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Medicine

बायोमटेरियल्स के लिए साइटोटॉक्सिसिटी और सेल प्रतिक्रिया तक पहुंचना।

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/61512
Automatic Translation
*1,2,3,4, *2,3,4,5, 1,2,3,4, 2,3,4,5, 2,3,4,6, 2,3,4,6, 2,3,4,7, 2,3,4,5, 1,2,3,4,8, 1,2,3,4
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal
* These authors contributed equally

Summary

इस पद्धति का उद्देश्य फ्लो साइटोमेट्री, आरटी-पीसीआर, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और अन्य सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान तकनीकों सहित व्यवहार्यता परख और फेनोटाइपिक विश्लेषण का उपयोग करके घुलनशील अर्क की तैयारी के माध्यम से बायोमटेरियल साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करना है।

Abstract

बायोमैटेरियल्स मानव ऊतकों के साथ प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से संपर्क करते हैं, जिससे इसकी साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण हो जाता है। यह मूल्यांकन कई तरीकों से किया जा सकता है, लेकिन उपयोग किए गए दृष्टिकोणों के बीच एक उच्च विसंगति मौजूद है, जो प्रजनन क्षमता और प्राप्त परिणामों के बीच तुलना से समझौता करती है। इस पेपर में, हम घुलनशील अर्क का उपयोग करके बायोमैटेरियल्स साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, जिसका उपयोग हम दंत बायोमटेरियल्स के लिए करते हैं। अर्क की तैयारी विस्तृत है, छर्रों के उत्पादन से लेकर संस्कृति माध्यम में इसके निष्कर्षण तक। बायोमैटेरियल्स साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन एमटीटी परख का उपयोग करके चयापचय गतिविधि, सल्फोरोडामाइन बी (एसबीआर) परख का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेल डेथ प्रोफाइल और मई-ग्रुनवाल्ड गिम्सा का उपयोग करके सेल आकृति विज्ञान पर आधारित है। साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के अतिरिक्त, सेल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किए गए विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति के आधार पर वर्णित है। यह प्रोटोकॉल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत तरीके से अर्क पद्धति का उपयोग करके बायोमटेरियल्स साइटोटॉक्सिसिटी और सेलुलर प्रभाव मूल्यांकन के लिए एक व्यापक मार्गदर्शिका प्रदान करता है।

Introduction

जैव-रासायनिकता को ऊतक को एकीकृत करने और स्थानीय और प्रणालीगत क्षति 1,2,3 से मुक्त एक अनुकूल चिकित्सीय प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए एक सामग्री की क्षमता के रूप में परिभाषित किया जासकता है। चिकित्सा उपयोग के लिए किसी भी सामग्री के विकास के लिए जैव-अनुकूलता मूल्यांकन महत्वपूर्ण है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल प्रत्येक शोधकर्ता के लिए एक व्यवस्थित और व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसका लक्ष्य नए बायोमैटेरियल्स विकसित करना या मौजूदा बायोमटेरियल्स के लिए नए अनुप्रयोगों का अध्ययन करना है।

इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षणों को व्यापक रूप से प्राथमिक सेल संस्कृतियों या सेल लाइनों का उपयोग करके जैव-अनुकूलता मूल्यांकन के लिए पहले चरण के रूप में उपयोग किया जाता है। परिणाम संभावित नैदानिक अनुप्रयोग का पहला संकेतक बनाते हैं। जैव सामग्री विकास के लिए महत्वपूर्ण होने के अलावा, यह परीक्षण ईयूए और यूरोपीय संघ के नियामकों (एफडीए और सीई प्रमाणन) 4,5,6,7,8 से बाजार परिचय के लिए वर्तमान नियमों का पालन करना अनिवार्य है। इसके अलावा, बायोमेडिकल अनुसंधान में मानकीकृत परीक्षण प्रजनन क्षमता और समान बायोमैटेरियल्सया उपकरणों पर विभिन्न अध्ययनों के परिणामों की तुलना के संदर्भ में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है।

अंतर्राष्ट्रीय मानकीकरण संगठन (आईएसओ) दिशानिर्देशों का व्यापक रूप से सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से परीक्षण सामग्री के लिए कई स्वतंत्र वाणिज्यिक, नियामक और शैक्षणिक प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जाता है। आईएसओ 10993-5 इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन और आईएसओ 10993-12 रिपोर्ट को नमूना तैयारी10,11 को संदर्भित करता है। बायोमटेरियल परीक्षण के लिए तीन श्रेणियां प्रदान की जाती हैं, जिन्हें सामग्री प्रकार, संपर्क ऊतकों और उपचार लक्ष्य के अनुसार चुना जाता है: अर्क, प्रत्यक्ष संपर्क, और अप्रत्यक्ष संपर्क 8,11,12,13। अर्क बायोमटेरियल के साथ एक सेल कल्चर माध्यम को समृद्ध करके प्राप्त किए जाते हैं। प्रत्यक्ष संपर्क परीक्षणों के लिए, बायोमटेरियल को सीधे सेल संस्कृतियों पर रखा जाता है, और, अप्रत्यक्ष संपर्क में, कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेशन एक बाधा द्वारा अलग किया जाता है, जैसे कि एक एगारोस जेल11। उचित नियंत्रण अनिवार्य हैं, और कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोग 5,8,10,11,14 किए जाने चाहिए।

साइटोटोक्सिक क्षमता निर्धारित करने के लिए नैदानिक स्थितियों को अनुकरण या अतिरंजित करना महत्वपूर्ण है। अर्क परीक्षण के मामले में, सामग्री का सतह क्षेत्र;  मध्यम मात्रा; माध्यम और सामग्री पीएच; सामग्री घुलनशीलता, परासरणता और प्रसार अनुपात; और आंदोलन, तापमान और समय जैसी निष्कर्षण स्थितियां मीडिया को प्रभावित करतीहैं।

कार्यप्रणाली ठोस और तरल दोनों तरह के कई दवा योगों के साइटोटॉक्सिसिटी के मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन की अनुमति देती है। कई परीक्षण किए जा सकते हैं, जैसे कि तटस्थ लाल अपटेक परीक्षण, कॉलोनी गठन परीक्षण, एमटीटी परख और एक्सटीटी परख 5,10,14।

