Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tilgang til cytotoksisitet og cellerespons på biomaterialer

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/61512
Automatic Translation
*1,2,3,4, *2,3,4,5, 1,2,3,4, 2,3,4,5, 2,3,4,6, 2,3,4,6, 2,3,4,7, 2,3,4,5, 1,2,3,4,8, 1,2,3,4
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal
* These authors contributed equally

Summary

Denne metoden tar sikte på å evaluere biomateriell cytotoksisitet gjennom fremstilling av løselige ekstrakter, ved hjelp av levedyktighetsanalyser og fenotypisk analyse, inkludert flowcytometri, RT-PCR, immunocytokjemi og andre cellulære og molekylærbiologiske teknikker.

Abstract

Biomaterialer kommer i direkte eller indirekte kontakt med humant vev, noe som gjør det viktig å evaluere cytotoksisiteten. Denne evalueringen kan utføres ved flere metoder, men det er stor uoverensstemmelse mellom tilnærmingene som brukes, noe som kompromitterer reproduserbarheten og sammenligningen mellom de oppnådde resultatene. I dette papiret foreslår vi en protokoll for å evaluere biomaterialer cytotoksisitet ved hjelp av løselige ekstrakter, som vi bruker til dentale biomaterialer. Ekstraktpreparatet er detaljert, fra pelletsproduksjon til ekstraksjon i et kulturmedium. Cytotoksisitetsevalueringen av biomaterialer er basert på metabolsk aktivitet ved bruk av MTT-analysen, cellelevedyktighet ved bruk av sulforhodamin B (SBR)-analysen, celledødsprofil ved flowcytometri og cellemorfologi ved bruk av May-Grünwald Giemsa. I tillegg til cytotoksisitetsevaluering beskrives en protokoll for å evaluere cellefunksjon basert på ekspresjon av spesifikke markører vurdert ved immuncytokjemi og PCR. Denne protokollen gir en omfattende veiledning for evaluering av biomaterialers cytotoksisitet og cellulære effekter, ved hjelp av ekstraktmetodikken, på en reproduserbar og robust måte.

Introduction

Biokompatibilitet kan defineres som kapasiteten til et materiale til å integrere vev og indusere en gunstig terapeutisk respons, fri for lokale og systemiske skader 1,2,3. Biokompatibilitetsevaluering er avgjørende for utviklingen av ethvert materiale beregnet på medisinsk bruk. Derfor gir denne protokollen en systematisk og omfattende tilnærming for alle forskere som tar sikte på å utvikle nye biomaterialer eller studere nye applikasjoner for eksisterende biomaterialer.

In vitro cytotoksisitetstester er mye brukt som den første fasen for biokompatibilitetsevaluering, ved bruk av primære cellekulturer eller cellelinjer. Resultatene utgjør en første indikator på potensiell klinisk anvendelse. Foruten å være avgjørende for utviklingen av biomateriale, er denne testingen obligatorisk for å overholde gjeldende forskrifter for markedsintroduksjon, fra EUA- og EU-regulatorer (FDA og CE-sertifisering) 4,5,6,7,8. Videre gir standardisert testing i biomedisinsk forskning en betydelig fordel når det gjelder reproduserbarhet og sammenligning av resultater fra ulike studier på lignende biomaterialer eller enheter9.

International Organization for Standardization (ISO) retningslinjer er mye brukt av flere uavhengige kommersielle, regulatoriske og akademiske laboratorier for testing av materialer på en nøyaktig og reproduserbar måte. ISO 10993-5 refererer til in vitro cytotoksisitetsvurderingen og ISO 10993-12 rapporterer til prøvetakingspreparat10,11. For biomaterialtesting er tre kategorier gitt, som skal velges i henhold til materialtype, kontaktvev og behandlingsmål: ekstrakter, direkte kontakt og indirekte kontakt 8,11,12,13. Ekstrakter oppnås ved å berike et cellekulturmedium med biomaterialet. For direkte kontakttester plasseres biomaterialet direkte på cellekulturer, og i indirekte kontakt utføres inkubasjon med cellene separert av en barriere, slik som en agarosegel11. Passende kontroller er obligatoriske, og minst tre uavhengige eksperimenter bør utføres 5,8,10,11,14.

Det er kritisk å simulere eller overdrive kliniske tilstander for å bestemme det cytotoksiske potensialet. Ved testing av ekstrakter, materialets overflateareal;  middels volum; mediet og materialet pH; materialløseligheten, osmolariteten og diffusjonsforholdet; og utvinningsforholdene som agitasjon, temperatur og tid påvirker medienes berikelse5.

Metoden tillater kvantitativ og kvalitativ evaluering av cytotoksisitet av flere farmasøytiske formuleringer, både faste og flytende. Flere analyser kan utføres, for eksempel nøytral rød opptakstest, kolonidannelsestest, MTT-analyse og XTT-analyse 5,10,14.

De fleste publiserte cytotoksisitetsstudier bruker enklere analyser, nemlig MTT og XTT, som gir begrenset informasjon. Evaluering av biokompatibilitet bør ikke bare innebære vurdering av cytotoksisitet, men også bioaktivitet av et gitt testmateriale2, som denne protokollen støtter. Ytterligere evalueringskriterier bør brukes når det er berettiget og dokumentert. Dermed tar denne protokollen sikte på å gi en omfattende veiledning som beskriver et sett med metoder for evaluering av biomaterialets cytotoksisitet. Dessuten beskrives evalueringen av forskjellige cellulære prosesser, nemlig typen celledød, cellemorfologi, cellefunksjon i syntesen av spesifikke proteiner og spesifikk vevsproduksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av pellets

  1. Forbered polyvinylklorid (PVC) former ved å utføre sirkulære hull med kjente dimensjoner i PVC-plater.
    MERK: PVC-lister kan lages i forskjellige størrelser. Beregn kontaktflaten til PVC-former ved å bruke formelen A = h (2πr) + 2πr2 (r: sylinderens radius; h: sylinderens høyde).
  2. Forbered biomaterialet som skal testes i henhold til produsentens instruksjoner og så nært som mulig til begynnelsen av forsøket.
    MERK: For fremstilling av pasta / lim formulering biomaterialer, blandes en tilstrekkelig mengde basepasta og katalysator manuelt med en blandespatel. For andre materialer basert på væske- og pulverformuleringer, bør manuell patulering eller mekanisk blanding med vibrasjon utføres, i henhold til produsentens instruksjoner eller tilstrekkelig for nye materialer. For flytende materialer er dette trinnet ikke nødvendig. Start protokollen i trinn 2.
  3. Plasser biomaterialet på formene med en slikkepott og la dem sette seg til riktig tid.
    MERK: Innstillingstiden og innstillingsforholdene til biomaterialene må følge produsentens instruksjoner eller tilstrekkelig for nye materialer.
  4. Etter innstilling, fjern biomaterialets pellets fra PVC-formene og legg dem i en beholder (en 6-brønnsplate eller en petriskål kan brukes).
  5. Steriliser pellets ved å plassere dem under en ultrafiolett lys (UV) lampe i 20 minutter for hver side.

