Summary
Deze methodologie is gericht op het evalueren van biomateriaal cytotoxiciteit door de bereiding van oplosbare extracten, met behulp van levensvatbaarheidstests en fenotypische analyse, waaronder flowcytometrie, RT-PCR, immunocytochemie en andere cellulaire en moleculaire biologietechnieken.
Abstract
Biomaterialen komen direct of indirect in contact met de menselijke weefsels, waardoor het belangrijk is om de cytotoxiciteit ervan te evalueren. Deze evaluatie kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, maar er bestaat een grote discrepantie tussen de gebruikte benaderingen, waardoor de reproduceerbaarheid en de vergelijking tussen de verkregen resultaten in het gedrang komen. In dit artikel stellen we een protocol voor om de cytotoxiciteit van biomaterialen te evalueren met behulp van oplosbare extracten, die we gebruiken voor tandheelkundige biomaterialen. De extractenbereiding is gedetailleerd, van de productie van pellets tot de extractie ervan in een kweekmedium. De cytotoxiciteitsevaluatie van biomaterialen is gebaseerd op metabole activiteit met behulp van de MTT-test, levensvatbaarheid van cellen met behulp van de Sulphorhodamine B (SBR) -test, celdoodprofiel door flowcytometrie en celmorfologie met behulp van May-Grünwald Giemsa. Naast cytotoxiciteitsevaluatie wordt een protocol beschreven om de celfunctie te evalueren op basis van de expressie van specifieke markers die zijn beoordeeld door immunocytochemie en PCR. Dit protocol biedt een uitgebreide gids voor de cytotoxiciteit van biomaterialen en de evaluatie van cellulaire effecten, met behulp van de extractenmethodologie, op een reproduceerbare en robuuste manier.
Introduction
Biocompatibiliteit kan worden gedefinieerd als het vermogen van een materiaal om weefsel te integreren en een gunstige therapeutische respons te induceren, vrij van lokale en systemische schade 1,2,3. Biocompatibiliteitsevaluatie is cruciaal voor de ontwikkeling van elk materiaal dat bedoeld is voor medisch gebruik. Daarom biedt dit protocol een systematische en alomvattende aanpak voor elke onderzoeker die nieuwe biomaterialen wil ontwikkelen of nieuwe toepassingen voor bestaande biomaterialen wil bestuderen.
In vitro cytotoxiciteitstests worden veel gebruikt als de eerste fase voor biocompatibiliteitsevaluatie, met behulp van primaire celculturen of cellijnen. De resultaten vormen een eerste indicator van mogelijke klinische toepassing. Naast het feit dat het van vitaal belang is voor de ontwikkeling van biomaterialen, is deze test verplicht om te voldoen aan de huidige regelgeving voor marktintroductie, van EUA- en EU-regelgevers (FDA- en CE-certificering)4,5,6,7,8. Bovendien bieden gestandaardiseerde tests in biomedisch onderzoek een aanzienlijk voordeel in termen van reproduceerbaarheid en vergelijking van resultaten van verschillende studies op vergelijkbare biomaterialen of apparaten9.
De richtlijnen van de International Organization for Standardization (ISO) worden veel gebruikt door meerdere onafhankelijke commerciële, regelgevende en academische laboratoria voor het testen van materialen op een nauwkeurige en reproduceerbare manier. De ISO 10993-5 verwijst naar de in vitro cytotoxiciteitsbeoordeling en de ISO 10993-12-rapporten naar bemonsteringsvoorbereiding10,11. Voor het testen van biomaterialen worden drie categorieën verstrekt, te selecteren op basis van het materiaaltype, contactweefsels en het behandelingsdoel: extracten, direct contact en indirect contact 8,11,12,13. Extracten worden verkregen door een celkweekmedium te verrijken met het biomateriaal. Voor de directe contacttests wordt het biomateriaal direct op de celculturen geplaatst en bij indirect contact wordt incubatie met de cellen uitgevoerd, gescheiden door een barrière, zoals een agarosegel11. Passende controles zijn verplicht en er moeten minimaal drie onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd 5,8,10,11,14.
Het is van cruciaal belang om klinische omstandigheden te simuleren of te overdrijven om het cytotoxische potentieel te bepalen. In het geval van extractentests, het oppervlak van het materiaal; het gemiddelde volume; het medium en de pH van het materiaal; de oplosbaarheid, osmolariteit en diffusieverhouding van het materiaal; en de extractieomstandigheden zoals agitatie, temperatuur en tijd beïnvloeden mediaverrijking5.
De methodologie maakt de kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van cytotoxiciteit van verschillende farmaceutische formuleringen, zowel vast als vloeibaar, mogelijk. Er kunnen verschillende testen worden uitgevoerd, zoals een neutrale rode opnametest, kolonievormingstest, MTT-test en XTT-test 5,10,14.
De meeste gepubliceerde cytotoxiciteitsbeoordelingsstudies gebruiken eenvoudigere testen, namelijk MTT en XTT, die beperkte informatie opleveren. De beoordeling van de biocompatibiliteit moet niet alleen de beoordeling van de cytotoxiciteit omvatten, maar ook de bioactiviteit van een bepaald testmateriaal2, zoals dit protocol onderschrijft. Aanvullende evaluatiecriteria moeten worden gebruikt wanneer dit gerechtvaardigd en gedocumenteerd is. Dit protocol is dus bedoeld om een uitgebreide gids te bieden, met een reeks methoden voor de evaluatie van de cytotoxiciteit van biomaterialen. Daarnaast wordt de evaluatie van verschillende cellulaire processen, namelijk het type celdood, celmorfologie, celfunctie bij de synthese van specifieke eiwitten en specifieke weefselproductie, beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pellets bereiding
- Bereid de polyvinylchloride (PVC) mallen voor door cirkelvormige gaten van bekende afmetingen in PVC-platen uit te voeren.
OPMERKING: PVC-lijsten kunnen van verschillende afmetingen worden gemaakt. Bereken het contactoppervlak van PVC-mallen met behulp van de formule A= h(2πr)+2πr2 (r: straal van de cilinder; h: hoogte van de cilinder). - Bereid het te testen biomateriaal voor volgens de instructies van de fabrikant en zo dicht mogelijk bij het begin van het experiment.
OPMERKING: Voor de bereiding van biomaterialen voor pasta/pastaformulering worden een voldoende hoeveelheid basispasta en katalysator handmatig gemengd met een mengspatel. Voor andere materialen op basis van vloeibare en poederformuleringen moet handmatige spatulatie of mechanische menging met trillingen worden uitgevoerd, volgens de instructies van de fabrikant of passend voor nieuwe materialen. Voor vloeibare materialen is deze stap niet nodig. Start het protocol in stap 2. - Plaats het biomateriaal met een spatel op de vormpjes en laat ze op de juiste tijd opstijven.
