Summary
We ontwikkelden een methode om Phytophthora capsici zoospores in waterbronnen te detecteren met behulp van een filter papier DNA-extractie methode in combinatie met een lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test die kan worden geanalyseerd in het veld of in het lab.
Abstract
Phytophthora capsici is een verwoestende oomycete ziekteverwekker die veel belangrijke solanaceous en cucurbit gewassen veroorzaakt aanzienlijke economische verliezen in de plantaardige productie jaarlijks beïnvloedt. Phytophthora capsici is bodemgedragen en een hardnekkig probleem in groentevelden als gevolg van de langlevende overlevingsstructuren (oospores en chlamydosporen) die verwering en afbraak weerstaan. De belangrijkste methode van verspreiding is door de productie van zoösporen, die eencellige, gevlagde sporen die kunnen zwemmen door dunne films van water aanwezig op oppervlakken of in met water gevulde bodem poriën en kan zich ophopen in plassen en vijvers. Daarom kunnen irrigatievijvers een bron zijn van de ziekteverwekker en de eerste punten van ziekte-uitbraken. Detectie van P. capsici in irrigatiewater is moeilijk met behulp van traditionele cultuur gebaseerde methoden, omdat andere micro-organismen aanwezig in het milieu, zoals Pythium spp., meestal overwoekeren P. capsici waardoor het niet op te sporen. Om de aanwezigheid van P. capsici sporen in waterbronnen (irrigatiewater, afvloeiing, enz.) te bepalen, ontwikkelden we een handpompgebaseerde filterpapier (8-10 μm) methode die de sporen van de ziekteverwekker (zoösporen) vangt en later wordt gebruikt om het DNA van de ziekteverwekker te versterken door middel van een nieuwe lusgemedieerde isothermale versterking (LAMP) assay ontworpen voor de specifieke versterking van P capsici. Deze methode kan versterken en detecteren DNA uit een concentratie zo laag als 1,2 x 102 zoösporen / mL, dat is 40 keer gevoeliger dan conventionele PCR. Er werd geen kruisversterking verkregen bij het testen van nauw verwante soorten. LAMP werd ook uitgevoerd met behulp van een colorimetrische LAMP master mix kleurstof, het weergeven van resultaten die kunnen worden gelezen met het blote oog voor on-site snelle detectie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere ziekteverwekkers die zich bevinden, accumuleren of verspreid zijn via verontreinigde irrigatiesystemen.
Introduction
Het recyclen van water in boerderijen en kwekerijen wordt steeds populairder door de stijging van de waterkosten en de milieuproblemen achter het watergebruik. Er zijn veel irrigatiemethoden ontwikkeld voor telers om de verspreiding en het optreden van plantenziekten te verminderen. Ongeacht de bron van het water (irrigatie of neerslag), afvloeiing wordt gegenereerd, en veel groente-en kwekers hebben een vijver te verzamelen en te recyclen runoff1. Hierdoor ontstaat een reservoir voor mogelijke pathogene accumulatie ten gunste van de verspreiding van ziekteverwekkers wanneer het gerecycleerde water wordt gebruikt om gewassen te irrigeren2,3,4. Oomycete plant pathogenen in het bijzonder profiteren van deze praktijk als zoösporen zal zich ophopen in water en de primaire dispersieve spore is zelf-motile, maar vereist oppervlaktewater5,6,7. Phytophthora capsici is een oomycete pathogene die een aanzienlijk aantal solanaceous en cucurbit gewassen op verschillende manieren beïnvloedt8. Vaak zijn de symptomen demping-off van zaailingen, wortel en kroonrot; echter, in gewassen zoals komkommer, pompoen, meloen, pompoen, watermeloen, aubergine en peper, hele oogsten kunnen verloren gaan als gevolg van fruitrot9. Hoewel er bekende methoden zijn om deze plantenpathogen te detecteren, vereisen de meeste een infectie die al heeft plaatsgevonden, wat te laat is om preventieve fungiciden een significant effect te hebben10.
De traditionele methode om irrigatiewater te testen op de detectie en diagnose van gerichte micro-organismen is een verouderde aanpak wanneer snelheid en gevoeligheid cruciaal zijn voor succes en winstgevende gewasproductie11,12. Plantweefsel dat gevoelig is voor de beoogde ziekteverwekker (bijvoorbeeld aubergine voor P. capsici)is bevestigd aan een gemodificeerde val die gedurende langere tijd in een irrigatievijver wordt opgehangen voordat het wordt verwijderd en gecontroleerd op infectie. Monsters van het plantenweefsel worden vervolgens verguld op semi-selectieve media (PARPH) en geïncubeerd voor groei van de cultuur, dan morfologische identificatie wordt uitgevoerd met behulp van een samengestelde microscoop13. Er zijn andere soortgelijke detectiemethoden voor andere plantpathogenen met behulp van selectieve media en plating kleine hoeveelheden verontreinigd water voor sub-culturing14,15. Deze methoden vereisen overal van 2 tot 6 weken, verschillende rondes van sub-culturing om het organisme te isoleren, en ervaring op Phytophthora diagnostiek te kunnen de belangrijkste morfologische kenmerken van elke soort te herkennen. Deze traditionele methoden werken niet goed voor de detectie van irrigatiewater besmet door P. capsici als gevolg van factoren zoals interferentie door andere micro-organismen die ook aanwezig zijn in de waterbronnen. Sommige snelgroeiende micro-organismen zoals Pythium spp. en door water overgedragen bacteriën kunnen overwoekeren op de plaat waardoor P. capsici niet op te sporen16,17.
Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een gevoelige en specifieke moleculaire methode die kan worden gebruikt in zowel veld- als laboratoriumomgevingen om P. capsici zoosporen in irrigatiewater te detecteren. Het protocol omvat de ontwikkeling van een nieuwe lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) primer set in staat om specifiek versterken P. capsici, gebaseerd op een 1121-base paar (bp) fragment van P. capsici18,19. Een eerder ontwikkelde LAMP primer van Dong et al. (2015) werd gebruikt in vergelijking met de test die werd ontwikkeld voor deze studie20.
De LAMP-test is een relatief nieuwe vorm van moleculaire detectie waarvan is aangetoond dat deze sneller, gevoeliger en specifieker is dan conventionele polymerasekettingreactie (PCR)21. In het algemeen kunnen conventionele PCR-tests niet onder 500 kopieën (1,25 pg/μL) worden gedetecteerd; in tegenstelling, eerdere studies hebben aangetoond dat de gevoeligheid van LAMP kan 10 tot 1.000 keer hoger zijn dan conventionele PCR en kan gemakkelijk detecteren zelfs 1 fg/μL van genomische DNA22,23. Bovendien kan de test snel worden uitgevoerd (vaak in 30 minuten) en on-site (in het veld) met behulp van een draagbaar verwarmingsblok voor versterking en een colorimetrische kleurstof die van kleur verandert voor een positief monster (waardoor de noodzaak van elektroforese wordt verwijderd). In deze studie hebben we de gevoeligheid van PCR- en LAMP-tests vergeleken met behulp van een filterextractiemethode. De voorgestelde detectiemethode stelt onderzoekers en extensiemiddelen in staat om de aanwezigheid van P. capsici sporen uit verschillende waterbronnen in minder dan twee uur gemakkelijk te detecteren. De test is bewezen gevoeliger te zijn dan conventionele PCR en werd ter plaatse gevalideerd door de aanwezigheid van de ziekteverwekker in het irrigatiewater te detecteren dat door een teler wordt gebruikt. Deze detectiemethode zal telers in staat stellen om de aanwezigheid en bevolkingsdichtheid van de ziekteverwekker in verschillende waterbronnen te schatten die worden gebruikt voor irrigatie, waardoor verwoestende uitbraken en economische verliezen worden voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. On-site detectie van Phytophthora capsici uit irrigatiewater met behulp van draagbare lus-gemedieerde isothermale versterking
- Het instellen van de pomp en het filter
- Bevestig een filterfles aan een buis die is aangesloten op een handpomp, zodat wanneer de pomp wordt geactiveerd, de lucht via de mond van de filterfles naar binnen wordt getrokken.
- Plaats de Buchner trechter in de rubberen stop in de mond van de filterfles en plaats het juiste formaat stuk filterpapier in de Buchner trechter, zodat de lucht door het filterpapier wordt getrokken. Het filterpapier moet een retentiegrootte van 15 μm hebben.
LET OP: Het filterpapier moet aan de randen van de Buchner trechter passen, zodat er minimaal water over het filterpapier stroomt.
- Waterbemonstering en -filtering
- Neem watermonsters van de beoogde bron. Water kan kleine hoeveelheden puin hebben, maar geen significant sediment of bodem.
- Giet tot 1.000 mL (1 liter) testwater over het filterpapier dat langzaam genoeg in de Buchnertrechter is geplaatst om overloop te voorkomen, terwijl de handpomp (of vacuüm) wordt gebruikt om een zuigkracht te creëren om het water erdoorheen te trekken.
OPMERKING: Er is geen minimale hoeveelheid water die kan worden getest met behulp van deze methode, en hoewel het ten minste 50 mL wordt voorgesteld, 1000 mL is het maximum voor deze methode. - Verwijder met behulp van tangen het filterpapier uit de Buchner trechter en snijd het in kleine stukjes met steriele schaar. Voeg zoveel stukken (8-12) toe als kan worden ondergedompeld in de hoeveelheid extractiebuffer (400 μL voor magnetische op kralen gebaseerde extractie) die door het protocol vereist is in een buis van 1,5 mL. Bewaar resterende stukjes filterpapier voor verwerking nadat de eerste set is geëxtraheerd.
- Vortex of anderszins roeren de stukken van filter papier en extractie buffer voor 10 s elke minuut gedurende 5 min. Verwijder vervolgens met behulp van tangen het filterpapier dat zo min mogelijk van de extractiebuffer verliest. Herhaal deze stap met de resterende stukjes filterpapier totdat alle stukken zijn vortexed / geagiteerd en gedrenkt in de extractie buffer.
- Magnetische kraal-gebaseerde extractie van DNA uit filterpapier
- Voeg aan de 1,5 mL-buis (die nu ongeveer 200-300 μL extractiebuffer bevat) 20 μL proteinase K en 10 μL van 10 ng/μL RNase toe.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, vortex of schud de buis om de 3 minuten.
- Voeg 500 μL magnetische kralen met de bindingsbuffer toe aan het monster en meng goed door te schudden. Dan incubeer voor 5 min bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis in het magnetisch scheidingsrek gedurende 2 min totdat alle kralen aan de magneet zijn getrokken. Verwijder en gooi de supernatant weg.
