Summary
Bu protokol, düşük maliyetli bir mikroenjeksiyon sisteminin inşasını, derin beyin yapılarına stereotaksik implantasyonunu ve uyanık ve sınırsız sıçanlarda tetrodotoksin zamanlanmış mikroenjeksiyon prosedürünü açıklar. Amaç, hipotalamik yapıların nöral aktivitelerini engelleyerek yumurtlamanın düzenlenmesine katılımını ortaya çıkarmaktır.
Abstract
Yumurtlamanın düzenlenmesinde beynin rolünü incelemek için birçok deneysel yaklaşım kullanılmıştır. Örnekler arasında, her ikisi de hedef alanın bütünlüğünü kalıcı olarak bozan invaziv yöntemler olan nöronal grupların lezyonu ve sağırferentasyonu say verilebilir. Bu yöntemlere akut ve zamansal düzenleyici mekanizmaların analizini etkileyebilecek ikincil etkiler eşlik eder. Belirli beyin bölgelerini hedefleyen kılavuz kanüllerin stereotaksik implantasyonu, ardından bir iyileşme dönemi, araştırmacıların ameliyatın istenmeyen etkilerinin ortadan kalkmasından sonra farklı ilaçları mikroenject etmelerini sağlar. Tetrodotoksin, çeşitli fizyolojik süreçlerde birkaç beyin bölgesinin rollerini belirlemek için kullanılmıştır, çünkü sodyuma bağımlı eylem potansiyellerini geçici olarak inhibe eder, böylece hedef bölgedeki tüm sinirsel aktiviteyi engeller. Bu protokol, bu yöntemi, östrous döngüsünün herhangi bir aşamasının belirli zamanlarında yumurtlamanın düzenlenmesinde ayrı beyin bölgelerinin rolünü ortaya çıkarmak için östrous döngüsünün ve yumurtlamanın değerlendirilmesi için stratejilerle birleştirir. Anesteziklerin ve stres hormonlarının yumurtlama üzerinde uyguladığı bloke etme etkilerinden kaçınmak için uyanık ve sınırsız sıçanlar(Rattus norvegicus)kullanılmıştır. Bu protokol, farklı fizyolojik süreçleri incelemek için diğer türlere, beyin hedeflerine ve farmakolojik ajanlara kolayca uyarlanabilir. Bu yöntemde gelecekteki iyileştirmeler, kılavuzüller yerine küçük çaplı cam kılcal damarlar kullanılarak bir mikroenjeksiyon sisteminin tasarlanmasını içerir. Bu, implantasyon sırasında hasar gören doku miktarını azaltacak ve aşılanan ilaçların hedef alan dışına yayılmasını azaltacaktır.
Introduction
Yumurtlama, her estral/adet döngüsünde bir veya daha fazla olgun oositin yumurtalıklardan salındığı süreçtir. Tüm memeli türleri üremek için gametlerin üretimine bağlı olduğu için, yumurtlamayı düzenleyen mekanizmaların anlaşılması biyotıp, hayvancılık endüstrisi ve nesli tükenmekte olan türlerin bakımından geniş alanlarda büyük bir etkiye sahiptir. Yumurtlama, birkaç hipotalamik ve ekstra hipotalamik alanı, ön hipofizdeki gonadotropları ve oositlerle birlikte yumurtalıkların içindeki yumurtalık köklerini oluşturan theca ve granüloza hücrelerini içeren hipotalamik-hipofiz-yumurtalık ekseni ile düzenlenir1.
Yumurtalık folikülleri, folikül uyarıcı hormonun tonik ve phasic salgılanmasına ve gonadotroplar tarafından salgılanan iki gonadotropin olan luteinize edici hormona yanıt olarak büyür, gelişir ve sonunda yumurtlar. Gonadotropin salgılama patörü, uygun foliküler gelişim ve yumurtlama için çok önemlidir ve gonadotropin salgılayan hormon (GnRH)1,2tarafından düzenlenir. Bu nöropeptid, bazal diencephalon boyunca dağılmış nöronlar tarafından sentezlendi ve daha sonra hipotalamus ve ön hipofizini birbirine bağlayan portal vaskülat salgılandı. GnRH-nöronların salgı aktivitesi, çeşitli beyin yapılarından kaynaklanan sinaptik girdi ile modüle edilir. Bu yapılar, yiyeceklerin mevcudiyeti, fotoperiyodun uzunluğu ve kandaki hormonların konsantrasyonu da dahil olmak üzere organizmanın dış ve iç ortamının durumu hakkında bilgi aktarır. Bu anlamda, her türün üreme düzenini şekillendiriyorlar ve yumurtlamayı yöneten mekanizmaların düzgün bir şekilde anlaşılması için bu tür yapıların belirli rolleri belirlenmelidir. Örnek olarak, östrous döngüsü sırasında estradiol seviyelerindeki dalgalanmanın GnRH salgısını düzenlediği gösterilmiştir; bununla birlikte, GnRH-nöronları bu tür değişiklikleri tespit etmek için gereken estradiol reseptör izoformını ifade etmez. Bu reseptörleri ifade eden iki nöron popülasyonu, sırasıyla üçüncü ventrikülün rostral periventriküler bölgesinde ve arcuate çekirdeğinde ve GnRH-nöronları ile stablish sinapslarında bulunur. Bu nöronların estradiol konsantrasyonunu yorumladığını ve daha sonra GnRH salgısının güçlü bir indüktörü olan kisspeptin'i serbest bırakarak GnRH-nöronlarının aktivitesini uyardığını gösteren kanıtlarvardır 3.
Thermik veya kimyasal lezyonların yanı sıra mekanik sağırferentasyonu içeren deneyler, araştırmacıların yumurtlama4,5 , 6 , 7 ,8,9,10,11,12'nin düzenlenmesinde birkaç beyin yapılarının katılımını belirlemelerine izinverdi. . Bununla birlikte, bu deneyler invaziv ve travmatik olmanın dezavantajıdır, tedavinin etkilerini değerlendirmeden önce birkaç gün iyileşme gerektirir ve tedavinin akut etkilerinin analizini engeller. Ayrıca hedeflenen alanları kalıcı olarak etkiler ve uzun vadede diğer fizyolojik süreçleri bozar. Bu sorunlar nedeniyle, bu deneylerin sonuçları genellikle hayvanın vücudundaki homeostatik telafi edici mekanizmalar tarafından gizlenmektedir ve alanın dahil olduğu zamansal düzenleyici dinamikler hakkında doğru bilgi almak oldukça zordur.
Nöronların aktivitesini geçici olarak bozan ilaçların kılavuz kanüller aracılığıyla mikroenjeksiyonu, yukarıda belirtilen dezavantajları aşan uygun bir alternatiftir. Kanüller stereotaksik bir ameliyatla herhangi bir beyin bölgesine yerleştirilecek ve araştırmacının ameliyatın şaşırtıcı etkileri ortadan kaybolduktan sonra ilaç tedavisine başlamasını sağlar. İlaçların zamanlanmış mikroenjeksiyon, araştırmacıların bölgenin sürecin belirli bir adımına katkısı ile ilgili hipotezleri test etmelerini sağlar ve uyanık kısıtlanmış veya serbest hareket eden hayvanlarda gerçekleştirilebilir. Lokal anestezistler, agonistler, antagonistler, ters agonistler ve tetrodotoxin (TTX) gibi biyolojik toksinler de dahil olmak üzere çeşitli ilaçlar belirli zamanlarda ilgi alanına mikroenjeksiyon yapılabilir.
TTX, kirpi balığının vücudunda yaşayan bakterilerin yanı sıra diğer omurgalılar ve omurgasızlar tarafından sentezlenen biyolojik bir toksindir. TTX, sodyum kanallarının seçici ve geçici ablukası yoluyla sinirsel aktiviteyi susturur, bu da sodyuma bağımlı eylem potansiyellerinin inhibisyonu ile sonuçlanır. TTX varlığında, hücreler depolarizasyon aşamasında bir değişiklik yaşarlar ve bu nedenle heyecan verici değildir, ancak canlı kalırlar. TTX'in bloke etkisi moleküler bileşimi ile açıklanmaktadır: bir guanidinium grubu sodyum kanalının hücre dışı yönünden geçebilir, ancak molekülün geri kalanı boyutu nedeniyle geçemez, bu nedenle sıkışmıştır ve kanal13 , 14,15,16,17'yi engeller. . TTX'in etki mekanizması, sinir sistemini hem in vitro hem de in vivo incelemek için bir araç olarak kullanılmasına izin verdi. Bu toksinin intraserebral enjeksiyonu, hafıza tutma18,uyku ve uyarılma 19 , yer tanıma20, mekansal navigasyon21, uyuşturucu bağımlılığı 22 , termoregülasyon23, şizofreni gelişimi24,cinsel davranış25ve yumurtlamanın düzenlenmesi26gibi çeşitli işlemlerde ayrı beyin bölgelerinin rolünü incelemek için kullanılmıştır. diğerleri arasında. Bu protokolde hipotalamik çekirdeklerin uyanık ve sınırsız sıçanlarda TTX mikroenjeksiyonu ile geçici inaktivasyonunun yumurtlaması üzerindeki etkileri açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren prosedürler Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Etik Kurulu, UNAM tarafından onaylandı. Bu kurum, meksika hayvan taşıma kurallarına, Resmi Norma: NOM-062-ZOO-1999'a sıkı sıkıya uygun olarak faaliyet göstermektedir.