2. Innhenting av biomaterialenes ekstrakter

MERK: Alle prosedyrer skal utføres under strenge, sterile forhold.

  1. Bestem nødvendig antall pellets ved å beregne pelletsoverflaten basert på formelen beskrevet i 1.1.
    MERK: Som referanseverdi oppnås kontaktflaten på 250 mm2/ml11,15 ved å tilsette 9 pellets (r 3 mm x h 1,5 mm) per ml av mediet.
  2. Forbered de løselige ekstraktene (ekstrakt beriket med biomaterialet).
    1. Plasser pellets i et 50 ml rør og tilsett tilsvarende av cellekulturmediet. Plasser rørene i 24 timer i inkubatoren ved 37 °, i konstant rotasjon.
      MERK: Bruk cellekulturmediet som er egnet for cellekulturer.
    2. Etter 24 timer, fjern rørene fra inkubatoren. På dette tidspunktet svarer ekstraktene til en konsentrasjon på 1/1 eller 100%.
    3. Gjør fortynninger av ekstraktet ved sekvensiell tilsetning av like volumer av betinget medium til cellekulturmedium.
      MERK: Ingen pH-justering skal gjøres på mediet.
      1. Tilsett 1 ml kulturmedier til 1 ml 100% ekstrakt for å oppnå et 50% ekstrakt. Tilsett 1 ml kulturmedier til 1 ml 50% ekstrakt for å oppnå et 25% ekstrakt, og så videre (figur 1).
        MERK: Bruk konsentrasjonene som er relevante for hver forbindelse.

Figure 1
Figur 1: Skjema for fremstilling og fortynning av oppløselige ekstrakter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Celleinkubasjon med biomaterialenes ekstrakter

  1. Forbered en cellulær suspensjon og plate den i en tilstrekkelig cellebeholder, for eksempel en flerbrønnsplate, i henhold til antall celler som trengs for forsøkene.
    1. Start med en kolbe av de ønskede cellene med 80% til 90% sammenløp.
    2. Kast cellekulturmediet, vask med fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og løsne cellene med trypsin-EDTA (1 til 2 ml for en 75 cm2 cellekulturkolbe).
    3. Tilsett cellekulturmediet (2 til 4 ml for en 75 cm2 cellekulturkolbe), overfør cellesuspensjonen til et rør og sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter.
    4. Suspender pelleten i et kjent volum av cellekulturmedier.
      MERK: Denne protokollen er designet for bruk av adherente cellekulturer; Imidlertid kan enkle tilpasninger gjøres for å arbeide med suspensjonscellekulturer.
    5. Telle cellene i hemocytometeret og beregne cellekonsentrasjonen av cellesuspensjonen.
    6. Suspender den bestemte mengden cellesuspensjon i kulturmedium og overfør til flerbrønnsretter. Som referanseverdi for såtetthet, vurder 5 – 20 x 105 celler / cm2.
      MERK: Det bevilgede antall celler må beregnes i henhold til celletype og celleegenskaper, nemlig celledoblingstid.
  2. Inkuber cellene i 24 timer for å tillate celleadhesjon.
  3. Etter denne perioden administreres de oppløselige ekstraktene i kulturplatene.
    1. Aspirer cellekulturmediet.
    2. Legg til biomaterialenes ekstrakter til hver brønn, i henhold til konsentrasjonssekvensen, som beskrevet tidligere. Tilsett friskt cellekulturmedium i kontrollbrønnene.
    3. Inkuber platene i 24 timer eller lenger.
      MERK: Negative kontroller må utføres i hver analyse, tilsvarende ubehandlede celler, opprettholdt i kulturmediet. Inkubasjonstidene kan velges i henhold til studiemålene.

4. Evaluering av metabolsk aktivitet

  1. Etter celleinkubasjonen med biomaterialets ekstrakter, aspirer mediet fra platene og vask hver brønn PBS.
  2. Plasser i hver brønn det tilstrekkelige volumet av 0,5 mg/ml 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolbromid (MTT) fremstilt i PBS, pH 7,4.
  3. Inkuber platene i 4 timer eller over natten i mørket ved 37 ° C.
  4. For å solubilisere de oppnådde formazankrystaller, tilsett det tilstrekkelige volumet av 0,04 M oppløsning av saltsyre i isopropanol til hver brønn og rør plater i 30 minutter.
    MERK: Juster mengden MTT og isopropanol i henhold til størrelsen på brønnene.
  5. Rør og homogeniser innholdet i hver brønn, om nødvendig, ved å pipettere opp og ned til ingen krystaller sees.
  6. Kvantifiser absorbansen ved en bølgelengde på 570 nm med et referansefilter på 620 nm, i spektrofotometeret.
  7. For å beregne metabolsk aktivitet, del absorbansen av de behandlede cellene ved absorbansen av kontrollkulturer. For å oppnå prosentverdier multipliser med 100.

5. Evaluering av celledød

MERK: For å utføre denne evalueringen bør minst 106 celler per tilstand brukes.

  1. Bruk sentrifugerør riktig identifisert, i samsvar med forholdene som vurderes.
  2. Etter celleinkubasjonen med biomaterialets ekstrakter, samle kulturmediet til det respektive røret.
  3. Løsne cellene og legg cellesuspensjonen til de respektive rørene.
  4. Konsentrer cellesuspensjonene ved sentrifugering ved 120 x g i 5 minutter.
  5. Vask pellets med PBS. Fjern PBS ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 minutter.
  6. Tilsett 1 ml PBS og overfør cellepellets til identifiserte cytometrirør.
  7. Fjern PBS ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 minutter.
  8. Inkuber med 100 μL bindingsbuffer (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl og 0,25 mM CaCl2)16, og la cellene hvile i ca. 15 minutter for gjenvinning av cellemembranen.
  9. Tilsett 2,5 μl fluorescerende merket Annexin-V og 1 μL propidiumjodid i 15 minutter ved romtemperatur i mørket.
  10. Etter inkubering, tilsett 400 μL PBS og analyser på cytometeret. For analyse og kvantifisering av informasjonen, bruk passende programvare.
  11. Presentere resultater som en prosentandel av levende celler, apoptose, sen apoptose / nekrose og nekrose.