प्रकाशित अधिकांश साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन अध्ययन सरल परख का उपयोग करते हैं, अर्थात् एमटीटी और एक्सटीटी, जो सीमित जानकारी प्रदान करते हैं। बायोकम्पैटिबिलिटी का मूल्यांकन करने में न केवल साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन शामिल होना चाहिए, बल्कि किसी दिए गए परीक्षण सामग्री2 की बायोएक्टिविटी भी शामिल होनी चाहिए, जैसा कि यह प्रोटोकॉल समर्थन करता है। उचित और प्रलेखित होने पर अतिरिक्त मूल्यांकन मानदंड का उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बायोमटेरियल साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए तरीकों के एक सेट का विवरण देते हुए एक व्यापक गाइड प्रदान करना है। इसके अलावा, विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं का मूल्यांकन, अर्थात् कोशिका मृत्यु का प्रकार, कोशिका आकृति विज्ञान, विशिष्ट प्रोटीन के संश्लेषण में कोशिका समारोह, और विशिष्ट ऊतक उत्पादन, वर्णित हैं।

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Protocol

1. छर्रों की तैयारी

  1. पीवीसी प्लेटों में ज्ञात आयामों के गोलाकार आकार के छेद करके पॉलीविनाइल क्लोराइड (पीवीसी) मोल्ड तैयार करें।
    नोट: पीवीसी मोल्डिंग विभिन्न आकारों से बनाया जा सकता है। सूत्र A = h(2 : r) + 2 : r2 (r: सिलेंडर की त्रिज्या; h: सिलेंडर की ऊंचाई) का उपयोग करके पीवीसी मोल्डों की संपर्क सतह की गणना करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार परीक्षण किए जाने वाले बायोमटेरियल को तैयार करें और प्रयोग की शुरुआत के जितना संभव हो उतना करीब हों।
    पेस्ट फॉर्मूलेशन बायोमटेरियल्स की तैयारी के लिए, पर्याप्त मात्रा में बेस पेस्ट और उत्प्रेरक को मिश्रण स्पैटुला के साथ मैन्युअल रूप से मिलाया जाता है। तरल और पाउडर योगों पर आधारित अन्य सामग्रियों के लिए, निर्माता के निर्देशों या नई सामग्रियों के लिए पर्याप्त का पालन करते हुए कंपन के साथ मैनुअल स्पैट्यूलेशन या यांत्रिक मिश्रण किया जाना चाहिए। तरल सामग्री के लिए, यह कदम आवश्यक नहीं है। चरण 2 में प्रोटोकॉल प्रारंभ करें।
  3. बायोमटेरियल को एक स्पैटुला के साथ मोल्डों पर रखें और उन्हें उचित समय के लिए सेट होने दें।
    नोट: बायोमैटेरियल्स की सेटिंग समय और सेटिंग शर्तों को निर्माता के निर्देशों या नई सामग्रियों के लिए पर्याप्त का पालन करना चाहिए।
  4. सेटिंग के बाद, पीवीसी मोल्डों से बायोमटेरियल के छर्रों को हटा दें और उन्हें एक कंटेनर में रखें (एक 6 वेल प्लेट या पेट्री डिश का उपयोग किया जा सकता है)।
  5. छर्रों को प्रत्येक पक्ष के लिए 20 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश (यूवी) दीपक के नीचे रखकर निष्फल करें।

2. बायोमटेरियल्स के अर्क प्राप्त करना

नोट: सभी प्रक्रियाओं को सख्त बाँझ स्थितियों के तहत किया जाना चाहिए।

  1. 1.1 में वर्णित सूत्र के आधार पर गोली की सतह क्षेत्र की गणना करके छर्रों की आवश्यक संख्या निर्धारित करें।
    नोट: एक संदर्भ मान के रूप में, 250 मिमी2/एमएल11,15 का संपर्क सतह क्षेत्र माध्यम के प्रति एमएल 9 छर्रों (आर 3 मिमी x एच 1.5 मिमी) को जोड़कर प्राप्त किया जाता है।
  2. घुलनशील अर्क तैयार करें (बायोमटेरियल से समृद्ध अर्क)।
    1. छर्रों को 50 एमएल ट्यूब में रखें और सेल कल्चर माध्यम के अनुरूप जोड़ें। ट्यूबों को इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 ° पर स्थिर रोटेशन में रखें।
      नोट: सेल संस्कृतियों के लिए उपयुक्त सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग करें।
    2. 24 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से ट्यूब हटा दें। इस बिंदु पर, अर्क 1/1 या 100% की एकाग्रता के अनुरूप होता है।
    3. वातानुकूलित माध्यम से सेल कल्चर माध्यम की समान मात्रा को जोड़कर अर्क को पतला करें।
      नोट: मीडिया के लिए कोई पीएच समायोजन नहीं किया जाना चाहिए।
      1. 50% अर्क प्राप्त करने के लिए 100% अर्क के 1 एमएल में 1 एमएल कल्चर मीडिया जोड़ें। 25% अर्क प्राप्त करने के लिए 50% अर्क के 1 एमएल में 1 एमएल कल्चर मीडिया जोड़ें, और इसी तरह (चित्रा 1)।
        नोट: प्रत्येक यौगिक के लिए प्रासंगिक पाए गए सांद्रता का उपयोग करें।

Figure 1
चित्रा 1: घुलनशील अर्क की तैयारी और कमजोर पड़ने की योजना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. बायोमटेरियल्स के अर्क के साथ सेल इनक्यूबेशन