1. İki taraflı canüllerin yapımı
- Paslanmaz çelik şaftı basınçlı cımbız kullanarak iki 23 G hipodermik iğnenin göbeğinden çıkarın ve ardından neşter bıçağı kullanarak kalan yapıştırıcıyı çıkarın.
- Şaftların künt ucundan 15 mm uzakta ince kalıcı bir işaretleyici ile bir çizgi çizin. Eğimli uçları çıkarmak için kesme cımbızı kullanın.
- 15 mm'lik parçaları ince hemostatlarla tutun ve 14 mm'lik boru parçaları elde edilene kadar bir döner alete bağlı bir kesme diski ile dik olarak bastırın. Bu adım, şaftların tıkalı kısmını ortadan kaldırmak için yapılır, açık ve künt uçlar oluşturur. Son olarak, herhangi bir iç tıkanıklığı ortadan kaldırmak için segmentlere 30 G'lik bir iğne yerleştirin.
- Beynin sol ve sağ yarımkürelerindeki ilgi yapıları arasındaki mesafeyi bir beyin atlası yardımıyla belirleyin27. İki 14 mm'lik parçayı bir mikroskop kaydırağından bağlamak ve her ikisinin de aynı yatay seviyede olduğundan emin olmak için kalıplama kilini kullanın. Bir oküler mikrometre (10x) ile gözlemleyin ve istenen mesafe elde edilene kadar parçaları ince cımbızla ayarlayın.
- Lehim macunu% 10 hidroklorik asitle 2:1 oranında karıştırın ve parçaların künt ucunun 2 mm altına bir damla karışım ekleyin. Lehimleme demiri ve 0,5 mm çapında lehim teli kullanarak her iki segmenti de tek bir nokta ile lehimler. Lehim parçaların lümenini engellemediğinden emin olun.
- 10 mm'lik esnek 0,3 mm paslanmaz çelik tel segmentini keserek, canülleri stereotaks tutucuya takmak için bir destek oluşturun. Bir önceki lehim noktasıyla temas eden telin 2 mm'sini ve geri kalanının de canüllerin künt ucunun üzerine sermek için kalıplama kili kullanın. Kabloyu konservelere lehimle.
- Lehim macunun fazlalığını gidermek için kanüllerin yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin. Metalik parçacıkları gidermek için kanolün içini steril suyla yıkayın. Mikroskop altında 10x büyütmede parçacık tespit edene kadar bu işlemi tekrarlayın.
2. Obturatörlerin ve kapakların yapımı
- Obturatörleri oluşturmak için yuvarlak paslanmaz çelik yumuşak telden (0,35 mm çapında) iki adet 16 mm'lik parça kesin. Hemostatlı, laboratuvar tezgahına dik iki taraflı bir canül tutun ve bu segmentlerden birini tezgaha ulaşana kadar her bir makula yerleştirin. Kalıntıyı 90° açıyla bükün.
- Kapaklar için iki adet 2 mm'lik silikon boruyu kesin (iç çap=0,76 mm) ve her segmentin uçlarından birine bir damla silikon yapıştırıcı uygulayın. Tutkalın boruya girmesine izin vermeyin. En az 24 saat kurulayın.
3. Mikroenjektörlerin yapımı
- Şaftları oluşturmak için 30 G hipodermik iğne kullanarak 1.1.
- Millerin künt ucundan 18,5 mm aralıklarla bir çizgi çizin ve eğimli uçların kalıntılarını kesme cımbızı ile çıkarın.
- 1.1. adımı tek bir 23 G iğneyle tekrarlayarak künt uçtan başlayarak 6 mm uzunluğunda iki segment keserek adaptörler oluşturun.
- 6 mm'lik parçaların tıkalı kısımlarını, iki adet 4 mm adaptör elde edilene kadar kesme diskine dik bir şekilde bastırarak ortadan kaldırın. herhangi bir iç tıkanıklığı ortadan kaldırın.
- 30 G segmentinin eğimli ucunun adaptörlere yerleştirin. Her ikisinin de, segmentlerin ve adaptörlerin sonunun aynı seviyede olduğundan emin olmak için bir stereomikroskoptan bakın. Distal ekleme pamuklu çubuk kullanarak siyanoakrilat tutkal uygulayın ve 15 dakika kurumaya bırakın.
- İki Teflon boru konnektörünü% 70 etanolde 5 dakika bekletin ve ardından adaptörler aracılığıyla mikroenjektörlere takın. Konektörlerin çapı en az 24 saat küçülene kadar bekleyin ve ardından konektörlerin zarar görmesini önlemek için mikroenjektörü düşük sıcaklık yöntemiyle sterilize etmeyin (etilen oksit sterilizasyonu önerilir).
4. Hayvan bakımı ve vajinal lekeler
- 230 ila 260 gram ağırlığında döngüsel yetişkin dişi kapüşonlu sıçanlar(Rattus norvegicus, CIIZ-V suşu) kullanın. Sıçanları 14:10 açık-koyu fotoperiyodlu bir odada standart polipropilen kafeslerde dört kişilik gruplar halinde barındırın. Sıcaklık ve nemi sırasıyla 22 ± 2 °C ve % 40 olarak ayarlayın. Gıda ve su reklam libitumsağlayın.
- Her gün 10:00-12:00 saatleri arasında vajinal smear alın.
- İç çapı 1 mm olan modifiye edilmiş bir bakteriyolojik döngüyü alkol lambası kullanarak sterilize edin ve steril suyla soğutun. Sıçanı güvenli bir kavrama ile tutun ve iç duvarlarına dokunarak vajinaya 5 mm bakteriyolojik döngü sokun. Bakteriyolojik döngüyü çıkarın. Başarılı olursa, uçta bulutlu bir düşüş görülecektir. Bu damlayı mikroskop slaydına yerleştirin.
- Her sıçan için bu işlemi tekrarlayın ve her hayvan arasındaki döngüyü sterilize edin ve soğutun.
- Damlalar kuruduktan sonra hematoksilin-eosin ile lekeleyin ve örnekleri 10x'te mikroskop altında gözlemleyin.
- Her smear üzerindeki lökositlerin, epitel çekirdekli hücrelerin ve keratinize hücrelerin oranını belirleyin ve şekil 1'debildirilen östrous döngü aşamalarının kriterlerine göre sınıflandırın , önceki literatür28,29ile aynı fikirdedir.
5. Canüllerin stereotaksik implantasyonu
NOT: Düzenli bir aseptik stereotaksik cerrahi sonrasında ve kurumsal normlara uygun olarak kanüllerin implantasyonunu gerçekleştirin.
- Ameliyattan önce
- Cerrahi aletleri, kanülleri, cerrahi vidaları, obturatörleri, gazlı bezleri ve ahşap pamuklu çubukları bir buhar otoklav kullanarak ameliyattan 24 saat önce sterilize edin. Metalik aletlerin arka arkaya ameliyatlar arasındaki uçlarını% 10 hidrojen peroksit ve ardından su ile temizleyerek sterilize edin ve ardından sıcak boncuk sterilizatörüne yerleştirin.
- Hayvanı evden çıkarmadan önce çalışma alanlarını ve stereotaksik aleti hazırlayın. İşlem sırasında kirlenmeyi önlemek için hayvanı ameliyat masasından mümkün olduğunca uzak bir alanda ameliyata hazırlayın.
- Hazırlık ve ameliyat alanlarını% 70 etanol ile temizleyin ve ardından on dakika boyunca% 10 klorür çözeltisi uygulaması yapın. Stereotaksik aletin tabanını, çerçevesini ve manipülatörlerini % 70 etanol ile temizleyin ve kulak çubuklarının uçlarını sıcak boncuk sterilizatörü kullanarak sterilize edin ve ameliyattan önce hava soğutun.
- Özel bir laboratuvar önlüğü, yüz maskesi, baş bone, cerrahi kollar, ayakkabı örtüleri ve cerrahi eldivenler giyerek ameliyatı gerçekleştirin. Asistandan hayvanları ameliyata hazırlamasını ve işlem sırasında genel durumlarını kontrol etmesini isteyin.
- Canül stereotaks tutucuya takın. Asistandan ameliyat edilecek ilk hayvanı odaya getirmesini isteyin. Laboratuvarımızdan yapılan gözlemler, bu hayvanların diğer aşamalarda çalıştırılan sıçanlardan daha hızlı uygun östrous döngülerini geri kazandığını gösterdiğinden, muhtemelen strese verilen yanıt östrous döngüsü ile birlikte değiştiğinden, ameliyat için diestrus'ta sıçanları seçin.