6. Morfologi evaluering

  1. Velg riktig størrelse på steriliserte glassdeksler som passer inn i flerbrønnsplaten.
  2. Plasser hvert lysbilde i en brønn ved hjelp av steril pinsett.
  3. Fordel en cellulær suspensjon med tilstrekkelig konsentrasjon i brønnene og la over natten i en inkubator ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2.
  4. Utsett cellekulturer til ekstraktene, som tidligere beskrevet.
  5. Aspirer mediet og vask med PBS.
  6. La dekslene tørke ved romtemperatur og tilsett deretter et tilstrekkelig volum May-Grünwald-oppløsning til å dekke dekslene. ruge i 3 minutter.
  7. Fjern fargestoffet og vask med destillert vann i 1 minutt.
  8. Fjern vannet og tilsett et tilstrekkelig volum Giemsa-oppløsning for å dekke dekslene. ruge i 15 minutter.
  9. Vask dekslene i rennende vann.
  10. Overfør følgesedlene til et lysbilde.
  11. Se under et mikroskop. Ta bildene med den valgte forstørrelsen.

7. Vurdering av cellefunksjon gjennom revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)

MERK: For å utføre denne evalueringen bør minst 2x106 celler per tilstand brukes. Som et eksempel presenteres alkalisk fosfatase som et gen av interesse for odontoblasts aktivitetsevaluering. Andre gener av interesse kan ses i tabell 1.

  1. Plate cellene som beskrevet ovenfor.
    MERK: Det kan være nødvendig å justere konsentrasjonen av celler som er belagt, i henhold til celletypen og cytotoksisiteten til biomaterialene som studeres.
  2. Inkuber med løselige ekstrakter, som beskrevet ovenfor.
  3. Løsne cellene for å oppnå en suspensjon som beskrevet tidligere.
  4. Vask cellene to ganger med PBS; For denne sentrifugen ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Lyse cellene ved å suspendere pelleten i 1 ml RNA-renseløsning (f.eks. NZYol), intens omrøring og påfølgende pipettering.
  6. Inkuber prøvene i 5 minutter ved romtemperatur.
  7. Tilsett 200 μL kloroform og rist rørene for hånd i 15 sekunder.
  8. Inkuber i 3 minutter ved romtemperatur.
  9. Sentrifugelysater ved 4 ° C i 15 minutter ved 12.000 x g. Under denne sentrifugeringen oppstår to faser i prøven, og etterlater RNA i den vandige (øvre) fasen.
  10. Fjern den vandige fasen til et nytt rør og tilsett 500 μL kald isopropanol for å utfelle RNA.
  11. Inkuber prøver ved romtemperatur i 10 minutter og sentrifuge ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
  12. Fjern supernatanten og vask pelleten med 1 ml 75% etanol ved sentrifugering ved 7,500 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
  13. Tørk pelleten ved romtemperatur til etanolfordampning.
  14. Suspender i RNase-fritt vann.
  15. Kvantifisere og bestemme graden av renhet av prøvene ved hjelp av absorpsjonsspektrofotometri, ved bølgelengdene 260 nm og 280 nm. Bestem RNA-renheten og bruk prøver med et renhetsforhold (A260/280) rundt 2,0.
  16. Oppbevar prøver ved -80 ° C.
  17. Fortsett å utføre RT-PCR etter produsentens protokoll17.
    MERK: I samsvar med studiemålet, velg de spesifikke markørene som skal evalueres.

8. Vurdering av cellefunksjon gjennom proteinidentifikasjon

MERK: I henhold til studiemålet, velg de spesifikke proteinene som skal evalueres. Som et eksempel presenteres dentin sialoprotein (DSP) som et protein av interesse for odontoblasts aktivitetsevaluering. Andre proteiner av interesse kan ses i tabell 1.

  1. Dyrkningsceller i coverslips og eksponere for ekstraktene, som beskrevet tidligere.
  2. Vask cellekulturer med PBS.
  3. Fiks med 3,7% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur.
  4. Vask to ganger med PBS.
  5. Permeabiliser med 0,5% Triton i PBS i 15 minutter.
  6. Blokker peroksidasen med 0,3% hydrogenperoksid i PBS i 5 minutter.
  7. Vask to ganger med PBS.
  8. Vask to ganger med 0,5% bovint serumalbumin (BSA).
  9. Blokker cellekulturer med 2% BSA i 45 minutter.
  10. Vask med 0,5% BSA i PBS.
  11. Inkuber kulturer med det primære antistoffet i henhold til det valgte proteinet i 60 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Denne protokollen bruker det primære antistoffet DSP (M20) antistoff (1:100) og det sekundære antistoffet Polyklonal kanin Anti-geit immunglobuliner / HRP (1:100).
  12. Vask fem ganger med 0,5% BSA i PBS.
  13. Inkuber med sekundært antistoff i 90 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Gjør antistofffortynningene ved å bruke 0,5% BSA i PBS.
  14. Vask fem ganger med 0,5% BSA i PBS i 1 minutt i hver vask.
  15. Inkuber kulturer med et substrat og en kromogenblanding i en konsentrasjon på 20 μL kromogen / ml substrat i 25 minutter.
  16. Vask to ganger med 0,5% BSA i PBS.
  17. Motflekk med hematoksylin i 15 minutter.
  18. Vask med en sekvens på 0,037 mol / l ammoniakk og destillert vann i 5 minutter for å fjerne overflødig fargestoff.
  19. Monter dekslene på lysbildene. Bruk glyserol som monteringsmedium.
  20. La det tørke over natten.
  21. Se under et mikroskop. Ta bildene med den valgte forstørrelsen.

