Summary
O AVC é um problema global com opções mínimas de tratamento e nenhuma terapia clínica atual para regenerar o tecido cerebral perdido. Aqui descrevemos métodos para criar um derrame fototrombótico preciso no córtex motor de roedores e posterior injeção de biomateriais de hidrogel para estudar seus efeitos na regeneração tecidual após o acidente vascular cerebral.
Abstract
O AVC é a principal causa de incapacidade e a quinta principal causa de morte nos Estados Unidos. Aproximadamente 87% de todos os derrames são derrames isquêmicos e são definidos como o bloqueio repentino de um vaso que fornece sangue ao cérebro. Poucos minutos após o bloqueio, as células começam a morrer e resultam em danos irreparáveis aos tecidos. Os tratamentos terapêuticos atuais se concentram na remoção do coágulo ou na lise para permitir a reperfusão e prevenir danos cerebrais mais graves. Embora a plasticidade cerebral transitória possa salvar parte do tecido danificado ao longo do tempo, frações significativas de pacientes são deixadas com déficits neurológicos que nunca se resolverão. Faltam opções terapêuticas para tratar déficits neurológicos causados pelo AVC, enfatizando a necessidade de desenvolver novas estratégias para tratar essa crescente população de pacientes. Os biomateriais injetáveis estão sendo projetados para melhorar a plasticidade cerebral e melhorar o reparo endógeno através da entrega de agentes ativos ou células-tronco. Um método para testar essas abordagens é utilizar um modelo de curso de roedor, injetar o biomaterial no núcleo do traçado e avaliar o reparo. Saber a localização precisa do núcleo do avc é imperativo para o tratamento preciso após o derrame, portanto, um modelo de derrame que resulte em um local previsível de derrame é preferível para evitar a necessidade de imagem antes da injeção. O protocolo a seguir abordará como induzir um derrame fototrombótico, como injetar um hidrogel de forma controlada e precisa, e como extrair e criosecção do cérebro enquanto mantém o bioma material intacto. Além disso, vamos destacar como esses mesmos materiais de hidrogel podem ser usados para a co-entrega de células-tronco. Este protocolo pode ser generalizado para o uso de outros biomateriais injetáveis no núcleo do traçado.
Introduction
O AVC é a principal causa de incapacidade e a quinta principal causa de morte nos Estados Unidos1. Aproximadamente 87% de todos os derrames são isquêmicos, enquanto a maioria dos 13% restantes são hemorrágicos2. Um derrame isquêmico é definido como o bloqueio do fluxo sanguíneo em uma artéria para o tecido circundante. Essa oclusão resulta em privação de oxigênio e necrose subsequente que muitas vezes leva à incapacidade permanente em pacientes sobreviventes. Embora tenha havido uma diminuição na taxa de mortalidade por acidente vascular cerebral3, espera-se que sua prevalência aumente para 3,4 milhões de pessoas até 20304. Esse aumento de sobreviventes com deficiência e consequente carga econômica levou a um impulso para a pesquisa de derrame que se concentra em mecanismos de reparação neural. Após o AVC há um período inflamatório que leva à formação de uma cicatriz que impede a expansão da região necrótica. A região em torno do núcleo necrosado é chamada de "peri-infarto" e há fortes evidências de que a plasticidade nesta região, que inclui o aumento da angiogênese, neurogênese e broto axonal, está diretamente ligada à recuperação observada em modelos animais e humanos5. Como não existem modelos in vitro que possam replicar adequadamente as interações complexas após o AVC, os modelos animais são essenciais para a pesquisa de avc.
Existem vários modelos in vivo que podem ser usados para produzir derrame isquêmico. Um dos modelos mais comuns utilizados em camundongos é a oclusão da artéria cerebral média, ou MCAo, através da oclusão distal ou proximal (via filamento intra-arterial). O modelo proximal, também conhecido como filamento MCAo (fMCAo), normalmente resulta em grandes derrames isquêmicos que abrangem entre 5% e 50% do hemisfério cerebral, dependentes do número de fatores6. Nesses modelos, uma sutura ou filamento é avançada da artéria carótida interna para a base da artéria cerebral média (MCA) e mantida no lugar por um período específico de tempo. Este método de oclusão, que pode ser feito temporário ou permanente, produz um infarto centrado no estriado e pode ou não envolver o córtex6. O tamanho resultante do acidente vascular cerebral é altamente variável, e técnicas de imagem, como doppler laser, são necessárias para confirmar a eficácia do procedimento em cada rato. A oclusão de filamento intra-arterial ou intra-luminal que dura mais de 30 minutos produz traços na extremidade maior da faixa de tamanho. Alguns investigadores se concentraram em tempos de oclusão de filamentos mais curtos, que requerem foco experimental substancial e validação laboratorial7. Os modelos de Filamento MCAo em camundongos seguem estágios semelhantes de morte celular, progressão isquêmica e formação de uma região peri-infarto, como visto em casos de derrame humano; no entanto, os derrames maiores se assemelham mais ao estado da doença de infartos cerebrais malignos, que são menos comuns, menos tratáveis derrames humanos6. Enquanto isso, a oclusão distal da MCA requer uma cirurgia mais envolvida e craniectomia. Neste modelo, a parte distal do MCA que corre ao longo da superfície do cérebro é diretamente ocluída com uma gravata de sutura ou cauterização. Em algumas variações da técnica, as artérias carótidas são unilateralmente ou transitoriamente ocluídas bilateralmente. Um benefício do MCAo distal é que ele produz um curso de base cortical que é menos variável em tamanho do que o modelo de filamento. No entanto, o modelo distal produz uma produção comportamental mais pobre devido à transeção da artéria carótida externa (ECA), que também é uma preocupação com o FMCAo6.
