Summary
Presenteras här är en fosfoproteomic strategi, nämligen stoppa och gå extraktionsspetsbaserad fosfoproteomic, som ger hög genomströmning och djup täckning av Arabidopsis fosfoproteome. Detta tillvägagångssätt avgränsar översikten över osmotic stress signalering i Arabidopsis.
Abstract
Proteinfosforylering är avgörande för reglering av enzymaktivitet och genuttryck under osmotiskt tillstånd. Masspektrometri (MS)-baserade fosfoproteomik har förändrat sättet att studera växtsignaltransduktion. Kravet på massor av utgångsmaterial och förlängd MS-mättid för att uppnå täckningsdjupet har dock varit den begränsande faktorn för den höga genomströmningsstudien av globala fosfoproteomiska förändringar i växter. För att förbättra känsligheten och genomströmningen av växtfosfoproteomik har vi utvecklat en stop and go-extraktion (steg) spetsbaserad fosfoproteomikmetod i kombination med Tandem Mass Tag (TMT) märkning för snabb och omfattande analys av växtfosforyleringsstörning som svar på osmotisk stress. Genom att utnyttja enkelheten och den höga genomströmningen av stegspetsteknik tar hela proceduren ungefär en timme att använda två tips för att avsluta fosfopeptidberikning, fraktionering och provrengöringssteg, vilket tyder på en lättanvänd och hög effektivitet av tillvägagångssättet. Detta tillvägagångssätt ger inte bara en djupgående växtfosfoproteomikanalys (> 11 000 fosfopeptididentifiering) utan visar också den överlägsna separationseffektiviteten (< 5% överlappning) mellan angränsande fraktioner. Vidare har multiplexering uppnåtts med hjälp av TMT-märkning för att kvantifiera fosfoproteomiska förändringar av vilda och snrk2 decuple mutanta växter. Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt använts för att avslöja fosforyleringshändelserna hos Raf-liknande kinaser som svar på osmotisk stress, vilket belyser förståelsen av tidig osmotisk signalering i landväxter.
Introduction
Hög salthalt, låg temperatur och torka orsakar osmotiska påfrestningar, vilket är en viktig miljöfaktor som påverkar anläggningens produktivitet1,2. Proteinfosforylering är en av de viktigaste postöversättningsmodifieringarna som förmedlar signaluppfattning och transduktion i växtrespons på osmotisk stress3,4,5. SNF1-relaterade proteinkinas 2s (SnRK2s) är involverade i osmotisk stresssignalering6. Nio av tio medlemmar av SnRK2-familjen visar betydande aktivering som svar på osmotisk stress7,8. Snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)mutant med mutationer i alla tio SnRK2 visade överkänslighet mot osmotic stress. I snrk2-dec mutant minskar den osmotiska stressinducerade ackumuleringen av inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscissyra (ABA) biosyntes och genuttryck kraftigt, vilket belyser SnRK2s vitala roll i osmotiskastresssvar 6. Det är dock fortfarande oklart hur SnRK2s kinaser reglerar dessa biologiska processer. Profilering av fosfoproteomiska förändringar som svar på osmotisk stress är ett effektivt sätt att överbrygga denna klyfta och avgränsa de osmotiska stressutlösta försvarsmekanismerna i växter.
Masspektrometri (MS) är en kraftfull teknik för kartläggning av växtfosfoproteome9. Karakterisering av växtfosfoproteomik är dock fortfarande en utmaning på grund av det dynamiska intervallet av växtproteom och komplexiteten hos växtlyat4. För att övervinna dessa utmaningar utvecklade vi ett universellt växtfosfoproteomiskt arbetsflöde, vilket eliminerar oönskade störningar som från fotosyntetiska pigment och sekundära metaboliter och möjliggör djup täckning av växtfosfoproteome10. Flera fosfopeptid anrikningsmetoder såsom immobiliserad metalljon affinitet kromatografi (IMAC) och metalloxid kromatografi (MOC) har utvecklats för berika fosfopeptider före MS analys11,12,13,14,15,16. Sura icke-fosfopeptider som samrenar med fosfopeptider är de största interferenserna för fosfopeptiddetektering. Tidigare standardiserade vi pH-värdet och organisk syrakoncentration av IMAC-belastningsbuffert för att eliminera bindningen av icke-fosfopeptider, för att erhålla mer än 90% anrikningsspecifikitet som kringgår förfraktionssteget11.