OPMERKING: De insteltijd en instelomstandigheden van de biomaterialen moeten voldoen aan de instructies van de fabrikant of aan de instructies die geschikt zijn voor nieuwe materialen. - Verwijder na het uitzetten de pellets van het biomateriaal uit de PVC-mallen en plaats ze in een container (een 6-putplaat of een petrischaal kan worden gebruikt).
- Steriliseer de pellets door ze gedurende 20 minuten voor elke kant onder een ultraviolette lichtlamp (UV) te plaatsen.
2. Verkrijging van de extracten van de biomaterialen
OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd onder strikte steriele omstandigheden.
- Bepaal het benodigde aantal pellets door het pelletoppervlak te berekenen op basis van de in punt 1.1 beschreven formule.
OPMERKING: Als referentiewaarde wordt het contactoppervlak van 250 mm2/ml11,15 bereikt door toevoeging van 9 pellets (r 3 mm x h 1,5 mm) per ml medium. - Bereid de oplosbare extracten (extract verrijkt met het biomateriaal).
- Doe de pellets in een buis van 50 ml en voeg het overeenkomstige celkweekmedium toe. Plaats de buizen gedurende 24 uur in de couveuse op 37°, in constante rotatie.
OPMERKING: Gebruik het celkweekmedium dat geschikt is voor de celculturen. - Verwijder na 24 uur de buizen uit de couveuse. Op dit punt komen de extracten overeen met een concentratie van 1/1 of 100%.
- Maak verdunningen van het extract door opeenvolgende toevoeging van gelijke volumes geconditioneerd medium aan celkweekmedium.
OPMERKING: Er mag geen pH-aanpassing worden uitgevoerd voor de media.- Voeg 1 ml kweekmedia toe aan 1 ml 100% extract om een extract van 50% te verkrijgen. Voeg 1 ml kweekmedia toe aan 1 ml 50% extract om een extract van 25% te verkrijgen, enzovoort (figuur 1).
OPMERKING: Gebruik de concentraties die relevant zijn bevonden voor elke verbinding.
- Voeg 1 ml kweekmedia toe aan 1 ml 100% extract om een extract van 50% te verkrijgen. Voeg 1 ml kweekmedia toe aan 1 ml 50% extract om een extract van 25% te verkrijgen, enzovoort (figuur 1).
- Doe de pellets in een buis van 50 ml en voeg het overeenkomstige celkweekmedium toe. Plaats de buizen gedurende 24 uur in de couveuse op 37°, in constante rotatie.
Figuur 1: Schema van de bereiding en verdunningen van oplosbare extracten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Celincubatie met de extracten van de biomaterialen
- Bereid een cellulaire suspensie voor en plaats deze in een geschikte celcontainer, zoals een multiwell-plaat, volgens het aantal cellen dat nodig is voor de experimenten.
- Begin met een kolf van de gewenste cellen met 80% tot 90% samenvloeiing.
- Gooi de celkweekmedia weg, was met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en maak de cellen los met trypsine-EDTA (1 tot 2 ml voor een 75 cm2 celkweekkolf).
- Voeg de celkweekmedia toe (2 tot 4 ml voor een 2-celkweekkolf van 75 cm), breng de celsuspensie over in een buis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g.
- Suspensie van de pellet in een bekend volume celkweekmedia.
OPMERKING: Dit protocol is ontworpen voor het gebruik van aanhangende celculturen; Er kunnen echter eenvoudige aanpassingen worden gemaakt om met suspensiecelculturen te werken. - Tel de cellen in de hemocytometer en bereken de celconcentratie van de celsuspensie.
- Suspensie de bepaalde hoeveelheid celsuspensie in kweekmedium en breng over naar multiwell-gerechten. Neem als referentiewaarde voor de zaaidichtheid 5 – 20 x 105 cellen/cm2.
OPMERKING: Het toegewezen aantal cellen moet worden berekend op basis van het celtype en de celkenmerken, namelijk de celverdubbelingstijd.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur om celhechting mogelijk te maken.
- Dien na deze periode de oplosbare extracten toe in de kweekplaten.
- Zuig het celkweekmedium op.
- Voeg de extracten van de biomaterialen toe aan elke put, volgens de volgorde van concentraties, zoals eerder beschreven. Voeg vers celkweekmedium toe aan de controleputten.
- Incubeer de platen gedurende 24 uur of langer.
OPMERKING: In elke test moeten negatieve controles worden uitgevoerd, overeenkomend met onbehandelde cellen, die in het kweekmedium worden bewaard. De incubatietijden kunnen worden geselecteerd op basis van de studiedoelen.
4. Evaluatie van de metabole activiteit
- Na de celincubatie met de extracten van de biomaterialen, zuig het medium uit de platen en was elke put PBS.
- Breng in elk putje het voldoende volume van 0,5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolbromide (MTT) bereid in PBS, pH 7,4.
- Incubeer de platen gedurende 4 uur of 's nachts in het donker bij 37 ° C.
- Om de verkregen formazankristallen op te lossen, voegt u het adequate volume van 0,04 M-oplossing van zoutzuur in isopropanol toe aan elke put en roert u de platen gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Pas de hoeveelheid MTT en isopropanol aan volgens de grootte van de putten. - Roer en homogeniseer de inhoud van elk putje, indien nodig, door op en neer te pipetteren totdat er geen kristallen meer te zien zijn.
- Kwantificeer de absorptie bij een golflengte van 570 nm met een 620 nm referentiefilter, in de spectrofotometer.
- Om de metabole activiteit te berekenen, deelt u de absorptie van de behandelde cellen door de absorptie van de controleculturen. Om percentagewaarden te verkrijgen, vermenigvuldigt u met 100.
5. Evaluatie van celdood
OPMERKING: Om deze evaluatie uit te voeren, moeten minimaal 106 cellen per aandoening worden gebruikt.
- Gebruik centrifugebuizen die naar behoren zijn geïdentificeerd, in overeenstemming met de omstandigheden die worden geëvalueerd.
- Na de celincubatie met de extracten van de biomaterialen, verzamelt u de kweekmedia naar de betreffende buis.
- Maak de cellen los en voeg de celsuspensie toe aan de respectievelijke buizen.
- Concentreer de celsuspensies door centrifugeren op 120 x g gedurende 5 minuten.
- Was de pellets met PBS. Verwijder de PBS door centrifugeren op 1.000 x g gedurende 5 minuten.