Um modelo alternativo de avc que é conhecido por ser menos invasivo é o modelo fototrombótico (PT). O modelo PT resulta em um local bem definido de isquemia e está associado a uma alta taxa de sobrevivência8. A técnica conta com um corante fotosensitivo injetado intraperitoneally que permite a fotoper oxidação intravascular simplesmente irradiando o tecido desejado com uma luz ou laser9. Após a excitação, forma-se radicais de oxigênio que causam danos endoteliais, que ativam a agregação de plaquetas e a formação de coágulos na área irradiada8,9. O controle rigoroso sobre o tamanho e a localização do traçado, bem como a alta reprodutibilidade do modelo PT, torna-o ideal para estudar biomateriais. Embora a precisão seja possível usando um laser e coordenadas estereotaxas, existem algumas desvantagens que podem tornar este modelo menos ideal para poucos estudos. Ao contrário do modelo fMCAo, o modelo de traçado PT não pode ser reperrido. Portanto, materiais para investigar agentes neuroprotetores específicos para danos após a reperfusão ou os mecanismos após a reperfusão não seriam úteis aqui8. Além disso, devido ao insulto microvascular do modelo PT, é vista penumbra isquêmica relativamente pequena. Em vez disso, ocorre o edema vasogênico local, que não é característico do AVC humano, tornando este modelo indesejável para estudos de drogas pré-cínicas focados na área peri-infarto6,8.
O objetivo geral das estratégias de biomateriais no AVC é entregar agentes bioativos ou atuar como uma matriz extracelular substituta para o crescimento do tecido cerebral. Uma estratégia que vamos explorar usando nossos métodos é entregar hidrogel diretamente no núcleo do avc, em oposição ao tecido peri-infarto onde muitas terapias celulares atuais são fornecidas10. A justificativa para essa abordagem é que o parto no tecido necrosado encontrado no núcleo evitará interromper o tecido saudável ou em recuperação do ambiente. Assumimos que a difusão de quaisquer agentes ativos incluídos no bioma material será capaz de atingir o peri-infarto do núcleo, especialmente porque descobrimos que a entrega de biomateriais de hidrogel reduz a espessura da cicatrizgliaria 11. Isso é importante, uma vez que a região peri-infarto tem sido mostrada para exibir neuroplasticidade após o AVC, tornando-se um alvo atraente. Além disso, a entrega de uma matriz substituta ao núcleo do avc pode ser carregada com12 ou13 fatores angiogênicos para orientar a formação de novos tecidos, bem como células para o parto14. A entrega celular é muito aprimorada usando uma matriz porque protege as células das duras forças de injeção e do ambiente local presentes durante a entrega, além de incentivar a diferenciação e o enxerto15.
Esses biomateriais terapêuticos injetáveis têm relevância clínica nas aplicações do AVC, pois atualmente não existem terapias médicas que estimulem a recuperação neuronal após o AVC. Os circuitos neurais subjacentes envolvidos na recuperação estão no tecido cerebral adjacente ao núcleo do traçado16,enquanto o próprio núcleo do derrame é desprovido de tecido neural viável. Prevemos que a entrega de um biomamaterial no núcleo do avc necrosado tem potencial para estimular o tecido adjacente em direção a processos regenerativos através de uma série de mecanismos mencionados anteriormente, incluindo a liberação de fatores de crescimento13,estimulação do tecido em crescimento e promoção da recuperação do desenvolvimento do tecido cerebral11,12, alteração das respostas imunes17, e entrega de terapêuticas derivadas de células-tronco14, 18. No entanto, para estudar efetivamente a possibilidade dessas aplicações, é necessário um método consistente e reprodutível para induzir derrame e injetar biomateriais. O modelo de traçado PT utiliza técnicas que oferecem controle preciso sobre a orientação e localização do curso. Um laser ligado ao dispositivo estereotaxic guia orientações, e bombas ligadas aos dispositivos estereotaxicos controlam a taxa de injeção do material sem a necessidade de formas adicionais de imagem. Por isso, optamos por descrever os métodos para a realização de um AVC PT nos córtex motor de camundongos e para injetar biomateriais no núcleo do curso. Aqui, usamos hidrogéis de partículas recadas microporosas (MAP) como o biomamaterial para injeção sem células adicionadas ou fatores de crescimento. Além disso, explicamos como recuperar com sucesso o cérebro com biomaterial intacto, e discutimos ensaios de imunoquímica usados para analisar o resultado do derrame com e sem injeção de biomateriais.
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Protocol
Os experimentos foram realizados de acordo com o IUCAC na Duke University e na University of California Los Angeles. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57Bl/6J masculinos de 8 a 12 semanas. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água. Os protocolos de analgesia e sedação são descritos como aprovados pelo IUCAC, mas podem diferir dos protocolos utilizados em outros laboratórios.