Provförlust i flerstegsprocessen av fosfopeptidberikning och fraktionering hämmar känsligheten hos fosfopeptididentifiering och djupet av fosfoproteomisk täckning. Stop-and-go-extraktionsspetsar (scentips) är pipettspetsar som innehåller små skivor för att kapa spetsens ände, som kan införlivas med kromatografi för peptidfraktionering ochrengöring 17. Provförlusten under stegspetsproceduren kan minimeras genom att undvika provöverföring mellan rören. Vi har framgångsrikt implementerat stegspets i Ga3 +- IMAC och Fe3 +-IMAC för att separera låga rikliga flera fosforylerade peptider från singly fosforylerade peptider, vilket förbättrade djupet av mänskliga fosfoproteome15. Dessutom har användningen av hög pH omvänd fas (Hp-RP) stegspets visat den bredare täckningen av mänskliga membran proteome jämfört med den för stark katjon utbyte (SCX) och stark anjon utbyte (SAX) kromatografi18. Att integrera IMAC- och Hp-RP-stegspetstekniker kan därför öka anläggningens fosfoproteome-täckning med enkelhet, hög specificitet och hög genomströmning. Vi har visat att denna strategi identifierade mer än 20 000 fosforyleringsplatser från Arabidopsis plantor, vilket representerar ett förbättrat djup av växtfosfoproteome19.
Här rapporterar vi ett stegspetsbaserat fosfoproteomiskt protokoll för fosfoproteomisk profilering i Arabidopsis. Detta arbetsflöde tillämpades för att studera fosfoproteomic stör av vilda och snrk2-dec mutant plantor som svar på osmotic stress. Fosfoproteomic analys visade fosforylering platser inblandade i kinas aktivering och tidiga osmotic stress signalering. Jämförande analys av vilda och snrk2-dec mutanta fosfoproteome data ledde upptäckten av en Raf-liknande kinas (RAF)-SnRK2 kinas kaskad som spelar en nyckelroll i osmore stress signalering i höga växter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provberedning
- Skörda de kontroll- och stressbehandlade plantorna (1 g) i en aluminiumfolie och blixt frysa proverna i flytande kväve.
OBS: Högre proteinkoncentration observeras vanligtvis från två veckor gamla plantor än från mogna växter. Ett gram plantor genererar cirka 10 mg proteinlyat, vilket räcker för MS-analysen. Alla centrifugeringssteg sker vid 16 000 x g i steg 1. - Mala frysta plantor i ett fint pulver med en mortel och mortel fylld med flytande kväve.
- Tillsätt 1 ml lysbuffert ((6 M guanidin-HCl i 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) med 10 mM Tris (2-karbidetyl)fosfinhydroklorid (TCEP), 40 mM 2-kloroacetamid (CAA), proteashämmare och fosfatashämmare cocktails) till mortel och blanda med hjälp av mortel.
- Överför växtlyset till ett 1,5 ml-rör och värm vid 95 °C i 5 minuter.
- Placera röret på is i 10 minuter. Sonicate röret på is i 10 s, pausa i 10 s och upprepa tre gånger.
- Centrifugera röret i 20 min och alikvot 150 μL växtlyat i ett 1,5 ml-rör.
- Tillsätt 600 μL 100% metanol i röret. Virvel och snurra ner röret.
- Tillsätt 150 μL 100% kloroform i röret. Virvel och snurra ner röret.
- Tillsätt 450 μL ddH2O i röret. Virvel och centrifugera röret i 3 min.
- Kassera det övre vattenhaltiga lagret. Tillsätt 600 μL 100% metanol i röret. Centrifugera röret i 3 minuter och kassera sedan lösningen.
- Tvätta proteinpellets med 600 μL 100% metanol. Kassera lösningen och lufttorka proteinpelleten.
- Återanvänd proteinpellets i 600 μL matsmältningsbuffert (12 mM natriumdeoxycholat (SDC)/12 mM natrium lauroylsarcosinat (SLS) i 100 mM Tris-HCl, pH 8,5). Sonicate röret tills suspensionen är homogeniserad.