- Voeg 1 ml PBS toe en breng de celpellets over naar geïdentificeerde cytometriebuizen.
- Verwijder de PBS door centrifugeren op 1.000 x g gedurende 5 minuten.
- Incubeer met 100 μL bindingsbuffer (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl en 0,25 mM CaCl2)16 en laat de cellen ongeveer 15 minuten rusten voor celmembraanherstel.
- Voeg 2,5 l fluorescerend gelabeld Annexin-V en 1 μl propidiumjodide toe gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg na incubatie 400 μL PBS toe en analyseer op de cytometer. Gebruik voor de analyse en kwantificering van de informatie geschikte software.
- Presenteer resultaten als een percentage van levende cellen, apoptose, late apoptose / necrose en necrose.
6. Morfologische evaluatie
- Selecteer de juiste maat gesteriliseerde glazen afdekplaten die in de multiwell-plaat passen.
- Plaats elke dia in een putje met een steriel pincet.
- Verdeel een cellulaire suspensie in een voldoende concentratie in de putten en laat een nacht in een incubator bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 95% lucht en 5% CO2.
- Stel de celculturen bloot aan de extracten, zoals eerder beschreven.
- Zuig de media op en was met PBS.
- Laat de afdekstroken drogen bij kamertemperatuur en voeg vervolgens een voldoende volume May-Grünwald-oplossing toe om de afdekstroken af te dekken; Incubeer gedurende 3 minuten.
- Verwijder de kleurstof en was met gedestilleerd water gedurende 1 minuut.
- Verwijder het water en voeg een voldoende volume Giemsa-oplossing toe om de afdekstroken te bedekken; Incubeer gedurende 15 minuten.
- Was de coverslips in stromend water.
- Breng de coverslips over op een dia.
- Kijk onder een microscoop. Maak de foto's met de gekozen vergroting.
7. Celfunctiebepaling door middel van reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR)
OPMERKING: Om deze evaluatie uit te voeren, moeten minimaal 2x106 cellen per aandoening worden gebruikt. Als voorbeeld wordt alkalische fosfatase gepresenteerd als een gen van belang voor de evaluatie van de odontoblastenactiviteit. Andere genen van belang zijn te zien in tabel 1.
- Plaats de cellen zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: De concentratie van de geplateerde cellen moet mogelijk worden aangepast aan het celtype en de cytotoxiciteit van de biomaterialen die worden bestudeerd. - Incubeer met oplosbare extracten, zoals hierboven beschreven.
- Maak de cellen los om een suspensie te verkrijgen zoals eerder beschreven.
- Was de cellen twee keer met PBS; voor deze centrifuge op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Lyseer de cellen door de pellet te suspenseren in 1 ml RNA-zuiveringsoplossing (bijv. NZYol), intensief roeren en opeenvolgend pipetteren.
- Incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 200 μL chloroform toe en schud de buisjes 15 seconden met de hand.
- Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer lysaten bij 4 °C gedurende 15 minuten bij 12.000 x g. Tijdens deze centrifugatie ontstaan er twee fasen in het monster, waardoor het RNA in de waterige (bovenste) fase achterblijft.
- Verwijder de waterige fase naar een nieuwe buis en voeg 500 μL koud isopropanol toe om RNA neer te slaan.
- Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en was de pellet met 1 ml 75% ethanol door centrifugeren op 7.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Droog de pellet bij kamertemperatuur tot de verdamping van de ethanol.
- Suspenderen in RNase-vrij water.
- Kwantificeer en bepaal de zuiverheidsgraad van de monsters met behulp van absorptiespectrofotometrie, op de golflengten 260 nm en 280 nm. Bepaal de RNA-zuiverheid en gebruik monsters met een zuiverheidsverhouding (A260/280) rond de 2,0.
- Bewaar monsters bij -80 °C.
- Ga verder met het uitvoeren van RT-PCR volgens protocol17 van de fabrikant.
OPMERKING: Selecteer in overeenstemming met het onderzoeksdoel de specifieke markers die moeten worden geëvalueerd.
8. Celfunctiebeoordeling door eiwitidentificatie
OPMERKING: Selecteer volgens het onderzoeksdoel de specifieke eiwitten die moeten worden geëvalueerd. Als voorbeeld wordt dentinesialoproteïne (DSP) gepresenteerd als een eiwit van belang voor de evaluatie van de odontoblastenactiviteit. Andere interessante eiwitten zijn te zien in tabel 1.
- Kweek cellen in coverslips en stel ze bloot aan de extracten, zoals eerder beschreven.
- Was de celculturen met PBS.
- Fixeren met 3,7% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was twee keer met PBS.
- Permeabilize met 0,5% Triton in PBS gedurende 15 minuten.
- Blokkeer het peroxidase met 0,3% waterstofperoxide in PBS gedurende 5 minuten.
- Was twee keer met PBS.
- Was tweemaal met 0,5% runderserumalbumine (BSA).
- Blokkeer celculturen met 2% BSA gedurende 45 minuten.
- Wassen met 0,5% BSA in PBS.
- Incubeer culturen met het primaire antilichaam volgens het geselecteerde eiwit gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van het primaire antilichaam DSP (M20) antilichaam (1:100) en het secundaire antilichaam Polyklonaal Konijn Anti-geit immunoglobulinen / HRP (1:100). - Was vijf keer met 0,5% BSA in PBS.
- Incubeer met secundair antilichaam gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Maak de antilichaamverdunningen met 0,5% BSA in PBS. - Was vijf keer met 0,5% BSA in PBS gedurende 1 minuut in elke wasbeurt.
- Incubeer culturen met een substraat en chromogeenmengsel in een concentratie van 20 μL chromogeen/ml substraat gedurende 25 minuten.
- Was tweemaal met 0,5% BSA in PBS.
- Tegenbein met Hematoxyline gedurende 15 minuten.
- Was met een reeks van 0,037 mol/L ammoniak en gedestilleerd water gedurende 5 minuten om overtollige kleurstof te verwijderen.
- Monteer de coverslips op de dia's. Gebruik glycerol als montagemedium.
- Laat een nacht drogen.
- Kijk onder een microscoop. Maak de foto's met de gekozen vergroting.
9. Mineralisatie beoordeling door middel van Alizarin Red S assay
- Bereid een Alizarin Red S-oplossing in een concentratie van 40 mM18. Roer de oplossing voor homogenisatie gedurende 12 uur in het donker.
OPMERKING: Om 100 ml Alizarin Red S-oplossing te bereiden, lost u 1,44 g alizarinepoeder (molecuulgewicht: 360 g / mol) op in ultrapuur water, beschermd tegen licht. Voor deze oplossing is de pH-waarde van cruciaal belang en moet deze tussen 4,1 en 4,3 liggen. - Incubeer celcultuur met oplosbare extracten, zoals hierboven beschreven.