- Verwijder de buis van de magnetische afscheider. Voeg 500 μL wasbuffer 1 toe en schort kralen opnieuw op door de buis krachtig te schudden. Wacht op 30 s en plaats de buis terug in de magnetische afscheider. Wacht 2 min tot alle kralen naar de magneet zijn getrokken voordat u de supernatant verwijdert en weggooit.
OPMERKING: In afwachting van de magnetische kralen te magnetiseren aan de separator, raden wij aan omkeren van de buis, die magnetische kralen vast aan de dop en de zijkanten van de buis kan verjagen en resulteren in een groter aantal kralen worden bevestigd. - Herhaal stap 1.3.5 met 500 μL wasbuffer 2.
- Herhaal stap 1.3.5 met 500 μL ethanol.
- Luchtdroge de magnetische kraalpellet gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (18-27 °C) met het deksel open. Als de temperaturen het niet toelaten, uitbroeden in een gehandschoende hand met de dop open voor 15 min.
- Verwijder de buis van de magnetische afscheider. Voeg 50 μL elutiebuffer toe en hang de kralen opnieuw op door 1 min op en neer te pipetten.
- Plaats buis terug in een magnetische afscheider. Wacht 2 minuten voordat u de supernatant overzet zonder de kralen te storen aan een aparte buis voor DNA-opslag.
OPMERKING: Hier kan het experiment worden onderbroken voordat het verder gaat. Geëxtraheerd DNA moet worden opgeslagen op ijs of in een vriezer van -20 °C.
- Toepassing van nieuw ontwikkelde LAMP-test
- Bereid lamp primer mix met 0,2 μM van elke F3 en B3 primer, 0,8 μM van elke Loop-F en Loop-B primer, en 1,6 μM van elke FIP en BIP primer (Tabel 2).
- Voeg de volgende LAMP-oplossing toe aan één PCR-buis, of aan elke afzonderlijke buis in de 8-buisstrip: 2,5 μL primermix (stap 1.4.1), 12,5 μL LAVA LAMP mastermix, 1 μL geëxtraheerd DNA en 9 μ L ddH2O. Het totale volume is 25 μL.
OPMERKING: Als u het draagbare versterkingsinstrument (bijvoorbeeld Genie III) met colorimetrische kleurstof (bijvoorbeeld Warmstart) gebruikt, raadpleegt u punt 2.4.2- 2.4.3. - Wijs twee buizen aan als positieve en negatieve controles. Voor de positieve controle, gebruik maken van een controle die door de LAVA LAMP kit, of een bekende positieve DNA-monster. Gebruik voor de negatieve controle ddH2O. Voor beide, vervang de 1 μL van geëxtraheerd DNA voor 1 μL van de positieve controle of ddH2O.
- Zet de monsters in een warmteblok (of draagbaar versterkingsinstrument) ingesteld op 64 °C gedurende 45 minuten.
LET OP: Andere extractiemethoden kunnen hier worden gebruikt in plaats van magnetische kraalgebaseerde extractie. CTAB en een commerciële DNA-extractiekit werden beide met succes getest met behulp van de standaardprotocollen en vervangen de filterpapierstukken voor het plantenmonster24,25. De resultaten werden vergeleken in tabel 2. Als de concentratie van DNA kan worden gekwantificeerd, gebruik tussen 1-10 ng genomic DNA.
- Visualisatie van resultaten
- Als deze in een laboratoriumomgeving wordt uitgevoerd, bekijkt u de versterkingsproducten door 5 μL van elk monster in een 1% agarosegel te laden, ze in een gelelektroforesemachine te laten draaien en ze in een UV-beeldmachine te plaatsen.
- Als een colorimetrische kleurstof (bijvoorbeeld Warmstart) is gebruikt, bekijkt u de kleurwijziging om de resultaten als positief of negatief te bepalen.
- Als een draagbaar versterkingsinstrument (bijvoorbeeld Genie III) is gebruikt, bekijkt u de versterkingsgrafiek op het scherm om de resultaten te bepalen.
- Toepassing van eerder ontwikkelde PCR-test
OPMERKING: Als u een conventionele PCR-test gebruikt, blijven stappen 1-3 hetzelfde en moeten de volgende stappen worden toegepast in plaats van de stappen 1.4 en 1.5.- Voeg 1 μL van elke DNA-extractie toe aan afzonderlijke buizen met de volgende componenten: 12,5 μL groene PCR-mastermix, 9,5 μL ddH2O en 1 μL voorwaartse en omgekeerde primers (tabel 2).
- Spin down elk monster met behulp van een microcentrifuge en plaats buizen in een thermische cycler.
- Gebruik de volgende thermische cycler-instellingen overeenkomstig de vorige publicaties: 94 °C gedurende 5 min, 30 cycli van denaturatie bij 94 °C voor 30 s, geannealing bij 54 °C voor 30 s, uitbreiding bij 72 °C gedurende 1 min, en definitieve verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.
- Voer het product in een 1% agarose gel. Observeer de aanwezigheid van banden onder UV-licht waar positieve reacties een bandgrootte van ~ 508 bp zullen hebben.
- Traditionele detectiemethode
OPMERKING: Er zijn meerdere methoden voor selectieve beplating voor pathogene detectie, en het volgende is een algemeen protocol voor P. capsici.- Verkrijg eerst een gezonde auberginevrucht (een vatbare gastheer voor P. capsici)en versteriliseer het oppervlak door het fruitoppervlak te wassen met 70% isopropylalcohol.