- Mät proteinkoncentrationen med hjälp av ett BCA-kit och justera koncentrationen till 4 μg/μL med rötningsbufferten. Överför 100 μL lysat (400 μg-proteiner) till ett nytt rör.
- Tillsätt 292 μL 50 mM triethylammoniumbikarbonat (TEAB) och 8 μL Lys-C (2,5 Unit/ml) i röret. Inkubera röret vid 37 °C i 3 timmar.
- Tillsätt 100 μL 50 mM TEAB med 8 μg trypsin till röret. Inkubera röret vid 37 °C i 12 timmar.
- Tillsätt 25 μL 10% trifluoracetisk syra (TFA) till röret. Virvel och centrifugera röret i 20 min vid 4 °C.
- Överför supernatanten till en konditionerad avsaltningskolonn för avsaltning. Torka eluatet med en vakuumcentrifugkoncentrator.
OBS: Aktivera hartset med 1 ml metanol följt av 1 ml 0,1% TFA i 80% acetonitril (ACN). Tvätta bort det organiska lösningsmedlet med minst 3 ml 0,1% TFA i 5% ACN. Ladda försurade peptidprover som bereds i steg 1.16 i kolonnen och tvätta sedan kolonnen med minst 3 ml 0,1% TFA i 5% ACN. Fler tvättar kan behövas för prover med höga saltkoncentrationer. Elute fosfopeptiderna med 1 ml 0,1% TFA i 80% ACN.
2. TMT-märkning (Tandem Mass Tag)
- Återanvänd de torkade peptiderna till 100 μL 200 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazinetanesulfonsyra (HEPES), pH 8,5.
- Lös upp TMT-reagenset för varje kanal (0,8 mg) i 40 μL vattenfri ACN. Virvel TMT reagensrör i 5 min och snurra ner det.
- Överför 40 μL TMT till provröret och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
OBS: I detta experiment var kanal 126 till 128 märkt med tre biologiska replikat av växter utan mannitolbehandling, och kanalen 129 till 131 var märkt med tre biologiska replikat av växter med mannitolbehandling. - Tillsätt 8 μL hydroxylamin och inkubera i 15 minuter.
- Blanda 6 prover i ett 5 ml-rör och tillsätt 14 μL 10 % TFA.
- Tillsätt 3 876 μL 0,1 % TFA till röret. Vortex och snurra ner.
- Överför lösningen till en konditionerad avsaltningskolonn för avsaltning. Torka eluatet med en förångare.
3. Förberedelse av IMAC-scenspets
- Använd en 16 G trubbig nål för att penetrera en polypropylenfritskiva.
OBS: Håll fräsen vinkelrätt mot skivans yta och rulla fräsen ett par gånger för att se till att skivan är helt struken. Placera disken i en Petri-skål för förvaring. Placera nålen i en 200 μL pipettspets och tryck in friten i spetsen med en kolv. - Tryck försiktigt in friten i spetsen med en kolv för att kapa spetsens ände.
- Placera spösskivan i spetsar med samma tryck, vilket ger bättre reproducerbarhet. Reproducerbarheten av stegspetsar produktion är viktigt för konstant ryggtryck, vilket påverkar tidpunkten för centrifugering steg och reproducerbarhet mellan tekniska replikat.
- Om scenspetsarna visar högt ryggtryck under konditioneringssteget, kassera spetsarna för att undvika potentiell spets igensättning när du laddar prover. Det kan vara så att disken kan ha tryckts för hårt på plats.
- Invertera Ni-NTA spinnkolonn och placera på ett 1,5 ml-rör.
- Använd en kolv för att trycka försiktigt på friten med Ni-NTA-pärlor och tryck in pärlorna i röret.
OBS: Se till att trycka försiktigt på spösen för att undvika potentiell pärlförlust eller adsorption på spinnkolonnen.
4. Förberedelse av Hp-RP-scenspets
- Förbered hp-RP-scenspets enligt beskrivningen för IMAC-scenspets med en C8-disk.
OBS: Använd inte stor kraft på disken eftersom det kan resultera i en tätt packad spjälst och öka scenspetsens ryggtryck. Alla centrifugeringssteg sker vid 1 000 x g i 5 min i steg 4. - Suspendera 1 mg C18-pärlor i 100 μL 100% metanol och skicka pärlorlösningen genom spetsen.