Os animais podem ser prematuramente eutanizados se experimentarem inquietação excessiva, vocalização (indicando dor incontrolável), autotraímento, mobilidade reduzida ou prejudicada, sinais físicos de infecção dérmica, perda de apetite e/ou perda de peso superior a 10%-15% como resultado da cirurgia de sobrevivência. Não há efeitos adversos antecipados da injeção do gel, pois é composto por um polímero que ocorre naturalmente dentro do cérebro. Os animais devem ser monitorados diariamente, incluindo fins de semana e feriados, e ressarcidos a cada dois dias. Estudos do nosso laboratório e de outros não encontraram déficits no preparo, perda de peso corporal ou sinais/sintomas de abstinência ou estresse crônico em camundongos após esses pequenos derrames corticais ou subcorticais. Se os animais apresentarem algum sinal de infecção local na cabeça, eles devem ser eutanizados. Os animais também devem ser monitorados por mau preparo, condição de ferimentos e evidências de luta entre animais (feridas nas costas). Se houver evidências de luta ou desamscência de feridas, os animais devem primeiro ser tratados após o contato com os veterinários. Isso muitas vezes envolve antibiótico na água e/ou aplicação de antibióticos tópicos locais. Se essas medidas não produzirem cura, os animais devem ser eutanatizados.
1. Preparação de materiais e instrumentos
- Prepare o corante fototrombótico antes da cirurgia. Pese 15 mg de Rose Bengala em um tubo de microcentrifus de 2 mL.
ATENÇÃO: Rose Bengala pode causar sérios danos oculares/irritação.- Dissolva a Bengala Rosa em 1,5 mL de PBS filtrado estéril para fazer uma concentração de trabalho de 10 mg/mL.
- Vórtice do tubo até que nenhum aglomerado seja visível, indicando que o corante se dissolveu completamente, depois cubra em papel alumínio até que use mais.
NOTA: A quantidade de corante necessária dependerá do número de ratos. O corante é injetado intraperitoneally IP a uma concentração de 10 μL/g, por exemplo, 200 μL para um mouse de 20 g.
- Ligue a almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do rato durante a anestesia (37 °C).
- Prepare tesouras autoclavadas, fórceps, algodão, pomada ocular veterinária, cola cirúrgica ou material de sutura, um marcador cirúrgico azul ou preto, e álcool estéril e lenços de iodo beta. Prepare a broca óssea com cabeças de broca esterilizadas.
- Ligue a esterilização das contas a 160 °C para permitir a esterilização de instrumentos entre a cirurgia dos camundongos. Reserve um tubo cônico de 50 mL de solução salina estéril ou 1x PBS para posterior utilização na manutenção de uma área de operação hidratada.
- Conecte o laser ao dispositivo estereotaxico. Usando óculos de segurança a laser, meça o poder do laser (mW).
ATENÇÃO: Use óculos de segurança a laser sempre que o laser estiver ligado no procedimento.- Ajuste a corrente no console a laser, seguindo as instruções de fabricação a laser, até que a saída de energia a laser leia 10 mW, e defina a corrente como um pré-definido no console de tela inicial. Em seguida, ajuste a corrente novamente para estabelecer outro pré-definido onde a potência de saída do laser lê 40 mW. Agora desligue o laser até que use mais.
NOTA: Os 10 mW serão usados para orientar o laser antes de ser utilizado.
- Ajuste a corrente no console a laser, seguindo as instruções de fabricação a laser, até que a saída de energia a laser leia 10 mW, e defina a corrente como um pré-definido no console de tela inicial. Em seguida, ajuste a corrente novamente para estabelecer outro pré-definido onde a potência de saída do laser lê 40 mW. Agora desligue o laser até que use mais.
- Prepare uma gaiola limpa para ratos após a cirurgia. Em seguida, coloque o rato na câmara de indução com uma concentração isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo pare e sua respiração chegue a uma taxa lenta e constante.
- Uma vez dormindo, pese o rato para determinar quanto corante Rose Bengala injetar. Em seguida, transfira e fixe o mouse para o dispositivo estereotaxico com uma concentração de isoflurane de manutenção de 1,5%.
NOTA: O aumento das concentrações de isoflurane pode dilatar os vasos e evitar oclusão suficiente ou derrames consistentemente dimensionados entre camundongos. - Aplique pomada ocular veterinária em ambos os olhos.
NOTA: Observe a respiração e a temperatura durante todo o procedimento e belisque os dedo dos dedo ocasionalmente para garantir que o mouse não possa sentir nada.
2. Traço fototrombótico modelo9
- Raspe a pele da cabeça do rato e prepare asepticamente a área usando um lenço de álcool seguido de uma limpeza beta de iodo. Repita três vezes.
NOTA: Se necessário, use um lenço de álcool extra no final para limpar todo o iodo beta, pois causa irritação na pele que leva os ratos a coçar o crânio após a cirurgia. - Usando uma tesoura de pequeno funcionamento, faça uma incisão lateral entre as orelhas até os olhos, cerca de 1-2 cm. Faça isso puxando a pele para cima com fórceps para criar uma tenda, cortando uma vez para baixo, em seguida, inserindo a tesoura na abertura e criando uma incisão contínua da linha média.
- Separe a pele e pressione levemente os ossos parietal com os fórceps para localizar o bregma. Marque o bregma com um ponto usando o marcador cirúrgico.
NOTA: O movimento do fragmento ósseo destaca a borda frontal dos ossos parietais. O bregma é o ponto central em que os fragmentos ósseos frontal e pariário se encontram(Figura 1A). - Usando óculos de segurança laser, mova o laser sobre o crânio do mouse, fixando o dispositivo estereotaxico em um ângulo de 90°. Selecione o pré-configurado de 10 mW e ligue o laser.
