा है हटा दिया जाता है ।
  6. एक बार मस्तिष्क अलग हो जाने के बाद, रात भर 4% पीएफए के 10 - 15 एमएल (24 घंटे से अधिक नहीं)।
  7. अगले दिन दिमाग को पीएफए से 30% सुक्रोज में ले जाएं। मस्तिष्क एक बार नीचे (लगभग 2 - 3 दिन) तक डूब जाने के बाद क्रायोसेक्शन के लिए तैयार हो जाता है। इसे इस बिंदु पर भंडारण के लिए भी छोड़ा जा सकता है।

6. क्रायोसेक्शनिंग और धुंधला

  1. मस्तिष्क को सुक्रोज से बाहर निकालें और ग्लास स्लाइड पर रखें। एक चक पर घुड़सवार होने के लिए एक फ्लैट हिस्सा बनाने के लिए एक उस्तरा ब्लेड के साथ बंद मस्तिष्क के पीछे का एक छोटा सा हिस्सा काटें।
    1. चक पर इष्टतम कटिंग टेम्परेचर कंपाउंड (OCT) का एक दोकलम रखें, और फिर मस्तिष्क, फ्लैट साइड को नीचे रखें, अक्टूबर में चक पर रखें । इस नमूने को सूखी बर्फ पर जमे हुए या फ्रीजिंग ब्लॉक पर क्रायोस्टेट में रखें ।
      नोट: OCT को पूरी तरह से मस्तिष्क को शामिल करने के लिए जोड़ा जा सकता है ताकि खंड के दौरान सामग्री को मस्तिष्क से अलग होने से रोकने में मदद मिल सके।
  2. 10 जिलेटिन कोटेड स्लाइड्स में 30 माइक्रोन मोटी धाराओं में -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टेट पर दिमाग को क्रमबद्ध रूप से काटें। हाइड्रोगेल को खोने के लिए सुनिश्चित करने के लिए अनुभागिंग करते समय ध्यान रखें। यदि यह हिस्सा मुश्किल है, तो जेल(चित्रा 3)पर मस्तिष्क के शीर्ष पर कुछ OCT रखें। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस से बाहर स्लाइड ले लो और उन्हें सूखने के लिए अनुमति देने के लिए एक धुंधला ट्रे पर जगह है। स्लाइड्स जो जमे हुए नहीं हैं, लेकिन सिर्फ सेक्शन्ड भी तुरंत दाग सकते हैं ।
  4. एक हाइड्रोफोबिक कलम का उपयोग करना, स्लाइड पर मस्तिष्क स्लाइस के चारों ओर एक चक्र आकर्षित । एक बार सूखने के बाद, मस्तिष्क के स्लाइस को 1x फ़िल्टर किए गए पीबीएस के साथ फिर से हाइड्रेट करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक शेखर पर रखें। यह 9 - 12 मस्तिष्क वर्गों के साथ प्रति स्लाइड बफर के बारे में 1 एमएल लेता है।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1x फ़िल्टर पीबीएस के साथ स्लाइड धोएं, तीन बार दोहराएं।
  6. पेट नर्तकी पर कमरे के तापमान पर 0.01% पीबीएस-ट्राइटन एक्स में 10% गधे सीरम के साथ एक घंटे के लिए 30 मिनट के लिए स्लाइड ब्लॉक। यह प्रति स्लाइड लगभग 200 μL लेता है।
  7. 0.01% पीबीएस-ट्राइटन एक्स के साथ 10% गधे सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी को एक शेकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। सही सांद्रता निर्धारित करने के लिए पहले प्राथमिक एंटीबॉडी का परीक्षण करें। यहां GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500)(चित्रा 4)का इस्तेमाल किया गया ।
  8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अगले दिन 1x फ़िल्टर पीबीएस के साथ स्लाइड धोएं, तीन बार दोहराएं।
  9. कमरे के तापमान पर लैब शेकर पर 2 घंटे के लिए 0.01% पीबीएस-ट्राइटन एक्स और डीएपीआई में 10% गधे सीरम में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट। 1:1,000 सभी माध्यमिक और DAPI के लिए इस्तेमाल किया गया था।
  10. 1x फ़िल्टर पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइड धोएं।
  11. अंधेरे में कमरे के तापमान पर वर्गों को सूखने दें। यह 20 मिनट से 4 घंटे तक ले जा सकता है; स्लाइड्स को एक डिसिकेटर में रखने से प्रक्रिया में तेजी आ सकती है।
  12. 50%, 70%, 95%, 100%, और 100% की शराब (1 मिनट प्रति समाधान) की आरोही सांद्रता में निर्जलित स्लाइड।
  13. 1 मिनट के लिए जाइलीन के पहले स्नान में डी-फैट, फिर 5 मिनट के लिए जाइलीन का दूसरा स्नान।
  14. स्लाइड्स को एक-एक करके जल्दी से बाहर निकालें और बढ़ते मीडियम को जोड़ें जबकि ब्रेन सेक्शन जाइलीन के साथ गीले होते हैं । जल्दी से शीर्ष पर एक ग्लास कवरलिप जोड़ें। एक कवर स्लिप का उपयोग करें जो क्रमशः इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली स्लाइड और माइक्रोस्कोप के लिए आवश्यक सही लंबाई और मोटाई की है।
  15. स्लाइड के केंद्र से एक जावक गति में एक पिपेट टिप के साथ धीरे से दबाकर कवरस्लिप के नीचे किसी भी बुलबुले से छुटकारा पाएं। डीपीएक्स को कमरे के तापमान पर अंधेरे में रात भर 4 घंटे के लिए सूखने दें।
  16. स्लाइड्स पर गिरा किसी भी सूखे बढ़ते माध्यम को कुरेदने के लिए रेजर ब्लेड का इस्तेमाल करें। लेंस क्लीनर के साथ स्लाइड नीचे पोंछें। स्लाइड्स में अब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ इमेज किया जा सकता है।
    नोट: इमेजिंग समाप्त होने तक अंधेरे में या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करना सबसे अच्छा है।