  1. एक सेलुलर निलंबन तैयार करें और प्रयोगों के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के अनुसार, इसे पर्याप्त सेल कंटेनर में प्लेट करें, जैसे कि मल्टीवेल प्लेट।
    1. 80% से 90% संगम के साथ वांछित कोशिकाओं के फ्लास्क से शुरू करें।
    2. सेल कल्चर मीडिया को छोड़ दें, फॉस्फेट-बफर्ड खारा घोल (पीबीएस) से धोएं और ट्रिप्सिन-ईडीटीए (75 सेमी 2 सेल कल्चर फ्लास्क के लिए 1 से2 एमएल) के साथ कोशिकाओं को अलग करें।
    3. सेल कल्चर मीडिया जोड़ें (75 सेमी 2 सेल कल्चर फ्लास्क के लिए2 से 4 एमएल), सेल निलंबन को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सेल कल्चर मीडिया की ज्ञात मात्रा में गोली को निलंबित करें।
      नोट: यह प्रोटोकॉल अनुयायी सेल संस्कृतियों के उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है; हालांकि, निलंबन सेल संस्कृतियों के साथ काम करने के लिए सरल अनुकूलन किए जा सकते हैं।
    5. हेमोसाइटोमीटर में कोशिकाओं की गणना करें और सेल निलंबन की सेल एकाग्रता की गणना करें।
    6. संस्कृति माध्यम में सेल निलंबन की निर्धारित मात्रा को निलंबित करें और मल्टीवेल व्यंजनों में स्थानांतरित करें। सीडिंग घनत्व के लिए संदर्भ मान के रूप में, 5 – 20 x 105 कोशिकाओं / सेमी2 पर विचार करें।
      नोट: कोशिकाओं की उपयुक्त संख्या की गणना सेल प्रकार और सेल विशेषताओं के अनुसार की जानी चाहिए, अर्थात् सेल डबलिंग समय।
  2. सेल आसंजन की अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. इस अवधि के बाद, घुलनशील अर्क को संस्कृति प्लेटों में प्रशासित करें।
    1. सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें।
    2. सांद्रता के अनुक्रम के अनुसार, प्रत्येक कुएं में बायोमटेरियल्स के अर्क जोड़ें, जैसा कि पहले वर्णित है। नियंत्रण कुओं में ताजा सेल कल्चर माध्यम जोड़ें।
    3. प्लेटों को 24 घंटे या उससे अधिक समय तक इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रत्येक परख में नकारात्मक नियंत्रण किया जाना चाहिए, अनुपचारित कोशिकाओं के अनुरूप, संस्कृति माध्यम में बनाए रखा जाना चाहिए। अध्ययन लक्ष्यों के अनुसार इनक्यूबेशन समय का चयन किया जा सकता है।

4. चयापचय गतिविधि का मूल्यांकन

  1. बायोमटेरियल्स के अर्क के साथ सेल इनक्यूबेशन के बाद, प्लेटों से माध्यम को अलग करें और प्रत्येक पीबीएस को अच्छी तरह से धो लें।
  2. प्रत्येक कुएं में, पीबीएस, पीएच 7.4 में तैयार 0.5 मिलीग्राम / एमएल 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल)-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोल ब्रोमाइड (एमटीटी) की पर्याप्त मात्रा रखें।
  3. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 4 घंटे या रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. प्राप्त फॉर्माज़न क्रिस्टल को घुलनशील करने के लिए, प्रत्येक कुएं में आइसोप्रोपेनोल में हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 0.04 एम समाधान की पर्याप्त मात्रा जोड़ें और प्लेटों को 30 मिनट तक हिलाएं।
    नोट: कुओं के आकार के अनुसार एमटीटी और आइसोप्रोपेनोल की मात्रा को समायोजित करें।
  5. यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक कुएं की सामग्री को हिलाएं और समरूप करें, जब तक कि कोई क्रिस्टल न दिखे।
  6. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 620 एनएम संदर्भ फिल्टर के साथ 570 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण की मात्रा निर्धारित करें।
  7. चयापचय गतिविधि की गणना करने के लिए, नियंत्रण संस्कृतियों के अवशोषण द्वारा उपचारित कोशिकाओं के अवशोषण को विभाजित करें। प्रतिशत मान प्राप्त करने के लिए 100 से गुणा करें।

5. कोशिका मृत्यु मूल्यांकन

नोट: इस मूल्यांकन को करने के लिए प्रति स्थिति न्यूनतम 106 कोशिकाओं का उपयोग किया जाना चाहिए।

  1. मूल्यांकन की जा रही स्थितियों के अनुसार, ठीक से पहचाने गए सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करें।
  2. बायोमटेरियल्स के अर्क के साथ सेल इनक्यूबेशन के बाद, संबंधित ट्यूब में कल्चर मीडिया एकत्र करें।
  3. कोशिकाओं को अलग करें और सेल निलंबन को संबंधित ट्यूबों में जोड़ें।
  4. 5 मिनट के लिए 120 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल निलंबन को केंद्रित करें।
  5. पीबीएस के साथ छर्रों को धो लें। 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पीबीएस को हटा दें।
  6. पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और सेल छर्रों को पहचाने गए साइटोमेट्री ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  7. 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पीबीएस को हटा दें।
  8. 100 μL बाइंडिंग बफर (0.01 M HEPES, 0.14 mM NaCl और 0.25 mM CaCl2)16 के साथ इनक्यूबेट करें, और कोशिका झिल्ली वसूली के लिए कोशिकाओं को लगभग 15 मिनट तक आराम करने की अनुमति दें।
  9. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 2.5 μL फ्लोरोसेंट लेबल एनेक्सीन-V और 1 μL प्रोपिडियम आयोडाइड जोड़ें।
  10. इनक्यूबेशन बाद, पीबीएस के 400 μL जोड़ें और साइटोमीटर पर विश्लेषण करें। जानकारी के विश्लेषण और परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  11. वर्तमान परिणाम जीवित कोशिकाओं, एपोप्टोसिस, देर से एपोप्टोसिस / नेक्रोसिस और नेक्रोसिस के प्रतिशत के रूप में हैं।