- Tillsätt 20 μL buffert 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10,0) till scenspetsen och passera bufferten 8 genom spetsen genom centrifugation.
- Tillsätt 20 μL buffert A (200 mM NH4HCO2) till scenspetsen och passera bufferten A genom spetsen genom centrifugering.
OBS: Balansera centrifugen under användning och se till att Hp-RP-scenspetsen inte är helt torkad.
5. Förberedelse av spinnadapter
- Använd skarpa änd pincett för att punktera ett hål i mitten av locket på ett 1,5 ml-rör.
- Sätt in IMAC-scenspetsen eller Hp-RP-scenspetsen i spinnadapterns hål.
OBS: Se till att scenspetsen inte är nära botten av rotationsadaptern.
6. Fosfopeptidberikning med IMAC-scenspets
- Suspendera 10 mg Ni-NTA-pärlor med 400 μL lastbuffert (6% ättiksyra (AA), pH 3.0) och ladda alla pärlor lösning i per spets. För lösningen genom spetsen med centrifugation.
OBS: Alla centrifugeringssteg sker vid 200 x g i 3 min i steg 6 förutom steg 6.8. - Ladda 100 μL 50 mM etylendiamintetraacetsyra (EDTA) för att ta bort nickeljonerna från IMAC-scenspetsen och föra lösningen genom spetsen genom centrifugering.
- Ladda 100 μL lastbuffert till scenspetsen och för lösningen genom spetsen med centrifugering.
- Ladda 100 μL 50 mM FeCl3 i 6% AA till scenspetsen och för lösningen genom spetsen genom centrifugation. Fe3+ joner kommer att kelatera till IMAC-scenspetsen.
- Lasta 100 μL lastbuffert för att konditionera scenspetsen och för lösningen genom spetsen genom centrifugering.
- Ladda 100 μL lastbuffert med provpeptider beredda i steg 2,7 till scenspetsen och för lösningen genom spetsen genom centrifugation.
OBS: Ta ett nytt rör som spinnadapter för att samla in genomflödet av prov och förvara genomflödet i frysen för framtida analys. - Ladda 100 μL tvättbuffert (4,5 % AA och 25 % ACN) på scenspetsen och för lösningen genom spetsen genom centrifugering.
- Utför den andra tvätten med laddningsbuffert. Ladda 100 μL lastbuffert till scenspetsen och för lösningen genom spetsen med 1000 × g centrifuge i 3 minuter.
OBS: Se till att tvättbufferten byts ut mot lastbuffert i scenspetsen för att eliminera förlusten av fosfopeptider under elueringssteget. Balansera IMAC-scenspetsen före fosfopeptide-eluering för att säkerställa att koncentrationen av ACN är under 5%. - Trimma IMAC-scenspetsen framtill med en sax och placera den trimmade IMAC-scenspetsen inuti Hp-RP-spetsen. Se till att de två lagren av scenspetsar inte vidrör centrifugens lock.
7. Phosphopeptide fraktionering med Hp-RP C18 stegspets
- Tillsätt 100 μL elueringsbuffert (200 mM ammoniumfosfat (NH4H2PO4))till den trimmade IMAC-scenspetsen och för lösningen genom de två skikten av stegspetsar genom centrifugering.
OBS: Om lösningen inte passerar genom scenspetsen, öka hastigheten på spinn ner. Alla centrifugeringssteg sker vid 1 000 x g i 5 min i steg 7. Alla Hp-RP-buffertar visas i tabell 1. - Kassera IMAC-scenspetsen med en pincett och tillsätt 20 μL buffert A till Hp-RP-scenspetsen och skicka bufferten genom spetsen genom centrifugering.
OBS: Se till att all elueringsbuffert passerar genom IMAC-scenspetsen innan du kasserar den. - Tillsätt 20 μL buffert 1 för att eluera fraktion 1 och samla eluatet i ett nytt rör genom centrifugering. Upprepa processen med buffertarna 2, 3, 4, 5, 6, 7 och 8 för att samla varje fraktion i ett nytt rör. Torka det slutliga eluatet för varje fraktion med hjälp av en vakuumkoncentrator.