- Was celculturen drie keer met PBS.
- Fixeren met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Was drie keer met PBS.
- Bevlek met Alizarin Red Staining oplossing gedurende 20 minuten bij 37 °C in het donker.
- Was na het kleuren de platen met PBS om de overtollige kleurstof te verwijderen.
- Kijk onder een microscoop. Maak de foto's met de gekozen vergroting.
- Voeg een extractieoplossing, bestaande uit 10% (m/v) azijnzuur en 20% (m/v) methanol, toe aan elk putje en laat 40 minuten roeren bij kamertemperatuur.
- Meet de absorptie bij een golflengte van 490 nm op een spectrofotometer19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve resultaten hier verwijzen naar de studie van tandheelkundige biomaterialen. De extractmethodologie maakt het mogelijk om een cytotoxiciteitsprofiel en celfunctie te verkrijgen na blootstelling aan de tandheelkundige materialen, met betrekking tot effecten op metabole activiteit (figuur 2), levensvatbaarheid van cellen, celdoodprofiel en celmorfologie (figuur 3) en expressie van specifieke eiwitten (figuur 4).
De MTT-test wordt gebruikt om op een eenvoudige manier een snel overzicht te krijgen van de cytotoxiciteit van de materialen. Er kan een vergelijking worden gemaakt tussen twee of meer materialen (figuur 2); een ernstige vermindering van de metabole activiteit, zelfs bij lage (6,25%) en gemiddelde concentraties (50%), duidt op een hogere toxiciteit (figuur 2a). Tegelijkertijd vertonen minder cytotoxische materialen slechts een lichtere of geen reductie (figuur 2b). Vergelijkingen tussen verschillende tijdstippen maken het mogelijk om meer onmiddellijke cytotoxische effecten of in latere stadia te bepalen.
Effecten op de levensvatbaarheid van cellen bieden belangrijke informatie over levensvatbare celreductie, die het vermogen van de weefsels om te herstellen na een schadelijk effect in gevaar kan brengen. De bepaling van het percentage levensvatbare cellen maakt het mogelijk om de cytotoxiciteit van het materiaal te vergelijken; meer cytotoxische materialen induceren een hogere celdood bij dezelfde concentratie (figuur 3a en 3b). Reducties van meer dan 30% zijn van cruciaal belang en definiëren materialen met een risico op lage biocompatibiliteit (figuur 3a). Deze informatie wordt aangevuld met het celdoodprofiel (figuur 3a en 3b). In de representatieve resultaten worden meer cytotoxische materialen gekenmerkt door een geaccentueerde afname van de levensvatbaarheid van cellen en voor een laat apoptose- en necroseceldoodprofiel (figuur 3a), terwijl minder cytotoxische materialen minder celdood en een meer apoptotisch en laat apoptotisch profiel vertonen (figuur 3b).
De informatie verkregen uit de cellulaire morfologie-evaluatie (figuur 3c) vormt een aanvulling op de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen. Veranderingen ten opzichte van de typische morfologie van de cel kunnen wijzen op een apoptotisch of necrotisch profiel16. Ook kan aanvullende informatie uit dit protocol worden verkregen, zoals de waarneming van materiaaldeeltjes (rode pijlen, figuur 3C).
Specifieke markers, fundamenteel voor de celfunctie, beïnvloed door de blootstelling aan extract, kunnen worden geëvalueerd met behulp van verschillende technieken, zoals immunohistochemie, PCR, flowcytometrie, blotting of colorimetrische assays (tabel 1). Representatieve resultaten van de DSP-expressie na blootstelling aan extracten zijn weergegeven in figuur 4a, en het is te zien dat sommige materialen (tricalciumsilicaten, cementen) de cellen stimuleren om de eiwitexpressie te verhogen. Anderen (calciumhydroxidecementen) bevorderen daarentegen een significante afname van de eiwitexpressie, onafhankelijk van verlies van levensvatbaarheid. In beide gevallen heeft de concentratie van de extracten direct invloed op de eiwitexpressie.
In de MDPC-23-cellijn van het odontoblastfenotype is de vorming van mineralisatieafzettingen kenmerkend. Het protocol voor de identificatie en kwantificering van gemineraliseerde afzettingen maakt het mogelijk om de specifieke functie van dit type gespecialiseerde cellen te evalueren. In het gepresenteerde geval werd waargenomen dat tricalciumsilicatencement niet alleen minder cytotoxisch is, maar ook de celfunctie stimuleert, zodra een toename van gemineraliseerde afzettingen werd waargenomen (figuur 4b). Integendeel, het meer cytotoxische calciumhydroxidecement leidde tot verminderde minerale afzetting als gevolg van celbeschadiging en sterfte (figuur 4b). Naast een kwalitatieve evaluatie kan een kwantitatieve bepaling worden uitgevoerd (figuur 4c).
Figuur 2: Metabole activiteit. Metabole activiteit van MDPC-23 cellen behandeld met calciumhydroxide cement [a)] en tricalciumsilicaat cement [b)] oplosbare extracten gedurende 24, 72 en 120 uur. De resultaten worden genormaliseerd naar de controlecelculturen, met een waarde van 100%. Significante verschillen worden weergegeven door *, waarbij * p<0,05 betekent, ** p<0,01 en *** p<0,001 betekent. Een deel van deze Figuur is met toestemming van uitgever20 aangepast ten opzichte van een eerdere publicatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Levensvatbaarheid van cellen, sterfteprofiel en celmorfologie. Levensvatbaarheid van cellen, celdoodprofiel en celmorfologie in MDPC-23-cellen die na 120 uur blootstelling werden behandeld met calciumhydroxide en tricalciumsilicaatbiomaterialen met een concentratie van 6,25% en 50%. a) en b) De resultaten worden uitgezet als het percentage levende cellen in apoptose, late apoptose of necrose en necrose. Significante verschillen met betrekking tot controle of tussen voorwaarden worden weergegeven met *, waarbij * p <0,05 betekent, ** p <0,01 en *** p <0,001 betekent. c) Cellen gekleurd met May-Grünwald Giemsa na behandeling met een concentratie van 50% biomaterialen oplosbare extracten. De controlegroep vertegenwoordigt cellen in cultuur in DMEM met 10% FBS. Afbeeldingen in de linkerkolom werden verkregen met een vergroting van 100x en de afbeeldingen in de kolom aan de rechterkant werden verkregen met een vergroting van 500x. Figuurbalken vertegenwoordigen 100 μm. Een deel van deze Figuur is met toestemming van uitgever20 aangepast ten opzichte van een eerdere publicatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: DSP-expressie en gemineraliseerde knobbelvorming. a) MDPC-23-cellen gelabeld door immunocytochemie voor de detectie van DSP-expressie bij behandeling met calciumhydroxide en tricalciumsilicaat in concentraties van 50% en 6,25% na 96 uur incubatie. b) Beelden van gekweekte MDPC-23-cellen gekleurd met Alizarin Red S-kleuring bij behandeling met calciumhydroxide en tricalciumsilicaatbiomaterialen in concentraties van 50% en 6,25% na 120 uur incubatie. Alle foto's zijn verkregen met een vergroting van 100x. Beide figuurbalken vertegenwoordigen 150μm. c) Vorming van calciumafzettingen uit MDPC-23-cellen behandeld met calciumhydroxide en tricalciumsilicaat na 120 uur blootstelling. De resultaten zijn de verhouding van de absorpties van de monsters en de controle. Significante verschillen worden weergegeven door *, waarbij * p<0,05 betekent, ** p<0,01 en *** p<0,001 betekent. Een deel van deze Figuur is met toestemming van uitgever20 aangepast ten opzichte van een eerdere publicatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Lijst van odontoblastische differentiatie/functiemarkers47-79. Deze tabel bevat een lijst van odontoblastische markers en detectiemethoden; Sommige van deze markers worden ook uitgedrukt door andere weefsels.