- Hayvanı tartın ve bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı sıçanlar için bir indüksiyon odasında% 100 oksijende% 4 izofluran ile anesteziye neden olabilir. Hayvanları strese sokarak önlemek için odayı önceden doldurmayın. Sağ refleksin kaybını gözlemledikten sonra gözbebeği genişlemesini ve kuyruk ve kulak çimdikleme testlerinin ölçttürü olduğu gibi ağrı kaybını kontrol ederek cerrahi bir anestezi düzlemini onaylayın.
- Bir izoflurane buharlaştırıcı yoksa, ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçanı uyuşturun.
- Sıçanı indüksiyon odasından çıkarın ve % 100 oksijende% 2.5 izofluran ile anestezinin etkilerini korumak için hazırlık tablosunda bir burun konisi kullanın. Saç derisinin saçını makasla kesin ve gevşek saçları bir tiftik silindiri ile çıkarın. Steroidal olmayan bir antienflamatuar/analjezik ve antibiyotik olarak sırasıyla 2 mg/kg Meloxicam ve 5 mg/kg Enrofloksasin preoperatif deri altı dozu enjekte edin.
- Ameliyat sırasında oluşmamak için her göze hypromelloz yapay gözyaşı uygulayın.
- Hayvanı stereotaksik alete, yırtılmayan kulak çubukları ve anestezi maskesi kullanarak bir ısıtma yastığının üzerine monte edin. Hayvanın başının düz olduğundan emin olmak için burun kelepçesini ayarlayın. Tıraşlı bölgede sabunlu povidone-iyot ile bir kez %70 etanol arasında değişen ve daha sonra iki kez povidone-iyot ve %70 etanol kullanarak cerrahi bir ovma yapın. İşlem sırasında hayvanın sıcaklığını kaydetmek için bir rektal termometre yerleştirin ve ardından steril bir cerrahi alanla örtün.
- Ameliyat sırasında
- Tıraş edilen bölgenin ortasında ciltte ve kasta 2 cm'lik bir kesi yapmak için neşter kullanın. Hedef koordinatları hesaplamak için kullanılacak yer işaretleri olan bregma veya lambda'yı ortaya çıkarmak için% 2 hidrojen peroksit ile kaplanmış bir pamuklu çubuk kullanarak periosteumu kafatasından çıkarın. Dönüm noktasının daha iyi görselleştirilmesi için kafatasını hava ile kurutun.
- Kanülleri tercih edilmiş dönüm noktasının hemen üzerinde bir konuma taşımak için stereotaksik cihazın manipülatörlerini kullanın. Ön-arka ve medial-lateral koordinatları stereotaksik aletten kaydedin ve hedef alanın koordinatlarını beyin atlası27'yegöre hesaplamak için kullanın.
- Hesaplanan koordinatları stereotaksik alete ayarlayın ve damarın ucunu kafatasının yüzeyine yerleştirin. Dorsal-ventral koordinatı kaydedin ve hedef bölgeye derinliği hesaplamak için kullanın.
- Manipülatörün kolunu çerçeveden sökerek çıkarın. Kraniyotomi yapılacak yerde bir iz bırakmak için 15.000 rpm hızında bir döner alete bağlı bir diş çapağı kullanın. Daha sonra çapak kullanarak üç delik açın ve işaretin etrafında eşkenar üçgen oluşturun. Bu delikler kafatasını delmemeli. Cerrahi vidaları deliklere yerleştirin ve sıkıca yerleştirildiklerinden emin olabilirsiniz.
- Kraniyotomiyi her yarımkürede hedef alanlar arasındaki mesafeyi karşılayacak kadar geniş hale getirin. Çapı mümkün olduğunca küçük olmalı, ancak kafatasının sınırlarına dokunmadan kanüllerin indirilmesine izin verecek kadar büyük olmalıdır, çünkü bu yörüngeyi değiştirecektir. Kraniyotomiyi mümkün olan en düşük basıncı uygulayarak kademeli olarak gerçekleştirin. Kemirgen kafatası sadece birkaç milimetre kalınlığındadır ve aşağıdaki dokuların bütünlüğünü korumak çok önemlidir.
- Dura mater görünür olduktan sonra, kemik kıymıklarını çıkarmak ve menenjitlerde ön-arka kesim yapmak için ucu 90 ° açıyla kavisli steril bir 21 G iğne kullanın. Hedef alan orta çizgiye yakın bir yerde bulunuyorsa üstün sagittal sinüsün zarar görmesini önlemek için Wirtshafter ve iş arkadaşları30 tekniğini kullanın.
- Kanül ile tutucuyu çerçeveye yerleştirin ve ventral koordinata ulaşmak için dorsal-ventral manipülatörü kullanın. İğnenin inerken kenarlıklara temas etmediğini kontrol edin ve gerekirse kraniyotomi çapını artırın.
NOT: Kılavuz canüllerin ucunun ilgi çekici bölgenin 0,5 ila 2,0 mm üzerinde bir bölgeyi hedeflemesi önemlidir. Bu, yabancı cisimlerin tanıtımına ve dokunun tahrip olmasına yanıt olarak beynin enflamatuar reaksiyonlarından kaynaklanmaktadır. Bu, özellikle ilgi alanı küçükse ve çalışma mesafesinin ampirik olarak önceden hesapılması gerekiyorsa kritik öneme sahiptir.
- Kanül ile tutucuyu çerçeveye yerleştirin ve ventral koordinata ulaşmak için dorsal-ventral manipülatörü kullanın. İğnenin inerken kenarlıklara temas etmediğini kontrol edin ve gerekirse kraniyotomi çapını artırın.
- Canülleri kafatasına takmak için diş çimentosu uygulayın ve kurumasını bekleyin. Diş çimentosunun kanüllerin künt ucunun üzerini kapatmamasını sağlayın, çünkü bu onu geri döndürülemez bir şekilde engelleyecektir. Çimento tamamen katılanınana kadar bekleyin.
- Daha fazla tıkanıklığı önlemek ve çalışma sırasında açıklığı sağlamak için obturatörleri yerleştirin. Kirlenmeyi önlemek için silikon kapağı takın.
- Ameliyattan sonra
- Kayıp sıvıları fizyolojik bir sıcaklıkta 1,0 mL steril salin çözeltisinin intraperitoneal enjeksiyonu ile değiştirin. Hayvanı anesteziden iyileşene kadar termal destekle bir geri kazanım kafesine yerleştirin. Hayvanın sıcaklığını ve ocağını / solunum hızını periyodik olarak kontrol edin. İzofluran etkileri gaz akısının kesilmesinden sonra birkaç dakika sürerken ketamin/ksilazin etkileri 40-50 dakika sürer.
- 48-72 saat boyunca antibiyotik, analjezik ve antienflamatuar ilaçların (daha önce belirtilen dozlarda ve rotalarda) ameliyat sonrası enjeksiyonlarını sağlayın ve deney geri kalanı için hayvanları günlük olarak yakından inceleyin. Herhangi bir ağrı, stres veya kilo kaybı belirtisini veteriner hizmetlerine veya laboratuvarın eğitimli bir üyesine bildirin. Bu süre zarfında sıçanlara başka bir manipülasyon yapmayın.
- Ameliyat sonrası tedaviden sonra vajinal smear almaya başlayın ve hayvan dört günlük ardışık üç östrous döngüsü gösterene kadar yapmaya devam edin.
NOT: Kronik juguler kateterler cerrahi olarak implante edilebilir, araştırmacının estradiol, progesteron, testosteron, luteinize edici hormon, folikül uyarıcı hormon ve kortikosteron gibi hormonların salgısını analiz etmek için seri kan örnekleri almasına izin verir. Hayvan beyin ameliyatından iyileştikten sonra böyle bir kateter yerleştirmenizi öneririz, çünkü bu hayatta kalma oranını artırırken aynı zamanda uzun bir iyileşme süresinden neden olabilecek kateterin tıkanmasını önler.
6. Tetrodotoksin elleçleme ve çözümlerin hazırlanması
DİkKAT: TTX bilinen en toksik maddelerden biridir. İskelet kaslarına ve sinir dokusuna etki eder. Temas yoluyla zehirlenme olası değildir, ancak herhangi bir açık yara vücuda aşılama için potansiyel bir yoldur. TTX ile çalışırken temel endişeler, toksinle temas etmiş keskin aletlerle cildin delinmesi ve ağız, göz ve mukoza zarlarına ulaşabilecek aerosollerin üretilmesidir. Doza bağlı olarak, TTX teneffüs edilirse, yutulursa veya cilt tarafından aşılanırsa ölümcül olabilir. Gözlerin güçlü tahrişine neden olur. LD50 farelerde oral ve intravenöz uygulama ile test edilmiştir ve sırasıyla 334 μg / kg ve 7.3 μg / kg'dır. Şu anda antitoksin mevcut değildir.