- Ajuste o eixo x e y do laser até que ele esteja diretamente sobre o bregma. Reinicie o x e o y no console de exibição digital e, em seguida, mova o laser 1,8 mm à esquerda do bregma. Agora traga o laser o mais perto possível do crânio sem deixá-lo tocar o crânio.
- Mova o laser para 2,2 mm à esquerda da bregma para garantir que ele possa se mover sem quaisquer obstruções. Desligue o laser.
- Injete a quantidade apropriada de corante rose bengala intraperitoneally (IP) usando uma agulha descartável de 29 G. Inicie imediatamente um temporizador de 7 minutos para permitir que o corante circule sistemicamente. Selecione o pré-definido por 40 mW sem ligar o laser.
NOTA: Uma vez confortável com o procedimento, o corante pode ser injetado antes da preparação asséptica do mouse e terminado antes que os 7 minutos acabem para economizar tempo. - Ligue o laser (40 mW) quando o temporizador de 7 minutos explodir, enquanto usa óculos de segurança a laser, e defina um temporizador de 10 minutos.
- Depois de 10 min, mova o laser para 2,2 mm à esquerda da bregma sem desligá-lo, e afina mais 10 minutos de temporizador.
- Uma vez que o segundo temporizador de 10 minutos tenha desligado, mude o laser de volta para 10 mW e mova o laser para 2,0 mm à esquerda do bregma. Marque este lugar com o marcador cirúrgico. Em seguida, desligue o laser.
- Levante o laser e desbloqueie-o do ângulo de 90° para que ele possa ser removido do mouse. Neste ponto, aplique o soro fisiológico estéril ou PBS com algodão se a área cirúrgica estiver seca.
- Perfurar em pequenas rajadas na marca de 2,0 mm perpendicular à superfície do crânio.
NOTA: Tenha cuidado para perfurar lentamente para evitar perfurar muito profundamente e atingir o cérebro. Haverá uma leve queda/mudança na resistência uma vez que a broca tenha atravessado o crânio, e a perfuração pode causar sangramento.- Use algodão para absorver qualquer excesso de sangue. É típico ver algum sangue de artérias cortadas no crânio após a perfuração – sangue excessivo significa que a broca atingiu o cérebro. Se isso acontecer, grave o identificador do mouse e siga em frente.
- Coloque uma pequena limpeza ao lado do mouse. Usando os fórceps, puxe a pele para perto para se preparar para a colagem.
NOTA: A sutura pode ser feita aqui em vez disso. A sutura normalmente requer apenas 3 suturas.- Usando os fórceps, pegue os dois lados da pele e puxe-os juntos e para cima. Desarme-se em gotas grandes de cola cirúrgica na extremidade da ponta na limpeza antes de aplicar no mouse.
- Aplique a cola cirúrgica com moderação e segure a pele junto com fórceps por 10 s. Continue até que não haja aberturas visíveis.
NOTA: A cola sai rapidamente – não aperte a garrafa. Evite colar a pele no crânio ou colocar cola no olho.
- Depois de colar, ou suturar, coloque o rato na nova gaiola para se recuperar da anestesia. Leva de 5 a 10 minutos para o animal se recuperar, e ajuda a descansar metade da gaiola em uma almofada de aquecimento.
3. Operação de traçado falso
- Realize todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima na seção 2, exceto injetar 1x PBS ou soro fisiológico em vez de corante rose bengala.
4. Injeção de hidrogel ou outros biomateriais
- Realize a injeção de biomateriais em um momento definido pelo usuário. Neste experimento foram realizadas injeções entre 5 e 7 dias após o derrame. 2 - 6 μL de hidrogel são injetados (definido pelo usuário).
- Ligue a almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo do rato durante a anestesia (37 °C).
- Prepare tesouras autoclavadas, fórceps, algodão, pomada ocular veterinária, cola cirúrgica ou material de sutura, e álcool estéril e lenços beta iodo. Prepare a broca óssea com cabeças de broca estéreis e as seringas Hamilton de vidro de 25 μL com agulhas metálicas de 30 G.
- Ligue a esterilização das contas a 160 °C para permitir a esterilização de instrumentos entre camundongos.
- Conecte as bombas de injeção ao dispositivo estereotaxico. Defina a vazão para 1 μL/min e ajuste o volume para 4 μL.
- Prepare uma gaiola limpa para os ratos depois da cirurgia.
- Coloque o rato na câmara de indução com uma concentração isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo pare e sua respiração chegue a uma taxa lenta e constante.
- Uma vez dormindo, transfira e fixe o mouse para o dispositivo estereotaxico com uma concentração de isoflurane de manutenção de 1,5%.
- Aplique a pomada ocular veterinária em ambos os olhos.
- Raspe qualquer pele que possa ter recreado da cabeça do rato, e prepare aseticamente a área usando um lenço de álcool seguido de uma limpeza beta de iodo. Repita três vezes.
NOTA: Se necessário, use um lenço de álcool extra no final para limpar todo o iodo beta, pois causa irritação na pele e leva os ratos a coçar o crânio após a cirurgia.
- Usando a tesoura pequena e/ou fórceps, reabra a pele acima do cérebro. Use algodão com soro fisiológico estéril ou PBS para limpar quaisquer detritos do crânio. Um círculo branco-amarelo (o traçado, Figura 1B) e o orifício de rebarba da broca serão visíveis. Se o tecido morto não for visível, provavelmente não ocorreu nenhum derrame. Se o orifício da rebarba não estiver centrado acima do traçado, refira-se para centralizar.
- Oriente a bomba de injeção sobre o mouse e bloqueie a 90°. Limpe a seringa com solução salina estéril ou PBS antes de recarregar o material.