| Gen of eiwit | Methode | Verwijzingen |
| Alkalische fosfatase (ALP) | Colorimetrische | 47 48 |
| Immunocytochemie | 20 49 | |
| Noordelijk Lot | 50 | |
| RT-PCR | 51 52 | |
| Decorin (DCN) | Colorimetrische ELISA | 53 |
| Immunocytochemie | 54 55 | |
| RT-PCR | 53 56 | |
| Dentine Matrix Eiwit 1 (DMP-1) | Flowcytometrie | 57 |
| Immunocytochemie | 58 59 | |
| Noordelijk Lot | 50 60 | |
| RT-PCR | 47 49 | |
| Western Blot | 50 60 | |
| Dentine Matrix Eiwit 2 (DMP-2) | Immunocytochemie | 60 61 |
| RT-PCR | 50 62 | |
| Noordelijk Lot | 60 | |
| Western Blot | 62 | |
| Dentinefosfoproteïne (DPP) | Immunocytochemie | 63 |
| Noordelijk Lot | 63 | |
| Dentine Sialoproteïne (DSP)* | Immunocytochemie | 20 60 |
| Noordelijk Lot | 60 63 | |
| RT-PCR | 50 | |
| Western Blot | 64 65 | |
| Dentinesialofosfoproteïne (DSPP) | Flowcytometrie | 57 |
| Immunocytochemie | 66 54 | |
| RT-PCR | 47 49 | |
| Noordelijk Lot | 67 68 | |
| Western Blot | 64 62 | |
| Enamelysine/Matrix Metalloproteinase-20 (MMP-20) | Noordelijk Lot | 68 |
| RT-PCR | 49 68 | |
| Nestin | Immunocytochemie | 54 69 |
| RT-PCR | 70 71 | |
| Western Blot | 72 | |
| Osteoadherine (OSAD) | Immunocytochemie | 73 74 |
| Noordelijk Lot | 73 | |
| RT-PCR | 75 | |
| Western Blot | 73 74 | |
| Osteopontine (OPN) | Immunocytochemie | 76 |
| Noordelijk Lot | 50 | |
| RT-PCR | 66 51 | |
| Western Blot | 77 | |
| Osteocalcine (OCN) | Immunocytochemie | 52 |
| Noordelijk Lot | 50 | |
| RT-PCR | 51 52 | |
| Western Blot | 77 78 | |
| Osterix (OSX)/ Transcriptiefactor Sp7 (Sp7) | Immunocytochemie | 54 58 |
| RT-PCR | 78 | |
| Western Blot | 78 79 | |
| Fosfaatregulerend gen met homologieën aan endopeptidasen op X-chromosoom (Phex) | Noordelijk Lot | 68 |
| RT-PCR | 49 68 | |
| Western Blot | 79 | |
| Runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (Runx2) | Immunocytochemie | 66 52 |
| RT-PCR | 66 70 | |
| Western Blot | 62 77 | |
| *DPP en DSP zijn de splitsingsproducten van DSPP. | ||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is ontworpen rekening houdend met de ISO 10993-5, die verwijst naar de evaluatie van in vitro cytotoxiciteit van biomaterialen die in contact komen met de weefsels, om de biocompatibiliteit te evalueren en om bij te dragen aan de reproduceerbaarheid van studies21. Dit is een groeiende zorg in de wetenschap, en veel auteurs volgen deze aanbevelingen al in het experimentele ontwerp van hun in vitro studies 15,22,23,24,25,26,27,28.
De voorgestelde methodologie werd geselecteerd om de meest relevante aspecten van de celbiologie te screenen. Dit protocol gaat dus verder dan de aanbevelingen, zodra het een volledige benadering biedt om cytotoxiciteit te evalueren met behulp van gemeenschappelijke testen en een aanvullende evaluatie, inclusief verschillende celparameters van fenotype tot functie. Deze aanvullende evaluatie is belangrijk om het effect van biomaterialen echt te beoordelen, zodra de levensvatbaarheid mogelijk geen veranderingen vertaalt op het niveau van gen- en eiwitexpressie, celcyclus of secretoom.
De extracten zijn voordelig, vooral in aanhangende cellijnen, omdat er geen interferentie is met de celaanhechting aan het substraat en optimale kweekomstandigheden, in tegenstelling tot sommige directe contactbenaderingen waarbij materialen op het oppervlak van de kweekplaatworden geplaatst 22,28.
Bovendien maken extracten celblootstelling aan verschillende concentraties29 mogelijk, waardoor diffusie van stoffen in weefsels wordt nagebootst, wat de klaring simuleert die ze in vivo ondergaan, vooral wanneer ze worden aangebracht in contact met extreem geïrrigeerde weefsels. Directe contacttests kunnen verschillende concentraties niet nauwkeurig beoordelen en indirecte contacttests toonden potentiële problemen aan met niet-diffusie, onvolledige diffusie door membranen of reactie met agar.
Tests die een kwantitatieve beoordeling bieden, hebben de voorkeur, waarbij de levensvatbaarheid van cellen met meer dan 30% wordt verminderd als cytotoxisch11,30. Bij de ontwikkeling van nieuwe biomaterialen, als een dergelijke reductie optreedt, bepaalt dit de noodzaak van herformulering of stopzetting. Als er bemoedigende resultaten worden bereikt, moeten verdere studies worden uitgevoerd met het oog op in vivo evaluatie29,31.