NOT: inaktive edici madde, 0.25 N NaOH veya % 10 çamaşır suyu çözeltisi olan veya olmayan% 1.0 NaOCl'dir. Tam inaktivasyon 30 dk maruz kaldıktan sonra gerçekleşir. TTX, %10'un altındaki bir konsantrasyonda, otomatik olarak veya 500 °F'den düşük bir sıcaklıkta kuru ısı sterilizasyonu ile türetilen herhangi bir klorür tarafından tamamen inaktive edilemez. TTX ile ilgili tüm prosedürler, iç ve dış nitril eldiven, özel laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlüğü, tek kullanımlık yüz maskesi, kapalı ayakkabı ve tam boy pantolon giyen iki bilgili kişi tarafından yapılmalıdır.
- Stok çözeltisinin hazırlanması
- Dökülme durumunda kirlenmeyi önlemek için duman kaputuna inaktive madde ile ıslatılmış bir ped yerleştirin. Başlamadan önce duman kaputunun düzgün çalıştığından emin olun. Pipet uçlarını atmak için inaktive çözeltisi ile bir kap hazırlayın.
- Steril TTX sitrat sitülize tozu, steril suni beyin omurilik sıvısı ile son derece dikkatli ve yavaş bir titrasyon ile üretici talimatlarına göre yeniden uygulayın ve işlem sırasında şişenin duvarlarını durulayın. Köpük ve aerosol oluşumundan kaçının. Canlı hayvanların beynine enjekte edildiğinden, TTX çözeltisinin kirlenmesini önlemek için aseptik bir teknik izleyin. TTX şişelerinizde aerosol oluşumunu önlemek için dış zar varsa mikropipette yerine iğneli şırınga kullanın.
- Stok çözeltisini steril mikro tüplere aliquot. Dondurma/çözme döngüleri moleküllerin stabilitesini değiştirebileceğinden, aliquotları mümkün olduğunca küçük hale getirin. Tüplerin yarısından fazlasını doldurmayın, çünkü su dondurulduğunda hacmi artar, bu da kapağın açılmasına ve tüpün ve kapta depolanan diğer numunelerin kirlenmesine neden olabilir.
- Tüplerin dışını ve TTX'in kullanıldığı yüzeyleri inaktivat maddesi ile arındırın. Tüpleri -20 °C'de ikincil bir kabın içindeki şişe kutusunda saklayın.
- Stok çözeltisini çalışma konsantrasyonuna seyreltme
- Seyreltilmiş çözeltiler daha az kararlı olduğundan, kullanılacakları gün taze seyreltilmiş çözeltiler hazırlayın. Duman kaputuna inaktivasyon maddesi ile ıslatılmış bir ped ve üzerine bir mikro tüp rafı yerleştirin. Pipet uçlarını atmak için inaktive çözeltisi ile bir kap hazırlayın.
- Stok çözeltisini steril bir mikrotüpün altına pipetleyin ve ardından 10 ng / μL konsantrasyon elde etmek için hesaplanan yapay beyin omurilik sıvısı miktarını ekleyin. TTX tozunun yeniden askıya alınması için açıklandığı gibi, şişenin duvarlarını durulayarak ve köpük ve aerosol oluşumunu önleyerek son derece dikkatli ve yavaş bir titrasyon gerçekleştirin.
- Dondurucuda bulunan numuneler mikroenjeksiyon için kullanılacaksa, deneyden önce en az bir saat oda sıcaklığında dengelenmelerine izin verilmelidir.
7. TTX veya araç çözümlerinin serbestçe hareket eden sıçanlara mikroenjeksiyon
- Mikroenjeksiyon pompasını deneye göre infüzyon oranı ve toplam enjeksiyon süresi ile yapılandırın. Hedef yapının kapladığı hacmi ve enjekte edilecek çözelti miktarını göz önünde bulundurarak bu parametreleri önceden hesaplayın. Bu deney için toplam 4 dakikalık bir infüzyon süresi için dakikada 50 nL hızında 200 nL çözelti enjekte edin.
- İki adet 10 μL Hamilton şırıngasını steril damıtılmış su ile doldurun, her mikroinjektörün boru konektörüne bir parça steril Teflon boru yerleştirin, boru uzunluğunun sıçanın hareketini kısıtlamamasını sağlayın (tüp etilen oksit kullanılarak sterilize edilebilir).
- İnaktive edici madde ve üzerine 2 cm x 2 cm kare parafin filmi ile ıslatılmış bir ped yerleştirin. Pipet enjektörün iğnesini ve filmin üzerindeki borunun 1 cm'sini doldurmak için yeterli miktarda TTX. Pistonu hafifçe geri çekerek TTX damlasını emin. Şırıngaları mikroenjeksiyon pompasına monte edin ve her mikroinjektörün ucunda bir damla TTX görülene kadar pistonu manipüle etmek için kontrollerini kullanın. Damlaları inaktive madde ile ıslatılmış ped içine atın.
- Mikroenjected olacak sıçanları seçin. Ameliyattan sonra sadece en az üç ardışık döngü gösteren sıçanları kullanın. Döngünün evresini ve günün saatini düşünün. Hem zaman hem de aşama, test edeceğiniz spesifik hipoteze bağlıdır, bu deney için 14:00 saat prosestrus seçilen, bu anda fason GnRH salgısını yöneten sinirsel preovülatör sinyaller meydana geldiğinden beri. Sıkıntıyı önlemek için enjeksiyonun kendi barınma kafeslerinin içinde gerçekleşeceği odaya taşıyın.
- Sıçanı sıkıca kavrayın, kapağı ve obturatörleri canüllerden çıkarın, mikroenjektörleri kılavuz damarlara yerleştirin ve hayvanı kafese geri koyun.
- Pompayı açın ve mikroenjeksiyon bitene kadar bekleyin. Mikroenjektörlerin olası bir kopuşlarını tespit etmek ve Teflon tüplerinin bükülmesini önlemek için bu süre zarfında hayvanı gözlemleyin.
- Çözeltinin reflüden kaçınmak için mikroenjektörleri iki dakika daha yerinde bırakın. Bunları çıkarın, implantın yüzeyini iodopovidon antiseptik çözeltisi ile temizleyin, kılavuz kanonların içindeki akışını önleyin. Steril obturatörler yerleştirin, kapağı takın ve hayvanı koloni odasına geri verin. İlacın olası yan etkilerini tespit etmek için hayvanı periyodik olarak gözlemleyin.
- Pompayı mikroenjeksiyon sırasındakiyle aynı parametrelerle açın ve işlem sırasında sistemin açıklığının korunup korunmadığını doğru bir akış olup olmadığını kontrol edin.
- Hava kabarcığı iğnenin ucuna ulaşana kadar TTX/aracı mikroenjektörden çıkarmak için pistona basın. TTX'i mikrotüpte hatırlayın. Şırınnayı damıtılmış suyla doldurun ve tüplerin içini temizlemek için kullanın. Suyu inaktive edici maddeye atın ve bu işlemi en az üç kez tekrarlayın. Şırıngaların, tüplerin ve mikroenjektörlerin dışını inaktivasyon maddesine batırılmış bir bezle temizleyin.
8. Ötenazi ve doku işleme
- Tahmin edilen veya vajinal olarak doğrulanan östrusun gününde, sıçana intraperitoneal aşırı doz sodyum pentobarbital (75 mg / kg) enjekte edin. Bilinç kaybını kontrol edin ve 7.1 ile 7.9 arasında açıklanan kılavuz ampuller aracılığıyla% 0.5 metilen mavi çözeltisinin 200 nL'sini enjekte edin. Parmak veya kuyruk kıstırma testini kullanarak ağrı belirtilerini kontrol edin ve hiçbiri tespit edilirse, kemirgen giyotini kullanarak sıçanın kafasını koparın.
- Karın boşluğunu açmak ve yumurtalıkları bulmak için makas kullanın. Her yumurtalığı kesmek için ince iris makası kullanın, bir büyüteç yardımıyla rahim-tubal kavşakta kesin. Yumurta kanalına zarar vermekten kaçının, çünkü bu oositlerin kaybına neden olacaktır.
- Yumurtalıkları stereomikroskop altına koyun ve organa zarar vermeden tüm yağ dokusunu çıkarmak için bir jilet kullanın. Ampulla bölgesinden mümkün olduğunca jiletle keserek her yumurtalıktan yumurtalığı çıkarın. Her yumurta kanalını farklı bir kaydıramaya monte edin ve bir damla su ile örtün. Yumurtalıkları Bouin'in çözeltisini içeren bir şişede saklayın.