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Representative Results

इस विधि का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना था कि स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क में बायोमैटेरियल्स को कैसे इंजेक्ट किया जाए। गुलाब बंगाल के साथ एक फोटोथ्रोम्बोटिक मॉडल और आकार और स्थान दोनों में स्ट्रोक घाव के नियंत्रित अभिविन्यास के लिए 520 एनएम लेजर का उपयोग किया गया था। स्ट्रोक के पांच दिन बाद इंफार्क को सर्जरी(चित्रा 1 बी)और टीटीसी और इमेजिंग आईएचसी दाग स्लाइड्स(चित्रा 2)के दौरान कल्पना की जा सकती है । 2x लेंस के साथ लेजर व्यास में वृद्धि से स्ट्रोक घाव में एक दृश्य वृद्धि होती है जो केवल लेजर (चित्रा 2) के साथ एक 1 मिमी अनुभाग बनाम2.5 मिमीसे अधिक फैला हुआ है। पीटी मॉडल के साथ सर्जरी के दौरान मृत्यु दर शायद ही कभी हुई, 1% से कम, न्यूनतम आक्रामक प्रक्रिया के कारण। सर्जरी के बाद मौत भी कम थी और चूहों के 5% से भी कम में देखा गया था ।

हायलूरोनिक एसिड आधारित हाइड्रोजेल माइक्रोकणाओं (एचएमपीएस) को स्ट्रोक(चित्रा 3)के पांच दिन बाद इंजेक्शन दिया गया था । स्ट्रोक घाव में इंजेक्शन के बाद एचएमपीएस एनीमल एक छिद्रपूर्ण पाड़ के साथ माइक्रोनीनल कणों (एमएपी) के रूप में है जो स्ट्रोक कोर(चित्रा 4)में सेल माइग्रेशन के लिए अनुमति देता है। इंजेक्शन चूहों के दस दिन बाद 4% पीएफए के साथ perfused थे और उनके दिमाग निकाले गए थे, 4% पीएफए में रात भर रखा गया था, और फिर दो दिनों के लिए 30% सुक्रोज में इससे पहले कि वे जमे हुए थे और IHC धुंधला और विश्लेषण के लिए sectioned ।