9. Mineraliseringsvurdering gjennom Alizarin Red S-analyse

  1. Forbered en Alizarin Red S-løsning i en konsentrasjon på 40 mM18. Rør løsningen for homogenisering i 12 timer i mørket.
    MERK: For å tilberede 100 ml Alizarin Red S-oppløsning, oppløselig 1,44 g alizarinpulver (molekylvekt: 360 g/mol) i ultrarent vann, beskyttet mot lys. For denne løsningen er pH-verdien kritisk og bør være mellom 4,1 og 4,3.
  2. Inkuber cellekultur med løselige ekstrakter, som beskrevet ovenfor.
  3. Vask cellekulturer tre ganger med PBS.
  4. Fest med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur.
  5. Vask tre ganger med PBS.
  6. Beis med Alizarin Red Staining oppløsning i 20 minutter ved 37 °C i mørket.
  7. Etter farging, vask platene med PBS for å fjerne overflødig fargestoff.
  8. Se under et mikroskop. Ta bildene med den valgte forstørrelsen.
  9. Tilsett en ekstraksjonsløsning, sammensatt av 10% (w / v) eddiksyre og 20% (w / v) metanol, til hver brønn, og la omrøring i 40 minutter ved romtemperatur.
  10. Mål absorbansen ved 490 nm bølgelengde på et spektrofotometer19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representative resultatene refererer her til studiet av dentale biomaterialer. Ekstraksjonsmetoden gjør det mulig å oppnå en cytotoksisitetsprofil og cellefunksjon etter eksposisjon til dentalmaterialet, angående effekter på metabolsk aktivitet (figur 2), cellelevedyktighet, celledødsprofil og cellemorfologi (figur 3) og spesifikt proteinuttrykk (figur 4).

MTT-analysen brukes til å få en rask oversikt over cytotoksisiteten til materialene på en enkel måte. En sammenligning mellom to eller flere materialer kan gjøres (figur 2); en alvorlig reduksjon av metabolsk aktivitet, selv ved lave (6,25 %) og middels konsentrasjoner (50 %), indikerer høyere toksisitet (figur 2a). Samtidig er mindre cytotoksiske materialer bare lettere eller ingen reduksjon (figur 2b). Sammenligninger mellom ulike tidspunkter gjør det mulig å bestemme mer umiddelbare cytotoksiske effekter eller i senere stadier.

Effekter på cellens levedyktighet gir viktig informasjon om levedyktig cellereduksjon, noe som kan kompromittere vevets evne til å gjenopprette etter en skadelig effekt. Bestemmelsen av prosentandelen av levedyktige celler gjør det mulig å sammenligne kjemisk cytotoksisitet; flere cytotoksiske materialer induserer høyere celledød for samme konsentrasjon (figur 3a og 3b). Reduksjoner på over 30 % er kritiske og definerer materialer med risiko for lav biokompatibilitet (figur 3a). Denne informasjonen suppleres med celledødsprofilen (figur 3a og 3b). I de representative resultatene er flere cytotoksiske materialer karakterisert ved en fremhevet reduksjon i cellenes levedyktighet og for en sen apoptose- og nekrosecelledødsprofil (figur 3a), mens mindre cytotoksiske gir mindre celledød og en mer apoptotisk og sen apoptotisk profil (figur 3b).

Informasjonen hentet fra den cellulære morfologievalueringen (figur 3c) utfyller cellens levedyktighetsevaluering. Endringer fra cellens typiske morfologi kan indikere en apoptotisk eller nekrotisk profil16. Tilleggsinformasjon kan også fås fra denne protokollen, som observasjon av materialpartikler (røde piler, figur 3C).

Spesifikke markører, som er grunnleggende for cellefunksjonen, påvirket av ekstrakteksponeringen, kan evalueres ved flere teknikker, som immunhistokjemi, PCR, flowcytometri, blotting eller kolorimetriske analyser (tabell 1). Representative resultater av DSP-uttrykket etter eksponering for ekstrakter er vist i figur 4a, og det kan sees at noen materialer (tricalciumsilikatsementer) stimulerer cellene til å øke proteinuttrykket. I motsetning til dette fremmer andre (kalsiumhydroksidsementer) en signifikant reduksjon i proteinuttrykk, uavhengig av levedyktighetstap. I begge tilfeller påvirker konsentrasjonen av ekstraktene direkte proteinuttrykket.

I MDPC-23-cellelinjen til odontoblastfenotypen er dannelsen av mineraliseringsavsetninger karakteristisk. Protokollen for identifisering og kvantifisering av mineraliserte forekomster gjør det mulig å evaluere den spesifikke funksjonen til denne typen spesialiserte celler. I det presenterte tilfellet ble det observert at i tillegg til å være mindre cytotoksisk, stimulerer tricalciumsilikatsement cellefunksjonen, når en økning i mineraliserte forekomster ble observert (figur 4b). Tvert imot førte mer cytotoksisk kalsiumhydroksidsement til redusert mineralavleiring på grunn av cellesvikt og død (figur 4b). I tillegg til en kvalitativ evaluering kan en kvantitativ bestemmelse utføres (figur 4c).

Figure 2
Figur 2: Metabolsk aktivitet. Metabolsk aktivitet av MDPC-23-celler behandlet med kalsiumhydroksidsement [a)] og tricalciumsilikatsement [b)] løselige ekstrakter i 24, 72 og 120 timer. Resultatene normaliseres til kontrollcellekulturer, med en verdi på 100%. Signifikante forskjeller er representert ved *, der * betyr p<0,05, ** betyr p<0,01, og *** betyr p<0,001. Deler av denne figuren er endret fra en tidligere publikasjon med tillatelse fra forlaget20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Cellenes levedyktighet, dødsprofil og cellemorfologi. Cellelevedyktighet, celledødsprofil og cellemorfologi i MDPC-23-celler utsatt for behandling med kalsiumhydroksid og tricalciumsilikatbiomaterialer ved 6,25 % og 50 % konsentrasjon, etter 120 timers eksponering. a) og b) Resultatene plottes som prosentandelen levende celler i apoptose, sen apoptose eller nekrose og nekrose. Signifikante forskjeller med hensyn til kontroll eller mellom forhold er representert med *, der * betyr p <0,05, ** betyr p <0,01, og *** betyr p <0,001. c) Celler farget med May-Grünwald Giemsa etter behandling med en 50% konsentrasjon av oppløselige biomaterialer ekstrakter. Kontrollgruppen representerer celler i kultur i DMEM med 10% FBS. Bilder i venstre kolonne ble oppnådd med en forstørrelse på 100x, og bildene i kolonnen til høyre ble oppnådd med en forstørrelse på 500x. Figurstolper representerer 100 μm. Deler av denne figuren er endret fra en tidligere publikasjon med tillatelse fra forlaget20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: DSP-ekspresjon og mineralisert knutedannelse. a) MDPC-23-celler merket ved immuncytokjemi for påvisning av DSP-ekspresjon når de utsettes for behandling med kalsiumhydroksid og trikalsiumsilikat i konsentrasjoner på 50 % og 6,25 % etter 96 timers inkubasjon. b) Bilder fra dyrkede MDPC-23-celler farget med Alizarin Red S-flekk ved behandling med kalsiumhydroksid og tricalciumsilikatbiomaterialer i konsentrasjoner på 50 % og 6,25 % etter 120 timers inkubasjon. Alle fotografiene ble oppnådd med en forstørrelse på 100x. Begge figurstolpene representerer 150μm. c) Dannelse av kalkavleiringer fra MDPC-23-celler behandlet med kalsiumhydroksid og trikalsiumsilikat etter 120 timers eksponering. Resultatene er forholdet mellom absorbansene i prøvene og kontrollen. Signifikante forskjeller er representert ved *, der * betyr p<0,05, ** betyr p<0,01, og *** betyr p<0,001. Deler av denne figuren er endret fra en tidligere publikasjon med tillatelse fra forlaget20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Liste over odontoblastiske differensierings-/funksjonsmarkører47-79. Denne tabellen inneholder en liste over odontoblastiske markører og deteksjonsmetoder. Noen av disse markørene uttrykkes også av andre vev.