OBS: Förbered nya fraktioneringsbuffertar. Ta 8 nya rör som spinnadapter för varje fraktion. Samla eluaten för varje fraktion i en annan spinnadapter. Fosfopeptider är inte stabila under grundläggande förhållanden, så torka eluaterna med en koncentrator eller försuras med 10% TFA omedelbart.
8. LC-MS/MS-analys och dataanalys
- Tillsätt 5 μL 0,1 % myrsyra (FA) och analysera provet med en masspektrometer.
- Kör en 90 min övertoning med 6-30% buffert B (80% ACN och 0,1% FA) för varje fraktion.
- Fragmentera de 10 bästa märkta peptiderna med hjälp av hög kollisionsenergidisociation (HCD). Slutför en databassökning för att identifiera fosforyleringsplatser.
- Läs in de råa filerna i MaxQuant-programvaran, namnge experimenten och ställ in bråktal och PTM.
Obs: Handledningen av MaxQuant programvara finns på https://www.maxquant.org/. - Välj reporterjon MS2 i typen av LC-MS/MS-körning och 6plex TMT som isobariska etiketter. Aktivera filter efter PIF-funktion och ställ in min PIF som 0,75.
- Välj Acetyl (Protein N-term), Oxidation (M) och Phospho (STY) till panelen med variabla modifieringar. Välj Carbamidomethyl (C) som fasta modifieringar.
- Ställ in matsmältningsläget som specifikt, välj Trypsin/P som matsmältningsenzym och två missade klyvning.
- Ställ in PSM false discovery rate (FDR) och protein FDR som 0,01. Ställ in minimipoängen för modifierade peptider som 40.
- Lägg till Arabidopsis thaliana databas till panelen av fasta filer och kör databassökning.
- Ladda txt-filen för Phospho (STY) -webbplatser till Perseus-programvaran när sökningen görs.
Obs: De detaljerade handledningarna av Perseus programvara finns på https://www.maxquant.org/perseus/. - Filtrera bort de omvända fosforyleringsplatserna. Filtrera bort de olokaliserade fosforyleringsplatserna med lokaliseringssannolikhet 75% som cut-off.
- Använd fosforyleringsplatsernas intensiteter för statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera prestandan hos detta arbetsflöde utnyttjade vi IMAC-scenspets i kombination med Hp-RP stegspetsfraktion för att mäta de fosfoproteomiska förändringarna i vilda och snrk2-dec mutantplantor med eller utan mannitolbehandling i 30 minuter. Varje prov utfördes i biologiska triplikater och det experimentella arbetsflödet representeras i figur 1. De smälta peptiderna (400 μg) i varje prov var märkta med en TMT-6plex kanal, poolade och avsaltade. Fosfopeptiderna berikades ytterligare med hjälp av en IMAC-scenspets, och de renade fosfopeptiderna fraktionerades därefter till åtta fraktioner av en Hp-RP-scenspets. Varje fraktion analyserades av en 90 min LC gradient analys. De råa filerna genomsöktes med hjälp av en sökmotor mot Arabidopsis thaliana databas.
Totalt identifierades 11 077 unika fosfopeptider motsvarande 3 630 fosfoproteiner med 6 852 lokaliserade fosforyleringsplatser (klass I, lokaliseringssannolikhet > 0,75), vilket indikerar den breda täckningen av Arabidopsis fosfoproteome. Totalt identifierades 8 107 respektive 7 248 fosfopeptider från mutantprov av vildtyp respektive snrk2 dec. Detta illustrerar arbetsflödets effektivitet när det gäller att tillhandahålla djupgående täckning för att beskriva den globala synen på signaltransduktion i Arabidopsis. Vi jämförde antalet identifierade fosfopeptider över 8 fraktioner. Några fosfopeptider identifierades i de två första fraktionerna, fraktionen 1 och 2. Majoriteten av fosfopeptiderna var dock jämnt fördelade i resten 6 fraktioner (Figur 2A), vilket tyder på att detta tillvägagångssätt ger förmågan att separera komplexa fosfopeptider från växten fosfoproteome. För att ytterligare visa separationseffektiviteten i detta arbetsflöde utvärderade vi överlappningen av fosfopeptider mellan två intilliggande fraktioner (eq. F1-till-F2). Mindre än 5% fosfopeptider överlappar varandra i de intilliggande fraktionerna, vilket indikerar robust fraktioneringseffektivitet hos Hp-RP-scenspetsen (Figur 2B).