In vitro tests moeten de klinische omstandigheden simuleren of overdrijven. De bepaling van de juiste oppervlaktevolumeverhoudingen voor extractbereiding is dus van cruciaal belang. Oppervlakte-volumeverhoudingen van 1,25-6 cm2/ml werden voorgesteld. In het geval van materialen met oppervlakte-onregelmatigheden zoals schuimen zijn 0,1-0,2 g/ml of 6 cm 2/ml een uitgangspunt 15,20,2. De verhouding van 250 mm2per ml medium werd gebruikt in representatieve resultaten die in dit protocol en andere onderzoeken werden gebruikt15,20.
Zelfs als ze niet op deze manier in de klinieken worden gebruikt, moeten de monsters worden gesteriliseerd met methoden die hun eigenschappen niet veranderen. UV-bestraling is vaak een goede keuze. Dit is van het grootste belang om microbiële besmetting van celculturen te voorkomen 11,24,32.
Extractiemedia omvatten celkweekmedium met of zonder serum, fysiologische zoutoplossing, dimethylsulfoxide of gezuiverd water, geselecteerd volgens de chemische kenmerken van biomaterialen11,33. Met het oog op celkweekstudies heeft het gebruik van het celkweekmedium de voorkeur, omdat het verdere verwerkingsstappen vermijdt. De voorwaarden voor extractie moeten worden aangepast aan het experimentele model. In de representatieve resultaten in dit protocol werd het DMEM-kweekmedium aangevuld met FBS gedurende 24 ± 2 uur bij 37 ± 1 °C gebruikt.
Sommige biomaterialen kunnen residuen achterlaten in de extractiemedia, die de celculturen negatief kunnen beïnvloeden. Hoewel filtratie en centrifugaties moeten worden vermeden, is een mogelijkheid om de deeltjes te laten bezinken voordat ze worden gebruikt. Een ander probleem is de pH die na extractie kan veranderen. Aangezien het niet wordt aanbevolen om verdere aanpassingen uit te voeren11, moet de pH van de extracten worden gemeten, geregistreerd en moeten indien nodig aanvullende controles om het pH-effect te isoleren in het experimentele ontwerp worden opgenomen.
Hoewel dit protocol werd beschreven voor aanhangende celculturen, kunnen eenvoudige modificaties worden uitgevoerd om suspensieculturen te gebruiken. Evenzo is het, naast het gebruik van vaste biomaterialen, mogelijk om de procedure, in wezen de extractiestappen, aan te passen om vloeistoffen, gels of schuimen te bestuderen34,35,36,37.
De bereiding van celculturen met de juiste dichtheid is van cruciaal belang, vooral bij celculturen met een hoge duplicatiesnelheid31. Volgens het aanbevolen zaaidichtheidsbereik van de gebruikte cellen, als langdurige incubaties zijn gepland, moet de vermindering van de initiële zaaidichtheid worden uitgevoerd om de problemen in verband met overmatige samenvloeiing te voorkomen. Bovendien kunnen zeer cytotoxische materialen hogere initiële zaaidichtheden vereisen.
Naast de voordelen van de extractmethodologie, is het niet de beste keuze voor materialen waar de evaluatie van celtrouw relevant is. In dit geval moeten de directe contactstudies worden uitgevoerd 38,39,40,41. Hoewel dit een alomvattende aanpak is, is het belangrijk om in gedachten te houden dat het een in-vitrobeoordeling is, die niet volledig de in vivo voorwaarden weerspiegelt42.
Een biomateriaal moet niet alleen schade aan het weefsel veroorzaken, maar ook enkele van de ontstekingsremmende en immunomodulerende processen stimuleren43,44,45,46. Dit protocol gaat dus verder, met de evaluatie van cellulaire mechanismen, waaronder de levensvatbaarheid van cellen en het celdoodprofiel, evenals andere mechanismen van eiwitsynthese. De uitgevoerde evaluatie moet het mogelijk maken om naast cytotoxiciteit ook de biomateriaalbioactiviteit in levende weefsels te achterhalen.
Met de explosie van nieuwe materialen voor medische toepassingen, niet alleen voor tandheelkunde, maar ook voor orthopedie, chirurgie, oogheelkunde, cardiologie, enz., Moeten de eerste screenings systematisch worden uitgevoerd. Dit protocol kan een belangrijk hulpmiddel zijn voor onderzoekers die nieuwe biomaterialen willen ontwikkelen en karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken de volgende voor hun steun: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB wordt gefinancierd door nationale fondsen via FCT (Foundation for Science and Technology) via het strategische project UIDB / 04539 / 2020 en UIDP / 04539 / 2020 (CIBB). We danken Jacques Nör, University of Michigan Dental School, voor het leveren van de cellijn MDPC-23.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
| ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
| Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
| Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma | 10035-04-8 | |
| CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
| CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
| CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
| Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
| cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
| DAB + Chromogen | Dako | K3468 | |
| Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
| DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | |
| DSP (M-20) Antibody, 1: 100 | Santa Cruz Biotechnology | LS-C20939 | |
| ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Hepes 0.01 M | Sigma | MFCD00006158 | |
| Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
| Giemsa Stain, modified GS-500 | Sigma | MFCD00081642 | |
| Glycerol | Dako | C0563 | |
| Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
| HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
| Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
| May-Grünwald Stain MG500 | Sigma | MFCD00131580 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
| Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
| NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 | Dako | G-21234 | |
| Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
| Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Substrate Buffer | Dako | 926605 | |
| Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
| Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| β-actin antibody | Sigma | A5316 |
References
- Williams, D. F.
- Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 126, 117-152 (2012).
- Wataha, J. C. Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry. 86 (2), 203-209 (2001).
- Mishra, S. F. D. A. CE mark or something else?-Thinking fast and slow. Indian Heart Journal. 69 (1), 1-5 (2016).
- Barbeck, M., et al. Balancing Purification and Ultrastructure of Naturally Derived Bone Blocks for Bone Regeneration: Report of the Purification Effort of Two Bone Blocks. Materials. 12 (19), 3234 (2019).
- Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
- Coelho, C. C., Araújo, R., Quadros, P. A., Sousa, S. R., Monteiro, F. J. Antibacterial bone substitute of hydroxyapatite and magnesium oxide to prevent dental and orthopaedic infections. Materials Science and Engineering: C. 97, 529-538 (2019).
- Jung, O., et al. Improved In Vitro Test Procedure for Full Assessment of the Cytocompatibility of Degradable Magnesium Based on ISO 10993-5/-12. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 255 (2019).
- Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
- ISO. I.O. for S. ISO 10993-12:2012 - part 12: Sample preparation and reference materials. ISO. , (2012).
- ISO. I.O. for S. ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices - part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. ISO. , (2009).
- Srivastava, G. K., et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation. Scientific Reports. 8 (1), 1425 (2018).
- Pusnik, M., Imeri, M., Deppierraz, G., Bruinink, A., Zinn, M. The agar diffusion scratch assay--A novel method to assess the bioactive and cytotoxic potential of new materials and compounds. Scientific Reports. 6, 20854 (2016).
- Spiller, K. L., et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 35 (15), 4477-4488 (2014).
- Zhou, H., et al. In Vitro Cytotoxicity Evaluation of a Novel Root Repair Material. Journal of Endodontics. 39 (4), 478-483 (2013).
- Bordron, A., et al. The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis. Journal of Clinical Investigation. 101 (10), 2029-2035 (1998).
- Palmini, G., et al. Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma. Journal of Visualized Experiments. (116), e53884 (2016).
- Gregory, C. A., Grady Gunn, W., Peister, A., Prockop, D. J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry. 329 (1), 77-84 (2004).
- Cai, S., Zhang, W., Chen, W. PDGFRβ+/c-kit+ pulp cells are odontoblastic progenitors capable of producing dentin-like structure in vitro and in vivo. BMC Oral Health. 16 (1), 113 (2016).
- Paula, A., et al. Biodentine Boosts, WhiteProRoot MTA Increases and Life Suppresses Odontoblast Activity. Materials. 12 (7), 1184 (2019).
- Chander, N. G.
- Cavalcanti, B. N., Rode de M, S., França, C. M., Marques, M. M. Pulp capping materials exert an effect on the secretion of IL-1β and IL-8 by migrating human neutrophils. Brazilian Oral Research. 25 (1), 13-18 (2011).
- Chang, S., Lee, S. Y., Ann, H. J., Kum, K. Y., Kim, E. C. Effects of calcium silicate endodontic cements on biocompatibility and mineralization-inducing potentials in human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 40 (8), 1194-1200 (2014).
- Daltoé, M. O., Paula-Silva, F. W. G., Faccioli, L. H., Gatón-Hernández, P. M., De Rossi, A., Bezerra Silva, L. A. Expression of Mineralization Markers during Pulp Response to Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate. Journal of Endodontics. 42 (4), 596-603 (2016).
- Elias, R. V., Demarco, F. F., Tarquinio, S. B. C., Piva, E. Pulp responses to the application of a self-etching adhesive in human pulps after controlling bleeding with sodium hypochlorite. Quintessence International. 38 (2), 67-77 (2007).
- Huang, G. T. J., Shagramanova, K., Chan, S. W. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. Journal of endodontics. 32 (11), 1066-1073 (2006).
- Jafarnia, B., et al. Evaluation of cytotoxicity of MTA employing various additives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 107 (5), 739-744 (2009).
- Paranjpe, A., Smoot, T., Zhang, H., Johnson, J. D. Direct contact with mineral trioxide aggregate activates and differentiates human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 37 (12), 1691-1695 (2011).
- Spagnuolo, G., et al. In vitro cellular detoxification of triethylene glycol dimethacrylate by adduct formation with N-acetylcysteine. Dental Materials. 29 (8), 153-160 (2013).
- Murray, P. E., García Godoy, C., García Godoy C, F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated. Medicina Oral, Patologia Oral y Cirugia Bucal. 12 (3), 258-266 (2007).
- Hanks, C. T., Wataha, J. C., Sun, Z. In vitro models of biocompatibility: a review. Dental Materials. 12 (3), 186-193 (1996).
- Eid, A. A., et al. In Vitro Biocompatibility and Oxidative Stress Profiles of Different Hydraulic Calcium Silicate Cements. Journal of Endodontics. 40 (2), 255-260 (2014).
- Nocca, G., et al. Effects of ethanol and dimethyl sulfoxide on solubility and cytotoxicity of the resin monomer triethylene glycol dimethacrylate. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 100 (6), 1500-1506 (2012).
- Abuarqoub, D., Aslam, N., Jafar, H., Abu Harfil, Z., Awidi, A. Biocompatibility of Biodentine with Periodontal Ligament Stem Cells: In Vitro Study. Dentistry Journal. 8 (1), 17 (2020).
- Coelho, A. S., et al. Cytotoxic effects of a chlorhexidine mouthwash and of an enzymatic mouthwash on human gingival fibroblasts. Odontology. 108 (2), 260-270 (2020).
- Wang, M. O., et al. Evaluation of the In Vitro Cytotoxicity of Cross-Linked Biomaterials. Biomacromolecules. 14 (5), 1321-1329 (2013).
- Tyliszczak, B., Drabczyk, A., Kudłacik-Kramarczyk, S., Bialik-Wąs, K., Sobczak-Kupiec, A. In vitro cytotoxicity of hydrogels based on chitosan and modified with gold nanoparticles. Journal of Polymer Research. 24 (10), 153 (2017).
- Widbiller, M., et al. Three-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 237-246 (2016).
- Pintor, A. V. B., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of ReOss in Powder and Putty Configurations. Brazilian Dental Journal. 29 (2), 117-127 (2018).
- Pellissari, C. V. G., et al. In Vitro Toxic Effect of Biomaterials Coated with Silver Tungstate or Silver Molybdate Microcrystals. Journal of Nanomaterials. 2020, 1-9 (2020).
- Collado-González, M., et al. Cytotoxicity and bioactivity of various pulpotomy materials on stem cells from human exfoliated primary teeth. International Endodontic Journal. 50, 19-30 (2017).
- Paula, A., et al. Direct Pulp Capping: Which is the Most Effective Biomaterial? A Retrospective Clinical Study. Materials. 12 (20), 3382 (2019).
- Williams, D. F. There is no such thing as a biocompatible material. Biomaterials. 35 (38), 10009-10014 (2014).
- Schuh, J. C. L. Medical device regulations and testing for toxicologic pathologists. Toxicologic Pathology. 36 (1), 63-69 (2008).
- Pizzoferrato, A., et al. Cell culture methods for testing Biocompatibility. Clinical Materials. 15 (3), (1994).
- Pereira Paula, A. B., et al. Direct pulp capping: what is the most effective therapy? - review and meta-analysis. Journal of Evidence Based Dental Practice. , (2018).
- Caiaffa, K. S., et al. Effect of analogues of cationic peptides on dentin mineralization markers in odontoblast-like cells. Archives of Oral Biology. 103, 19-25 (2019).