- Yumurta kanallarını emici bir kağıt havlu ile hafifçe kurulayın ve stereomikroskop altında ampulla arayın. Baskın olmayan el ile ampulla uzak bir yere 23 G iğne ile sıkıştırarak yumurta kanalını yerinde tutun, ardından ampullanın orta bölgesinde 1 mm'lik bir kesi yapmak için baskın elde 23 G'lik bir iğne daha kullanın. Kümülüs-oosit kompleksleri kesiden viskoz sıvı damlası olarak çıkıntı yapacaktır(Şekil 2D). Damlayı yumurtalıktan yavaşça ve yavaşça çekmek için baskın eldeki iğneyi kullanın. İçinde oosit kalmadığından emin olmak için ampulla kalıntısına basın. Yumurta kanallarının çıkarılması oositleri geri döndürülemez bir şekilde içine hapsedeceğinden, yumurta kanallarından mümkün olduğunca hızlı bir şekilde oositleri çıkarın.
- Yumurta kanalını slayttan çıkarın ve oositleri içeren sıvı damlası kuruyana kadar bekleyin. Örneği hematoksilin-eosin ile lekele. Kapak kaplamak için montaj ortamını kullanın. Her yumurtalığın döktüğü oosit sayısını belirlemek için mikroskop altında (10x) gözlemleyin.
NOT: Kardiyak perfüzyon ile kurban bu protokolde yapılmaz, çünkü oositler yumurtlamalarda sıkışıp kalacaktır ve bu nedenle yumurtlamayı değerlendirmek için histolojik yöntemler gerekli olacaktır. Kullanıcının diğer dokuları analiz etmek için perfuse yapması gerekiyorsa, önce yumurtalıklar çıkarılabilir ve inen arterler fiksatif sızıntıyı önlemek için karaciğerin altındaki kalın hemostatlarla kenetlenebilir. - Başın derisini çıkarın ve kafatasını% 10 formalin çözeltisi ile bir cam kaba batırın. Dokunun bozulmasını önlemek için canülleri çıkarmadan önce başın en az on gün sabitlenmesine izin verin. Canül kaldırmak için, onu çevreleyen kafatası bölgesindeki tüm kasları ayırmak için makas kullanın. Burun ve frontal kemikler arasında kemik düzelticilerle kesin ve ardından oksipital kemiği çıkarın. Düzelticilerin ucunu foramen magnum'a yerleştirin ve burun kemiğinin kalıntısına ulaşan sagittal kretleri kesmeye başlayın.
- Kafatasının üst kısmının izole bölgesi ön ve parietal kemikleri içermelidir. Kafatasının tepesine takılan implante kanülü yavaşça dik olarak başa doğru çekerek çıkarın. Beynin deformasyonunu önlemek için menenjitlerin herhangi bir kısmını ince iris makası ile kesin.
- Menenjitlerde ön-arka kesim yapın ve beyni kafatasının tabanından çıkarmak için bir kenara koyun. Koku ampullerinin altına künt cımbız yerleştirin ve optik sinirler görünene kadar beyni hafifçe yukarı çekin. İnce iris makasıyla sinirleri kesin ve beyni çekin. Beyni fiksatif çözeltide koruyun.
- Bir vibratom kullanarak beynin 50 μm kalınlığında bölümlerini elde edin, poli-L-lizin kaplı slaytlara (damıtılmış suda% 0.1) monte edin ve Nissl tekniği ile lekeleyin. Bir sıçan beyin atlası27yardımıyla, kolayların son konumunu ( Şekil 2A-2C) ve boyanın yayılmasını belirlemek için mikroskop altındaki slaytları(10x)gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokol, tek bir TTX veya aracın (yapay beyin omurilik sıvısı) etkileri değerlendirilerek test edildi; ACSF) sıçanda yumurtlamanın düzenlenmesinde rol aldığı bilinen iki farklı çekirdeklerden birine mikroenjeksiyon: suprachiasmatic ve arcuate çekirdeği. Suprachiasmatic çekirdeği, memelilerde merkezi sirkadiyen kalp pilini içerdiğinden seçilmiştir. Gonadotropinlerin salgılanması olarak döngüsel olayların düzenlenmesinde rol oynar. Arcuate çekirdeği, östrous döngüsünün çoğunda GnRH salgısını uyaran estradiol reseptörlerini ifade eden bir nöron popülasyonu içerdiğinden seçilmiştir. Mikroenjeksiyon, gonadotropinlerin yumurtlama öncesi salınımını düzenleyen merkezi mekanizmaların çoğunun ortaya çıkması nedeniyle "kritik pencere" olarak bilinen bir dönem olan prosestrus evresinde saat 14:00'te gerçekleştirildi. Tedaviden sonra her gün vajinal smearlar alındı ve sıçanlar, östrusun vajinal smear özelliğine denk gelen tahmini östrus gününün saat 09:00'larında ötenaziye tabi tökezlendi. Ek bir kontrol grubu olarak, östrus aşamasında ötenazi yapılan beş sağlam sıçan kullanıldı. Ameliyattan sonra bisiklete binen hayvanların fraksiyonu ve her grubun yumurtlayan sıçanlarının (yumurtlayan sıçanlar/n) fraksiyonu Fisher'ın kesin olasılık testi kullanılarak hesaplandı ve analiz edildi. Her iki yumurtanın döktüğü yumurta sayısı Kruskal-Wallis testi ve ardından Dunn'ın testi ile analiz edildi. Örneklem boyutunun yeterli olduğundan emin olmak için uygun istatistiksel testler yapıldı.
İki hedef bölgeden birini hedefleyen kılavuzlu canüllerle toplam 30 dişi sıçan yerleştirildi. Şekil 3'tegösterildiği gibi, tüm hayvanlar ameliyattan önce döngüseldi, ancak sadece yedisinde canülasyon işleminden sonra östrous döngüsünde değişiklik göstermedi. Yirmi üç hayvan, lökosit smear ile gün sayısında bir artışla karakterize edilen döngülerinde geçici değişiklikler gösterdi. Bu tür değişiklikler muhtemelen ameliyatın neden olduğu strese bağlı ve yavaş yavaş azaldı. Beşinci döngüde yirmi sekiz sıçan döngüsel olarak kabul edildi ve kalan ikisi deneyden atıldı. Bu sonuç, dört östrous döngüsünden (16 gün) sonra, konserve hayvanların çoğunun daha fazla deney için uygun olduğunu göstermektedir.
Şekil 4A ve Şekil 4B, yumurtlayan hayvanların yüzdesini ve ova kulübesinin sayısını, sırasıyla, sağlam hayvanlar ve ACSF veya TTX ile tedavi edilen gruplar tarafından suprachiasmatic çekirdeğe tasvir eder. Tüm bozulmamış sıçanlar yumurtlandı ve aynı şey ACSF grubu için de geçerliydi. Bununla birlikte, hayvanların hiçbiri TTX ile mikroenjected yumurtladı. Aracın enjeksiyonu ova kulübesinin sayısını değiştirmedi. Bununla birlikte, salınan oositlerin canlılığını ve kalitesini değerlendirmek ilginç olacaktır. Benzer sonuçlar, arcuate çekirdeğine mikroenjakte edilmiş sıçanlar için Şekil 4C ve Şekil 4D'de de görülebilir. Her iki durumda da, bu yöntem, ilk olarak lezyon çalışmalarından çıkarılan ancak doğrulanamayan prosestrus evresinin kritik penceresinde yumurtlamanın düzenlenmesinde ayrı bir beyin bölgesinin katılımını kanıtlamıştır. TTX mikroenjeksiyonunun etkileri, önceki bir deney, suprachiasmatik çekirdeğe enjekte edilen sıçanların östrusun beklenen gününde yumurtladığını gösterdiğinden, kalıcı değil geçici gibi görünmektedir26. Bununla birlikte, hayvanların 24 saat ile veya serusun açık bir vajinal lekesi elde edilene kadar kurban edildiği kontrol gruplarının dahil edilmesi de bu sorunu ele almak için önerilir.
Şekil 5A-B'deki sonuçlar, ACSF veya TTX ile tedavi edilen hayvanların yumurtlama sonucunu temsil eder. Ancak histolojik doğrulamadan sonra belirlendiği üzere, halülleri amaçlanan bölgenin dışında yer aldı. Bu kanüllerin çoğu ön komiserliğe veya retrokiazmatik alana, yumurtlamanın düzenlenmesine katkıda bulunmayan iki alana yerleştirildi. Suprachiasmatic ve arcuate çekirdeği ile birlikte bu yapıların her ikisi de üçüncü ventrikülden çok yakındır, bunu göz önünde bulundurarak, ilacın ventriküle sızması durumunda tüm hayvanlarda yumurtlama ablukası beklenir. Hedeflerin dışındaki TTX mikroenjeksiyonunun yumurtlamayı engelleyememesi, seçilen oranda aşılanan TTX hacminin ventrikül içine sızmadığını, bu nedenle TTX'in bölgeye özgü etkilerini ortaya çıkarmıştır. Bu fikri desteklemek için, beyin dilimlerinin histolojik analizi sadece kılavuz kanüllerin ucuna yakın lekeli nöronlar gösterdi. Bununla birlikte, ilacın yayılmasına ilişkin doğrudan bir değerlendirme yapılmadığını ve bu nedenle bu sonucun daha fazla ele alınması gerektiğini açıklığa kavuşturmalıyız.