हमारी प्रयोगशाला में पिछले काम स्ट्रोक घाव में मानचित्र हाइड्रोगेल के इंजेक्शन का प्रदर्शन स्ट्रोक घाव में पांच दिन स्ट्रोक26के बाद । कॉर्टेक्स के मॉड्यूलस से मेल खाने वाले हायलूरोनिक हाइड्रोगेल के इंजेक्शन ने पेरी-इनफार्ट के साथ-साथ मैप जेल के अंदर प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स में काफी कमी की। इसके अलावा, हाइड्रोगेल के भीतर भी माइक्रोग्लिया ने प्रो-रिपेयर M2 मार्कर व्यक्त किए। इससे पता चलता है कि मैप हाइड्रोगेल इंजेक्शन के बाद सिर्फ दो दिनों में एस्ट्रोसाइट रिएक्टिविटी को कम कर सकता है और प्रो-रिकवरी एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया(चित्रा 5)के साथ अधिक विरोधी भड़काऊ वातावरण को बढ़ावा दे सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: ब्रेग्मा का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और स्ट्रोक का स्थानीयकरण। (क)पैरीटल लोब्स ब्रेग्मा बनाने के लिए शीर्ष पर मिलते हैं । लेजर प्लेसमेंट ब्रेग्मा के 2.0 मिमी बाएं केंद्रित था। (ख)स्ट्रोक और बर्र होल की विजुअल फॉर्मेशन स्ट्रोक के 5 दिन बाद देखी गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इनफारेक्ट में फैले कोरोनल सेक्शन। (A)स्ट्रोक के 5 दिन बाद दिमाग के सीरियल आईएचसी सेक्शन, लेजर के साथ स्ट्रोक केवल (ऊपर) और 2x लेंस (नीचे) । स्लाइस पिछले खंड से प्रत्येक खंड 300 माइक्रोन के साथ 30 माइक्रोन मोटी थे। (ख)बढ़े आईएचसी दाग, 500 माइक्रोन स्केल-बार। नाभिक (DAPI) नीले रंग में दिखाया गया है, एस्ट्रोसाइट्स (GFAP +) लाल रंग में, और माइक्रोग्लियल (Iba1 +) हरे रंग में, 4x आवर्धन । (ग)स्ट्रोक के 5 दिन बाद घाव की मात्रा की कल्पना करने के लिए टीटीसी के साथ दाग दिमाग की धाराएं, 1 सेमी स्केलबार के साथ 1 मिमी मोटी धाराएं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: इंजेक्शन और जैव सामग्री का दृश्य। (एक)सर्जरी के दौरान जेल इंजेक्शन का दृश्य। (ख)खोपड़ी को हटाते समय जेल की कल्पना आंखों से की जा सकती थी । (ग)एक बार जमे हुए और घुड़सवार, जेल मस्तिष्क में अनुभागिंग करते समय दिखाई दे रहा था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: केवल हाइड्रोगेल के साथ स्ट्रोक की तुलना में स्ट्रोक के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री दाग। (क)क्रायोस्ेक्शनेड दिमाग की योजनाबद्ध 30 माइक्रोन मोटी। बीच में कई वर्गों छवि विश्लेषण के लिए चुना गया था। (ख)स्ट्रोक केवल, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) स्ट्रोक के 15 दिन बाद दाग । एस्ट्रोसाइट्स (GFAP +) कोशिकाओं को लाल रंग में दिखाया गया है, माइक्रोग्लिया (Iba1 +) हरे रंग के होते हैं, और जहाजों (ग्लूट1 +) सफेद होते हैं। स्ट्रोक + हाइड्रोगेल स्थिति, आईएचसी 10डी पोस्ट