- Fujiwara, S., Kumabe, S., Iwai, Y. Isolated rat dental pulp cell culture and transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anatomica Japonica. 83 (1), 15-24 (2006).
- Nakashima, M., et al. Stimulation of Reparative Dentin Formation by Ex Vivo Gene Therapy Using Dental Pulp Stem Cells Electrotransfected with Growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Therapy. 15 (11), 1045-1053 (2004).
- Narayanan, K., et al. Differentiation of embryonic mesenchymal cells to odontoblast-like cells by overexpression of dentin matrix protein 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4516-4521 (2001).
- Kim, H. J., Yoo, J. H., Choi, Y., Joo, J. Y., Lee, J. Y., Kim, H. J. Assessing the effects of cyclosporine A on the osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, and angiogenesis mediated by the human periodontal ligament stem cells. Journal of Periodontology. , (2019).
- Bou Assaf, R., et al. Healing of Bone Defects in Pig's Femur Using Mesenchymal Cells Originated from the Sinus Membrane with Different Scaffolds. Stem Cells International. , (2019).
- He, W., et al. Lipopolysaccharide enhances decorin expression through the toll-like receptor 4, myeloid differentiating factor 88, nuclear factor-kappa B, and mitogen-activated protein kinase pathways in odontoblast cells. Journal of Endodontics. 38 (4), 464-469 (2012).
- Xiong, Y., et al. Wnt Production in Dental Epithelium Is Crucial for Tooth Differentiation. Journal of Dental Research. 98 (5), 580-588 (2019).
- Haruyama, N., et al. Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization. Matrix Biology. 28 (3), 129-136 (2009).
- Sreenath, T., et al. Dentin Sialophosphoprotein Knockout Mouse Teeth Display Widened Predentin Zone and Develop Defective Dentin Mineralization Similar to Human Dentinogenesis Imperfecta Type III. Journal of Biological Chemistry. 278 (27), 24874-24880 (2003).
- Yang, Y., Zhao, Y., Liu, X., Chen, Y., Liu, P., Zhao, L. Effect of SOX2 on odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. Molecular Medicine Reports. 16 (6), 9659-9663 (2017).
- Tao, H., et al. Klf4 Promotes Dentinogenesis and Odontoblastic Differentiation via Modulation of TGF-β Signaling Pathway and Interaction With Histone Acetylation. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (8), 1502-1516 (2019).
- Massa, L. F., Ramachandran, A., George, A., Arana-Chavez, V. E. Developmental appearance of dentin matrix protein 1 during the early dentinogenesis in rat molars as identified by high-resolution immunocytochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 124 (3-4), 197-205 (2005).
- Hao, J., Zou, B., Narayanan, K., George, A. Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone. 34 (6), 921-932 (2004).
- Tompkins, K., Alvares, K., George, A., Veis, A. Two related low molecular mass polypeptide isoforms of amelogenin have distinct activities in mouse tooth germ differentiation in vitro. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (2), 341-349 (2005).
- Zhai, Y., et al. Activation and Biological Properties of Human β Defensin 4 in Stem Cells Derived From Human Exfoliated Deciduous Teeth. Frontiers in Physiology. 10, (2019).
- Bègue-Kirn, C., Ruch, J. V., Ridall, A. L., Butler, W. T. Comparative analysis of mouse DSP and DPP expression in odontoblasts, preameloblasts, and experimentally induced odontoblast-like cells. European Journal of Oral Sciences. 106, 254-259 (1998).
- Kikuchi, H., Suzuki, K., Sakai, N., Yamada, S. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture. Cell and Tissue Research. 317 (2), 173-185 (2004).
- Li, X., Yang, G., Fan, M. Effects of homeobox gene distal-less 3 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 38 (11), 1504-1510 (2012).
- Chen, S., et al. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during odontoblast cytodifferentiation. Journal of Biological Chemistry. 280 (33), 29717-29727 (2005).
- Narayanan, K., Gajjeraman, S., Ramachandran, A., Hao, J., George, A. Dentin matrix protein 1 regulates dentin sialophosphoprotein gene transcription during early odontoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281 (28), 19064-19071 (2006).
- Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. A substractive PCR-based cDNA library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biology. 19 (5), 421-430 (2000).
- Miyazaki, T., Baba, T., Mori, T., Komori, T. Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts. Acta Histochemica et Cytochemica. 51 (6), 185-190 (2018).
- Yokoi, M., Kuremoto, K., Okada, S., Sasaki, M., Tsuga, K. Effect of attenuation of fibroblast growth factor receptor 2b signaling on odontoblast differentiation and dentin formation. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 55 (3), 211-219 (2019).
- Tohma, A., et al. Glucose Transporter 2 and 4 Are Involved in Glucose Supply during Pulpal Wound Healing after Pulpotomy with Mineral Trioxide Aggregate in Rat Molars. Journal of Endodontics. , (2019).
- Sueyama, Y., Kaneko, T., Ito, T., Kaneko, R., Okiji, T. Implantation of Endothelial Cells with Mesenchymal Stem Cells Accelerates Dental Pulp Tissue Regeneration/Healing in Pulpotomized Rat Molars. Journal of Endodontics. 43 (6), 943-948 (2017).
- Petersson, U., Hultenby, K., Wendel, M. Identification, distribution and expression of osteoadherin during tooth formation. European Journal of Oral Sciences. 111 (2), 128-136 (2003).
- Couble, M. L., et al. Immunodetection of osteoadherin in murine tooth extracellular matrices. Histochemistry and Cell Biology. 121 (1), 47-53 (2004).
- Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. Expression of the small leucine-rich proteoglycan osteoadherin/osteomodulin in human dental pulp and developing rat teeth. Bone. 27 (2), 265-270 (2000).
- Salmon, B., et al. Abnormal osteopontin and matrix extracellular phosphoglycoprotein localization, and odontoblast differentiation, in X-linked hypophosphatemic teeth. Connective Tissue Research. 55, SUPPL. 1 79-82 (2014).
- Liao, C., Ou, Y., Wu, Y., Zhou, Y., Liang, S., Wang, Y. Sclerostin inhibits odontogenic differentiation of human pulp-derived odontoblast-like cells under mechanical stress. Journal of Cellular Physiology. 234 (11), 20779-20789 (2019).
- Deng, X., et al. The combined effect of oleonuezhenide and wedelolactone on proliferation and osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Phytomedicine. 153103, (2019).
- Choi, H., Kim, T. H., Yun, C. Y., Kim, J. W., Cho, E. S. Testicular acid phosphatase induces odontoblast differentiation and mineralization. Cell and Tissue Research. 364 (1), 95-103 (2016).