- Plaats de auberginevruchten in melkkratten met een drijfapparaat (polyethyleenschuim of andere) en zet in irrigatievijvers. Zet elke aasval op één punt en laat de vallen in het waterreservoir (gerecycleerd irrigatiewater) gedurende ten minste 7 dagen of totdat de symptomen van fruitrot worden waargenomen. Verzamel het fruit en transport het naar het laboratorium.
- Spoel en droog de vrucht in een steriele kap voordat u kleine stukjes geïnfecteerde weefsels verwijdert en leg ze op een plaat van PARPH medium gewijzigd met 25 mg/L pentachloronitrobenzene, 0,0005% pimaricine, 250 mg/L ampicilline, 10 mg/L rifampicin en 50 mg/L hymexazol. Incubeerplaten bij 25 °C gedurende 5 dagen.
- Bekijk platen onder een samengestelde microscoop voor traditionele morfologische identificatie op 4 dagen na isolatie.
2. Bepaling van de detectiegrens van de concentratie van zoösporen
- Het maken van zoospore schorsing
- Incubate P. capsici op V8 agar (100 mL V8 sap, 900 mL ddH2O, 1 g CaCO3) platen gedurende 1 week bij 26 °C. Meerdere platen kunnen worden gebruikt om een grotere hoeveelheid zoospore suspensie te verkrijgen.
- De platen onder continu licht gedurende 3 dagen onder continu licht incubeerpen om de sporulatie te stimuleren.
- Overspoel de platen door 15 mL ddH2O aan elke plaat toe te voegen en leg ze gedurende 25 minuten in een koelkast van 4 °C. Keer dan terug naar kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Roer platen om zoösporen los te maken en de oplossing in één buis van 50 mL van alle platen te verwijderen.
- Om een nauwkeurige schatting van de concentratie van zoöspore te verkrijgen, voegt u 10 μL van de sporensuspensie toe aan een hemocytometer en observeer u onder een microscoop zoosporen en schat u de gemiddelde concentratie.
- Seriële verdunning
- Voeg 1 mL van de sporenvering en 9 mL ddH2O toe aan een aparte buis. Herhaal deze stap voor zoveel 10-voudige verdunningen als gewenst.
- Spore-oplossingen worden vervolgens ingediend voor DNA-extractie op basis van het vorige protocol met behulp van de filtratiemethode.
LET OP: Als een groter volume van de suspensie gewenst is, verdubbel het volume: 2 mL spore vering en 18 mL ddH2O.
- Detectie van zoösporingsconcentratielimiet
- Evalueer de detectielimiet van sporen door elke seriële verdunning afzonderlijk door de test te laten lopen totdat duidelijk positieve resultaten niet meer worden waargenomen. Zodra de uiteindelijke verdunning is verkregen, verdun je met een factor 2 (4,8 tot 2,4 in dit voorbeeld) en voer je de test opnieuw uit om een nauwkeurigere detectielimiet te krijgen.
- Ontwikkeling en optimalisatie van de LAMP-methode
OPMERKING: LAMPprimers zijn ontworpen op basis van een 1121-base pair (bp) fragment van P. capsici (Li et al.19) zoals weergegeven in aanvullende figuur 2.- Als colorimetrische kleurstof (bijvoorbeeld Warmstart) wordt gebruikt, gebruikt u de volgende oplossing: 2,5 μL primermix, 12,5 μL colorimetrische kleurstof, 0,5 μL groene fluorescerende kleurstof, 1 μL geëxtraheerd DNA en 8,5 μL ddH2O. Het totale volume is 25 μL.
- Bij gebruik van het draagbare versterkingsinstrument met LAVALAMP mastermix, hebben een eerste stap van 95 °C voor 3 minuten, zoals aanbevolen door de fabrikant, maar dit is niet vereist. Een laatste annealing stap is niet nodig om de kleurverandering of versterking grafiek te observeren. Voer geen warmstart stap uit als de commerciële colorimetrische kleurstof moet worden gebruikt.
- Bekijk lamp test resultaten in een van de volgende methoden: monsters uitvoeren op een 1% agarose gel of bekijken met behulp van een UV-imaging machine met het blote oog of uitzicht op de Genie III real-time versterking scherm.
- Optimaliseer de temperatuur van de LAMP-test met behulp van het draagbare versterkingsinstrument en analyseer de real-time versterkingsgrafiek voor snelheid en gevoeligheidsniveau. Voer monsters uit met unieke temperaturen om de snelste versterking te bepalen met het hoogste gevoeligheidsniveau.
- Bepaal de detectielimiet van de door de lamp ontwikkelde test door een seriële verdunning van geëxtraheerd DNA (zoals bij sporensuspensie in stap 2.2.1) en behoud van reactieomstandigheden zoals eerder beschreven voor de LAMP-reactie voor elke verdunning.
- Detectielimietbepaling en vergelijking met conventionele PCR-methode
- Gebruik DNA dat in stappen in punt 1.3 wordt geëxtraheerd om het detectieniveau van conventionele PCR te vergelijken met dat van de LAMP-test.
- Voeg 1 μL DNA toe aan een PCR-buis die 1 μL van zowel voorwaartse als omgekeerde PCR-primers(tabel 2),12,5 μL groene PCR Mastermix en 9,5 μL ddH2O bevatte voor een totaal van 25 μL.
- Verdringing van monsters in een thermisch cycler met behulp van de volgende voorwaarden: 94 °C gedurende 5 min, 30 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 30 s, annealing bij 54 °C voor 30 s, uitbreiding bij 72 °C gedurende 1 min, en definitieve verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten.