6. आकृति विज्ञान मूल्यांकन

  1. मल्टीवेल प्लेट के अंदर फिट होने वाले स्टरलाइज्ड ग्लास कवरलिप्स के उपयुक्त आकार का चयन करें।
  2. बाँझ चिमटी का उपयोग करके प्रत्येक स्लाइड को एक कुएं में रखें।
  3. कुओं में पर्याप्त सांद्रता पर एक सेलुलर निलंबन वितरित करें और 95% हवा और 5% सीओ 2 के साथ एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रात भर छोड़ दें।
  4. सेल संस्कृतियों को अर्क में उजागर करें, जैसा कि पहले वर्णित है।
  5. मीडिया को एस्पिरेट करें और पीबीएस से धो लें।
  6. कवरलिप्स को कमरे के तापमान पर सूखने दें और फिर कवरलिप्स को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में मई-ग्रुनवाल्ड समाधान जोड़ें; 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. डाई निकालें और 1 मिनट के लिए आसुत जल से धो लें।
  8. पानी निकालें और कवरलिप्स को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में गिम्सा समाधान जोड़ें; 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. कवरलिप्स को बहते पानी में धो लें।
  10. कवरलिप्स को स्लाइड में स्थानांतरित करें।
  11. माइक्रोस्कोप के नीचे देखो। चुने हुए आवर्धन के साथ तस्वीरें लें।

7. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) के माध्यम से सेल फ़ंक्शन मूल्यांकन।

नोट: इस मूल्यांकन को करने के लिए प्रति स्थिति न्यूनतम 2x106 कोशिकाओं का उपयोग किया जाना चाहिए। एक उदाहरण के रूप में, क्षारीय फॉस्फेट को ओडोंटोब्लास्ट्स गतिविधि मूल्यांकन के लिए रुचि के जीन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। रुचि के अन्य जीन तालिका 1 में देखे जा सकते हैं।

  1. ऊपर वर्णित के रूप में कोशिकाओं को प्लेट करें।
    नोट: अध्ययन किए जा रहे बायोमैटेरियल्स के सेल प्रकार और साइटोटॉक्सिसिटी के अनुसार चढ़ाए गए कोशिकाओं की एकाग्रता को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. घुलनशील अर्क के साथ इनक्यूबेट करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है।
  3. पहले वर्णित निलंबन प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को अलग करें।
  4. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं; इसके लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. आरएनए शुद्धिकरण समाधान (जैसे, NZYol), तीव्र सरगर्मी और क्रमिक पाइपिंग के 1 मिलीलीटर में गोली को निलंबित करके कोशिकाओं को लाइज़ करें।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  7. क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें और 15 सेकंड के लिए हाथ से ट्यूब हिलाएं।
  8. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. 12,000 x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज लाइसेट। इस सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, नमूने में दो चरण उत्पन्न होते हैं, जिससे आरएनए जलीय (ऊपरी) चरण में रह जाता है।
  10. जलीय चरण को एक नई ट्यूब में निकालें और आरएनए को अवक्षेपित करने के लिए 500 μL ठंडा आइसोप्रोपेनोल जोड़ें।
  11. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने इनक्यूबेट करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  12. सतह पर तैरनेवाला को निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7,500 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 75% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ गोली को धो लें।
  13. इथेनॉल वाष्पीकरण तक कमरे के तापमान पर गोली को सुखाएं।
  14. RNase-मुक्त पानी में निलंबित करें।
  15. 260 एनएम और 280 एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करके नमूनों की शुद्धता की डिग्री निर्धारित और निर्धारित करें। आरएनए शुद्धता निर्धारित करें और 2.0 के आसपास शुद्धता अनुपात (ए 260/280) के साथ नमूने का उपयोग करें।
  16. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
  17. निर्माता के प्रोटोकॉल17 का पालन करते हुए आरटी-पीसीआर करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: अध्ययन लक्ष्य के अनुसार, मूल्यांकन किए जाने वाले विशिष्ट मार्करों का चयन करें।

8. प्रोटीन पहचान के माध्यम से सेल फ़ंक्शन मूल्यांकन

नोट: अध्ययन लक्ष्य के अनुसार, मूल्यांकन किए जाने वाले विशिष्ट प्रोटीन का चयन करें। एक उदाहरण के रूप में, डेंटिन सियालोप्रोटीन (डीएसपी) को ओडोंटोब्लास्ट्स गतिविधि मूल्यांकन के लिए रुचि के प्रोटीन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। रुचि के अन्य प्रोटीन तालिका 1 में देखे जा सकते हैं।

  1. कवरलिप्स में कल्चर कोशिकाएं और अर्क के संपर्क में आना, जैसा कि पहले वर्णित है।
  2. पीबीएस के साथ सेल संस्कृतियों को धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 3.7% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें।
  4. पीबीएस के साथ दो बार धो लें।
  5. 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% ट्राइटन के साथ परमेबिलाइज करें।
  6. 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ पेरोक्सीडेज को अवरुद्ध करें।
  7. पीबीएस के साथ दो बार धो लें।
  8. 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ दो बार धोएं।
  9. 45 मिनट के लिए 2% बीएसए के साथ ब्लॉक सेल संस्कृतियां।
  10. पीबीएस में 0.5% बीएसए के साथ धोएं।
  11. कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए चयनित प्रोटीन के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल प्राथमिक एंटीबॉडी डीएसपी (एम 20) एंटीबॉडी (1: 100) और द्वितीयक एंटीबॉडी पॉलीक्लोनल खरगोश एंटी-बकरी इम्युनोग्लोबुलिन / एचआरपी (1: 100) का उपयोग करता है।
  12. पीबीएस में 0.5% बीएसए के साथ पांच बार धोएं।
  13. कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: पीबीएस में 0.5% बीएसए का उपयोग करके एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
  14. प्रत्येक धोने में 1 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5% बीएसए के साथ पांच बार धोएं।
  15. 25 मिनट के लिए 20 μL क्रोमोजेन / एमएल सब्सट्रेट की एकाग्रता पर एक सब्सट्रेट और क्रोमोजेन मिश्रण के साथ संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
  16. पीबीएस में 0.5% बीएसए के साथ दो बार धोएं।
  17. 15 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन के साथ काउंटरस्टेन।
  18. अतिरिक्त डाई को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 0.037 मोल / एल अमोनिया और आसुत जल के अनुक्रम से धो लें।
  19. स्लाइड्स पर कवरलिप्स माउंट करें। ग्लिसरॉल का उपयोग माउंटिंग माध्यम के रूप में करें।
  20. रात भर सूखने दें।
  21. माइक्रोस्कोप के नीचे देखो। चुने हुए आवर्धन के साथ तस्वीरें लें।