Med hjälp av de data som erhållits av arbetsflödet jämförde vi de fosfoproteomiska profilerna av vilda och snrk2-dec mutant vid mannitolbehandling. Totalt 433 och 380 fosforyleringsplatser ökades efter mannitolbehandling i mutantprov av vildtyp respektive snrk2 dec (figur 3). Bland det visade 312 fosfositer induktion (FDR < 0,01) i vilda, men inte i snrk2-dec mutanta växter. Gen ontologi (GO) analys visade att funktionen av fosforylering och aktivering av proteinkinas, reglering av fosfat metabolisk process, signal transduktion, är betydligt berikade i SnRK2-beroende fosfoproteiner. Intressant nog berikades GO-termen relaterad till rotutveckling också i SnRK2-beroende grupp, i överensstämmelse med fenotypen av rottillväxt retardation under osmotisk stress6. Vi identifierade också 116 fosfositer uppreglerade av mannitol behandling i både vilda och snrk2-dec mutant. Dessa fosfoproteiner var oberoende av SnRK2, eller kandidater som förmedla osmotic stress-utlöst signalering före SnRK2s aktivering. Vi observerade att flera B4 undergrupp RAF såsom RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) och RAF42 (AT3G46920), var betydligt uppreglerade av osmotic stress. Ytterligare studie visade att RAF kinaser aktiveras snabbt av osmotic stress och krävs för fosforylering och aktivering av SnRK2s20.
Figur 1: Arbetsflöde för stegspetsbaserad fosfoproteomisk metod. Protein extraherades och smältes från vilda och snrk2-dec mutantplantor behandlas med eller utan mannitol. De smälta peptiderna i varje replikat var märkta med en unik TMT6-plexkanal. Fosfopeptider poolades och berikades sedan med hjälp av en IMAC-scenspets. De renade fosfopeptiderna separerades av en Hp-RP-scenspets. Varje fraktion analyserades av masspektrometer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Fosfoproteomisk profilering av vilda och snrk2 decuple mutantplantor med IMAC-scenspets och Hp-RP-fraktionering. A)Antalet identifierade fosfopeptider per fraktion. (B) Separationseffektiviteten hos den stegspetsbaserade Hp-RP-kromatografin. Överlappningen mellan de intilliggande fraktionerna representeras av procentandelen av samma peptid som identifieras i de intilliggande fraktionerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Kvantifiering av fosfoproteomiska förändringar som svar på osmotisk stress. Vulkantomter visar den log2-vikiga förändringen av fosforyleringsplatser i (A) vilda och (B) snrk2-dec mutantplantor som svar på mannitolbehandling. Den svarta cirkeln representerar kinasfosforyleringsplatserna som induceras av mannitol. Den röda cirkeln anger fosforyleringsplatserna för RAFs uppreglerade som svar på mannitol. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Buffert A | 200 mM ammoniumformat (NH4HCO2), pH 10,0. | |
| Buffert B | 100% ACN. | |
| Buffert 1 | 5% Buffert B, 95% Buffert A. | |
| Buffert 2 | 8% Buffert B, 92% Buffert A. | |
| Buffert 3 | 11% Buffert B, 89% Buffert A. | |
| Buffert 4 | 14% Buffert B, 86% Buffert A. | |
| Buffert 5 | 17% Buffert B, 83% Buffert A. | |
| Buffert 6 | 20% Buffert B, 80% Buffert A. | |
| Buffert 7 | 23% Buffert B, 77% Buffert A. | |
| Buffert 8 | 80% Buffert B, 20% Buffert A. | |
Tabell 1: Buffertar för hp-RP-stegspetsfraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det dynamiska området och komplexiteten hos växtproteom och fosfoproteome är fortfarande en begränsande faktor till djupet av fosfoproteomiska analyser. Trots förmågan hos LC-MS/MS-analys med enkel körning att identifiera 10 000 fosforyleringsplatser21,22, är täckningen av hela växtfosfoproteom fortfarande begränsad. Därför krävs ett fosfoproteomiskt arbetsflöde som ger hög känslighet och överlägsen separationseffektivitet för att profilera den globala synen på växtsignalnätverk som svar på miljöbelastning. Kommersiell högtrycksvätskakromatografi (HPLC) kolumnbaserad kromatografi är en vanlig metod för att minska peptidkomplexiteten föreMS-analys 23,24. Tråkiga provsamlingssteg och stor elueringsvolym är dock de största utmaningarna med HPLC-baserade metoder när det gäller känslighet och dataflöde. stegtips är ett alternativt tillvägagångssätt för att utföra peptidförfraktion eller anrikning för högkänslighet och hög genomströmningsarbeten. Denna nya fosfoproteomic arbetsflöde exploatera isobaric märkning i kombination med fosfopeptid anrikning och fraktionering ger bättre täckning och djup av växtfosfoproteomics över andra fosfoproteomic arbetsflöden25,26.