इंजेक्शन, स्ट्रोक के 15 दिन बाद। एस्ट्रोसाइट्स (GFAP +) कोशिकाओं को लाल रंग में दिखाया गया है, माइक्रोग्लिया (Iba1 +) हरे रंग के होते हैं, हाइड्रोगेल सामग्री सफेद होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: स्ट्रोक के बाद प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया पर माइक्रोपोरस एनील्ड पार्टिकल हाइड्रोगेल का प्रभाव। (क)प्रायोगिक समयरेखा का योजनाबद्ध जहां तीर स्ट्रोक दिवस का प्रतीक है, + इंजेक्शन दिवस का प्रतीक है, और एक्स बलिदान और विश्लेषण समय बिंदु का प्रतीक है । (ख)विश्लेषण सेटअप की योजनाबद्ध दिखा रहा है जहां वर्गों की छवि और विश्लेषण किया गया । (ग)आईएचसी छवियां पीईआरके, S100b, GFAP के माध्यम से एस्ट्रोसाइट रिएक्टिविटी दिखा रही हैं । (घ)एस्ट्रोसाइट्स के पीईआरके/जीएफएपी प्रतिशत का परिमाणीकरण जो अत्यधिक प्रतिक्रियाशील थे । (ई)एस्ट्रोसाइट्स के S100b/GFAP प्रतिशत का परिमाणीकरण जो अत्यधिक प्रतिक्रियाशील थे । (F)CD11b, Arg1, और iNOS धुंधला के माध्यम से माइक्रोग्लिया प्रतिक्रियाशीलता की आईएचसी छवियां । (जी)माइक्रोग्लियल समर्थक भड़काऊ फेनोटाइप के निर्धारण के लिए आईनोस/डैपी का क्वांटिफिकेशन । (H)माइक्रोग्लियल प्रो-रिपेयर फेनोटाइप के निर्धारण के लिए Arg1/Dapi का क्वांटिफिकेशन । सभी पैमाने पर बार = 100 माइक्रोन। ग्राफपैड चश्मे में सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। * संकेत डेटा Tukey पोस्ट-हॉक परीक्षण और पी<0.05 के साथ एक 95% विश्वास अंतराल का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। व्यक्तिगत पी-मानों ने टी-टेस्ट का संकेत दिया । यह आंकड़ा रेफरी26से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम एक आसानी से प्रजनन योग्य, न्यूनतम आक्रामक, स्थायी स्ट्रोक मॉडल प्रदर्शित करते हैं और स्ट्रोक के पांच दिन बाद इनफाक्ट में बायोमटेरियल इंजेक्ट करने का वर्णन करते हैं। फोटोथ्रोम्बोटिक डाई रोज बंगाल और स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस से जुड़े 520 एनएम कोलिमेटेड लेजर का इस्तेमाल हमें माउस के मोटर कॉर्टेक्स में स्ट्रोक को बढ़ी हुई सटीकता के साथ रखने की क्षमता देता है। स्ट्रोक के पांच दिन बाद, इनफारेक्ट का स्थान विकिरण के केंद्र में आंखों से दिखाई देता है, ब्रेग्मा के लिए 2.0 मिमी मेडियो-पार्श्व। हाइड्रोजेल तो सही सिरिंज पंपों का उपयोग कर स्ट्रोक कोर में इंजेक्शन है । सर्जरी के दौरान और इस मॉडल में स्ट्रोक के बाद मृत्यु दर वस्तुतः अनुपस्थित है, संज्ञाहरण जटिलताओं के कारण सर्जरी के बाद मरने वाले चूहों की केवल एक मुट्ठी भर के साथ। जैव सामग्री अनुप्रयोगों के लिए पीटी स्ट्रोक का उपयोग करने के फायदों के बावजूद, कई जैविक सीमाएं और तकनीकी कठिनाइयां हैं जिन्हें संबोधित किया जाना चाहिए।