Şekil 1: Vajinal lekeler sıçan östrous döngüsünün her aşamasının temsilcisidir. Östrus (A) epitel desquamation sonucu kümülatif oluşturma tek başına bulunabilecek bir çekirdek olmadan epitel cornified hücrelerin varlığı için karakterizedir. Metestrus(B)içinde bu cornified hücrelerin bazıları hala mevcut olabilir, ancak Diestrus(C)de baskın hücre tipi olan lökositler tarafından sayıca azdır. Proestrus örnekleri (D) viskoz kıvam ve epitel çekirdekli hücrelerin baskınlığı ile karakterizedir. Her paneldeki ölçek çubuğu 10 μm'yi temsil eder.
Şekil 2: Ötanazi sonrası örneklerin histolojik incelemesi. Sağlam bir sıçanın(A),iki taraflı olarak konserve bir sıçanın(B)ve yanlış yerleştirilmiş bir kavunlu bir sıçanın(C)arcuate çekirdeği (ARC) ve ortanca saygınlık (EM) bölgesindeki beyin koronal bölümleri. Yıldız işaretleri, kılavuz ampullerin ucunun bulunduğu bölgedeki noktayı, B'de ventromedial çekirdeğin (VMH) bazal marjında çıkıntılı enjektörlerin ARC'ın üst marjına ulaşmasını sağlayan uçları gösterir. C'de bir kavun üçüncü ventrikülün (3V) içinde bulundu ve bu da lokalize olmayan bir ventrikül mikroenjeksiyonu ile sonuçlandı. Hedef orta çizgiye yakın bir yerde bulunduğunda ve bu hayvanlardan gelen veriler atılmalıdır. Düzgün bir şekilde gerçekleştirildiğinde, oositlerin ekstraksiyonu, panelde(D)görüldüğü gibi incelenen yumurta kanalından tüm oositleri içeren tek bir viskoz sıvı damlasına neden olmalıdır. Her paneldeki ölçek çubuğu 500 μm'yi temsil eder.
Şekil 3: Kanül implantasyonundan önce ve sonra bisiklete binen hayvanların kümülatif yüzdesi (***p≤0.0001; **p=0.0003 ve ameliyat öncesi döngü, Fisher'ın kesin olasılık testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hedef yapı #1'e mikroenjekte edilen hayvanlar tarafından dökülen ova sayısının interquartile aralığına (hata çubukları) sahip yumurtlayan hayvanların ve ortancanın yüzdesi (suprachiasmatic çekirdek, A-B) veya #2 (arcuate nucleus, C-D) ile yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) veya tetrodotoksin (TTX) prosestrus aşamasının 14:00'ünde. Bozulmamış grup karşılaştırma amacıyla her grafiğe eklendi ve çubukların içindeki sayı yumurtlayan kadınların fraksiyonunu temsil ediyor (sırasıyla Sağlam ve ACSF grupları, Fisher'ın kesin olasılık testi ve Kruskal-Wallis testi) ≤*p.0.01). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Şekerüllerinin hedef alanların dışında olduğu belirlenen hayvanlar tarafından yumurtalanan hayvanların (A) ve ova kulübesi (B) sayısının interquartile aralığına (hata çubukları) sahip ortanca yüzdesi. Bu hayvanlar saat 14:00'te prosestrüste yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) veya tetrodotoksin (TTX) ile mikroenjeksiyon edildi. Bozulmamış grup karşılaştırma amacıyla her grafiğe eklendi ve çubukların içindeki sayı yumurtlayan kadınların fraksiyonunu temsil ediyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, uyanık ve sınırsız sıçanların beyninde herhangi bir zamanda ayrı bir bölgeyi geçici olarak devre dışı bırakma yöntemi açıklanmaktadır. Östrous döngülerini izlemek ve yumurtlamayı değerlendirmek için basit bir yöntem de sağlanır. Bu protokol, TTX ile tedavi edilen hayvanların yumurtlama sonuçlarını araç tarafından tedavi edilenlerinkiyle karşılaştırarak belirli beyin bölgelerinin yumurtlamayı yönlendiren mekanizmalara katkısının basit bir analizine izin verir. Nörobilim laboratuvarlarında yaygın olan stereotaksik alet ve mikroenjeksiyon pompası dışında, bu yöntem pahalı malzemeler gerektirmez. Ticari kanüller ve mikroenjektörler bu tür bir deney için olağan seçimdir, ancak burada açıklanan yapımı kolay sistem maliyetleri düşürür ve sonuçlar ayırt edilemez. Bu protokol ve bu makaleye eşlik eden tabloda listelenen malzemeler kullanılarak, on hayvan için ticari bir kitin mal olacağı miktarda para harcanarak on kat daha fazla canül üretilebilir. Çalışma için gerekli özelleştirme ne olursa olsun, on bilateral canül inşaatı birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir. Ek olarak, tüm bileşenler yeniden kullanılabilir ve bu da maliyet etkinliğini artırır.
Fayda-maliyet oranı ile birlikte, bu protokol herhangi bir laboratuvar ortamı için uygundur, çünkü kemirgen manipülasyonu, stereotaksik cerrahi ve biyolojik toksinlerin ve ilgili atıkların işlenmesi bilgisi ile öğrenciler de dahil olmak üzere herhangi bir personel tarafından gerçekleştirilebilir. Ek olarak, tavşan, gelincik, marmosets dahil olmak üzere kemirgen ve diğer küçük memelilerin herhangi bir türünde ve hatta kuşlar ve sürüngenler gibi memeli olmayan türlerde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Yukarıda belirtilen özelliklerin yanı sıra, bu protokolün temel avantajı, çevresel organların aktivitesi, çevresel zorluklara homeostatik yanıt ve çeşitli davranışlar gibi beynin düzenlenmesi altındaki diğer süreçlerin incelenmesi için kolayca uyarlanabilmesidir.
İstenilen sonuçlara ulaşmak için denemeye başlamadan önce gerçekleştirilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, hedeflenen yapının koordinatları ampirik olarak hesapılmalıdır, çünkü beyin atlaslarında bildirilenler, zorlanmaları, cinsiyetleri veya yaşları nedeniyle çalışma için belirlenen hayvanlarla eşleşmeyecektir. Çeşitli çalışmalar, implante edilen elektrotların ve infüzyon problarının yaralı bölgenin işlevini sadece sinir cisimlerinin ve liflerin yok edilmesiyle değil, aynı zamanda glial hücrelerin aktivasyonuyla da değiştirdiğini göstermiştir. İmplantasyondan hemen sonra başlatılan enflamatuar reaksiyon tipik olarak yabancı cismlerin glial hücreler tarafından kapsüllenmesine neden olur. Bu hücreler, nörotransmitterlerin akışını engelleyen ve nöronları yerinden eden sıkı bir kılıf oluşturur ve nörodejenerasyon sürecini başlatır31. İmplantasyon prosedürünün zararlı etkilerinden kaçınılamaz ve bu tür etkilerin beyin bölgesinden mümkün olduğunca uzak gerçekleşmesini sağlamaya özen gösterilmelidir. Koordinatlar, kılavuzülleri hedef alana yerleştirmek için hesaplanmalıdır, ancak alanın en fazla% 10'unun canülden zarar görmemesini sağlayacak kadar büyükse. Bu yaklaşım, örneğin korteksin geniş alanlarının çalışılacaksa yararlıdır. Bu durumda bile implantın ilgi süreci üzerindeki etkilerinin hesaba katılması için kontrol grubunun detaylı bir analizi yapılmalıdır. Ayrık hipotalamik çekirdekler gibi küçük yapılar için araştırmacılara, kılavuz kanülleri beyin atlası(Şekil 2B)göre ön-arka ve medial-lateral düzlemlerde orta bölgedeki hedef yapının üst sınırından 0,5 ila 2 mm arasında değişen bir mesafeye yerleştirme koordinatlarını hesaplamalarını tavsiye ederiz. Bu yaklaşım için enjektörler hedefin sınırına ulaşacak kadar çıkıntı yapmak üzere tasarlanmalıdır. Bunu bu protokolde açıklanan iki çekirdek için test ettik ve bu sıçanların östrous döngülerini ve hedeflerin içine yerleştirilen kanüllere sahip hayvanlardan daha hızlı yumurtlama yeteneklerini geri bulduklarını bulduk.