- Voer monsters in een elektroforese machine op een 1% agarose gel en kijk op een UV-beeldmachine. De uitgezonderde band grootte was 508 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimalisatie van de LAMP-methode
In deze studie ontdekten we de aanwezigheid van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van een draagbare lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test. Ten eerste werd de voorgestelde LAMP-test geoptimaliseerd door verschillende LAMP primerconcentraties te testen [F3, B3 (0,1–0,5 μM per stuk); LF, LB (0,5–1,0 μM per stuk) en FIP, BIP (0,8–2,4 μM per stuk)], duur (30-70 min) en temperaturen (55-70 °C). De uiteindelijke LAMP primer mix die in deze studie werd gebruikt was: 0,2 μM van elke F3 en B3 primer, 0,8 μM van elke Loop-F en Loop-B primer, 1,6 μM van elke FIP en BIP primer. Optimalisatie van de reactietemperatuur werd uitgevoerd in het draagbare versterkingsinstrument (bijvoorbeeld Genie III) door te bepalen welke temperatuur de snelste reactie uitvoerde zonder extra negatieve versterking. De optimale temperatuur werd bevestigd op 64 °C (gegevens niet getoond). De optimale tijd voor het uitvoeren van de test bij 64 °C was 45 min, omdat de laagste concentraties die positief waren voor detectie (1,2 x 102 sporen/mL) nog steeds versterkt door 40 min, terwijl hogere concentraties versterkt op 20 min (Figuur 2D). De versterkte LAMP producten werden verder waargenomen op 1% agarose gel gekleurd met een nucleïnezuur vlek om versterking te bevestigen. Alle reacties werden minstens drie keer herhaald.
Isolaten van P. capsici werden genomen uit Tennessee, Florida en Georgië en werden voorgelegd aan hetzelfde protocol beschreven in de methoden. Alle monsters van P. capsici-isolaten werden in alle runs van de test met succes versterkt(figuur 3).
Detectie- en gevoeligheidstests van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van draagbare LAMP-test
We hebben deze op filterpapier gebaseerde LAMP-methode gestandaardiseerd onder laboratoriumomstandigheden met behulp van een seriële verdunning van P. capsici sporensuspensies(figuur 1). Seriële verdunningen werden gemaakt van een P. capsici sporenvering vanaf 4,8 x 104 zoösporen/mL en worden uitgevoerd met de LAMP-test in drievoud. Sporenconcentraties worden getoond in plaats van DNA-concentratie als gevolg van de methode die betrokken is bij DNA-extractie. CTAB DNA-extractie van de hoogste sporenconcentratie was 4,5 ng/μL gemeten door Nanodrop, en het magnetische kraal-DNA-extractieprotocol leverde 3,8 ng/μL26op. De nieuw ontworpen LAMP primer set kan detecteren een concentratie zo laag als 1,2 x 102 sporen / mL (Figuur 2B, 2C, & 2D) met alle methoden van extractie. De gevoeligheid in de grafiek van versterking op het draagbare versterkingsinstrument was identiek aan die in het UV-beeld zonder extra gevoeligheid. Dezelfde seriële verdunning werd uitgevoerd in een LAMP-reactie met behulp van de colorimetrische kleurstof om het niveau van gevoeligheid voor het blote oog voor velddetectie te bepalen. De laagste waarneembare concentratie was 4,8 x 103 sporen/mL (figuur 2C).
Om het vermogen van deze test te evalueren aan de hand van praktijkmonsters, werden watermonsters verzameld uit zeven vijvers die werden gebruikt voor commerciële plantaardige productie in Tift County, Georgia(tabel 1, figuur 5en aanvullende figuur 1). Van de 7 vijvers vertoonden 3 positieve lampresultaten (P1, P4 en P6) (figuur 6A, 6B en 6C). Deze resultaten suggereren dat de draagbare filter papier gebaseerde LAMP methode kan zeer nuttig zijn voor de detectie van de ziekteverwekker, zelfs met een lage zoospore concentratie. Dit toont de toepasbaarheid van LAMP als een gevoeligere detectietest dan PCR voor het screenen van irrigatiewaterverontreiniging door P. capsici.
Vergelijkende analyse van verschillende methoden: Traditioneel aas, conventionele PCR en de draagbare op LAMP gebaseerde test
Om de detectiegevoeligheid van LAMP te vergelijken met conventionele PCR, werd het DNA uit de seriële verdunning van sporensuspensies uitgevoerd in een PCR-reactie. De resultaten toonden aan dat conventionele PCR 40x minder gevoelig was dan LAMP, alleen in staat om een zoösporeconcentratie te detecteren tot 4,8 x 103 sporen/mL(figuur 2A). Bovendien, de DNA-monsters verkregen uit gefilterde irrigatie vijver water werden getest met behulp van conventionele PCR, en slechts een van de drie positieve monsters (P4) werd met succes versterkt als verwachte band grootte plus aanzienlijke verontreinigingen resulterend in een aantal smeren en niet-specifieke banden (Figuur 6D). Tabel 3 geeft de verschillen weer tussen detectiemethoden met behulp van variabelen zoals tijd, kosten, gevoeligheid en voorbereiding vereist. LAMP was de minst dure methode onder deze drie methoden en het was ook de snelste, variërend van 30-60 min voor versterking (DNA-extractie uitgesloten). Conventionele PCR varieerde van 120-180 min voor versterking (DNA-extractie uitgesloten).
Tot slot, om de specificiteit van de primers te bepalen, monsters van nauw verwante oomycete pathogenen (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexanen, Phytopythium helicoides, en Pythium aphanidermatum) werden verkregen, DNA werd geëxtraheerd met behulp van hetzelfde protocol voor consistentie en geëvalueerd door de nieuwe LAMP test met een positieve en negatieve controle (Figuur 4) om de specificiteit van de primers te bepalen. Alle niet-doelmonsters waren negatief met behulp van de geoptimaliseerde 64 °C gedurende 45 min. Dit werd waargenomen op de real-time versterking grafiek en afgebeeld op een 1% agarose gel onder UV-licht.
Figuur 1: Diagram met de verschillende stappen die betrokken zijn bij Phytophthora capsici van een seriële verdunning van een geconcentreerde sporensuspensie onder laboratoriumomstandigheden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Laboratoriumoptimalisatie van de limiet voor detectie van Phytophthora capsici. AA) Conventionele PCR-test werd uitgevoerd met behulp van specifieke P. capsici primers op seriële verdunningsfactoren en gevisualiseerd op 1% agarose gel. 1, Ladder; 2-7, 4,8 x 104, 4,8 x10 3, 4,8 x 102, 2,4 x 102, respectievelijk 1,2 x10 2 sporen/mL en 7, negatieve waterbeheersing. (B) LAMP test seriële verdunningsfactoren gevisualiseerd op 1% agarose gel. 1-6, een afnemende sporenconcentratie: 4,8 x 104,4,8 x10 3,4,8 x 102, 2,4 x 102,1,2 x10 2 sporen/mL en 7, negatieve waterbeheersing. (C) LAMP resultaten gevisualiseerd met behulp van de colorimetrische kleurstof. 1-6, een afnemende sporenconcentratie: 4,8 x 104,4,8 x10 3,4,8 x 102, 2,4 x 102,1,2 x10 2 sporen/mL en 7, negatieve waterbeheersing. (D) LAMP resultaten gevisualiseerd op de versterking grafiek. Rood = 4,8 x 104, Donkerblauw = 4,8 x10 3, Oranje = 4,8 x 102, Lichtblauw = 2,4 x 102, Groen = 1,2 x10 2 sporen/mL, Roze = Negatief besturingselement (andere Fytophthora-soorten), Geel = ddH2O. (E) Een standaardcurve met kwantificering van de waarden die in de real-time resultaten worden weergegeven. Ln (Spore count) wordt weergegeven op de X-as en minuten tot versterking op de Y-as. (F) LAMP-test met gepubliceerde primer (Dong et al. 2015) op seriële verdunningsfactoren gevisualiseerd op 1% agarose gel. 1-6, een afnemende sporenconcentratie: 4,8 x 104,4,8 x10 3,4,8 x 102, 2,4 x 102,1,2 x10 2 sporen/mL en 7, negatieve waterbeheersing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Versterking van P. capsici DNA van verschillende locaties. (A) LAMP resultaten gevisualiseerd op 1% agarose gel. 1. PC_TN1; 2. PC_TN2; 3. PC_FL1; 4,PC_FL2; 5. PC_GA1; 6. PC_GA2; N, Negatieve controle. Monsters 1 en 2 werden geïsoleerd van TN; monsters 3 en 4 geïsoleerd van FL; monsters 5 en 6 werden geïsoleerd van GA. (B) Resultaten gevisualiseerd met behulp van de colorimetrische kleurstof. 1. PC_TN1; 2, PCTN2; 3. PC_FL1; 4,PC_FL2; 5. PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Resultaten gevisualiseerd op de versterkingsgrafiek. Rood, PC_TN1; Oranje, PCTN2; Geel, PC_FL1; Groen, PC_FL2; Donkerblauw, PC_GA1; Lichtblauw, PC_GA2; Roze, negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Specificiteit bepaling van LAMP-test met behulp van DNA van niet-doelsoorten P. capsici. (A) LAMP-testreactie met verwante niet-doelsoorten op agarosegel en gevisualiseerd op 1% agarose gel. L, Ladder; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexanen; 7. Negatieve controle; 8, Phytophthora capsica. (B) LAMP resultaten gevisualiseerd met behulp van de colorimetrische kleurstof. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexanen; 7. Negatieve controle; 8, Phytophthora capsici (C) LAMP resultaten gevisualiseerd op de versterking grafiek. Rood = Phytophthora capcisi, werden alle andere niet-doelsoortenmonsters niet versterkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Afbeeldingen met de bemonstering en verwerking van gerecycleerd water voor de detectie van Phytophthora capsici in het veld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Resultaten van de detectie ter plaatse van Phytophthora capsici in irrigatiewaterbronnen. (A) Agarose gel met resultaten van de LAMP versterking van getest water uit zeven boerderij in Zuid-Georgië. Voorbeeldnamen van links naar rechts: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negatief besturingselement, N. (B) LAMP resultaten gevisualiseerd met behulp van warmstart colorimetrische kleurstof van veldmonsters: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negatieve controle, N. (C) Resultaten van LAMP versterking van het veld met behulp van monsters grafiek. Rood: P1, Groen: P2, Paars: P3, Geel: P4, Blauw: P5, Oranje: P6, Roze: P7, Negatieve controle, N. (D) Agarose gel met conventionele PCR resultaten van de versterking met behulp van specifieke primers PC-1/PC-2 (let op dan slechts een site positief getest in vergelijking met drie in LAMP). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| De naam van de vijver | Provincie, Staat | Doelgewassen voor irrigatie | PCR-detectie | LAMP Detectie | Geschiedenis van de ziekte (Y/N) |
| P1 | Tift, GA | Groenten | | + | N |
| P2 | Tift, GA | Groenten | - | - | N |
| P3 | Tift, GA | Groenten | - | - | N |
| P4 | Tift, GA | Groenten | + | + | N |
| P5 | Tift, GA | Groenten | - | - | N |
| P6 | Tift, GA | Groenten | - | + | N |
| P7 | Tift, GA | Groenten | - | - | N |
Tabel 1: Detectie van irrigatiewater uit Zuid-GA.
| Type Primer | Naam primer | Volgorde 5'-3' | Bron | ||
| Lamp | PCA3-F3 | TGTGTGTGTTCGATCACA | Deze studie | ||
| PCA3-B3 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Deze studie | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCGTACTOGTTTTTTTATGTGCAGAGGGAGA | Deze studie | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTCGGCGGCGTTTTGAAAAAGGACCACCCG | Deze studie | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Deze studie | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATGACTGAC | Deze studie | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | Zhang et al., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Zhang et al., 2006 | |||
Tabel 2: Primers gebruikt in deze studie.
| Parameters | Traditionele | Conventionele PCR | Lamp |
| Gevoeligheid | NA | 4,8 x 102 sporen/ml | 1,2 x 102 sporen/ml |
| Tijd | 2 weken of langer | 2-3 uur (exclusief DNA-extractie) | 30 minuten - 1 uur (exclusief DNA-extractie) |
| Voorbereiding | • Mediacreatie • Plating en isolatie en • Het ontwerpen van een val |
• Spore-collectie met filterpapier • DNA-extractie en • PCR-test |
• Spore-collectie met filterpapier • DNA-extractie en • LAMP-assay |
| Materialen | • Autoclave • Media en platen • Incubatiekamer • Flow kap • Aubergine • Melkkrat |
• Thermische fietser • Agar gel • Gel Doc |
• Hitteblok of • Genie III |
| Kosten | $ 5,00 per val | $0.60 per reactie | $0.75 per reactie |
Tabel 3: Vergelijking van methoden voor de opsporing van P. capsici.
Aanvullende figuur 1: Locatie van Tift County, GA en monsters van irrigatiewater genomen uit verschillende locaties uit de staat. Positieve monsters werden getoond als rode stippen. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Ontwerp van LAMP primer set. Pijlen geven richting aan hoe primers worden gelezen. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het testen van irrigatiewater voor fytopathogenen is een cruciale stap voor telers die irrigatievijvers en gerecycled watergebruiken 27. Irrigatievijvers bieden een reservoir en broedplaats voor een aantal fytopathogenen als overtollig irrigatiewater wordt gericht van het veld naar de vijver die met zich mee alle ziekteverwekkers die aanwezig kunnen zijn geweest16,27. De traditionele methode voor de detectie van een plant pathogenen in een grote waterbron is om een aas voor de ziekteverwekker met behulp van vatbaar gastheerweefsel (bijvoorbeeld fruit, bladeren) opgehangen in de vijver en wachten tot een infectie plaats te vinden, verwijder dan de vrucht / bladeren en bevestig de diagnose met microscopie of moleculaire methoden13,14. Deze methoden zijn beperkt vanwege de hoeveelheid tijd die nodig is om de detectietest uit te voeren (2 weken of langer), en de benodigde arbeid en apparatuur. Daarnaast zijn uitgebreide ervaring en kennis in visuele diagnose, pathogenmorfologie en taxonomie vereist voor nauwkeurige resultaten. Moleculaire technieken zoals PCR, qPCR en DNA-hybridisatie vereisen aanzienlijk minder tijd (3-4 uur) dan de traditionele detectiemethoden; ze vereisen echter dure apparatuur en een laboratoriumomgeving. Bovendien maken deze technieken geen mogelijkheid om grote hoeveelheden water te verwerken. Serologische testen ook, tekort schieten in hun detectie vermogen als gevolg van niet-doel positieve reacties, en geen soort-specifieke tests voor Phytophthora soorten zijn ontwikkeld. Loop-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) is onlangs gebruikt als een on-site diagnose techniek voor snelle en gevoelige detectie van meerdere pathogenen als de test vereist slechts een enkele temperatuur in plaats van een thermische cycler28,29. LAMP kan worden uitgevoerd in het veld met behulp van een colorimetrische kleurstof voor visuele bevestiging of met behulp van een real-time versterking machine voor resultaten in minder dan een uur30.
Het doel van dit experiment was om een snelle en gevoelige methode te ontwikkelen om de aanwezigheid van Phytophthora capsici in waterbronnen te detecteren, hetzij ter plaatse of in een laboratorium. Om de detectiesnelheid te verhogen en de beperkingen van de eerder genoemde methoden voor het detecteren van P. capsici in irrigatiewater te bestrijden, ontwierpen we een methode met behulp van filterpapier om de sporen vast te leggen en hun DNA uit een groter volume water te halen. Nadat sporen werden gevangen met behulp van de filterpapiertechniek en DNA werd geëxtraheerd, werd de aanwezigheid van de ziekteverwekker bevestigd op basis van een nieuw ontworpen LAMP primer set die specifiek is voor P. capsici. Detectiegevoeligheid en specificiteit werd vergeleken met lamp en PCR. In alle 3 replicaties en met alle zoospore concentraties, LAMP was een snellere en meer gevoelige detectie methode(Tabel 3). Deze methode wordt niet beperkt door het hebben van een klein monstervolume als traditionele methoden, omdat deze methode tot 1 L water in één keer kan worden getest, waardoor de kans op detectie van ziekteverwekkers toeneemt. Tijdens het testen werd opgemerkt dat het langzaam gieten van irrigatiewater door de Buchner trechter met een snelheid van niet meer dan 40 mL per seconde het sporenvangvermogen van het filterpapier verhoogde.
Om het detectieprotocol te valideren, werden ook watermonsters genomen uit het veld waar P. capsici vermoedelijk aanwezig waren (aanvullende figuur 1) om de ontworpen methode te testen met een praktisch scenario. Van de 7 geteste bedrijven waren er 3 positief voor de aanwezigheid van P. capsici met behulp van de LAMP-test (figuur 6A-6C), terwijl slechts één bedrijf positief was bij het gebruik van de conventionele PCR-test (figuur 6D), met LAMP als een gevoeligere test voor deze methode om irrigatiewater te testen. Hoewel, dit filter gebaseerde LAMP test dna kon detecteren van een concentratie zo laag als 1,2 x 102 zoösporen / mL die aanzienlijk minder dan de oorspronkelijke gevoeligheid van deze test (0,01 ng genomic DNA gelijk aan ~ 5 sporen) met ongefilterde zoospore suspensie. De vorige LAMP test van Dong et. al. (2015)20 werd uitgevoerd op dezelfde seriële verdunning en het gevoeligheidsniveau was hetzelfde (figuur 2F). Het niveau van detectie voor een PCR-test met ongefilterde sporenoplossing heeft ook een hoger detectieniveau (equivalent ~ 10 sporen) aangetoond, wat zeer vergelijkbaar was met de vorige PCR-gebaseerde bevindingen10. De detectielimiet van de traditionele aasmethode van detectie werd niet gecontroleerd omdat een enkele sporen infectie kan veroorzaken, afhankelijk van het individuele vermogen. De verminderde gevoeligheid gevonden in zowel LAMP en PCR testen is waarschijnlijk te wijten aan een aantal sporen stromen door of rond het filter papier, of eenmaal bevestigd aan het filter papier, niet kan worden geëxtraheerd met 100% efficiëntie. Niettemin kan dit nieuwe LAMP- en filtersysteem een veel hoger volume water verwerken en analyseren dan eerdere methoden en geeft het een hoger niveau van specificiteit en snelheid voor detectie in het veld.
Van de gebruikte extractiemethoden was de extractie op basis van magnetische kralen het snelst en was het gebruik van externe machines zoals een kraalklopper of centrifuge niet nodig voor extracties in het veld en complimenten voor het draagbare kenmerk van de LAMP-test. De op CTAB gebaseerde methode leverde de hoogste concentratie DNA op, maar nam de langste hoeveelheid tijd in beslag, terwijl de commerciële planten-DNA-extractiekit (bijvoorbeeld DNeasy) tweede was in zowel de benodigde tijd als de DNA-concentratie.
Met zowel CTAB en de commerciële plant DNA extractie kit, tijdens de homogenisatie van filter papier werd opgemerkt dat homogenisatie was succesvoller en leverde een hogere concentratie als de CTAB oplossing (of extractie buffer) werd toegevoegd aan de buis met de stukken filter papier voordat kraal slaan of hand homogenisatie begonnen. Kraal slaan werd gedaan 3 keer voor een minuut per stuk, maar vortexen en roeren de buis tussen elke ronde was noodzakelijk voor volledige homogenisatie in alle extractie methoden. Belangrijk is dat het filterpapier aan de zijkanten of onderkant van de buis vast komt te zitten, dus het is cruciaal om ervoor te zorgen dat het filterpapier van de muren is, zodat het wordt gehomogeniseerd.
De totale tijd die nodig is voor versterking is 90-120 min en kan gemakkelijk worden gedaan in het veld voor de diagnose ter plaatse. Deze filtermethode is ook ontworpen om aanzienlijke hoeveelheden water te filteren om de mogelijke kansen voor de detectie van de ziekteverwekker te vergroten. Deze methode is ook van toepassing op vele ziekteverwekkers die zich kunnen ophopen in een waterbron, met name geslachten zoals: Pythium, Phytophthora, Fusarium, en bacteriën; de enige verandering die nodig is, is de ontwikkeling van een even specifieke LAMP primer set voor de beoogde ziekteverwekker30.
Een aanzienlijke output van dit werk is de ontwikkeling van een zeer gevoelige en snelle filter papier gebaseerde LAMP test voor de detectie van P. capsici in irrigatiewaterbronnen. We verwachten dat deze studie zal leiden tot een toename van het bewustzijn van verontreiniging van gerecycleerd irrigatiewater, uiteindelijk een verbetering van het beheer van Phytophthora geassocieerde ziekten, en dus de productiekosten te verlagen en de gewasopbrengst te verhogen. Dergelijke informatie is hard nodig om de duurzaamheid van de plantaardige productie te verbeteren en de winstgevendheid van groenteproducties te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen of belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk kreeg de financiële steun van Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP00016659. De auteurs danken Dr Pingsheng Ji, Universiteit van Georgië en Dr Anne Dorrance, Ohio State University voor het verstrekken van pure culturen van Phytophthora spp. We danken ook Li Wang en Deloris Veney voor hun technische bijstand tijdens het onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