Gen eller protein Metode Referanser
Alkalisk fosfatase (ALP) Kolorimetrisk 47 48
Immunocytokjemi 20 49
Nordre Blot 50
RT-PCR 51 52
Dekorin (DCN) Kolorimetrisk ELISA 53
Immunocytokjemi 54 55
RT-PCR 53 56
dentin matriksprotein 1 (DMP-1) Flowcytometri 57
Immunocytokjemi 58 59
Nordre Blot 50 60
RT-PCR 47 49
Western Blot 50 60
Dentin matriksprotein 2 (DMP-2) Immunocytokjemi 60 61
RT-PCR 50 62
Nordre Blot 60
Western Blot 62
Dentin fosfoprotein (DPP) Immunocytokjemi 63
Nordre Blot 63
Dentin Sialoprotein (DSP)* Immunocytokjemi 20 60
Nordre Blot 60 63
RT-PCR 50
Western Blot 64 65
dentin sialofosfoprotein (DSPP) Flowcytometri 57
Immunocytokjemi 66 54
RT-PCR 47 49
Nordre Blot 67 68
Western Blot 64 62
Emalje / matrise metalloproteinase-20 (MMP-20) Nordre Blot 68
RT-PCR 49 68
Nestin Immunocytokjemi 54 69
RT-PCR 70 71
Western Blot 72
Osteoadherin (OSAD) Immunocytokjemi 73 74
Nordre Blot 73
RT-PCR 75
Western Blot 73 74
Osteopontin (OPN) Immunocytokjemi 76
Nordre Blot 50
RT-PCR 66 51
Western Blot 77
Osteocalcin (OCN) Immunocytokjemi 52
Nordre Blot 50
RT-PCR 51 52
Western Blot 77 78
Osterix (OSX)/ transkripsjonsfaktor Sp7 (Sp7) Immunocytokjemi 54 58
RT-PCR 78
Western Blot 78 79
Fosfatregulerende gen med homologier til endopeptidaser på X-kromosom (Phex) Nordre Blot 68
RT-PCR 49 68
Western Blot 79
Runt-relatert transkripsjonsfaktor 2 (Runx2) Immunocytokjemi 66 52
RT-PCR 66 70
Western Blot 62 77
*DPP og DSP er spaltningsproduktene til DSPP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen ble utformet under hensyntagen til ISO 10993-5, som refererer til evaluering av in vitro cytotoksisitet av biomaterialer som kommer i kontakt med vevet, for å evaluere biokompatibiliteten og for å bidra til studier reproduserbarhet21. Dette er en økende bekymring i vitenskapen, og mange forfattere følger allerede disse anbefalingene i den eksperimentelle utformingen av deres in vitro-studier 15,22,23,24,25,26,27,28.

Den foreslåtte metodikken ble valgt for å screene de mest relevante aspektene ved cellebiologi. Dermed går denne protokollen utover anbefalingene, når den gir en komplett tilnærming til å evaluere cytotoksisitet ved hjelp av vanlige analyser og en komplementær evaluering, inkludert flere celleparametere fra fenotype til funksjon. Denne komplementære evalueringen er viktig for å virkelig vurdere biomaterialeffekten, når levedyktigheten kanskje ikke oversetter endringer på nivået av gen- og proteinuttrykk, cellesyklus eller sekretom.

Ekstraktene er fordelaktige, spesielt i adherente cellelinjer, fordi det ikke er noen interferens med cellefeste til substratet og optimale kulturforhold, i motsetning til noen direkte kontakttilnærminger der materialer plasseres på overflaten av kulturplaten22,28.

Videre tillater ekstrakter celleeksponering for forskjellige konsentrasjoner29, etterligner diffusjon av stoffer i vev, som simulerer clearance de gjennomgår in vivo, spesielt når de påføres i kontakt med ekstremt vannet vev. Direkte kontakttester kan ikke nøyaktig vurdere forskjellige konsentrasjoner, og indirekte kontakttester viste potensielle vanskeligheter med ikke-diffusjon, ufullstendig diffusjon gjennom membraner eller reaksjon med agar.

Tester som gir en kvantitativ vurdering foretrekkes, med celle levedyktighet reduksjon med mer enn 30% anses cytotoksisk11,30. Ved utvikling av nye biomaterialer, hvis en slik reduksjon oppstår, bestemmer den behovet for reformulering eller forlatelse. Hvis oppmuntrende resultater oppnås, bør det utføres ytterligere studier som ser for seg in vivo evaluering29,31.

In vitro tester skal simulere eller overdrive de kliniske tilstandene. Derfor er bestemmelsen av passende overflatevolumforhold for ekstraktforberedelse kritisk. Forhold mellom overflate og volum på 1,25–6 cm2/ml ble foreslått. For materialer med overflateuregelmessigheter som skum er 0,1–0,2 g/ml eller 6 cm 2/ml et utgangspunkt: 15,20,2. Forholdet mellom 250 mm2per ml medium ble brukt i representative resultater brukt i denne protokollen og andre studier15,20.