PH-värdet av prover är den avgörande faktorn som bestämmer berikningsspecifikiteten hos fosfopeptider. PH-värdet kan påverkas av det föregående steget i provberedningen, så det är viktigt att kontrollera pH-värdet före provbelastning. Om pH-värde flyttas tillsätts ättiksyra eller natriumhydroxid till proverna för att justera pH-talet till 3,0. Vi utför detta protokoll för samtidig eluering och lastning av fosfopeptider på C18 stegspets. Därför är det viktigt att jämvikta IMAC-scenspetsen före fosfopeptid eluering för att säkerställa att koncentrationen av ACN är under 5%.
Antalet bråk är beroende av komplexiteten och urvalsstorlekarna. Vanligtvis är 5 till 8 fraktioner tillräckligt för att ge bred täckning av fosfopeptididentifiering i växter. Koncentrationen av ACN i fraktioneringsbuffertar kan justeras enligt provernas hydrofobiska. De flesta fosfopeptider är eluerade från C18 pärlor med intervallet 5% till 25% ACN koncentration. Fosfopeptider är vanligtvis mer hydrofila jämfört med icke-fosforylerade peptider på grund av fosfatgruppens ytterligare negativa laddningar. Märkning av TMT-reagens på N-ändstation av peptid leder dock till en ökning av hydrofobin hos märktapeptider 27, som kan förklara varför färre fosfopeptider identifierades i de två första fraktionerna i vårt fall (Figur 2A). Således kan ett test med hjälp av ett TMT-noll-reagens och en alikvot av prover användas för att utvärdera antalet fraktioner och ACN-koncentrationen i varje fraktioneringsbuffertar. De optimerade buffertarna kan resultera i bättre separationseffektivitet hos TMT-6plex märkta fosfopeptider.
Begränsningarna för stegspetsbaserad fraktionering är antalet fraktioner och kapaciteten hos tips. Det är svårt att utöka antalet fraktioner i stegspetsseparation eftersom diskontinuerliga övertoningsbuffertar används för stegspetsfraktion. Å andra sidan kan en kontinuerlig övertoning tillämpas på HPLC-kolumner för att uppnå ett högt fraktionsnummer. Tipsens kapacitet är en annan faktor som begränsar tillämpningen av scentips. För storskalig fosfoproteomikanalys (> 10 mg proteiner) är det bättre att använda HPLC-baserad berikning med längre kolumnlängd packad med fler C18-pärlor och fraktionering, vilket ligger utanför den analytiska skalan av scenspetsar. Sammantaget är stegspetsbaserad fosfopeptidberikning och fraktionering en användbar metod för liten till medelhög skala av fosfoproteomiska analyser. Detta tillvägagångssätt kan integreras med isobarisk märkning för att uppnå multiplexerad kvantifiering. Resultaten visade också att det kunde användas för djupgående växtfosfoproteomikprofilering och kvantifiering. Detta arbetsflöde är tillämpligt på andra arter och olika vävnadstyper för avgränsning av specialiserade signalnätverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det strategiska prioriterade forskningsprogrammet för Den kinesiska vetenskapsakademin, Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
- Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
- Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
- Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
- Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
- Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
- Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
- Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
- Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
- Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430 (2015).
- Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068 (2018).
- Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
- Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
- Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
- Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
- Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
- Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613 (2020).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
- Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
- Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
- Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).