9. अलीजारिन रेड एस परख के माध्यम से खनिज करण मूल्यांकन।

  1. 40 mM18 की एकाग्रता पर एक Alizarin Red S घोल तैयार करें। अंधेरे में 12 घंटे के लिए होमोजेनाइजेशन के लिए घोल को हिलाएं।
    नोट: 100 एमएल एलिजारिन रेड एस समाधान तैयार करने के लिए, प्रकाश से संरक्षित अल्ट्राप्योर पानी में 1.44 ग्राम एलिज़रीन पाउडर (आणविक भार: 360 ग्राम / इस समाधान के लिए, पीएच मान महत्वपूर्ण है और 4.1 और 4.3 के बीच होना चाहिए।
  2. घुलनशील अर्क के साथ सेल कल्चर को इनक्यूबेट करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है।
  3. पीबीएस के साथ सेल संस्कृतियों को तीन बार धोएं।
  4. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें।
  5. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  6. अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अलीजारिन रेड स्टेनिंग घोल के साथ दाग लगाएं।
  7. धुंधला होने के बाद, अतिरिक्त डाई को हटाने के लिए प्लेटों को पीबीएस से धो लें।
  8. माइक्रोस्कोप के नीचे देखो। चुने हुए आवर्धन के साथ तस्वीरें लें।
  9. प्रत्येक कुएं में 10% (डब्ल्यू / वी) एसिटिक एसिड और 20% (डब्ल्यू / वी) मेथनॉल से बना एक निष्कर्षण समाधान जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 40 मिनट तक हिलाने दें।
  10. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर19 पर 490 एनएम तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापें।

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Representative Results

यहां प्रतिनिधि परिणाम दंत बायोमैटेरियल्स के अध्ययन का उल्लेख करते हैं। अर्क पद्धति चयापचय गतिविधि (चित्रा 2), सेल व्यवहार्यता, कोशिका मृत्यु प्रोफ़ाइल और कोशिका आकृति विज्ञान (चित्रा 3), और विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति (चित्रा 4) पर प्रभाव के बारे में दंत सामग्री के प्रदर्शन के बाद साइटोटॉक्सिसिटी प्रोफाइल और सेल फ़ंक्शन प्राप्त करने की अनुमति देती है।

एमटीटी परख का उपयोग सीधे तरीके से सामग्री की साइटोटॉक्सिसिटी का त्वरित अवलोकन प्राप्त करने के लिए किया जाता है। दो या दो से अधिक सामग्रियों के बीच तुलना की जा सकती है (चित्रा 2); चयापचय गतिविधि की एक गंभीर कमी, भले ही कम (6.25%) और मध्यम सांद्रता (50%) पर हो, उच्च विषाक्तता को इंगित करता है (चित्रा 2 ए)। इसी समय, कम साइटोटोक्सिक सामग्री केवल हल्की या कोई कमी नहीं होती है (चित्रा 2 बी)। विभिन्न समय बिंदुओं के बीच तुलना अधिक तत्काल साइटोटोक्सिक प्रभाव या बाद के चरणों में निर्धारित करने की अनुमति देती है।

सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव व्यवहार्य सेल कमी के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं, जो हानिकारक प्रभाव के बाद ऊतकों की क्षमता को ठीक करने से समझौता कर सकता है। व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण सामग्री साइटोटॉक्सिसिटी की तुलना करने की अनुमति देता है; अधिक साइटोटोक्सिक सामग्री एक ही एकाग्रता के लिए उच्च कोशिका मृत्यु को प्रेरित करती है (चित्रा 3 ए और 3 बी)। 30% से बेहतर कटौती महत्वपूर्ण है और कम जैव-रासायनिकता के जोखिम वाली सामग्री को परिभाषित करती है (चित्रा 3 ए)। यह जानकारी कोशिका मृत्यु प्रोफ़ाइल (चित्रा 3 ए और 3 बी) के साथ पूरी होती है। प्रतिनिधि परिणामों में, अधिक साइटोटोक्सिक सामग्रियों को सेल व्यवहार्यता में कमी और देर से एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस सेल डेथ प्रोफाइल (चित्रा 3 ए) की विशेषता है, जबकि कम साइटोटोक्सिक कम कोशिका मृत्यु और अधिक एपोप्टोटिक और देर से एपोप्टोटिक प्रोफाइल (चित्रा 3 बी) पेश करते हैं।

सेलुलर आकृति विज्ञान मूल्यांकन (चित्रा 3 सी) से प्राप्त जानकारी सेल व्यवहार्यता मूल्यांकन का पूरक है। सेल की विशिष्ट आकृति विज्ञान से परिवर्तन एक एपोप्टोटिक या नेक्रोटिक प्रोफाइल16 का संकेत दे सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल से अतिरिक्त जानकारी प्राप्त की जा सकती है, जैसे भौतिक कणों का अवलोकन (लाल तीर, चित्रा 3 सी)।

अर्क एक्सपोजर से प्रभावित सेल फ़ंक्शन के लिए मौलिक विशिष्ट मार्करों का मूल्यांकन कई तकनीकों द्वारा किया जा सकता है, जैसे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, पीसीआर, फ्लो साइटोमेट्री, ब्लोटिंग, या कलरिमेट्रिक परख (तालिका 1)। अर्क के संपर्क में आने के बाद डीएसपी अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4 ए में दिखाए गए हैं, और यह देखा जा सकता है कि कुछ सामग्री (ट्राइकैल्शियम सिलिकेट्स सीमेंट) प्रोटीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए कोशिकाओं को उत्तेजित करती हैं। इसके विपरीत, अन्य (कैल्शियम हाइड्रॉक्साइड सीमेंट) व्यवहार्यता हानि से स्वतंत्र रूप से प्रोटीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी को बढ़ावा देते हैं। दोनों मामलों में, अर्क की एकाग्रता सीधे प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है।