- Uma vez limpo, desmonte a seringa de vidro para que não haja agulha. Encarregar a seringa usando uma pipeta de deslocamento positivo de 25 μL com o 10 μL de hidrogel (ou outro biomaterial aqui com ou sem células).
- Usando o êmbolo da seringa, empurre o gel até a frente da seringa. Em seguida, remonte a seringa e continue empurrando até que o gel exale visivelmente da agulha.
- Coloque a seringa na bomba. A parte de trás da bomba pode precisar ser ajustada para que a seringa se encaixe. Faça isso ajustando a taxa de fluxo para 30 μL/min, selecione Retirada ou Inje, dependendo da direção que precisa mover e pressione Iniciar. Aperte Stop quando a parte de trás da bomba estiver no local correto.
- Enrosque a parte de trás da bomba para que a seringa esteja segura. Se os ajustes foram feitos anteriormente, certifique-se de que a taxa de fluxo seja fixada para 1 μL/min e esteja definida para injetar.
- Mova a bomba na direção x e y para orientá-la sobre o orifício. Mova a bomba para baixo na direção z até que a agulha da seringa toque a parte superior do orifício.
- Reinicie o z no console de exibição digital. Em seguida, mova a seringa para baixo na direção z 0,750 mm. Se a seringa se curva ou há resistência, o crânio ou curado ou não foi completamente perfurado e precisa ser re perfurado.
- Pressione Inicie o console da bomba para injetar 4 - 6 μL do hidrogel a uma taxa de 1 μL/min.
- Defina um temporizador de 5 minutos quando a bomba parar de injetar para permitir que o gel comece a se cruzar.
- Depois de 5 minutos, puxe lentamente a seringa girando o z nob. Observe para ver se algum material é acidentalmente puxado ou vazando do buraco. Desbloqueie a bomba e mova-a para longe do rato quando a agulha estiver longe o suficiente do crânio.
- Usando fórceps, cola cirúrgica ou suturas, feche a pele acima da cabeça. Coloque o mouse na gaiola limpa e observe sua recuperação. Deve levar cerca de 5 a 10 minutos para o rato se recuperar da anestesia.
5. Perfusão e coleta de amostras
- Anestesiar o rato usando isoflurano.
- Fixar o animal na posição supina e abrir a cavidade abdominal com um corte mediano. Opcionalmente, aperte a aorta abdominal descendente para usar menos fixação e PBS.
- Abra o diafragma e mova as laterais da caixa torácica para abrir a cavidade torácica. Insira uma cânula de perfusão no ventrículo esquerdo e corte uma abertura no átrio direito. Comece a perfundir lentamente com 10-20 mL de PBS ou até que o líquido seja semi-claro.
- Uma vez claro, mude para 4% PFA para outros 10 – 20 mL. Desempinar as armas permite que eles contraam à medida que o PFA infunde. Assim que pararem de se mover, esperem mais 30.
- Decapitar o animal e puxar a pele para expor o crânio. Usando fórceps finos e bruscos, remova cuidadosamente os pedaços do crânio para expor o cérebro. Cuidados especiais devem ser tomados ao remover o crânio acima do local do derrame. Uma pequena tesoura cirúrgica pode ser usada aqui para ajudar a cortar o crânio. O maior desafio é gel ficar preso ao crânio e sair do cérebro quando o crânio é removido.
- Uma vez que o cérebro é destacado, coloque em 10 - 15 mL de 4% PFA durante a noite (não mais do que 24 horas).
- Mova os cérebros da PFA para 30% de sacarose no dia seguinte. O cérebro está pronto para a crioseção uma vez que afunda até o fundo (cerca de 2 a 3 dias). Ele também pode ser deixado para armazenamento neste momento.
6. Criosectioning e coloração
- Tire o cérebro da sacarose e coloque em uma lâmina de vidro. Corte uma pequena parte da parte de trás do cérebro com uma lâmina de barbear para criar uma porção plana para ser montada em um mandril.
- Coloque um montão de composto de temperatura de corte ideal (OCT) no mandril e, em seguida, coloque o cérebro, lado plano para baixo, sobre o mandril no OCT. Coloque este espécime em gelo seco até congelar ou no criostat no bloco de congelamento.
NOTA: O OCT pode ser adicionado para abranger totalmente o cérebro para ajudar a evitar que o material se separe do cérebro durante a secção.
- Coloque um montão de composto de temperatura de corte ideal (OCT) no mandril e, em seguida, coloque o cérebro, lado plano para baixo, sobre o mandril no OCT. Coloque este espécime em gelo seco até congelar ou no criostat no bloco de congelamento.
- Corte os cérebros em série em um criostat a -20 °C a 30 μm de espessura em 10 lâminas revestidas de gelatina. Tome cuidado ao seção garantindo não perder o hidrogel. Se essa parte for difícil, coloque algum OCT na parte superior do cérebro sobre o gel(Figura 3). Armazene a -80 °C até que use mais.
- Tire lâminas do -80 °C e coloque em uma bandeja de coloração para permitir que elas sequem. Slides que não foram congelados, mas apenas seccionados também podem ser manchados imediatamente.
- Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe um círculo em torno das fatias cerebrais no escorregador. Uma vez seco, reidratar as fatias cerebrais com PBS filtrado de 1x e coloque em um agitador à temperatura ambiente por 15 minutos. Isso leva cerca de 1 mL de tampão por slide com 9 - 12 seções cerebrais.