जैविक सीमाओं के संदर्भ में, पीटी एक स्ट्रोक मॉडल नहीं है जो सेरेब्रल रिफ्यूजन के लिए विकल्प प्रदान करता है, एक प्रक्रिया जो मानव स्ट्रोक में अनायास या एंडोवैस्कुलर क्लॉट रिट्रीवल/लाइसिस के जवाब में हो सकती है। इसके अतिरिक्त, एमसीएओ मॉडल के विपरीत जो एक प्रमुख सेरेब्रल पोत को ओक्लेड करके अधिकांश मानव स्ट्रोक के एटियोलॉजी की नकल करता है, पीटी कई छोटे जहाजों के माध्यम से रक्त प्रवाह को ख़राब करता है। हाइड्रोजेल बायोमैटेरियल्स इंजेक्शन की एक तकनीकी कठिनाई सर्जरी के दौरान या निकासी के दौरान खोपड़ी के लिए सिरिंज का पालन करने की उनकी प्रवृत्ति है। एक हाइड्रोगेल डिजाइन करना जो इंजेक्शन के दौरान तरल के रूप में रहता है और फिर सीटू में जैल पहले मुद्दे को संबोधित कर सकता है; हालांकि, जेल को ड्यूरा मेटर से चिपके रहने से रोकना अक्सर अपरिहार्य होता है क्योंकि इंजेक्शन साइट और स्ट्रोक कोर मस्तिष्क की सतह पर रहते हैं। इससे बायोमटेरियल को बरकरार रखते हुए ब्रेन टिश्यू निकालना मुश्किल हो सकता है। इस प्रकार, मस्तिष्क से खोपड़ी के टुकड़ों को हटाते समय विशेष सावधानी बरतनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ड्यूरा मेटर खोपड़ी के साथ नहीं उठाता है और अनजाने में जेल को उखाड़ देता है। क्रायोसेक्शनिंग दिमाग को तकनीकी कौशल की भी आवश्यकता होती है क्योंकि हैंडलिंग प्रक्रिया और ब्लेड ट्रांसेक्शन दोनों आसानी से जेल को अपने आसपास के ऊतकों से अलग कर सकते हैं, जिससे सेल घुसपैठ के बारे में डेटा संग्रह सीमित हो जाता है। जब सामग्री ऊतक के साथ पूरी तरह से एकीकृत नहीं होती है तो टुकड़ी को बढ़ा दिया जाता है। OCT के साथ नमूना तैयार करना एक सुदृढीकरण खोल बनाता है जो काटने के दौरान सामग्री अलगाव को कम करने में मदद करता है।