ओडोंटोब्लास्ट फेनोटाइप की एमडीपीसी -23 सेल लाइन में, खनिज जमा का गठन विशेषता है। खनिज जमा की पहचान और परिमाणीकरण के लिए प्रोटोकॉल इस प्रकार की विशेष कोशिकाओं के विशिष्ट कार्य का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। प्रस्तुत मामले में, यह देखा गया कि कम साइटोटोक्सिक होने के अलावा, ट्राइकैल्शियम सिलिकेट्स सीमेंट सेल फ़ंक्शन को उत्तेजित करता है, एक बार खनिज जमा में वृद्धि देखी गई थी (चित्रा 4 बी)। इसके विपरीत, अधिक साइटोटोक्सिक कैल्शियम हाइड्रॉक्साइड सीमेंट ने कोशिका हानि और मृत्यु के कारण खनिज जमाव को कम कर दिया (चित्रा 4 बी)। गुणात्मक मूल्यांकन के अतिरिक्त, एक मात्रात्मक निर्धारण किया जा सकता है (चित्रा 4 सी)।

Figure 2
चित्र 2: चयापचय गतिविधि। एमडीपीसी -23 कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि कैल्शियम हाइड्रॉक्साइड सीमेंट [ए)] और ट्राइकैल्शियम सिलिकेट सीमेंट [बी)] घुलनशील अर्क के साथ 24, 72 और 120 घंटे के लिए इलाज किया जाता है। परिणाम 100% के मूल्य के साथ नियंत्रण सेल संस्कृतियों के लिए सामान्यीकृत हैं। महत्वपूर्ण अंतर * द्वारा दर्शाए जाते हैं, जहां * का अर्थ है p<0.05, ** का अर्थ है p<0.01, और *** का अर्थ है p<0.001। इस चित्र का एक भाग प्रकाशक20 की अनुमति से पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेल व्यवहार्यता, मृत्यु प्रोफ़ाइल, और सेल आकृति विज्ञान। एमडीपीसी -23 कोशिकाओं में सेल व्यवहार्यता, सेल डेथ प्रोफाइल और सेल आकृति विज्ञान 120 घंटे के संपर्क के बाद 6.25% और 50% एकाग्रता पर कैल्शियम हाइड्रॉक्साइड और ट्राइकैल्शियम सिलिकेट बायोमैटेरियल्स के साथ उपचार के अधीन है। ए) और बी) परिणामों को एपोप्टोसिस, देर से एपोप्टोसिस या नेक्रोसिस और नेक्रोसिस में जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्लॉट किया जाता है। नियंत्रण के संबंध में या शर्तों के बीच महत्वपूर्ण अंतर * के साथ दर्शाया जाता है, जहां * का अर्थ है पी <0.05, ** का अर्थ है पी <0.01, और *** का अर्थ है पी <0.001। सी) बायोमैटेरियल्स घुलनशील अर्क की 50% एकाग्रता के साथ उपचार के बाद मई-ग्रुनवाल्ड गिम्सा से सना हुआ कोशिकाएं। नियंत्रण समूह 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम में संस्कृति में कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। बाएं कॉलम में छवियों को 100x के आवर्धन के साथ प्राप्त किया गया था, और दाईं ओर कॉलम में छवियों को 500x के आवर्धन के साथ प्राप्त किया गया था। चित्रा पट्टियाँ 100 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस चित्र का एक भाग प्रकाशक20 की अनुमति से पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: डीएसपी अभिव्यक्ति और खनिज नोड्यूल गठन। ए) एमडीपीसी -23 कोशिकाओं को डीएसपी अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा लेबल किया जाता है जब 96 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद 50% और 6.25% की सांद्रता में कैल्शियम हाइड्रॉक्साइड और ट्राइकैल्शियम सिलिकेट के साथ उपचार किया जाता है। ख) 120 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद 50% और 6.25% की सांद्रता पर कैल्शियम हाइड्रॉक्साइड और ट्राइकैल्शियम सिलिकेट बायोमैटेरियल्स के साथ इलाज किए जाने पर एलिजारिन रेड एस दाग से सना सुसंस्कृत एमडीपीसी -23 कोशिकाओं से चित्र। सभी तस्वीरों को 100x के आवर्धन के साथ प्राप्त किया गया था। दोनों चित्रा सलाखों 150μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। c) 120 घंटे के एक्सपोजर के बाद कैल्शियम हाइड्रॉक्साइड और ट्राइकैल्शियम सिलिकेट के साथ इलाज किए गए एमडीपीसी -23 कोशिकाओं से कैल्शियम जमा का गठन। परिणाम नमूने और नियंत्रण के अवशोषण का अनुपात हैं। महत्वपूर्ण अंतर * द्वारा दर्शाए जाते हैं, जहां * का अर्थ है p<0.05, ** का अर्थ है p<0.01, और *** का अर्थ है p<0.001। इस चित्र का एक भाग प्रकाशक20 की अनुमति से पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: ओडोंटोब्लास्टिक भेदभाव / फ़ंक्शन मार्करों की सूची47-79। यह तालिका ओडोंटोब्लास्टिक मार्करों और पहचान विधियों की एक सूची प्रदान करती है; इनमें से कुछ मार्कर अन्य ऊतकों द्वारा भी व्यक्त किए जाते हैं।