Selv om prøvene ikke brukes på denne måten i klinikkene, må de steriliseres med metoder som ikke endrer egenskapene. UV-bestråling er ofte et godt valg. Dette er av avgjørende betydning for å forhindre mikrobiell forurensning av cellekulturer 11,24,32.

Ekstraksjonsmedier inkluderer cellekulturmedium med eller uten serum, fysiologisk saltoppløsning, dimetylsulfoksid eller renset vann, valgt i henhold til biomaterialets kjemiske egenskaper11,33. Med sikte på cellekulturstudier foretrekkes bruk av cellekulturmediet siden det unngår ytterligere behandlingstrinn. Betingelsene for utvinning bør tilpasses den eksperimentelle modellen. I de representative resultatene vist i denne protokollen ble DMEM-dyrkningsmediet supplert med FBS brukt i 24 ± 2 timer ved 37 ± 1 °C.

Noen biomaterialer kan etterlate rester i ekstraksjonsmediet, noe som kan påvirke cellekulturene negativt. Mens filtrering og sentrifugeringer bør unngås, er en mulighet å la partiklene sedimentere før bruk. Et annet problem er pH som kan lide endring etter ekstraksjon. Siden det ikke anbefales å utføre ytterligere justeringer11, må pH i ekstraktene måles, registreres, og ytterligere kontroller for å isolere pH-effekten må inkluderes i eksperimentell design om nødvendig.

Mens denne protokollen ble beskrevet for adherente cellekulturer, kan enkle modifikasjoner utføres for å bruke suspensjonskulturer. På samme måte, i tillegg til å bruke faste biomaterialer, er det mulig å tilpasse prosedyren, i hovedsak ekstraksjonstrinnene, for å studere væsker, geler eller skum34,35,36,37.

Fremstilling av cellekulturer med passende tetthet er kritisk, spesielt på cellekulturer med høy dupliseringshastighet31. I henhold til det anbefalte såtetthetsområdet for cellene som brukes, hvis langtidsinkubasjoner er planlagt, må reduksjonen av den opprinnelige såtettheten utføres for å unngå problemene forbundet med overdreven sammenløp. I tillegg kan høycytotoksiske materialer kreve høyere innledende såtetthet.

Foruten fordelene med ekstraktmetodikken, er det ikke det beste valget for materialer der evalueringen av celleadherens er relevant. I dette tilfellet må de direkte kontaktstudiene utføres 38,39,40,41. Selv om dette er en helhetlig tilnærming, er det viktig å huske på at det er en in vitro-vurdering, som ikke helt gjenspeiler in vivo-betingelsene42.

Et biomateriale skal ikke bare forårsake skade på vevet, men stimulere noen av de antiinflammatoriske og immunmodulerende prosessene43,44,45,46. Dermed går denne protokollen videre, med evaluering av cellulære mekanismer, inkludert celle levedyktighet og celledødsprofil, samt andre mekanismer for proteinsyntese. Den utførte evalueringen bør tillate konklusjon om biomaterialet bioaktivitet i levende vev, i tillegg til cytotoksisitet.