बायोमैटेरियल्स इंजेक्शन लगाने से पहले, हम कृंतक तनाव और प्रयोगशाला सेटअप के आधार पर वांछित स्ट्रोक आकार को अनुकूलित करने की सलाह देते हैं। लेजर आउटपुट तीव्रता, बीम आवर्धन और विकिरण समय: छोटे या बड़े infarcts तीन मुख्य मापदंडों को समायोजित करके किया जा सकता है। स्ट्रोक के आकार को प्रभावित करने के लिए दिखाए गए अन्य कारकों में आइसोफ्लुन19 की एकाग्रता और डाई को विकिरण से पहले प्रसारित करने की अनुमति है। लेजर उत्पादन तीव्रता (बिजली/क्षेत्र या mW/सेमी2)के बारे में, हमने पाया कि 10 mW की एक लेजर शक्ति क्षैतिज व्यास के साथ एक छोटे से infarct का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त था थोड़ा लेजर बीम के लिए छोटा है । उच्च लेजर शक्ति मामूली व्यापक लेकिन काफी गहरी infarcts (डेटा नहीं दिखाया) लेजर बीम एक गॉसियन विकिरण प्रोफ़ाइल होने के कारण मिले । तीव्रता में वृद्धि करके, अधिकतम विकिरण का केंद्र बिंदु खोपड़ी के पिछले गहरे प्रवेश कर सकता है, साथ ही लेजर के स्पॉट आकार प्रवेश में मामूली वृद्धि का कारण बन सकता है। अन्य स्ट्रोक मॉडलों ने कम लेजर तीव्रता20को बनाए रखते हुए प्रकाश प्रवेश और थक्के की बाद की प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए प्रकाश या लेजर लगाने से पहले इसे सैंडिंग करके खोपड़ी को पतला कर दिया है । हालांकि, यह खोपड़ी में रक्तस्राव का कारण बन सकता है और सर्जरी और कौशल के दौरान उचित मात्रा में समय लेता है ताकि इस प्रक्रिया में मस्तिष्क को दुर्घटनापूर्वक नुकसान पहुंचाए बिना मास्टर किया जा सके। तीव्रता के समान, लेजर बीम व्यास में वृद्धि ने भी इनफार्ट आकार में वृद्धि की; हालांकि, लेजर तीव्रता और बीम व्यास एक दूसरे के संबंध में रैखिक पैमाने पर नहीं है, लेकिन समीकरण का पालन करें, बिजली घनत्व = लेजर शक्ति(डब्ल्यू)/2,जहां बीम के त्रिज्या है । विकिरण समय के संदर्भ में, हमने पाया कि प्रजनन योग्य स्ट्रोक प्राप्त करने के लिए न्यूनतम 10 मिनट की आवश्यकता थी। ऊर्ध्वाधर गहराई को स्थिर रखते हुए इनफार्क के क्षैतिज व्यास को बढ़ाने के लिए, हमने लेजर को क्रमिक रूप से 10 मिनट के लिए आसन्न स्थानों पर लागू किया। गुलाब बंगाल के आइसोफ्लुन एकाग्रता और परिसंचरण समय के प्रभाव को दूर करने के लिए, हमने पाया कि आईपी इंजेक्शन के बाद 1.5% आइसोफ्लुरेन एकाग्रता और 7 मिनट परिसंचरण के परिणामस्वरूप स्ट्रोक का लगातार निर्माण हुआ। इन पांच मापदंडों को हमारे विशेष उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। हम व्यवहार परिवर्तन अभी तक सबवेंट्रिकुलर क्षेत्र है, जहां हम तंत्रिका जनक कोशिकाओं पर हमारी सामग्री के प्रभाव का अध्ययन करने के उद्देश्य के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए एक बड़े पर्याप्त स्ट्रोक की आवश्यकता है । स्ट्रोक के आकार के अलावा, हमें इंजेक्शन लगाने के लिए इष्टतम जेल की मात्रा निर्धारित करने की भी आवश्यकता थी। कम से कम, हमें स्ट्रोक गुहा को पूरी तरह से भरने के लिए पर्याप्त जेल की आवश्यकता थी क्योंकि हमने पाया कि जेल और आसपास के ऊतकों के बीच अंतराल हमारे नियंत्रण समूहों के समान परिणामों का कारण बनता है, जबकि जेल और ऊतक के बीच संपर्क के परिणामस्वरूप कम प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स और बढ़ी हुई सेलुलर घुसपैठ हुई। हम जेल के 4-6 माइक्रोन की कम सीमा पर पहुंचे, जिसने इंजेक्शन (अप्रकाशित डेटा) के बाद कोई प्रतिकूल प्रभाव उत्पन्न नहीं किया।