Enjekte edilecek farmakolojik ajanların çözünürlüğü, araç çözeltisinin beyin omurilik sıvısına mümkün olduğunca benzemesi için düşünülmelidir. TTX, tek başına veya sitrat ile liyofilize bir toz olarak satın alınabilir. birincisi suda düşük çözünürlüğe sahiptir ve yeniden inşa etmek için 5.0 civarında pH'a sahip asidik bir tampon önerilir, ancak bu, aracın tek başına enjeksiyonları sonucunda dokuya zarar verme olasılığını ortaya çıkarabilir. Öte yandan, TTX sitrat, her ikisi de araç olarak yaygın olarak kullanılan suda veya% 0.9 tuzlu çözeltide çözülebilir. Bu araçların her ikisinin de kullanılmasına karşı tavsiye ediyoruz ve bunun yerine yapay beyin omurilik sıvısı veya Ringer'ın laktat çözeltisi kullanılmasını öneriyoruz. Daha önceki bir çalışma, suprachiasmatic çekirdeğe mikroenjected salin çözeltisinin östrus veya diestrus26'dagerçekleştirildiğinde yumurtlama üzerinde zararlı etkileri olduğunu göstermiştir. Birkaç makale, beyin omurilik sıvısının fiziksel ve kimyasal özelliklerine uymayan çözeltilerle sinir dokusunun perfüzyonunun nöronların anatomisini ve fizyolojisini değiştirdiğini ve enflamatuar yanıtları ve hücre ölümünü desteklediğini bildirmiştir32,33,34,35. Bu sonuçlar göz önüne alındığında, ilaçların beyne mikroenjeksiyonunu içeren tüm deneylerde yapay beyin omurilik sıvısının araç olarak kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
Deneylere başlamadan önce, araştırmacılar hem bitişik yapılara sızma hem de yetersiz kapsama alanı sonuçların yorumlanmasını karıştırabileceğinden, enjekte edilecek en uygun çözelti hacmini ampirik olarak belirlemelidir. Bu, suda çözünür bir boyanın berrak agar veya jelatin küplerine mikroenjecting ile gerçekleştirilebilir. Boyanın dağılımı daha sonra tahmin edilebilir ve beyin atlasında bildirildiği gibi hedefin beklenen boyutu ile karşılaştırılabilir. Yine de, hücresel yoğunluğu ve fiber yolların veya ventrikül sınırlarının varlığı gibi ilgi çekici beyin bölgesinin özellikleri difüzyon dinamiklerini etkileyecektir ve sonuçlar agar ve jelatin bulunanlardan farklı olabilir. Buna göre, araştırmacı daha sonra birkaç hayvanın hedef bölgesinde in vitro elde edilen parametreleri test etmelidir. Sıçanlarda intraserebral mikroinjeksiyonlar için belirli bir çözelti hacminin difüzyonunu belirlemek için birkaç boya başarıyla kullanılmıştır. En yaygın örnekler cresyl violet, thionine blue, metilen mavisi, Evan'ın mavisi, hızlı yeşili ve Hindistan mürekkepleridir. Bu boyalar damıtılmış suda% 0,5 veya daha düşük konsantrasyonda çözülür. Evan'ın mavisi, floresan mikroskopta (620 nm'de eksistasyon ve 680 nm'de emisyon) tespit edilebilir olma avantajına sahiptir ve yayılmanın daha nicel bir analizini sağlar. Lateks mikrobeadlar da bu yaklaşım için uygun olabilir. Mekanik hasar ve doku yer değiştirmesi meydana geldiğinden, 2.0 μL'den büyük hacimlerin bu teknikle beyne uygulanmaması gerektiğini belirtmek önemlidir36.
Çözeltinin akış hızı da kontrol etmek için önemli bir faktördür, çünkü yüksek hacimlerin yüksek hızda mikroenjeksiyon doku yer değiştirmesine ve mekanik lezyonlara neden olur40. Ek olarak, yüksek oranda infüzyon da ilacın yayılmasını arttırır ve komşu yapıların inaktivasyonuna neden olur. Bir çözeltinin kapsadığı alanda üç kat artış kadar, infüzyon oranının 100 nL/ 5 dakikadan 100 nL / 1 dakika36'yadeğiştirilmesinden kaynaklanabilir. Metilen mavisi enjekte edilen sıçan beyinlerinin histolojik gözlemleri, 50 nL/dakika infüzyon oranının, ilacı hedef bölgeye hapsederken dokuyu yerinden etmediğini göstermektedir (kişisel gözlemler). Bu sadece 200 nL'ye eşit veya daha düşük hacimlerle test edildi ve bu nedenle araştırmacılar daha büyük hacimler kullanılacaksa pilot deneyler yapmalıdır.
Çalışma hacmi belirlendikten sonra, her hayvandaki yayılmanın değerlendirilmesi önerilir. Bu, bu protokolde açıklandığı gibi, ilaçlarla birlikte bir boya enjekte ederek veya ötanaziden birkaç dakika önce enjekte edilerek yapılabilir. Eski model, boyanın toksinle birlikte yayılmasını sağlar, böylece etkilenen alanın daha doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu yöntemin bir dezavantajı, boyanın ilacın aktivitesine müdahale edebileceği ve ayrıca sitotoksik olabileceğidir. Son olarak, hayvanın enjeksiyon işleminden sonra birkaç gün hayatta kalması gerekiyorsa sinir dokusundan boşluk oluşabilir, bu da yayılma tahminini etkiler. Bu yaklaşım kullanılacaksa, araç+boya grubunun sonucu bozulmamış hayvanlarınkiyle karşılaştırılarak boyanın incelenen süreç üzerindeki etkileri ele alınmalıdır. Boya enjeksiyonu ötanaziden önce gerçekleşecekse, mikroenjeksiyon sırasındaki parametrelerin aynısını (infüzyon oranı ve hacmi) izleyerek yapılması önerilir. Bu, çözümün yayılmasına izin vermek için ötanaziden en az 10 dakika önce yapılmalıdır. Bu yöntemle, TTX/metilen mavisi çözeltinin 200 nL'nin 0,6 mm çapındaki bir küreyi kapsadığı ve mikroenjeksiyonun fedakarlıklardan 1 saat önce gerçekleşmesi durumunda dağılımın önemli ölçüde değişmediği bulunmuştur (kişisel gözlem). Bu, Freund ve meslektaşları37ve Zhuravin ve Bures38tarafından yapılan çalışmaya katılıyor Her ikisi de 1 μL TTX çözeltisinin yaklaşık 3 mm çapında küresel şekilli bir hacimde yayıldığını buldu. Genel olarak, ilacın dağılımının moleküler ağırlığına ve enjekte edilen hacme bağlı olduğu gösterilmiştir,39 ve yukarıda belirtilen sonuçlar, TTX'inkine benzer bir moleküler ağırlığa sahip boyaların difüzyonu ile eşleşir. Dispersiyonun daha doğru bir kontrolü gerekiyorsa, radyolabelli TTX enjeksiyonu veya piyasada bulunan antikorlarla düzenli TTX'e karşı immünostokimyanın uygulanmasıyapılabilir 37. İlacın kapsadığı alanın daha iyi bir şekilde belirtilmesinin yanı sıra, bu iki yaklaşım, hayvanın mikroenjeksiyondan birkaç gün sonra hayatta kalması durumunda göz önünde bulundurulması gereken TTX'in dokudan temizlenmesiyle sınırlıdır, öte yandan radyoaktif malzemenin çalışılması ve bertaraf edilmesi, tüm laboratuvarlar ve protokollerle uyumlu olamamış yeni adımlar ve güvenlik sorunları getirecektir.
Çalışılan sürecin düzenlenmesinde rolü olmayan bir beyin bölgesine enjekte edilen hayvanlardan oluşan bir kontrol grubunun dahil edilmesi önerilir. Bu grup, araştırmacının bu sürecin düzenlenmesinde hedef alanın özgüllüğünü belirlemesine yardımcı olacak ve herhangi bir yapıya enjekte edilen ilaçların, stresin veya bağışıklık ekseninin aktivasyonu gibi daha yaygın bir mekanizmaya dayanan bir engelleme sinyalini tetikleyebileceği olasılığını atacaktır. En çok denenen stereotaksik cerrahlar bile küçük yapılar hedeflendiğinde %100 başarı oranı elde edemediklerinden, bu deneylere genellikle istenilen yapının dışına yerleştirilen kanüller eşlik eder ve bu nedenle bu kontrol grubuna istemeden ulaşılır. Canüllerin yanlış yerleştirilmediği hayvanlardan elde edilen sonuçlar değerlidir ve atılmamalıdır; bunun yerine, enjekte edilen alan ve ilacın dağılımı göz önünde bulundurularak kapsamlı bir analiz yapılmalıdır. Özel ilgi alanları, hedeflere yakın bölgelerde enjekte edilen hayvanlarda farklı bir etki (veya hiç) gösteren sonuçlardır.