Med eksplosjonen av nye materialer for medisinske applikasjoner, ikke bare for tannlegen, men også for ortopedi, kirurgi, oftalmologi, kardiologi, etc., bør de første screeningene gjøres systematisk. Denne protokollen kan være et viktig verktøy for forskere som tar sikte på å utvikle og karakterisere nye biomaterialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker følgende for støtte: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB er finansiert av National Funds via FCT (Foundation for Science and Technology) gjennom det strategiske prosjektet UIDB/04539/2020 og UIDP/04539/2020 (CIBB). Vi takker Jacques Nör, University of Michigan Dental School, for å gi cellelinjen MDPC-23.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CaCl2 Sigma 10035-04-8
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
DAB + Chromogen Dako K3468
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 Santa Cruz Biotechnology LS-C20939
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Hepes 0.01 M Sigma MFCD00006158
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Giemsa Stain, modified GS-500 Sigma MFCD00081642
Glycerol Dako C0563
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
May-Grünwald Stain MG500 Sigma MFCD00131580
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 Dako G-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Substrate Buffer Dako 926605
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
β-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  2. Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 126, 117-152 (2012).
  3. Wataha, J. C. Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry. 86 (2), 203-209 (2001).
  4. Mishra, S. F. D. A. CE mark or something else?-Thinking fast and slow. Indian Heart Journal. 69 (1), 1-5 (2016).
  5. Barbeck, M., et al. Balancing Purification and Ultrastructure of Naturally Derived Bone Blocks for Bone Regeneration: Report of the Purification Effort of Two Bone Blocks. Materials. 12 (19), 3234 (2019).
  6. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  7. Coelho, C. C., Araújo, R., Quadros, P. A., Sousa, S. R., Monteiro, F. J. Antibacterial bone substitute of hydroxyapatite and magnesium oxide to prevent dental and orthopaedic infections. Materials Science and Engineering: C. 97, 529-538 (2019).
  8. Jung, O., et al. Improved In Vitro Test Procedure for Full Assessment of the Cytocompatibility of Degradable Magnesium Based on ISO 10993-5/-12. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 255 (2019).
  9. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  10. ISO. I.O. for S. ISO 10993-12:2012 - part 12: Sample preparation and reference materials. ISO. , (2012).
  11. ISO. I.O. for S. ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices - part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. ISO. , (2009).
  12. Srivastava, G. K., et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation. Scientific Reports. 8 (1), 1425 (2018).
  13. Pusnik, M., Imeri, M., Deppierraz, G., Bruinink, A., Zinn, M. The agar diffusion scratch assay--A novel method to assess the bioactive and cytotoxic potential of new materials and compounds. Scientific Reports. 6, 20854 (2016).
  14. Spiller, K. L., et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 35 (15), 4477-4488 (2014).
  15. Zhou, H., et al. In Vitro Cytotoxicity Evaluation of a Novel Root Repair Material. Journal of Endodontics. 39 (4), 478-483 (2013).
  16. Bordron, A., et al. The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis. Journal of Clinical Investigation. 101 (10), 2029-2035 (1998).
  17. Palmini, G., et al. Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma. Journal of Visualized Experiments. (116), e53884 (2016).
  18. Gregory, C. A., Grady Gunn, W., Peister, A., Prockop, D. J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry. 329 (1), 77-84 (2004).
  19. Cai, S., Zhang, W., Chen, W. PDGFRβ+/c-kit+ pulp cells are odontoblastic progenitors capable of producing dentin-like structure in vitro and in vivo. BMC Oral Health. 16 (1), 113 (2016).
  20. Paula, A., et al. Biodentine Boosts, WhiteProRoot MTA Increases and Life Suppresses Odontoblast Activity. Materials. 12 (7), 1184 (2019).
  21. Chander, N. G. Standardization of in vitro studies. Journal of Indian Prosthodontic Society. 16 (3), 227-228 (2016).
  22. Cavalcanti, B. N., Rode de M, S., França, C. M., Marques, M. M. Pulp capping materials exert an effect on the secretion of IL-1β and IL-8 by migrating human neutrophils. Brazilian Oral Research. 25 (1), 13-18 (2011).
  23. Chang, S., Lee, S. Y., Ann, H. J., Kum, K. Y., Kim, E. C. Effects of calcium silicate endodontic cements on biocompatibility and mineralization-inducing potentials in human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 40 (8), 1194-1200 (2014).
  24. Daltoé, M. O., Paula-Silva, F. W. G., Faccioli, L. H., Gatón-Hernández, P. M., De Rossi, A., Bezerra Silva, L. A. Expression of Mineralization Markers during Pulp Response to Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate. Journal of Endodontics. 42 (4), 596-603 (2016).
  25. Elias, R. V., Demarco, F. F., Tarquinio, S. B. C., Piva, E. Pulp responses to the application of a self-etching adhesive in human pulps after controlling bleeding with sodium hypochlorite. Quintessence International. 38 (2), 67-77 (2007).
  26. Huang, G. T. J., Shagramanova, K., Chan, S. W. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. Journal of endodontics. 32 (11), 1066-1073 (2006).
  27. Jafarnia, B., et al. Evaluation of cytotoxicity of MTA employing various additives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 107 (5), 739-744 (2009).
  28. Paranjpe, A., Smoot, T., Zhang, H., Johnson, J. D. Direct contact with mineral trioxide aggregate activates and differentiates human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 37 (12), 1691-1695 (2011).
  29. Spagnuolo, G., et al. In vitro cellular detoxification of triethylene glycol dimethacrylate by adduct formation with N-acetylcysteine. Dental Materials. 29 (8), 153-160 (2013).
  30. Murray, P. E., García Godoy, C., García Godoy C, F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated. Medicina Oral, Patologia Oral y Cirugia Bucal. 12 (3), 258-266 (2007).
  31. Hanks, C. T., Wataha, J. C., Sun, Z. In vitro models of biocompatibility: a review. Dental Materials. 12 (3), 186-193 (1996).
  32. Eid, A. A., et al. In Vitro Biocompatibility and Oxidative Stress Profiles of Different Hydraulic Calcium Silicate Cements. Journal of Endodontics. 40 (2), 255-260 (2014).
  33. Nocca, G., et al. Effects of ethanol and dimethyl sulfoxide on solubility and cytotoxicity of the resin monomer triethylene glycol dimethacrylate. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 100 (6), 1500-1506 (2012).
  34. Abuarqoub, D., Aslam, N., Jafar, H., Abu Harfil, Z., Awidi, A. Biocompatibility of Biodentine with Periodontal Ligament Stem Cells: In Vitro Study. Dentistry Journal. 8 (1), 17 (2020).
  35. Coelho, A. S., et al. Cytotoxic effects of a chlorhexidine mouthwash and of an enzymatic mouthwash on human gingival fibroblasts. Odontology. 108 (2), 260-270 (2020).
  36. Wang, M. O., et al. Evaluation of the In Vitro Cytotoxicity of Cross-Linked Biomaterials. Biomacromolecules. 14 (5), 1321-1329 (2013).
  37. Tyliszczak, B., Drabczyk, A., Kudłacik-Kramarczyk, S., Bialik-Wąs, K., Sobczak-Kupiec, A. In vitro cytotoxicity of hydrogels based on chitosan and modified with gold nanoparticles. Journal of Polymer Research. 24 (10), 153 (2017).
  38. Widbiller, M., et al. Three-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 237-246 (2016).
  39. Pintor, A. V. B., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of ReOss in Powder and Putty Configurations. Brazilian Dental Journal. 29 (2), 117-127 (2018).
  40. Pellissari, C. V. G., et al. In Vitro Toxic Effect of Biomaterials Coated with Silver Tungstate or Silver Molybdate Microcrystals. Journal of Nanomaterials. 2020, 1-9 (2020).
  41. Collado-González, M., et al. Cytotoxicity and bioactivity of various pulpotomy materials on stem cells from human exfoliated primary teeth. International Endodontic Journal. 50, 19-30 (2017).