स्ट्रोक के परिणाम का आकलन करने के बारे में आईएचसी स्टेनिंग से परे कई विकल्प हैं, जैसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, व्यवहार परीक्षण, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, और टीटीसी (2,3,5-त्रिफेनिट्राजोलम क्लोराइड) धुंधला। उपयोग में आसानी और तत्काल परिणामों के कारण स्ट्रोक के प्रारंभिक अनुकूलन के लिए टीटीसी का उपयोग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। हमारी प्रयोगशाला में पिछले व्यवहार परीक्षण सिलेंडर परीक्षण/सहज अग्रभाग कार्य, ग्रिड चलने परीक्षण, और पास्ता परीक्षण12, 21कोदेखागया है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रोटारोड परीक्षण पीटी स्ट्रोक विधि लागू होने के बाद व्यवहार परिणामों में महत्वपूर्ण कमी नहीं दिखा (डेटा नहीं दिखाया गया था)। इस प्रकार, व्यवहार परीक्षणों को बहुत जटिल कार्यों का आकलन करना चाहिए जिनके लिए महत्वपूर्ण कॉर्टिकल इनपुट की आवश्यकता होती है।

यहां हमने विकास कारकों या कोशिकाओं के वितरण के बिना स्ट्रोक के बाद हाइड्रोगेल इंजेक्शन की तकनीक का प्रदर्शन किया। हालांकि, हाइड्रोगेल का उपयोग सेल प्रत्यारोपण के साथ-साथ दवा और विकास कारक वितरण के लिए भी किया गया है, और स्ट्रोक के बाद जीव विज्ञान का अध्ययन करने और चिकित्सा के नए तरीकों की जांच करने दोनों के लिए एक मूल्यवान संसाधन साबित हो सकता है। स्ट्रोक के संदर्भ में, हमारी प्रयोगशाला ने गैर-असुरक्षित हायलूरोनिक एसिड हाइड्रोगेल को प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न तंत्रिका जनक कोशिकाओंको 14,18 सांद्रता पर 25,000 कोशिकाओं/ हाइड्रोजेल के उपयोग के परिणामस्वरूप कोशिका व्यवहार्यता और भेदभाव में वृद्धि हुई। अन्य प्रयोगशालाओं ने भी 22-24स्ट्रोक के बाद स्टेम सेल प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल हाइड्रोगेल के जवाब में कोशिका भेदभाव और ऊतक उत्थान में वृद्धि की सूचना दी है । इसके अतिरिक्त, हमने स्ट्रोक के बाद विकास कारकों के साथ हाइड्रोगेल इंजेक्ट किए हैं जो स्ट्रोक13, 14के बाद ऊतक उत्थान और व्यवहार में सुधार का कारणबनतेहैं। सामग्री डिजाइन के संदर्भ में, इंजेक्शन एक मूल्यवान विशेषता है जो आक्रामकता को कम करने का काम करती है; इसलिए, हाइड्रोगेल को स्थिर परिस्थितियों में सोल-जैल (तरल-से-ठोस), कतरनी पतला (जी' > जी" के रूप में तैयार किया जाना चाहिए; प्रवाह के दौरान जी > जी), या दानेदार जैल में बिल्डिंग ब्लॉक शामिल होते हैं जिनका व्यास सुई12, 25,26के आंतरिक व्यास से कमहोताहै। इसके बाद दवाओं या विकास कारकों के प्रसार का परीक्षण करने के लिए अनुकूलन किया जाना चाहिए, सेल सांद्रता, जेल की स्थिति और इंजेक्शन मापदंडों की एक श्रृंखला के तहत सेल व्यवहार्यता, जैसे गति, सुई गेज, इंजेक्शन गहराई, और इंजेक्शन के दिन के सापेक्ष जब स्ट्रोक प्रेरित किया गया था। उदाहरण के लिए, सामग्री इंजेक्शन का दिन स्ट्रोक के बाद एक दिन से लेकर, जब तक तीन सप्ताह के बाद स्ट्रोक27,28है । यहां, हम पांच दिन की रिपोर्ट लेकिन पहले स्ट्रोक के बाद सात दिन इंजेक्शन जब कोशिकाओं प्रत्यारोपण । इन दिनों को भड़काऊ प्रतिक्रिया की समय रेखा के साथ - साथ एंजियोजेनेसिस और न्यूरोजेनेसिस की चोटी की गतिविधि के आधार पर चुना गया था , जो स्ट्रोक 5,29,30,31के एक सप्ताह बाद देखी गई थी । वॉल्यूम लक्षण वर्णन भी हर इंजेक्शन समय बिंदु पर किया जाना चाहिए, के रूप में स्ट्रोक की मात्रा शोष के कारण समय के साथ कम हो जाएगा । यह देखते हुए कि इन मापदंडों इंजेक्शन से पहले अनुकूलित कर रहे हैं, यहां तरीकों के लिए उपयोगकर्ताओं को कोशिकाओं और/या विकास कारकों और दवाओं के अलावा के साथ बायोमैटेरियल्स सुई मार्गदर्शन करने के लिए पर्याप्त हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि टीएस टेम्पो चिकित्सा विज्ञान में एक संस्थापक है, जो मानचित्र हाइड्रोगेल का व्यावसायीकरण करना चाहता है ।

Acknowledgments

हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक फॉर फंडिंग (R01NS079691) को स्वीकार करना पसंद करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Normal Goat Serum VWR 100504-028 For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium Medline MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle Fishcer Scientific 14824663 Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette Gilson M-25
2x Beam Expander, 400-650nm Thorlabs GBE02-A Laser beam expander
Adjustable Stage Platform Kopf Instruments 901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit Abcam ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat abcam ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" Medsupply 367294 For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil Thorlabs BKF12 To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" Sklar surgical instruments 64-2035
C57BL/6 Mice Jackson Laboratory 000664 8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob Thorlabs ER3-P4 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter Fine Science Tools 19007-05 For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate VWR EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers Thorlabs CLD1010LP
Cotton Swabs VWR 89031-288
CP 25 pipette tips Gilson F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488) abcam ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) abcam ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) abcam ab150154
EMS DPX Mountant Elecron Microscopy Sciences 13512 Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom Electron Microscopy Sciences 16564 For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 45 PFA
ESD Worstation kit Elmstat WSKK5324SB Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded Thorlabs HCA3 Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort Thorlabs PAF-X-5-A FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm Fine Science Tools 14028-10
GFAP Antibody, rat Thermo Fisher Scientific 13-0300
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000 For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center VetEquip 901808
Iodine Prep Pads Medx Supple MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5 GFS chemicals 46085
Laser Safety Glasses Thorlabs LG10B Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck United Scope LED-11C
Medical USP Grade Oxygen Airgas OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade Intefra Miltex V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer Harvard aparatus 72-6110
Mini-pump variable flow Thomas Scientific 70730-064 Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm Kent Scientific RBMA-200c For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder Kopf Instruments 923-B
Nanojet Control Box Chemyx 10050
Nanojet pump header Chemxy 10051 Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch Fishcer Scientific NC9459562
Non-rupture ear bars 60º Kopf Instruments 922
PBS buffer pH 7.4 VWR 97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin Thorlabs LP520-MF100
Positive charge glass slides Hareta AHS90-WH
Power engergy meter Thorlabs PM100D Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment Dr. Foster Smith 9N-76855
Rectal Probe Mouse kopf Instruments Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95% Sigma-Aldrich 330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth Kopf Instruments 1770-02 For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor Thorlabs S130VC Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining Thorlabs CP02 For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL VWR 10002-726 To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System Simport Scientific M920-2 For staining slides
Sterotaxic device Kopf Instruments 940 Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1x2 teeth Fine Science Tools 91127-12
Student Fine Forceps - straight/broad Shanks Fine Science Tools 91113-10
Temperature Controller Kopf Instruments TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound VWR 25608-930
Triton X-100 VWR 97063-864
Upper Bracket Clamp Kopf Instruments 1770-c For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL Santa Cruz Biotechnology sc-361931
Vogue Professional My Manicurist Bargin Source 6400 For Burrs
VWR Bead Sterilizers VWR 75999-328
Tissue Tek OCT compound Sakura 4583 For tissue embeding

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References

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जीव विज्ञान अंक 164 स्ट्रोक फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक बायोमैटेरियल्स हाइड्रोजेल इंजेक्शन हाइड्रोगेल हाइड्रोजेल मचान न्यूरोबायोलॉजी बायोमेडिकल इंजीनियरिंग
स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क को हाइड्रोजेल बायोमटेरियल मचान का इंजेक्शन
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Wilson, K. L., Carmichael, S. T.,… More

Wilson, K. L., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke. J. Vis. Exp. (164), e61450, doi:10.3791/61450 (2020).

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