जीन या प्रोटीन पद्धति संदर्भ
क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) कलरिमेट्रिक 47 48
इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 20 49
उत्तरी धब्बा 50
आरटी-पीसीआर 51 52
डेकोरिन (डीसीएन) कलरिमेट्रिक एलिसा 53
इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 54 55
आरटी-पीसीआर 53 56
डेंटिन मैट्रिक्स प्रोटीन 1 (डीएमपी -1) फ्लो साइटोमेट्री 57
इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 58 59
उत्तरी धब्बा 50 60
आरटी-पीसीआर 47 49
वेस्टर्न ब्लॉट। 50 60
डेंटिन मैट्रिक्स प्रोटीन 2 (डीएमपी -2) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 60 61
आरटी-पीसीआर 50 62
उत्तरी धब्बा 60
वेस्टर्न ब्लॉट। 62
डेंटिन फॉस्फोप्रोटीन (डीपीपी) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 63
उत्तरी धब्बा 63
डेंटिन सियालोप्रोटीन (डीएसपी) * इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 20 60
उत्तरी धब्बा 60 63
आरटी-पीसीआर 50
वेस्टर्न ब्लॉट। 64 65
डेंटिन सियालोफॉस्फोप्रोटीन (डीएसपीपी) फ्लो साइटोमेट्री 57
इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 66 54
आरटी-पीसीआर 47 49
उत्तरी धब्बा 67 68
वेस्टर्न ब्लॉट। 64 62
मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेस -20 (एमएमपी -20)। उत्तरी धब्बा 68
आरटी-पीसीआर 49 68
नेस्टिन इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 54 69
आरटी-पीसीआर 70 71
वेस्टर्न ब्लॉट। 72
ओस्टियोएडेरिन (ओएसएडी) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 73 74
उत्तरी धब्बा 73
आरटी-पीसीआर 75
वेस्टर्न ब्लॉट। 73 74
ओस्टियोपोंटिन (ओपीएन) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 76
उत्तरी धब्बा 50
आरटी-पीसीआर 66 51
वेस्टर्न ब्लॉट। 77
ओस्टियोकैल्सिन (OCN) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 52
उत्तरी धब्बा 50
आरटी-पीसीआर 51 52
वेस्टर्न ब्लॉट। 77 78
ओस्टरिक्स (ओएसएक्स)/ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एसपी 7 (एसपी 7) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 54 58
आरटी-पीसीआर 78
वेस्टर्न ब्लॉट। 78 79
एक्स-क्रोमोसोम (फेक्स) पर एंडोपेप्टिडेस के होमोलॉजी के साथ फॉस्फेट-विनियमन जीन उत्तरी धब्बा 68
आरटी-पीसीआर 49 68
वेस्टर्न ब्लॉट। 79
रंट से संबंधित प्रतिलेखन कारक 2 (Runx2) इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। 66 52
आरटी-पीसीआर 66 70
वेस्टर्न ब्लॉट। 62 77
*डीपीपी और डीएसपी डीएसपीपी के क्लीवेज उत्पाद हैं।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल को आईएसओ 10993-5 को ध्यान में रखते हुए डिज़ाइन किया गया था, जो बायोमैटेरियल्स के इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी के मूल्यांकन को संदर्भित करता है जो ऊतकों के साथ संपर्क करते हैं, जैव-रासायनिकता का मूल्यांकन करने और अध्ययन प्रजनन क्षमता21 में योगदान करने के लिए। यह विज्ञान में एक बढ़ती चिंता है, और कई लेखक पहले से ही अपने इन विट्रो अध्ययन 15,22,23,24,25,26,27,28 के प्रयोगात्मक डिजाइन में इन सिफारिशों का पालन कर रहे हैं।

प्रस्तावित पद्धति को कोशिका जीव विज्ञान के सबसे प्रासंगिक पहलुओं को स्क्रीन करने के लिए चुना गया था। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल सिफारिशों से परे जाता है, एक बार जब यह सामान्य परख और एक पूरक मूल्यांकन का उपयोग करके साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक पूर्ण दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसमें फेनोटाइप से फ़ंक्शन तक कई सेल पैरामीटर शामिल हैं। यह पूरक मूल्यांकन वास्तव में बायोमैटेरियल्स प्रभाव का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है, एक बार व्यवहार्यता जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेल चक्र या स्राव के स्तर पर परिवर्तन का अनुवाद नहीं कर सकती है।

अर्क लाभप्रद हैं, विशेष रूप से अनुयायी सेल लाइनों में, क्योंकि सब्सट्रेट और इष्टतम संस्कृति स्थितियों के लिए सेल लगाव के साथ कोई हस्तक्षेप नहीं है, कुछ प्रत्यक्ष संपर्क दृष्टिकोणों के विपरीत जहां सामग्री को कल्चर प्लेट22,28 की सतह पर रखा जाता है।

इसके अलावा, अर्क विभिन्न सांद्रता29 के लिए सेल एक्सपोजर की अनुमति देते हैं, ऊतकों में पदार्थों के प्रसार की नकल करते हैं, जो विवो में उनके द्वारा की जाने वाली निकासी का अनुकरण करता है, खासकर जब वे बेहद सिंचित ऊतकों के संपर्क में लागू होते हैं। प्रत्यक्ष संपर्क परीक्षण विभिन्न सांद्रता का सटीक आकलन नहीं कर सकते हैं, और अप्रत्यक्ष संपर्क परीक्षणों ने गैर-प्रसार, झिल्ली के माध्यम से अपूर्ण प्रसार, या अगर के साथ प्रतिक्रिया के साथ संभावित कठिनाइयों का प्रदर्शन किया।

मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करने वाले परीक्षणों को प्राथमिकता दी जाती है, जिसमें सेल व्यवहार्यता में 30% से अधिक की कमी को साइटोटोक्सिक11,30 माना जाता है। नए बायोमैटेरियल्स के विकास में, यदि ऐसी कमी होती है, तो यह पुनर्निर्माण या परित्याग की आवश्यकता को निर्धारित करता है। यदि उत्साहजनक परिणाम प्राप्त किए जाते हैं, तो विवो मूल्यांकन29,31 में कल्पना करते हुए आगे के अध्ययन किए जाने चाहिए।

इन विट्रो परीक्षणों को नैदानिक स्थितियों का अनुकरण या अतिरंजित करना चाहिए। इस प्रकार, निकालने की तैयारी के लिए उपयुक्त सतह मात्रा अनुपात का निर्धारण महत्वपूर्ण है। सतह से आयतन अनुपात 1.25-6 सेमी2/एमएल का सुझाव दिया गया था। सतह की अनियमितताओं वाली सामग्री के मामले में जैसे फोम 0.1-0.2 ग्राम / एमएल या 6 सेमी 2 / एमएल एक प्रारंभिक बिंदु 15,20,2 हैं। इस प्रोटोकॉल और अन्य अध्ययनों15,20 में उपयोग किए गए प्रतिनिधि परिणामों में 250 मिमी2प्रति एमएल माध्यम के अनुपात का उपयोग किया गया था।