- Lave os slides com PBS filtrado de 1x por 5 minutos à temperatura ambiente, repita três vezes.
- Bloqueie slides por 30 minutos a uma hora com soro de burro de 10% em 0,01% PBS-Triton X à temperatura ambiente na dançarina do ventre. Isso leva cerca de 200 μL por slide.
- Incubar o anticorpo primário em 10% de soro de burro com 0,01% PBS-Triton X durante a noite a 4°C em um shaker. Teste os anticorpos primários primeiro para determinar as concentrações corretas. Aqui foram utilizados GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Figura 4).
- Lave slides com PBS filtrado de 1x no dia seguinte por 5 minutos em temperatura ambiente, repita três vezes.
- Incubar com anticorpo secundário em 10% de soro de burro em 0,01% PBS-Triton X e DAPI por 2 h no agitador de laboratório à temperatura ambiente. 1:1.000 foi usado para todos os secundários e DAPI.
- Lave os slides por 5 minutos com PBS filtrado de 1x.
- Deixe que as seções sequem à temperatura ambiente no escuro. Isso pode levar de 20 min a 4 h; colocar os slides em um desiccator pode acelerar o processo.
- Desidratar slides em concentrações ascendentes de álcool (1 min por solução) de 50%, 70%, 95%, 100% e 100%.
- Desonera no primeiro banho de xileno por 1 min, depois segundo banho de xileno por 5 minutos.
- Retire rapidamente os slides um por um e adicione o meio de montagem enquanto as seções cerebrais estão molhadas com xileno. Adicione rapidamente uma mancha de vidro por cima. Use um deslizamento de tampa que seja de comprimento e espessura corretos necessários para o slide e microscópio utilizados para imagens, respectivamente.
- Livre-se de qualquer bolha sob o deslizamento, pressionando suavemente com uma ponta de pipeta em um movimento externo do centro do slide. Deixe que o DPX seque por 4h a noite no escuro à temperatura ambiente.
- Use uma lâmina de barbear para raspar qualquer meio de montagem seco que derramou sobre os slides. Limpe os slides com o limpador de lentes. Slides agora podem ser imagens com microscopia de fluorescência.
NOTA: É melhor armazenar o slide no escuro ou a 4 °C até que a imagem esteja terminada.
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Representative Results
O objetivo deste método era demonstrar como injetar biomateriais no cérebro após o derrame. Um modelo fototrombótico com bengala rosa e um laser de 520 nm foi utilizado para orientação controlada da lesão do derrame tanto no tamanho quanto na localização. Cinco dias após o derrame, o infarto pôde ser visualizado durante a cirurgia(Figura 1B) e por TTC e imagens de lâminas manchadas de IHC(Figura 2). Um aumento no diâmetro do laser com uma lente 2x leva a um aumento visual na lesão do derrame que se estendeu por mais de 2,5 mm contra uma única seção de 1 mm apenas com o laser(Figura 2). A mortalidade durante a cirurgia com o modelo PT raramente ocorreu, inferior a 1%, devido ao procedimento minimamente invasivo. A morte após a cirurgia também foi baixa e vista em menos de 5% dos camundongos.
As micropartículas de hidrogel à base de ácido hialurônico (HMPs) foram injetadas cinco dias após o derrame(Figura 3). Os HMPs anneal após injeção na lesão do derrame para formar partículas microarrecidas (MAP) com um andaime poroso que permitiu a migração celular para o núcleo do curso(Figura 4). Dez dias após a injeção os camundongos foram perfundidos com 4% de PFA e seus cérebros foram extraídos, colocados em 4% de PFA durante a noite, e depois em 30% de sacarose por dois dias antes de serem congelados e seccionados para coloração e análise do IHC.
Trabalhos anteriores em nosso laboratório demonstraram a injeção de hidrogéis MAP na lesão do derrame cinco dias após o derrame26. A injeção de hidrogéis hialurônicos que correspondem ao módulo do córtex levou a uma diminuição significativa dos astrócitos reativas dentro do peri-infarto, bem como dentro do gel MAP. Além disso, microglia que também estavam dentro do hidrogel expressou marcadores M2 pró-reparo. Isso sugere que o hidrogel MAP pode reduzir a reatividade do astrócito em apenas dois dias após as injeções e promover um ambiente mais anti-inflamatório com astrócitos pró-recuperação e microglia(Figura 5).