Bu protokol, canüllerin kronik yerleşiminin doğasında bulunan sınırlamalara sahiptir. Geçiş liflerinin ve nöronal cisimlerin kalıba yörüngesinde kalıcı olarak yok edilmesini önlemek mümkün değildir. Birkaç mikrometre uç çapına sahip cam kılcal damarların kullanımı, dokuya en az hasarla beyne ilaç ulaştırmak için tercih yöntemidir41. Bununla birlikte, bu metodoloji çoğunlukla hayvanın uyuşturulduğu ve / veya başın stereotaksik aparatlara veya diğer tutucu cihazlara bağlı olduğu deneylerde kullanılmıştır. Bu esas olarak kılcal damarın kendisinin kırılganlığından kaynaklanmaktadır, bu da onu uyanık ve sınırsız bir hayvana bağlamayı zorlaştırır. Kılavuz kanollar yerine ozmotik pompalara bağlı cam kılcal damarların kullanılan bir sistem, hasar gören beyin dokusu miktarında ve yaralanmaya glial yanıtta önemli bir iyileşme göstermiştir42. Bununla birlikte, bu sistemde, ilaçların infüzyonu zamanlanmış değil kroniktir ve bu nedenle enjeksiyon süresinin tam olarak kontrol edilmesi gereken deneylerde yararlı değildir. Daha önce yerleştirilen bir kılavuz damar aracılığıyla hedef bölgeye yerleştirilen cam kılcal damara dayanan bir mikroenjeksiyon sistemi Akinori ve meslektaşları tarafından tanımlanmıştır43. Bu sistem, uyanık bir hayvanın istenen zamanda enjeksiyonuna izin verir, ancak çok sağlam değildir ve işlem sırasında hayvanın kısıtlanması gerekir, bu da stres yanıtının aktivasyonuna neden olabilir. Bu protokolde kılavuz damarın yörüngesinde sinir dokusuna verilen hasarın etkileri sağlam ve araç grupları karşılaştırılarak kontrol edilebilir. Burada her iki grup için de benzer bir yumurtlama sonucu gösterildi ve etkilenen dokunun yanı sıra aracın enjeksiyonunun yumurtlamayı engellemediği sonucuna varıldı. Araştırmacılar, dorsal'ı hedef alanlarına yer alan ve renül tarafından yok edilecek yapıların çalışılan sürecin düzenlenmesinde yer alıp almadığını belirlemek için pilot çalışmalar yapmalıdır. Yine de, bu çalışma için gelecek vaat eden bir yön, hem kılavuzüllerin hem de cam kılcal damarların güçlü yönlerinden yararlanan bir teslimat sistemi tasarlamaktır.
Araştırmacılar için bir diğer önemli husus da TTX'in eylem zamanıdır. Zhuravin ve Bures38, TTX'in yaklaşık bir buçuk saat süren ve birkaç saat içinde kademeli olarak azalan maksimum sinirsel iletim ablukasına ulaşmasının birkaç dakika sürdüğünü göstermiştir. Bu, uzun süreli inaktivasyon gerektiğinde TTX'i tercih edilen ilaç haline getirir. Deney daha hızlı inaktivasyon gerektiriyorsa, maksimum ablukaya ulaşmak sadece birkaç saniye sürdüğünden lidokin gibi lokal anestezikler kullanılabilir. Bu ilacın etkileri 20 dakikadan az sürer ve TTX'ten daha ince bir zamansal çözünürlük sağlar. Yukarıda belirtilen özellikler, TTX'i daha az iyi tanımlanmış zamansal pencerelerde üretilen sinir sinyallerinin varlığını inceleyen keşif deneyleri için iyi bir araç haline getirmektedir. Öte yandan lidokin, bu pencereyi tanımlamak için yararlıdır44. Her iki ilacın da bir dezavantajı, geçiş liflerindeki eylem potansiyellerinin iletimini engellemeleri ve sinyalin enjekte edilen bölgeye aksonal projeksiyonlar gönderen farklı bir yapıdan gelebileceğinden, verilerin yorumlanmasında eserler getirmeleridir. Bu durumda hedef bölge dışında olduğu belirlenen enjeksiyonların dikkatli analizi çok önemlidir. Örneğin, bu makalede, TTX infüzyonunun suprachiasmatic çekirdeğin sadece ön kısmındaki bölgeye ve arcuate çekirdeği ile arasındaki bölgeye yumurtlamayı engellemediği gösterilmiştir. Bu sonuçlar, bu bölgelerdeki liflerin ve hücrelerin yumurtlamanın düzenlenmesinde yer almadığını ortaya koydu, bu da suprachiasmatic çekirdeği hem arcuate çekirdeği hem de GnRH nöronlarını içeren ön bölgelerle bağlayan karşılıklı bir lif çıtçıtının varlığı nedeniyle beklenmedikti.
Enjekte edilen bölgedeki geçiş lifleri boyunca iletimi engellemeyen bir alternatif, her ikisi de nörotransmitterlerin presinaptik terminaller tarafından salınması engellenen kobalt ve magnezyum gibi divalent katyonların kullanılmasıdır. Bununla birlikte, bu yaklaşımla ilgili sorun, inaktivat eyleminin ve yüksek toksisitenin çok kısasüresidir 44. Liflerin bloke olmasını önlemek için diğer seçenekler, her ikisi de belirli nöronal popülasyonların aktivitesinin manipülasyonu için stratejiler olan optogenetik ve kemogenetik yaklaşımlardır. Seçicilik, iyon kanallarına bağlı opsinler veya belirli promotörler altında ifade edilen değiştirilmiş reseptörler için kodlanan diziler eklemek için tasarlanmış viral vektörlerle nöronların transfeksiyonu ile kazanilir. Vektörün mikroenjeksiyoni, cam kılcal damarlar kullanılarak uyuşturulmuş hayvanlarda gerçekleştirilir ve çevre dokunun çok az bozulmasına neden edilir. Optik liflerin implantasyonu veya sentetik ilaçların sistemik enjeksiyonu, hedef popülasyonun çok hassas bir şekilde manipüle edilmesine izin verir45. Bu teknikler, tek başına veya bu protokolde sunulan TTX mikroenjeksiyon gibi tekniklerle birlikte bir çalışmada yararlıolmuştur 46. Yine de, ifade özgüllüğünün doğrulanması, transfected hücre sayısının kontrol edilmesi, toksisitenin değerlendirilmesi ve ışık ve kimyasal stimülasyonun yan etkilerinin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere başarılı deneyler tasarlamak için bu yöntemlerin çeşitli yönleri düşünülmelidir.
Bu protokolün kritik bileşenleri, her hayvan için östrous döngüsünün aşamasının uygun şekilde belirlenmesini içeriyordu. Bu prosedürü başarıyla gerçekleştirmek için vajinal epitelin kalite örneklerini almak ve sonuçları doğru yorumlamak çok önemlidir (Şekil 1'itakip etmenizi tavsiye ederiz). Ek olarak, araştırmacılar, yanlış miktarlarda ilacın enjeksiyonu ile sonuçlanabilecek hava kabarcıklarının birleştirilmesini önlemek için enjeksiyon sistemini dikkatlice doldurmalıdır. Ayrıca, hayvanların boruyu ısırmalarını veya sisteme başka bir şekilde müdahale etmelerini önlemek için mikroenjeksiyon sırasında izlenmesi de önemlidir. Son olarak, deneysel koşullara kör olan araştırmacılar, sonuçların yorumlanmasının tarafsız olmasını sağlamak için yumurtlamanın sonucunu, kanüllerin son konumunu ve çözeltinin hedef alana dağılmasını analiz etmelidir.
Burada, yumurtlamanın düzenlenmesinde beynin ayrık bölgelerinin katkısını analiz etmek için güvenilir, uygun maliyetli ve basit bir yöntem tanımlanmıştır. Bu prosedür uyanık ve sınırsız sıçanlarda, nörotransmisyonun ablukasının zararlı etkilerini ve ayrıca kortizol ve kortikosteron gibi stres hormonlarının GnRH salgılanmasına uyguladığı inhibitör etkileri aşarak gerçekleştirilir. Bu yöntem tamamen özelleştirilebilir ve herhangi bir ilacı beynin herhangi bir yapısına teslim etmek için kullanılabilir. Ek olarak, laboratuvarda kullanılan yaygın kemirgen ve kemirgen olmayan türler için kolayca uyarlanabilir. Son olarak, bu protokol, kandaki hormonlar ve metabolitler gibi maddelerin ölçülmesi, hücre ve dokulardaki gen ekspresyonunun değerlendirilmesi, nöronal aktivitenin kaydedilmesi ve ayrıca belirli beyin alanlarının çeşitli davranışsal ve fizyolojik süreçlerdeki rolünü belirlemek için davranış testlerinde uyanık hayvanların performansı için yöntemlerle birlikte kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu makaleye göre açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Acknowledgments
Washington Üniversitesi'nden Raymond Sanchez'e el yazması düzenlemedeki değerli yardımları ve M.Sc Georgina Cortés ve M.Sc Cintia Javier'e bu tekniğin standartlaştırılmasındaki teknik destekleri için minnettarız. Ayrıca Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ'deki veterinerlik hizmetleri üyelerine de minnettarız. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández ve MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán deney hayvanlarının mükemmel bakımı ve bakımı için. Bu protokolde açıklanan deneyler DGAPA-PAPIIT hibe numarası: IN216015 ve CONACyT hibe numarası: roberto Domínguez'e 236908 desteklendi. Carlos-Camilo Silva, Program de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) doktor öğrencisidir ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Hibe numarası: 294555) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J.
- Narahashi, T.
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