यहां तक कि अगर क्लीनिक ों में इस तरह से उपयोग नहीं किया जाता है, तो नमूनों को उन तरीकों से निष्फल किया जाना चाहिए जो उनके गुणों को नहीं बदलते हैं। यूवी विकिरण अक्सर एक अच्छा विकल्प है। सेल संस्कृतियों 11,24,32 के माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए यह सर्वोपरि महत्व का है।

निष्कर्षण मीडिया में सीरम, शारीरिक नमकीन समाधान, डाइमिथाइलसल्फोक्साइड, या शुद्ध पानी के साथ या बिना सेल कल्चर माध्यम शामिल हैं, जो बायोमैटेरियल्स रासायनिक विशेषताओं11,33 के अनुसार चुने गए हैं। सेल कल्चर अध्ययन के लिए लक्षित, सेल कल्चर माध्यम का उपयोग पसंद किया जाता है क्योंकि यह आगे के प्रसंस्करण चरणों से बचता है। निष्कर्षण के लिए शर्तों को प्रयोगात्मक मॉडल में समायोजित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए प्रतिनिधि परिणामों में, एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम संस्कृति माध्यम का उपयोग 37 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 24 2 घंटे ± लिए किया गया था।

कुछ बायोमटेरियल निष्कर्षण मीडिया में अवशेष छोड़ सकते हैं, जो सेल संस्कृतियों को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। जबकि निस्पंदन और सेंट्रीफ्यूजेशन से बचा जाना चाहिए, एक संभावना यह है कि उपयोग करने से पहले कणों को तलछट की अनुमति दी जाए। एक और मुद्दा पीएच है जो निष्कर्षण के बाद परिवर्तन का सामना कर सकता है। चूंकि आगे समायोजन करने की सिफारिश नहीं की जाती है, इसलिए अर्क के पीएच को मापा, पंजीकृत किया जाना चाहिए, और यदि आवश्यक हो तो पीएच प्रभाव को अलगकरने के लिए अतिरिक्त नियंत्रण प्रयोगात्मक डिजाइन में शामिल किया जाना चाहिए।

जबकि इस प्रोटोकॉल को अनुयायी सेल संस्कृतियों के लिए वर्णित किया गया था, निलंबन संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए सरल संशोधन किए जा सकते हैं। इसी तरह, ठोस बायोमैटेरियल्स का उपयोग करने के अलावा, तरल पदार्थ, जैल या फोम34,35,36,37 का अध्ययन करने के लिए प्रक्रिया, अनिवार्य रूप से निष्कर्षण चरणों को अनुकूलित करना संभव है।

उचित घनत्व के साथ सेल संस्कृतियों की तैयारी महत्वपूर्ण है, खासकर उच्च दोहराव दर31 के साथ सेल संस्कृतियों पर। उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की अनुशंसित सीडिंग घनत्व सीमा के अनुसार, यदि लंबे समय तक ऊष्मायन की योजना बनाई जाती है, तो अत्यधिक संगम से जुड़ी समस्याओं से बचने के लिए प्रारंभिक सीडिंग घनत्व में कमी की जानी चाहिए। इसके अलावा, अत्यधिक साइटोटोक्सिक सामग्री को उच्च प्रारंभिक सीडिंग घनत्व की आवश्यकता हो सकती है।

अर्क पद्धति के फायदों के अलावा, यह उन सामग्रियों के लिए सबसे अच्छा विकल्प नहीं है जहां सेल पालन का मूल्यांकन प्रासंगिक है। इस मामले में, प्रत्यक्ष संपर्क अध्ययन 38,39,40,41 किया जाना चाहिए। यद्यपि यह एक व्यापक दृष्टिकोण है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह एक इन विट्रो मूल्यांकन है, जो विवो स्थितियों42 में पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करता है।

एक बायोमटेरियल को न केवल ऊतक को नुकसान पहुंचाना चाहिए, बल्कि कुछ विरोधी भड़काऊ और इम्यूनोमॉड्यूलेंट प्रक्रियाओं को उत्तेजित करना चाहिए43,44,45,46। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता और सेल डेथ प्रोफाइल, साथ ही प्रोटीन संश्लेषण के अन्य तंत्रों सहित सेलुलर तंत्र के मूल्यांकन के साथ आगे बढ़ता है। किए गए मूल्यांकन को साइटोटॉक्सिसिटी के अलावा जीवित ऊतकों में बायोमटेरियल बायोएक्टिविटी पर निष्कर्ष निकालने की अनुमति देनी चाहिए।

चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए नई सामग्रियों के विस्फोट के साथ, न केवल दंत चिकित्सा के लिए बल्कि आर्थोपेडिक्स, सर्जरी, नेत्र विज्ञान, कार्डियोलॉजी आदि के लिए भी, प्रारंभिक स्क्रीनिंग व्यवस्थित रूप से की जानी चाहिए। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है जो नए बायोमैटेरियल्स को विकसित करने और चिह्नित करने का लक्ष्य रखते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों का अन्य टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम समर्थन के लिए निम्नलिखित को धन्यवाद देते हैं: जीएआई 2013 (फैकुलाडे डी मेडिसिना दा यूनिवर्सिडेड डी कोइम्ब्रा); सीआईबीबी को रणनीतिक परियोजना यूआईडीबी/04539/2020 और यूआईडीपी/04539/2020 (सीआईबीबी) के माध्यम से एफसीटी (फाउंडेशन फॉर साइंस एंड टेक्नोलॉजी) के माध्यम से राष्ट्रीय निधि द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। सेल लाइन एमडीपीसी -23 प्रदान करने के लिए हम जैक्स नोर, मिशिगन डेंटल स्कूल विश्वविद्यालय को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CaCl2 Sigma 10035-04-8
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
DAB + Chromogen Dako K3468
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 Santa Cruz Biotechnology LS-C20939
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Hepes 0.01 M Sigma MFCD00006158
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Giemsa Stain, modified GS-500 Sigma MFCD00081642
Glycerol Dako C0563
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
May-Grünwald Stain MG500 Sigma MFCD00131580
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 Dako G-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Substrate Buffer Dako 926605
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
β-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho,… More

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