Figura 1: Representação esquemática de bregma e localização do AVC. (A) Os lobos parietal se encontram no topo para formar o bregma. A colocação do laser foi centrada 2,0 mm à esquerda do bregma. (B) A conformação visual do avc e do orifício da rebarba foi observada 5 dias após o derrame. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Seções coronais que abrangem o infarto. (A) Seções IHC serial de cérebros 5 dias após o derrame, curso com laser apenas (superior) e lente 2x (inferior). As fatias eram de 30 μm de espessura a cada seção 300 μm de distância da seção anterior. (B) Mancha de IHC ampliada, barra de escala de 500 μm. Os núcleos (DAPI) são mostrados em azul, astrócitos (GFAP+) em vermelho e microglial (Iba1+) em verde, ampliação de 4x. (C) Seções de cérebros manchados com TTC para visualizar o volume da lesão 5 dias após o derrame, seções de 1 mm de espessura com barra de 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Injeção e visualização de biomateriais. (A) Visual da injeção de gel durante a cirurgia. (B) O gel pode ser visualizado pelo olho ao remover o crânio. (C) Uma vez congelado e montado, o gel era visível no cérebro durante a secção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: As manchas imunohistoquímicas do derrame só se comparam ao derrame com hidrogéis. (A) Esquema de cérebros criosecados 30 μm de espessura. Várias seções no meio foram escolhidas para análise de imagens. (B) Apenas Avc, a imunohistoquímica (IHC) mancha 15 dias após o derrame. As células de astrócitos (GFAP+) são mostradas em vermelho, microglia (Iba1+) são verdes e vasos (GLUT1+) são brancos. AVC + Condição de hidrogel, IHC 10d pós-injeção, 15 dias após o derrame. As células de astrócitos (GFAP+) são mostradas em vermelho, microglia (Iba1+) são verdes, o material de hidrogel é branco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeitos de hidrogéis de partículas recanais microporos em astrócitos reativas e microglia após o acidente vascular cerebral. (A) Esquema da linha do tempo experimental onde a seta significa dia de derrame, + significa dia de injeção, e x significa sacrifício e ponto de tempo de análise. (B) Esquema de configuração de análise mostrando onde as seções foram imagens e analisadas. (C) Imagens IHC mostrando reatividade de astrócito através de pERK, S100b, GFAP. (D) Quantificação de pERK/GFAP por cento dos astrócitos altamente reativos. (E) Quantificação de S100b/GFAP por cento dos astrócitos que eram altamente reativos. (F) Imagens IHC de reatividade de microglia através da coloração de CD11b, Arg1 e iNOS. (G) Quantificação do iNOS/Dapi para determinação do fenótipo pró-inflamatório microglial. (H) Quantificação de Arg1/Dapi para determinação de fenótipo microglial pró-reparação. Toda a barra de escala = 100 μm. A análise estatística foi feita no GraphPad Prism. * os dados indicados foram analisados utilizando-se o teste pós-hoc tukey e um intervalo de confiança de 95% com P<0,05. Valores P individuais indicados t-test. Este valor é modificado a partir do ref.26. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui demonstramos um modelo de derrame facilmente reprodutível, minimamente invasivo e permanente e descrevemos como injetar um biomamaterial no infarto cinco dias após o derrame. O uso do corante fototrombotico Rose Bengala e um laser collimado de 520 nm conectado ao dispositivo estereotaxico nos dá a capacidade de posicionar o curso no córtex motor do mouse com precisão aprimorada. Cinco dias após o derrame, a localização do infarto é visível pelo olho no centro da irradiação, 2,0 mm medio-lateral para o bregma. O hidrogel é então injetado com precisão no núcleo de traçado usando bombas de seringa. A mortalidade durante a cirurgia e após o AVC neste modelo está praticamente ausente, com apenas um punhado de camundongos morrendo após a cirurgia devido a complicações anestesiológicas. Apesar das vantagens do uso do AVC PT para aplicações biomateriais, existem várias limitações biológicas e dificuldades técnicas que devem ser abordadas.
Em termos de limitações biológicas, o PT não é um modelo de derrame que oferece a opção de reperfusão cerebral, um processo que pode ocorrer espontaneamente em derrames humanos ou em resposta à recuperação/lise do coágulo endovascular. Além disso, ao contrário do modelo mcao que imita a etiologia da maioria dos derrames humanos ao ocluar um vaso cerebral principal, o PT prejudica o fluxo sanguíneo através de muitos vasos menores. Uma dificuldade técnica de injetar biomateriais de hidrogel é sua tendência a aderir à seringa durante a cirurgia ou ao crânio durante as extrações. Projetar um hidrogel que permanece como um líquido durante a injeção e, em seguida, géis in situ podem abordar o primeiro problema; no entanto, evitar que o gel grude na dura mater é muitas vezes inevitável, uma vez que o local de injeção e o núcleo do curso residem na superfície do cérebro. Isso pode dificultar a extração do tecido cerebral mantendo o bioma material intacto. Como tal, deve-se tomar cuidado especial ao remover pedaços de crânio do cérebro para garantir que a dura-aduca não levante com o crânio e, involuntariamente, retire o gel. O cérebro criosectioning também requer habilidade técnica, pois tanto o processo de manuseio quanto a transeção da lâmina podem facilmente separar o gel de seu tecido circundante, limitando assim a coleta de dados em relação à infiltração celular. O desprendimento é exacerbado quando o material não está totalmente integrado com o tecido. Preparar a amostra com OCT cria uma concha de reforço que ajuda a minimizar a separação do material durante o corte.
Antes de injetar biomateriais, recomendamos otimizar o tamanho do traçado desejado, dependendo da cepa de roedores e da configuração laboratorial. Infartos menores ou maiores podem ser feitos ajustando três parâmetros principais: intensidade de saída do laser, ampliação do feixe e tempo de irradiação. Outros fatores que também têm sido mostrados para afetar o tamanho do avc incluem a concentração de isoflurane19 e a quantidade de tempo que o corante é permitido circular antes da irradiação. Em relação à intensidade de saída do laser (potência/área ou mW/cm2), descobrimos que uma potência laser de 10 mW foi suficiente para produzir um pequeno infarto com diâmetro horizontal ligeiramente menor ao do feixe laser. Maior potência laser rendeu infartos marginalmente mais amplos, mas substancialmente mais profundos (dados não mostrados) devido ao raio laser ter um perfil de irradiação gaussiana. Aumentando a intensidade, o ponto central da irradiação máxima pode penetrar mais fundo além do crânio, bem como causar o ligeiro aumento na penetração do tamanho do ponto do laser. Outros modelos de avc diminuíram o crânio lixando-o antes de aplicar luz ou laser, a fim de aumentar a penetração da luz e a reprodutibilidade subsequente da coagulação, mantendo uma intensidade de laser mais baixa20; no entanto, isso pode causar hemorragia no crânio e leva uma boa quantidade de tempo durante a cirurgia e habilidade para dominar sem danificar acidentalmente o cérebro no processo. Semelhante à intensidade, o aumento do diâmetro do feixe de laser também aumentou o tamanho do infarto; no entanto, a intensidade do laser e o diâmetro do feixe não escalam linearmente em relação um ao outro, mas seguem a equação, densidade de potência = potência laser (w)/ πr2, onde estão o raio do feixe. Em termos de tempo de irradiação, descobrimos que era necessário um mínimo de 10 minutos para produzir derrames reprodutíveis. Para aumentar o diâmetro horizontal do infarto, mantendo a profundidade vertical constante, aplicamos o laser em locais adjacentes por 10 minutos cada, sequencialmente. Para abordar a influência da concentração isoflurane e do tempo de circulação da bengala rosa, verificou-se que 1,5% da concentração de isoflurane e 7 minutos de circulação após a injeção de IP resultaram em formação consistente de derrames. Estes cinco parâmetros foram otimizados para o nosso uso particular. Precisávamos de um derrame grande o suficiente para causar mudanças comportamentais, mas não interferir na zona subventricular, onde tínhamos como objetivo estudar o efeito do nosso material nas células progenitoras neurais. Além do tamanho do traçado, também precisávamos determinar o volume ideal de gel para injetar. No mínimo, precisávamos de gel suficiente para preencher inteiramente a cavidade do derrame porque descobrimos que as lacunas entre gel e tecido circundante levaram a resultados semelhantes aos nossos grupos de controle, enquanto o contato entre gel e tecido resultou em menos astrócitos reativos e aumento da infiltração celular. Chegamos a um limite menor de 4-6 μL de gel, que não produziu efeitos adversos após injetados (dados não publicados).
Quanto à avaliação do desfecho do AVC, existem várias opções além da coloração do IHC, como ressonância magnética, testes comportamentais, análise histológica e TTC (cloreto de triphenyltetrazolium). É altamente recomendável usar TTC para otimização preliminar do curso devido à sua facilidade de uso e resultados imediatos. Testes comportamentais anteriores em nosso laboratório analisaram a tarefa de teste de cilindro/membro espontâneo, o teste de caminhada na grade e o teste demassas 12,21. Deve-se notar que o teste rotarod não apresentou reduções significativas nos desfechos comportamentais após a implementação do método de avc pt (dados não apresentados). Assim, os testes comportamentais devem avaliar tarefas muito complexas que requerem entrada cortical significativa.
Aqui demonstramos a técnica de injetar hidrogéis após o AVC sem a entrega de fatores de crescimento ou células. No entanto, hidrogéis também foram utilizados para transplante celular, bem como o fornecimento de medicamentos e fatores de crescimento, e podem ser um recurso valioso tanto para estudar biologia após o AVC quanto para investigar novos métodos de terapia. No contexto do derrame, nosso laboratório injetou hidrogéis de ácido hialurônico não porosos encapsulando células progenitoras pluripotentes induzidas derivadas de células-tronco14,18 em concentrações que variam de 25.000 células/ μL a 50.000 células/μL de gel. O uso de um hidrogel resultou em um aumento da viabilidade e diferenciação celular. Outros laboratórios também relataram diferenciação celular e aumento da regeneração tecidual em resposta aos hidrogéis usados para transplantar células-tronco após o AVC 22-24. Além disso, injetamos hidrogéis com fatores de crescimento após o AVC que levam à regeneração tecidual e à melhora comportamental após o AVC13,14. Em termos de design de material, a injeçãobilidade é uma característica valiosa que serve para minimizar a invasividade; portanto, os hidrogéis devem ser formulados como sol-géis (líquido-a-sólido), afinação de tesoura (G' > G" em condições estáticas; G" > G' durante o fluxo), ou géis granulares compostos por blocos de construção cujo diâmetro é inferior ao diâmetro interno de uma agulha12,25,26. A otimização deve então ser realizada para testar a difusão de drogas ou fatores de crescimento, viabilidade celular sob uma série de concentrações celulares, condições de gel e parâmetros de injeção, como velocidade, medidor de agulha, profundidade de injeção e dia de injeção em relação ao momento em que o derrame foi induzido. Por exemplo, o dia da injeção de material variou de um dia após o derrame até, desde três semanas após o curso27,28. Aqui, relatamos cinco dias, mas já injetamos sete dias após o derrame ao transplantar células. Os dias de hoje foram escolhidos com base na linha do tempo da resposta inflamatória, bem como no pico de atividade da angiogênese e neurogênese observada uma semana após o AVC5,29,30,31. A caracterização do volume também deve ser realizada em cada ponto de tempo de injeção, pois o volume de avc diminuirá ao longo do tempo devido à atrofia. Dado que esses parâmetros são otimizados antes da injeção, os métodos aqui são suficientes para orientar os usuários a injetar biomateriais com a adição de células e/ou fatores de crescimento e medicamentos.
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Disclosures
Os autores declaram que a TS é fundadora da Tempo Therapeutics, que busca comercializar hidrogéis MAP.
Acknowledgments
Gostamos de reconhecer os Institutos Nacionais de Saúde e o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC para financiamento (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
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