  42. Paula, A., et al. Direct Pulp Capping: Which is the Most Effective Biomaterial? A Retrospective Clinical Study. Materials. 12 (20), 3382 (2019).
  43. Williams, D. F. There is no such thing as a biocompatible material. Biomaterials. 35 (38), 10009-10014 (2014).
  44. Schuh, J. C. L. Medical device regulations and testing for toxicologic pathologists. Toxicologic Pathology. 36 (1), 63-69 (2008).
  45. Pizzoferrato, A., et al. Cell culture methods for testing Biocompatibility. Clinical Materials. 15 (3), (1994).
  46. Pereira Paula, A. B., et al. Direct pulp capping: what is the most effective therapy? - review and meta-analysis. Journal of Evidence Based Dental Practice. , (2018).
  47. Caiaffa, K. S., et al. Effect of analogues of cationic peptides on dentin mineralization markers in odontoblast-like cells. Archives of Oral Biology. 103, 19-25 (2019).
  48. Fujiwara, S., Kumabe, S., Iwai, Y. Isolated rat dental pulp cell culture and transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anatomica Japonica. 83 (1), 15-24 (2006).
  49. Nakashima, M., et al. Stimulation of Reparative Dentin Formation by Ex Vivo Gene Therapy Using Dental Pulp Stem Cells Electrotransfected with Growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Therapy. 15 (11), 1045-1053 (2004).
  50. Narayanan, K., et al. Differentiation of embryonic mesenchymal cells to odontoblast-like cells by overexpression of dentin matrix protein 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4516-4521 (2001).
  51. Kim, H. J., Yoo, J. H., Choi, Y., Joo, J. Y., Lee, J. Y., Kim, H. J. Assessing the effects of cyclosporine A on the osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, and angiogenesis mediated by the human periodontal ligament stem cells. Journal of Periodontology. , (2019).
  52. Bou Assaf, R., et al. Healing of Bone Defects in Pig's Femur Using Mesenchymal Cells Originated from the Sinus Membrane with Different Scaffolds. Stem Cells International. , (2019).
  53. He, W., et al. Lipopolysaccharide enhances decorin expression through the toll-like receptor 4, myeloid differentiating factor 88, nuclear factor-kappa B, and mitogen-activated protein kinase pathways in odontoblast cells. Journal of Endodontics. 38 (4), 464-469 (2012).
  54. Xiong, Y., et al. Wnt Production in Dental Epithelium Is Crucial for Tooth Differentiation. Journal of Dental Research. 98 (5), 580-588 (2019).
  55. Haruyama, N., et al. Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization. Matrix Biology. 28 (3), 129-136 (2009).
  56. Sreenath, T., et al. Dentin Sialophosphoprotein Knockout Mouse Teeth Display Widened Predentin Zone and Develop Defective Dentin Mineralization Similar to Human Dentinogenesis Imperfecta Type III. Journal of Biological Chemistry. 278 (27), 24874-24880 (2003).
  57. Yang, Y., Zhao, Y., Liu, X., Chen, Y., Liu, P., Zhao, L. Effect of SOX2 on odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. Molecular Medicine Reports. 16 (6), 9659-9663 (2017).
  58. Tao, H., et al. Klf4 Promotes Dentinogenesis and Odontoblastic Differentiation via Modulation of TGF-β Signaling Pathway and Interaction With Histone Acetylation. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (8), 1502-1516 (2019).
  59. Massa, L. F., Ramachandran, A., George, A., Arana-Chavez, V. E. Developmental appearance of dentin matrix protein 1 during the early dentinogenesis in rat molars as identified by high-resolution immunocytochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 124 (3-4), 197-205 (2005).
  60. Hao, J., Zou, B., Narayanan, K., George, A. Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone. 34 (6), 921-932 (2004).
  61. Tompkins, K., Alvares, K., George, A., Veis, A. Two related low molecular mass polypeptide isoforms of amelogenin have distinct activities in mouse tooth germ differentiation in vitro. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (2), 341-349 (2005).
  62. Zhai, Y., et al. Activation and Biological Properties of Human β Defensin 4 in Stem Cells Derived From Human Exfoliated Deciduous Teeth. Frontiers in Physiology. 10, (2019).
  63. Bègue-Kirn, C., Ruch, J. V., Ridall, A. L., Butler, W. T. Comparative analysis of mouse DSP and DPP expression in odontoblasts, preameloblasts, and experimentally induced odontoblast-like cells. European Journal of Oral Sciences. 106, 254-259 (1998).
  64. Kikuchi, H., Suzuki, K., Sakai, N., Yamada, S. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture. Cell and Tissue Research. 317 (2), 173-185 (2004).
  65. Li, X., Yang, G., Fan, M. Effects of homeobox gene distal-less 3 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 38 (11), 1504-1510 (2012).
  66. Chen, S., et al. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during odontoblast cytodifferentiation. Journal of Biological Chemistry. 280 (33), 29717-29727 (2005).
  67. Narayanan, K., Gajjeraman, S., Ramachandran, A., Hao, J., George, A. Dentin matrix protein 1 regulates dentin sialophosphoprotein gene transcription during early odontoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281 (28), 19064-19071 (2006).
  68. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. A substractive PCR-based cDNA library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biology. 19 (5), 421-430 (2000).
  69. Miyazaki, T., Baba, T., Mori, T., Komori, T. Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts. Acta Histochemica et Cytochemica. 51 (6), 185-190 (2018).
  70. Yokoi, M., Kuremoto, K., Okada, S., Sasaki, M., Tsuga, K. Effect of attenuation of fibroblast growth factor receptor 2b signaling on odontoblast differentiation and dentin formation. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 55 (3), 211-219 (2019).
  71. Tohma, A., et al. Glucose Transporter 2 and 4 Are Involved in Glucose Supply during Pulpal Wound Healing after Pulpotomy with Mineral Trioxide Aggregate in Rat Molars. Journal of Endodontics. , (2019).
  72. Sueyama, Y., Kaneko, T., Ito, T., Kaneko, R., Okiji, T. Implantation of Endothelial Cells with Mesenchymal Stem Cells Accelerates Dental Pulp Tissue Regeneration/Healing in Pulpotomized Rat Molars. Journal of Endodontics. 43 (6), 943-948 (2017).
  73. Petersson, U., Hultenby, K., Wendel, M. Identification, distribution and expression of osteoadherin during tooth formation. European Journal of Oral Sciences. 111 (2), 128-136 (2003).
  74. Couble, M. L., et al. Immunodetection of osteoadherin in murine tooth extracellular matrices. Histochemistry and Cell Biology. 121 (1), 47-53 (2004).
  75. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. Expression of the small leucine-rich proteoglycan osteoadherin/osteomodulin in human dental pulp and developing rat teeth. Bone. 27 (2), 265-270 (2000).
  76. Salmon, B., et al. Abnormal osteopontin and matrix extracellular phosphoglycoprotein localization, and odontoblast differentiation, in X-linked hypophosphatemic teeth. Connective Tissue Research. 55, SUPPL. 1 79-82 (2014).
  77. Liao, C., Ou, Y., Wu, Y., Zhou, Y., Liang, S., Wang, Y. Sclerostin inhibits odontogenic differentiation of human pulp-derived odontoblast-like cells under mechanical stress. Journal of Cellular Physiology. 234 (11), 20779-20789 (2019).
  78. Deng, X., et al. The combined effect of oleonuezhenide and wedelolactone on proliferation and osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Phytomedicine. 153103, (2019).
  79. Choi, H., Kim, T. H., Yun, C. Y., Kim, J. W., Cho, E. S. Testicular acid phosphatase induces odontoblast differentiation and mineralization. Cell and Tissue Research. 364 (1), 95-103 (2016).

Tags

Retraksjon utgave 173 biokompatibilitet biomaterialer cellekultur cytotoksisitet betinget medium ekstrakter
Tilgang til cytotoksisitet og cellerespons på biomaterialer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho,… More

Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho, A. S., Abrantes, A. M., Gonçalves, A. C., Sarmento-Ribeiro, A. B., Ferreira, M. M., Botelho, M. F., Marto, C. M., Carrilho, E. Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials. J. Vis. Exp. (173), e61512, doi:10.3791/61512 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter