Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tillgång till cytotoxicitet och cellrespons på biomaterial

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/61512
Automatic Translation
*1,2,3,4, *2,3,4,5, 1,2,3,4, 2,3,4,5, 2,3,4,6, 2,3,4,6, 2,3,4,7, 2,3,4,5, 1,2,3,4,8, 1,2,3,4
1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal
* These authors contributed equally

Summary

Denna metod syftar till att utvärdera biomaterialets cytotoxicitet genom beredning av lösliga extrakt, med hjälp av viabilitetsanalyser och fenotypisk analys, inklusive flödescytometri, RT-PCR, immunocytokemi och andra cellulära och molekylärbiologiska tekniker.

Abstract

Biomaterial kommer i direkt eller indirekt kontakt med mänskliga vävnader, vilket gör det viktigt att utvärdera dess cytotoxicitet. Denna utvärdering kan utföras med flera metoder, men det finns en hög skillnad mellan de använda metoderna, vilket äventyrar reproducerbarheten och jämförelsen mellan de erhållna resultaten. I detta dokument föreslår vi ett protokoll för att utvärdera biomaterials cytotoxicitet med hjälp av lösliga extrakt, som vi använder för dentala biomaterial. Beredningen av extrakt är detaljerad, från pelletsproduktion till dess extraktion i ett odlingsmedium. Utvärderingen av biomaterialets cytotoxicitet baseras på metabolisk aktivitet med MTT-analysen, cellviabilitet med användning av SBR-analysen (Sulphorhodamine B), celldödsprofil med flödescytometri och cellmorfologi med May-Grünwald Giemsa. Utöver cytotoxicitetsutvärderingen beskrivs ett protokoll för att utvärdera cellfunktionen baserat på uttrycket av specifika markörer bedömda med immunocytokemi och PCR. Detta protokoll ger en omfattande guide för biomaterial cytotoxicitet och cellulära effekter utvärdering, med hjälp av extrakt metodik, på ett reproducerbart och robust sätt.

Introduction

Biokompatibilitet kan definieras som ett materials förmåga att integrera vävnad och inducera ett gynnsamt terapeutiskt svar, fritt från lokala och systemiska skador 1,2,3. Utvärdering av biokompatibilitet är avgörande för utvecklingen av material som är avsett för medicinskt bruk. Därför ger detta protokoll ett systematiskt och omfattande tillvägagångssätt för varje forskare som syftar till att utveckla nya biomaterial eller studera nya tillämpningar för befintliga biomaterial.

In vitro-cytotoxicitetstester används ofta som den första fasen för utvärdering av biokompatibilitet, med användning av primära cellkulturer eller cellinjer. Resultaten utgör en första indikator på potentiell klinisk tillämpning. Förutom att vara avgörande för utvecklingen av biomaterial är denna testning obligatorisk för att följa gällande regler för marknadsintroduktion, från EUA och EU: s tillsynsmyndigheter (FDA och CE-certifiering) 4,5,6,7,8. Dessutom ger standardiserade tester inom biomedicinsk forskning en betydande fördel när det gäller reproducerbarhet och jämförelse av resultat från olika studier på liknande biomaterial eller produkter9.

Riktlinjer från International Organization for Standardization (ISO) används ofta av flera oberoende kommersiella, reglerande och akademiska laboratorier för att testa material på ett korrekt och reproducerbart sätt. ISO 10993-5 hänvisar till cytotoxicitetsbedömningen in vitro och ISO 10993-12-rapporterna till provtagningspreparatet10,11. För biomaterialtestning tillhandahålls tre kategorier, som ska väljas utifrån materialtyp, kontaktvävnader och behandlingsmålet: extrakt, direktkontakt och indirekt kontakt 8,11,12,13. Extrakt erhålls genom att berika ett cellodlingsmedium med biomaterialet. För direktkontakttesterna placeras biomaterialet direkt på cellkulturerna, och vid indirekt kontakt utförs inkubation med cellerna separerad av en barriär, såsom en agarosgel11. Lämpliga kontroller är obligatoriska och minst tre oberoende experiment bör utföras 5,8,10,11,14.

Det är viktigt att simulera eller överdriva kliniska tillstånd för att bestämma den cytotoxiska potentialen. Vid extraktprovning, materialets yta.  medelvolymen; mediet och materialets pH; materialets löslighet, osmolaritet och diffusionsförhållande; och extraktionsförhållandena som omrörning, temperatur och tid påverkar medieberikare5.

Metodiken möjliggör kvantitativ och kvalitativ utvärdering av cytotoxicitet hos flera farmaceutiska formuleringar, både fasta och flytande. Flera analyser kan utföras, såsom neutralt rött upptagstest, kolonibildningstest, MTT-analys och XTT-analys 5,10,14.

De flesta publicerade cytotoxicitetsbedömningsstudier använder enklare analyser, nämligen MTT och XTT, som ger begränsad information. Utvärdering av biokompatibilitet bör inte bara omfatta bedömning av cytotoxicitet utan även bioaktivitet hos ett visst testmaterial2, vilket bekräftas i detta protokoll. Ytterligare utvärderingskriterier bör användas när det är motiverat och dokumenterat. Således syftar detta protokoll till att ge en omfattande guide som beskriver en uppsättning metoder för biomaterialets cytotoxicitetsutvärdering. Dessutom beskrivs utvärderingen av olika cellulära processer, nämligen typ av celldöd, cellmorfologi, cellfunktion vid syntes av specifika proteiner och specifik vävnadsproduktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av pellets

  1. Förbered polyvinylkloridformarna (PVC) genom att utföra cirkulärformade hål med kända dimensioner i PVC-plattor.
    OBS: PVC-lister kan tillverkas av olika storlekar. Beräkna kontaktytan för PVC-formar med formeln A = h (2πr) + 2πr2 (r: cylinderns radie; h: cylinderns höjd).
  2. Förbered biomaterialet som ska testas enligt tillverkarens instruktioner och så nära experimentets början som möjligt.
    OBS: För beredning av biomaterial för pasta/pastaformulering blandas en tillräcklig mängd baspasta och katalysator manuellt med en blandningsspatel. För andra material baserade på vätske- och pulverformuleringar bör manuell spatulering eller mekanisk blandning med vibrationer utföras, enligt tillverkarens instruktioner eller lämplig för nya material. För flytande material är detta steg inte nödvändigt. Starta protokollet i steg 2.
  3. Lägg biomaterialet på formarna med en spatel och låt dem stelna under lämplig tid.
    OBS: Inställningstiden och inställningsvillkoren för biomaterialen måste följa tillverkarens instruktioner eller lämpliga för nya material.
  4. Efter inställning, ta bort biomaterialets pellets från PVC-formarna och placera dem i en behållare (en 6-brunnsplatta eller en petriskål kan användas).
  5. Sterilisera pelletsen genom att placera dem under en ultraviolett ljus (UV) lampa i 20 minuter för varje sida.

2. Erhållande av biomaterialens extrakt

OBS: Alla procedurer bör utföras under strikt sterila förhållanden.

  1. Bestäm det nödvändiga antalet pellets genom att beräkna pelletsytan baserat på formeln som beskrivs i 1.1.
    Anmärkning: Som referensvärde uppnås kontaktytan på 250 mm2/ml11,15 genom tillsats av 9 pellets (r 3 mm x h 1,5 mm) per ml av mediet.
  2. Bered de lösliga extrakten (extrakt berikat med biomaterialet).
    1. Placera pelletsen i ett 50 ml rör och tillsätt motsvarande cellodlingsmedium. Placera rören i 24 timmar i inkubatorn vid 37 °, i konstant rotation.
      OBS: Använd det cellodlingsmedium som är lämpligt för cellkulturerna.
    2. Efter 24 timmar, ta bort rören från inkubatorn. Vid denna tidpunkt motsvarar extrakten en koncentration av 1/1 eller 100%.
    3. Gör utspädningar av extraktet genom sekventiell tillsats av lika stora volymer konditionerat medium till cellodlingsmedium.
      OBS: Ingen pH-justering bör göras på mediet.
      1. Tillsätt 1 ml odlingsmedia till 1 ml 100% extrakt för att erhålla ett 50% extrakt. Tillsätt 1 ml odlingsmedia till 1 ml 50% extrakt för att erhålla ett 25% extrakt, och så vidare (figur 1).
        OBS: Använd de koncentrationer som är relevanta för varje förening.

Figure 1
Figur 1: Beredningsschema och spädning av lösliga extrakt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Cellinkubation med biomaterialens extrakt

  1. Förbered en cellulär suspension och platta den i en adekvat cellbehållare, såsom en multiwellplatta, beroende på antalet celler som behövs för experimenten.
    1. Börja med en kolv av önskade celler med 80% till 90% sammanflöde.
    2. Kassera cellodlingsmediet, tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lossa cellerna med trypsin-EDTA (1 till 2 ml för en 75 cm 2-cellodlingskolv).
    3. Tillsätt cellodlingsmediet (2 till 4 ml för en 75 cm 2-cellsodlingskolv), överför cellsuspensionen till ett rör och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter.
    4. suspendera pelleten i en känd volym cellodlingsmedia.
      OBS: Detta protokoll är utformat för användning av vidhäftande cellkulturer; Enkla anpassningar kan dock göras för att fungera med suspensionscellkulturer.
    5. Räkna cellerna i hemocytometern och beräkna cellkoncentrationen i cellsuspensionen.
    6. suspendera den bestämda mängden cellsuspension i odlingsmediet och överför till multiwell-skålar. Som referensvärde för sådddensitet, överväga 5 – 20 x 105 celler/cm2.
      OBS: Det tilldelade antalet celler måste beräknas enligt celltypen och cellegenskaperna, nämligen cellfördubblingstiden.
  2. Inkubera cellerna i 24 timmar för att möjliggöra celladhesion.
  3. Efter denna period, administrera de lösliga extrakten i odlingsplattorna.
    1. Aspirera cellodlingsmediet.
    2. Tillsätt biomaterialens extrakt till varje brunn, enligt koncentrationssekvensen, som beskrivits tidigare. Tillsätt färskt cellodlingsmedium till kontrollbrunnarna.
    3. Inkubera plattorna i 24 timmar eller längre.
      Anmärkning: Negativa kontroller måste utföras i varje analys, motsvarande obehandlade celler, som hålls i odlingsmediet. Inkubationstiderna kan väljas i enlighet med studiemålen.

4. Utvärdering av den metaboliska aktiviteten

  1. Efter cellinkubationen med biomaterialets extrakt, aspirera mediet från plattorna och tvätta varje brunn PBS.
  2. Placera i varje brunn den adekvata volymen 0,5 mg/ml 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolbromid (MTT) beredd i PBS, pH 7,4.
  3. Inkubera plattorna i 4 timmar eller över natten i mörkret vid 37 ° C.
  4. För att solubilisera de erhållna formazankristallerna, tillsätt den adekvata volymen av 0,04 M lösning av saltsyra i isopropanol till varje brunn och rör om plattorna i 30 minuter.
    OBS: Justera mängden MTT och isopropanol efter brunnarnas storlek.
  5. Rör om och homogenisera innehållet i varje brunn, om nödvändigt, genom pipettering upp och ner tills inga kristaller ses.
  6. Kvantifiera absorbansen vid en våglängd på 570 nm med ett 620 nm referensfilter i spektrofotometern.
  7. För att beräkna den metaboliska aktiviteten, dela absorbansen hos de behandlade cellerna genom absorbansen hos kontrollkulturerna. För att få procentvärden multiplicera med 100.

5. Utvärdering av celldöd

OBS: För att utföra denna utvärdering bör minst 106 celler per tillstånd användas.

  1. Använd centrifugrör som är korrekt identifierade, i enlighet med de förhållanden som utvärderas.
  2. Efter cellinkubationen med biomaterialextrakten, samla odlingsmediet till respektive rör.
  3. Lossa cellerna och tillsätt cellsuspensionen till respektive rör.
  4. Koncentrera cellsuspensionerna genom centrifugering vid 120 x g i 5 minuter.
  5. Tvätta pelletsen med PBS. Avlägsna PBS genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 minuter.
  6. Tillsätt 1 ml PBS och överför cellpellets till identifierade cytometrirör.
  7. Avlägsna PBS genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 minuter.
  8. Inkubera med 100 μL bindningsbuffert (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl och 0,25 mM CaCl2)16 och låt cellerna vila i cirka 15 minuter för cellmembranåterhämtning.
  9. Tillsätt 2,5 μl fluorescerande märkt Annexin-V och 1 μl propidiumjodid i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  10. Efter inkubation, tillsätt 400 μL PBS och analysera på cytometern. För analys och kvantifiering av informationen använd lämplig programvara.
  11. Presentera resultat i procent av levande celler, apoptos, sen apoptos / nekros och nekros.

6. Morfologi utvärdering

  1. Välj lämplig storlek på steriliserade glastäcken som passar inuti multiwellplattan.
  2. Placera varje bild i en brunn med steril pincett.
  3. Fördela en cellulär suspension i tillräcklig koncentration i brunnarna och låt över natten ligga i en inkubator vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 95 % luft och 5 %CO2.
  4. Exponera cellkulturerna för extrakten, som tidigare beskrivits.
  5. Aspirera media och tvätta med PBS.
  6. Låt täckglasen torka vid rumstemperatur och tillsätt sedan en tillräcklig volym May-Grünwald-lösning för att täcka täckglasen. Inkubera i 3 minuter.
  7. Ta bort färgämnet och tvätta med destillerat vatten i 1 minut.
  8. Ta bort vattnet och tillsätt en tillräcklig volym Giemsa-lösning för att täcka täckglasen. Inkubera i 15 minuter.
  9. Tvätta täckglasen i rinnande vatten.
  10. Överför täckglasen till en bild.
  11. Titta under ett mikroskop. Ta fotografierna med den valda förstoringen.

7. Bedömning av cellfunktion genom omvänd transkription polymeraskedjereaktion (RT-PCR)

OBS: För att utföra denna utvärdering bör minst 2x106 celler per tillstånd användas. Som ett exempel presenteras alkaliskt fosfatas som en gen av intresse för utvärdering av odontoblastaktivitet. Andra gener av intresse kan ses i tabell 1.

  1. Platta cellerna enligt beskrivningen ovan.
    OBS: Koncentrationen av celler som pläterats kan behöva justeras i enlighet med celltypen och cytotoxiciteten hos de biomaterial som studeras.
  2. Inkubera med lösliga extrakt, enligt beskrivningen ovan.
  3. Lossa cellerna för att erhålla en suspension enligt beskrivningen ovan.
  4. Tvätta cellerna två gånger med PBS; för denna centrifug vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
  5. Lysera cellerna genom att suspendera pelleten i 1 ml RNA-reningslösning (t.ex. NZYol), intensiv omrörning och successiv pipettering.
  6. Inkubera proverna i 5 minuter vid rumstemperatur.
  7. Tillsätt 200 μL kloroform och skaka rören för hand i 15 sekunder.
  8. Inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
  9. Centrifuglyserar vid 4 ° C i 15 min vid 12 000 x g. Under denna centrifugering har två faser sitt ursprung i provet och lämnar RNA i den vattenhaltiga (övre) fasen.
  10. Ta bort vattenfasen till ett nytt rör och tillsätt 500 μL kall isopropanol för att fälla ut RNA.
  11. Inkubera proverna vid rumstemperatur i 10 minuter och centrifugera vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C.
  12. Ta bort supernatanten och tvätta pelleten med 1 ml 75% etanol genom centrifugering vid 7,500 x g i 5 minuter vid 4 ° C.
  13. Torka pelleten vid rumstemperatur tills etanolavdunstning.
  14. Suspendera i RNasfritt vatten.
  15. Kvantifiera och bestäm provernas renhetsgrad med hjälp av absorptionsspektrofotometri vid våglängderna 260 nm och 280 nm. Bestäm RNA-renheten och använd prover med ett renhetsförhållande (A260/280) runt 2,0.
  16. Förvara prover vid -80 ° C.
  17. Fortsätt att utföra RT-PCR enligt tillverkarens protokoll17.
    OBS: I enlighet med studiemålet, välj de specifika markörer som ska utvärderas.

8. Cellfunktionsbedömning genom proteinidentifiering

OBS: Enligt studiemålet, välj de specifika proteiner som ska utvärderas. Som ett exempel presenteras dentinsialoprotein (DSP) som ett protein av intresse för utvärdering av odontoblasters aktivitet. Andra proteiner av intresse kan ses i tabell 1.

  1. Odla celler i täckglas och exponeras för extrakten, som beskrivits tidigare.
  2. Tvätta cellkulturerna med PBS.
  3. Fixa med 3,7% paraformaldehyd i 30 minuter vid rumstemperatur.
  4. Tvätta två gånger med PBS.
  5. Permeabilisera med 0,5% Triton i PBS i 15 minuter.
  6. Blockera peroxidaset med 0,3% väteperoxid i PBS i 5 minuter.
  7. Tvätta två gånger med PBS.
  8. Tvätta två gånger med 0,5% bovint serumalbumin (BSA).
  9. Blockera cellkulturer med 2% BSA i 45 minuter.
  10. Tvätta med 0,5% BSA i PBS.
  11. Inkubera kulturer med den primära antikroppen enligt det valda proteinet i 60 minuter vid rumstemperatur.
    OBS: Detta protokoll använder den primära antikroppen DSP (M20) Antibody (1:100) och den sekundära antikroppen Polyclonal Rabbit Anti-get immunoglobuliner / HRP (1:100).
  12. Tvätta fem gånger med 0,5% BSA i PBS.
  13. Inkubera med sekundär antikropp i 90 minuter vid rumstemperatur.
    OBS: Gör antikroppsutspädningarna med 0,5% BSA i PBS.
  14. Tvätta fem gånger med 0,5% BSA i PBS i 1 minut i varje tvätt.
  15. Inkubera kulturer med ett substrat och kromogen blandning i en koncentration av 20 μL kromogen/ml substrat i 25 minuter.
  16. Tvätta två gånger med 0,5% BSA i PBS.
  17. Motfärga med hematoxylin i 15 minuter.
  18. Tvätta med en sekvens av 0,037 mol / L ammoniak och destillerat vatten i 5 minuter för att avlägsna överskott av färgämne.
  19. Montera täckglasen på bilderna. Använd glycerol som monteringsmedium.
  20. Låt torka över natten.
  21. Titta under ett mikroskop. Ta fotografierna med den valda förstoringen.

9. Mineraliseringsbedömning genom Alizarin Red S-analys

  1. Förbered en Alizarin Red S-lösning i en koncentration av 40 mM18. Rör om lösningen för homogenisering i 12 timmar i mörkret.
    OBS: För att förbereda 100 ml Alizarin Red S-lösning, solubilisera 1,44 g alizarinpulver (molekylvikt: 360 g / mol) i ultrarent vatten, skyddat från ljus. För denna lösning är pH-värdet kritiskt och bör vara mellan 4,1 och 4,3.
  2. Inkubera cellkultur med lösliga extrakt, såsom beskrivits ovan.
  3. Tvätta cellkulturer tre gånger med PBS.
  4. Fixa med 4% paraformaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur.
  5. Tvätta tre gånger med PBS.
  6. Färga med Alizarin Red Färgningslösning i 20 minuter vid 37 °C i mörker.
  7. Tvätta plattorna med PBS efter färgning för att ta bort överflödigt färgämne.
  8. Titta under ett mikroskop. Ta fotografierna med den valda förstoringen.
  9. Tillsätt en extraktionslösning, sammansatt av 10 % (vikt/volym) ättiksyra och 20 % (vikt/volym) metanol, till varje brunn och låt omrörningen stå i rumstemperatur i 40 minuter.
  10. Mät absorbansen vid 490 nm våglängd på en spektrofotometer19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representativa resultaten här avser studier av dentala biomaterial. Extraktmetoden gör det möjligt att erhålla en cytotoxicitetsprofil och cellfunktion efter exponering för dentala material, avseende effekter på metabolisk aktivitet (figur 2), cellviabilitet, celldödsprofil och cellmorfologi (figur 3) och specifikt proteinuttryck (figur 4).

MTT-analysen används för att få en snabb överblick över materialens cytotoxicitet på ett enkelt sätt. En jämförelse mellan två eller flera material kan göras (figur 2); en kraftig minskning av den metaboliska aktiviteten, även vid låga (6,25%) och medelhöga koncentrationer (50%), indikerar högre toxicitet (figur 2a). Samtidigt uppvisar mindre cytotoxiska material endast lättare eller ingen reduktion (figur 2b). Jämförelser mellan olika tidpunkter gör det möjligt att bestämma mer omedelbara cytotoxiska effekter eller i senare skeden.

Effekter på cellviabilitet ger viktig information om livskraftig cellreduktion, vilket kan äventyra vävnadernas förmåga att återhämta sig efter en skadlig effekt. Bestämningen av procentandelen livskraftiga celler gör det möjligt att jämföra materialcytotoxicitet; fler cytotoxiska material inducerar högre celldöd för samma koncentration (figur 3a och 3b). Minskningar på över 30 % är kritiska och definierar material med risk för låg biokompatibilitet (figur 3a). Denna information kompletteras med celldödsprofilen (figur 3a och 3b). I de representativa resultaten kännetecknas fler cytotoxiska material av en accentuerad minskning av cellviabiliteten och för en sen apoptos och nekroscelldödsprofil (figur 3a), medan mindre cytotoxiska uppvisar mindre celldöd och en mer apoptotisk och sen apoptotisk profil (figur 3b).

Informationen från den cellulära morfologiutvärderingen (figur 3c) kompletterar utvärderingen av cellviabiliteten. Förändringar från cellens typiska morfologi kan indikera en apoptotisk eller nekrotisk profil16. Dessutom kan ytterligare information erhållas från detta protokoll, som observation av materialpartiklar (röda pilar, figur 3C).

Specifika markörer, grundläggande för cellfunktionen, som påverkas av extraktexponeringen kan utvärderas med flera tekniker, såsom immunhistokemi, PCR, flödescytometri, blotting eller kolorimetriska analyser (tabell 1). Representativa resultat av DSP-uttrycket efter exponering för extrakt visas i figur 4a, och det kan ses att vissa material (trikalciumsilikatcement) stimulerar cellerna att öka proteinuttrycket. Däremot främjar andra (kalciumhydroxidcement) en signifikant minskning av proteinuttrycket, oberoende av livskraftsförlust. I båda fallen påverkar koncentrationen av extrakten direkt proteinuttrycket.

I MDPC-23-cellinjen av odontoblastfenotypen är bildandet av mineraliseringsavlagringar karakteristiskt. Protokollet för identifiering och kvantifiering av mineraliserade avlagringar gör det möjligt att utvärdera den specifika funktionen hos denna typ av specialiserade celler. I det presenterade fallet observerades att förutom att vara mindre cytotoxiska stimulerar tricalciumsilikatcement cellfunktionen, när en ökning av mineraliserade avlagringar observerades (figur 4b). Tvärtom ledde den mer cytotoxiska kalciumhydroxidcementen till minskad mineralavsättning på grund av cellnedsättning och död (figur 4b). Utöver en kvalitativ utvärdering kan en kvantitativ bestämning utföras (figur 4c).

Figure 2
Figur 2: Metabolisk aktivitet. Metabolisk aktivitet hos MDPC-23-celler behandlade med lösliga extrakt av kalciumhydroxidcement [a)] och trikalciumsilikatcement [b)] i 24, 72 och 120 timmar. Resultaten normaliseras till kontrollcellkulturerna, med ett värde av 100%. Signifikanta skillnader representeras av *, där * betyder p<0,05, ** betyder p<0,01 och *** betyder p<0,001. En del av denna figur har ändrats från en tidigare publikation med tillstånd från förlaget20. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Cellviabilitet, dödsprofil och cellmorfologi. Cellviabilitet, celldödsprofil och cellmorfologi i MDPC-23-celler som utsatts för behandling med kalciumhydroxid- och trikalciumsilikatbiomaterial vid 6,25% och 50% koncentration, efter 120 timmars exponering. a) och b) Resultaten plottas som procentandelen levande celler i apoptos, sen apoptos eller nekros och nekros. Signifikanta skillnader med avseende på kontroll eller mellan villkor representeras med *, där * betyder p <0,05, ** betyder p <0,01 och *** betyder p <0,001. c) Celler färgade med May-Grünwald Giemsa efter behandling med en 50% koncentration av biomateriallösliga extrakt. Kontrollgruppen representerar celler i odling i DMEM med 10% FBS. Bilder i den vänstra kolumnen erhölls med en förstoring av 100x, och bilderna i kolumnen till höger erhölls med en förstoring av 500x. Figurstaplar representerar 100 μm. En del av denna figur har ändrats från en tidigare publikation med tillstånd från förlaget20. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: DSP-uttryck och mineraliserad knölbildning. a) MDPC-23-celler märkta med immunocytokemi för detektion av DSP-uttryck när de utsätts för behandling med kalciumhydroxid och trikalciumsilikat i koncentrationer av 50% och 6,25% efter 96 timmars inkubation. b) Bilder från odlade MDPC-23-celler färgade med Alizarin Red S-fläck när de behandlades med kalciumhydroxid och trikalciumsilikatbiomaterial i koncentrationer av 50% och 6,25% efter 120 timmars inkubation. Alla fotografier erhölls med en förstoring på 100x. Båda figurstaplarna representerar 150 μm. c) Bildning av kalciumavlagringar från MDPC-23-celler behandlade med kalciumhydroxid och trikalciumsilikat efter 120 timmars exponering. Resultaten är förhållandet mellan provernas absorbanser och kontrollen. Signifikanta skillnader representeras av *, där * betyder p<0,05, ** betyder p<0,01 och *** betyder p<0,001. En del av denna figur har ändrats från en tidigare publikation med tillstånd från förlaget20. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Förteckning över odontoblastisk differentiering/funktionsmarkörer47-79. Denna tabell innehåller en lista över odontoblastiska markörer och detektionsmetoder; Några av dessa markörer uttrycks också av andra vävnader.

Gen eller protein Metod Referenser
Alkaliskt fosfatas (ALP) Kolorimetrisk 47 48
Immunocytokemi 20 49
Norra Blot 50
RT-PCR 51 52
Decorin (DCN) Kolorimetrisk ELISA 53
Immunocytokemi 54 55
RT-PCR 53 56
Dentinmatrisprotein 1 (DMP-1) Flödescytometri 57
Immunocytokemi 58 59
Norra Blot 50 60
RT-PCR 47 49
Västra Blot 50 60
Dentinmatrisprotein 2 (DMP-2) Immunocytokemi 60 61
RT-PCR 50 62
Norra Blot 60
Västra Blot 62
Dentinfosfoprotein (DPP) Immunocytokemi 63
Norra Blot 63
Dentin Sialoprotein (DSP)* Immunocytokemi 20 60
Norra Blot 60 63
RT-PCR 50
Västra Blot 64 65
Dentinsialofosfoprotein (DSPP) Flödescytometri 57
Immunocytokemi 66 54
RT-PCR 47 49
Norra Blot 67 68
Västra Blot 64 62
Enämligensin/matrismetalloproteinas-20 (MMP-20) Norra Blot 68
RT-PCR 49 68
Nästäl Immunocytokemi 54 69
RT-PCR 70 71
Västra Blot 72
Osteoadherin (OSAD) Immunocytokemi 73 74
Norra Blot 73
RT-PCR 75
Västra Blot 73 74
Osteopontin (OPN) Immunocytokemi 76
Norra Blot 50
RT-PCR 66 51
Västra Blot 77
Osteokalcin (OCN) Immunocytokemi 52
Norra Blot 50
RT-PCR 51 52
Västra Blot 77 78
Osterix (OSX)/ transkriptionsfaktor Sp7 (Sp7) Immunocytokemi 54 58
RT-PCR 78
Västra Blot 78 79
Fosfatreglerande gen med homologier till endopeptidaser på X-kromosom (Phex) Norra Blot 68
RT-PCR 49 68
Västra Blot 79
Runt-relaterad transkriptionsfaktor 2 (Runx2) Immunocytokemi 66 52
RT-PCR 66 70
Västra Blot 62 77
*DPP och DSP är klyvningsprodukter från DSPP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll utformades med hänsyn till ISO 10993-5, som hänvisar till utvärderingen av cytotoxicitet in vitro hos biomaterial som kommer i kontakt med vävnaderna, för att utvärdera biokompatibiliteten och bidra till studiernas reproducerbarhet21. Detta är ett växande problem inom vetenskapen, och många författare följer redan dessa rekommendationer i den experimentella utformningen av sina in vitro-studier 15,22,23,24,25,26,27,28.

Den föreslagna metoden valdes för att screena de mest relevanta aspekterna av cellbiologi. Således går detta protokoll utöver rekommendationerna, när det ger ett komplett tillvägagångssätt för att utvärdera cytotoxicitet med hjälp av vanliga analyser och en kompletterande utvärdering, inklusive flera cellparametrar från fenotyp till funktion. Denna kompletterande utvärdering är viktig för att verkligen bedöma biomaterialeffekten, när livskraften kanske inte översätter förändringar på nivån av gen- och proteinuttryck, cellcykel eller sekretom.

Extrakten är fördelaktiga, särskilt i vidhäftande cellinjer, eftersom det inte finns någon interferens med cellbindning till substratet och optimala odlingsförhållanden, i motsats till vissa direktkontaktmetoder där material placeras på ytan av odlingsplattan22,28.

Dessutom tillåter extrakt cellexponering för olika koncentrationer29, vilket efterliknar diffusion av ämnen i vävnader, vilket simulerar det clearance de genomgår in vivo, särskilt när de appliceras i kontakt med extremt bevattnade vävnader. Direktkontakttester kanske inte exakt bedömer olika koncentrationer, och indirekta kontakttester visade potentiella svårigheter med icke-diffusion, ofullständig diffusion genom membran eller reaktion med agar.

Tester som ger en kvantitativ bedömning är att föredra, där minskning av cellviabiliteten med mer än 30% anses vara cytotoxisk11,30. Vid utveckling av nya biomaterial, om en sådan minskning sker, bestämmer den behovet av omformulering eller övergivande. Om uppmuntrande resultat uppnås bör ytterligare studier utföras med en in vivo-utvärdering29,31.

In vitro-tester bör simulera eller överdriva de kliniska tillstånden. Således är bestämningen av lämpliga ytvolymförhållanden för extraktberedning kritisk. Yt-volymförhållanden på 1,25–6 cm2/ml föreslogs. När det gäller material med ojämnheter i ytan, som skum, är 0,1–0,2 g / ml eller 6 cm 2 / ml en utgångspunkt: 15,20,2. Förhållandet 250 mm2per ml medium användes i representativa resultat som används i detta protokoll och andra studier15,20.

Även om de inte används på detta sätt i klinikerna måste proverna steriliseras med metoder som inte förändrar deras egenskaper. UV-bestrålning är ofta ett bra val. Detta är av största vikt för att förhindra mikrobiell kontaminering av cellkulturer 11,24,32.

Extraktionsmedier inkluderar cellodlingsmedium med eller utan serum, fysiologisk saltlösning, dimetylsulfoxid eller renat vatten, valt enligt biomaterialets kemiska egenskaper11,33. Med sikte på cellodlingsstudier är användningen av cellodlingsmediet att föredra eftersom det undviker ytterligare bearbetningssteg. Villkoren för extraktion bör anpassas till den experimentella modellen. I de representativa resultaten som visas i detta protokoll användes DMEM-odlingsmediet kompletterat med FBS i 24 ± 2 timmar vid 37 ± 1 °C.

Vissa biomaterial kan lämna rester i extraktionsmediet, vilket kan påverka cellkulturerna negativt. Även om filtrering och centrifugering bör undvikas, är det möjligt att låta partiklarna sedimentera innan de används. En annan fråga är pH som kan drabbas av förändring efter extraktion. Eftersom det inte rekommenderas att utföra ytterligare justeringar11 måste extraktens pH-värde mätas och registreras, och ytterligare kontroller för att isolera pH-effekten måste vid behov ingå i försöksplaneringen.

Medan detta protokoll beskrevs för vidhäftande cellkulturer, kan enkla modifieringar utföras för att använda suspensionskulturer. På samma sätt är det förutom att använda fasta biomaterial möjligt att anpassa proceduren, i huvudsak extraktionsstegen, för att studera vätskor, geler eller skum34,35,36,37.

Beredningen av cellkulturer med lämplig densitet är kritisk, särskilt på cellkulturer med hög dupliceringshastighet31. Enligt det rekommenderade sådddensitetsområdet för de använda cellerna måste minskningen av den initiala sådddensiteten utföras för att undvika problem i samband med överdriven sammanflöde om långvariga inkubationer planeras. Dessutom kan mycket cytotoxiska material kräva högre initiala sådddensiteter.

Förutom fördelarna med extraktmetoden är det inte det bästa valet för material där utvärderingen av cellvidhäftning är relevant. I detta fall måste direktkontaktstudierna utföras 38,39,40,41. Även om detta är ett övergripande tillvägagångssätt är det viktigt att komma ihåg att det är en in vitro-bedömning, som inte helt återspeglar in vivo-förhållandena42.

Ett biomaterial bör inte bara orsaka skador på vävnaden utan stimulera några av de antiinflammatoriska och immunmodulerande processerna43,44,45,46. Således går detta protokoll vidare, med utvärderingen av cellulära mekanismer, inklusive cellviabilitet och celldödsprofil, liksom andra mekanismer för proteinsyntes. Den utvärdering som utförs bör göra det möjligt att dra slutsatser om biomaterialets bioaktivitet i levande vävnader, förutom cytotoxicitet.

Med explosionen av nya material för medicinska tillämpningar, inte bara för tandvård utan även för ortopedi, kirurgi, oftalmologi, kardiologi etc., bör de första screeningarna göras systematiskt. Detta protokoll kan vara ett viktigt verktyg för forskare som syftar till att utveckla och karakterisera nya biomaterial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar följande för stöd: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB finansieras av nationella medel via FCT (Foundation for Science and Technology) genom det strategiska projektet UIDB/04539/2020 och UIDP/04539/2020 (CIBB). Vi tackar Jacques Nör, University of Michigan Dental School, för att tillhandahålla cellinjen MDPC-23.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CaCl2 Sigma 10035-04-8
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
DAB + Chromogen Dako K3468
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
DSP (M-20) Antibody, 1: 100 Santa Cruz Biotechnology LS-C20939
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Hepes 0.01 M Sigma MFCD00006158
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Giemsa Stain, modified GS-500 Sigma MFCD00081642
Glycerol Dako C0563
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
May-Grünwald Stain MG500 Sigma MFCD00131580
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobulins / HRP, 1: 100 Dako G-21234
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Substrate Buffer Dako 926605
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
β-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  2. Bruinink, A., Luginbuehl, R. Evaluation of biocompatibility using in vitro methods: interpretation and limitations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 126, 117-152 (2012).
  3. Wataha, J. C. Principles of biocompatibility for dental practitioners. The Journal of Prosthetic Dentistry. 86 (2), 203-209 (2001).
  4. Mishra, S. F. D. A. CE mark or something else?-Thinking fast and slow. Indian Heart Journal. 69 (1), 1-5 (2016).
  5. Barbeck, M., et al. Balancing Purification and Ultrastructure of Naturally Derived Bone Blocks for Bone Regeneration: Report of the Purification Effort of Two Bone Blocks. Materials. 12 (19), 3234 (2019).
  6. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  7. Coelho, C. C., Araújo, R., Quadros, P. A., Sousa, S. R., Monteiro, F. J. Antibacterial bone substitute of hydroxyapatite and magnesium oxide to prevent dental and orthopaedic infections. Materials Science and Engineering: C. 97, 529-538 (2019).
  8. Jung, O., et al. Improved In Vitro Test Procedure for Full Assessment of the Cytocompatibility of Degradable Magnesium Based on ISO 10993-5/-12. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 255 (2019).
  9. Ruzza, P., et al. H-Content Is Not Predictive of Perfluorocarbon Ocular Endotamponade Cytotoxicity in Vitro. ACS Omega. 4 (8), 13481-13487 (2019).
  10. ISO. I.O. for S. ISO 10993-12:2012 - part 12: Sample preparation and reference materials. ISO. , (2012).
  11. ISO. I.O. for S. ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices - part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. ISO. , (2009).
  12. Srivastava, G. K., et al. Comparison between direct contact and extract exposure methods for PFO cytotoxicity evaluation. Scientific Reports. 8 (1), 1425 (2018).
  13. Pusnik, M., Imeri, M., Deppierraz, G., Bruinink, A., Zinn, M. The agar diffusion scratch assay--A novel method to assess the bioactive and cytotoxic potential of new materials and compounds. Scientific Reports. 6, 20854 (2016).
  14. Spiller, K. L., et al. The role of macrophage phenotype in vascularization of tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 35 (15), 4477-4488 (2014).
  15. Zhou, H., et al. In Vitro Cytotoxicity Evaluation of a Novel Root Repair Material. Journal of Endodontics. 39 (4), 478-483 (2013).
  16. Bordron, A., et al. The binding of some human antiendothelial cell antibodies induces endothelial cell apoptosis. Journal of Clinical Investigation. 101 (10), 2029-2035 (1998).
  17. Palmini, G., et al. Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma. Journal of Visualized Experiments. (116), e53884 (2016).
  18. Gregory, C. A., Grady Gunn, W., Peister, A., Prockop, D. J. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Analytical Biochemistry. 329 (1), 77-84 (2004).
  19. Cai, S., Zhang, W., Chen, W. PDGFRβ+/c-kit+ pulp cells are odontoblastic progenitors capable of producing dentin-like structure in vitro and in vivo. BMC Oral Health. 16 (1), 113 (2016).
  20. Paula, A., et al. Biodentine Boosts, WhiteProRoot MTA Increases and Life Suppresses Odontoblast Activity. Materials. 12 (7), 1184 (2019).
  21. Chander, N. G. Standardization of in vitro studies. Journal of Indian Prosthodontic Society. 16 (3), 227-228 (2016).
  22. Cavalcanti, B. N., Rode de M, S., França, C. M., Marques, M. M. Pulp capping materials exert an effect on the secretion of IL-1β and IL-8 by migrating human neutrophils. Brazilian Oral Research. 25 (1), 13-18 (2011).
  23. Chang, S., Lee, S. Y., Ann, H. J., Kum, K. Y., Kim, E. C. Effects of calcium silicate endodontic cements on biocompatibility and mineralization-inducing potentials in human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 40 (8), 1194-1200 (2014).
  24. Daltoé, M. O., Paula-Silva, F. W. G., Faccioli, L. H., Gatón-Hernández, P. M., De Rossi, A., Bezerra Silva, L. A. Expression of Mineralization Markers during Pulp Response to Biodentine and Mineral Trioxide Aggregate. Journal of Endodontics. 42 (4), 596-603 (2016).
  25. Elias, R. V., Demarco, F. F., Tarquinio, S. B. C., Piva, E. Pulp responses to the application of a self-etching adhesive in human pulps after controlling bleeding with sodium hypochlorite. Quintessence International. 38 (2), 67-77 (2007).
  26. Huang, G. T. J., Shagramanova, K., Chan, S. W. Formation of odontoblast-like cells from cultured human dental pulp cells on dentin in vitro. Journal of endodontics. 32 (11), 1066-1073 (2006).
  27. Jafarnia, B., et al. Evaluation of cytotoxicity of MTA employing various additives. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 107 (5), 739-744 (2009).
  28. Paranjpe, A., Smoot, T., Zhang, H., Johnson, J. D. Direct contact with mineral trioxide aggregate activates and differentiates human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 37 (12), 1691-1695 (2011).
  29. Spagnuolo, G., et al. In vitro cellular detoxification of triethylene glycol dimethacrylate by adduct formation with N-acetylcysteine. Dental Materials. 29 (8), 153-160 (2013).
  30. Murray, P. E., García Godoy, C., García Godoy C, F. How is the biocompatibilty of dental biomaterials evaluated. Medicina Oral, Patologia Oral y Cirugia Bucal. 12 (3), 258-266 (2007).
  31. Hanks, C. T., Wataha, J. C., Sun, Z. In vitro models of biocompatibility: a review. Dental Materials. 12 (3), 186-193 (1996).
  32. Eid, A. A., et al. In Vitro Biocompatibility and Oxidative Stress Profiles of Different Hydraulic Calcium Silicate Cements. Journal of Endodontics. 40 (2), 255-260 (2014).
  33. Nocca, G., et al. Effects of ethanol and dimethyl sulfoxide on solubility and cytotoxicity of the resin monomer triethylene glycol dimethacrylate. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 100 (6), 1500-1506 (2012).
  34. Abuarqoub, D., Aslam, N., Jafar, H., Abu Harfil, Z., Awidi, A. Biocompatibility of Biodentine with Periodontal Ligament Stem Cells: In Vitro Study. Dentistry Journal. 8 (1), 17 (2020).
  35. Coelho, A. S., et al. Cytotoxic effects of a chlorhexidine mouthwash and of an enzymatic mouthwash on human gingival fibroblasts. Odontology. 108 (2), 260-270 (2020).
  36. Wang, M. O., et al. Evaluation of the In Vitro Cytotoxicity of Cross-Linked Biomaterials. Biomacromolecules. 14 (5), 1321-1329 (2013).
  37. Tyliszczak, B., Drabczyk, A., Kudłacik-Kramarczyk, S., Bialik-Wąs, K., Sobczak-Kupiec, A. In vitro cytotoxicity of hydrogels based on chitosan and modified with gold nanoparticles. Journal of Polymer Research. 24 (10), 153 (2017).
  38. Widbiller, M., et al. Three-dimensional culture of dental pulp stem cells in direct contact to tricalcium silicate cements. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 237-246 (2016).
  39. Pintor, A. V. B., et al. In Vitro and In Vivo Biocompatibility of ReOss in Powder and Putty Configurations. Brazilian Dental Journal. 29 (2), 117-127 (2018).
  40. Pellissari, C. V. G., et al. In Vitro Toxic Effect of Biomaterials Coated with Silver Tungstate or Silver Molybdate Microcrystals. Journal of Nanomaterials. 2020, 1-9 (2020).
  41. Collado-González, M., et al. Cytotoxicity and bioactivity of various pulpotomy materials on stem cells from human exfoliated primary teeth. International Endodontic Journal. 50, 19-30 (2017).
  42. Paula, A., et al. Direct Pulp Capping: Which is the Most Effective Biomaterial? A Retrospective Clinical Study. Materials. 12 (20), 3382 (2019).
  43. Williams, D. F. There is no such thing as a biocompatible material. Biomaterials. 35 (38), 10009-10014 (2014).
  44. Schuh, J. C. L. Medical device regulations and testing for toxicologic pathologists. Toxicologic Pathology. 36 (1), 63-69 (2008).
  45. Pizzoferrato, A., et al. Cell culture methods for testing Biocompatibility. Clinical Materials. 15 (3), (1994).
  46. Pereira Paula, A. B., et al. Direct pulp capping: what is the most effective therapy? - review and meta-analysis. Journal of Evidence Based Dental Practice. , (2018).
  47. Caiaffa, K. S., et al. Effect of analogues of cationic peptides on dentin mineralization markers in odontoblast-like cells. Archives of Oral Biology. 103, 19-25 (2019).
  48. Fujiwara, S., Kumabe, S., Iwai, Y. Isolated rat dental pulp cell culture and transplantation with an alginate scaffold. Okajimas Folia Anatomica Japonica. 83 (1), 15-24 (2006).
  49. Nakashima, M., et al. Stimulation of Reparative Dentin Formation by Ex Vivo Gene Therapy Using Dental Pulp Stem Cells Electrotransfected with Growth/differentiation factor 11 (Gdf11). Human Gene Therapy. 15 (11), 1045-1053 (2004).
  50. Narayanan, K., et al. Differentiation of embryonic mesenchymal cells to odontoblast-like cells by overexpression of dentin matrix protein 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4516-4521 (2001).
  51. Kim, H. J., Yoo, J. H., Choi, Y., Joo, J. Y., Lee, J. Y., Kim, H. J. Assessing the effects of cyclosporine A on the osteoblastogenesis, osteoclastogenesis, and angiogenesis mediated by the human periodontal ligament stem cells. Journal of Periodontology. , (2019).
  52. Bou Assaf, R., et al. Healing of Bone Defects in Pig's Femur Using Mesenchymal Cells Originated from the Sinus Membrane with Different Scaffolds. Stem Cells International. , (2019).
  53. He, W., et al. Lipopolysaccharide enhances decorin expression through the toll-like receptor 4, myeloid differentiating factor 88, nuclear factor-kappa B, and mitogen-activated protein kinase pathways in odontoblast cells. Journal of Endodontics. 38 (4), 464-469 (2012).
  54. Xiong, Y., et al. Wnt Production in Dental Epithelium Is Crucial for Tooth Differentiation. Journal of Dental Research. 98 (5), 580-588 (2019).
  55. Haruyama, N., et al. Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization. Matrix Biology. 28 (3), 129-136 (2009).
  56. Sreenath, T., et al. Dentin Sialophosphoprotein Knockout Mouse Teeth Display Widened Predentin Zone and Develop Defective Dentin Mineralization Similar to Human Dentinogenesis Imperfecta Type III. Journal of Biological Chemistry. 278 (27), 24874-24880 (2003).
  57. Yang, Y., Zhao, Y., Liu, X., Chen, Y., Liu, P., Zhao, L. Effect of SOX2 on odontoblast differentiation of dental pulp stem cells. Molecular Medicine Reports. 16 (6), 9659-9663 (2017).
  58. Tao, H., et al. Klf4 Promotes Dentinogenesis and Odontoblastic Differentiation via Modulation of TGF-β Signaling Pathway and Interaction With Histone Acetylation. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (8), 1502-1516 (2019).
  59. Massa, L. F., Ramachandran, A., George, A., Arana-Chavez, V. E. Developmental appearance of dentin matrix protein 1 during the early dentinogenesis in rat molars as identified by high-resolution immunocytochemistry. Histochemistry and Cell Biology. 124 (3-4), 197-205 (2005).
  60. Hao, J., Zou, B., Narayanan, K., George, A. Differential expression patterns of the dentin matrix proteins during mineralized tissue formation. Bone. 34 (6), 921-932 (2004).
  61. Tompkins, K., Alvares, K., George, A., Veis, A. Two related low molecular mass polypeptide isoforms of amelogenin have distinct activities in mouse tooth germ differentiation in vitro. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (2), 341-349 (2005).
  62. Zhai, Y., et al. Activation and Biological Properties of Human β Defensin 4 in Stem Cells Derived From Human Exfoliated Deciduous Teeth. Frontiers in Physiology. 10, (2019).
  63. Bègue-Kirn, C., Ruch, J. V., Ridall, A. L., Butler, W. T. Comparative analysis of mouse DSP and DPP expression in odontoblasts, preameloblasts, and experimentally induced odontoblast-like cells. European Journal of Oral Sciences. 106, 254-259 (1998).
  64. Kikuchi, H., Suzuki, K., Sakai, N., Yamada, S. Odontoblasts induced from mesenchymal cells of murine dental papillae in three-dimensional cell culture. Cell and Tissue Research. 317 (2), 173-185 (2004).
  65. Li, X., Yang, G., Fan, M. Effects of homeobox gene distal-less 3 on proliferation and odontoblastic differentiation of human dental pulp cells. Journal of Endodontics. 38 (11), 1504-1510 (2012).
  66. Chen, S., et al. Differential regulation of dentin sialophosphoprotein expression by Runx2 during odontoblast cytodifferentiation. Journal of Biological Chemistry. 280 (33), 29717-29727 (2005).
  67. Narayanan, K., Gajjeraman, S., Ramachandran, A., Hao, J., George, A. Dentin matrix protein 1 regulates dentin sialophosphoprotein gene transcription during early odontoblast differentiation. Journal of Biological Chemistry. 281 (28), 19064-19071 (2006).
  68. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. A substractive PCR-based cDNA library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biology. 19 (5), 421-430 (2000).
  69. Miyazaki, T., Baba, T., Mori, T., Komori, T. Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts. Acta Histochemica et Cytochemica. 51 (6), 185-190 (2018).
  70. Yokoi, M., Kuremoto, K., Okada, S., Sasaki, M., Tsuga, K. Effect of attenuation of fibroblast growth factor receptor 2b signaling on odontoblast differentiation and dentin formation. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 55 (3), 211-219 (2019).
  71. Tohma, A., et al. Glucose Transporter 2 and 4 Are Involved in Glucose Supply during Pulpal Wound Healing after Pulpotomy with Mineral Trioxide Aggregate in Rat Molars. Journal of Endodontics. , (2019).
  72. Sueyama, Y., Kaneko, T., Ito, T., Kaneko, R., Okiji, T. Implantation of Endothelial Cells with Mesenchymal Stem Cells Accelerates Dental Pulp Tissue Regeneration/Healing in Pulpotomized Rat Molars. Journal of Endodontics. 43 (6), 943-948 (2017).
  73. Petersson, U., Hultenby, K., Wendel, M. Identification, distribution and expression of osteoadherin during tooth formation. European Journal of Oral Sciences. 111 (2), 128-136 (2003).
  74. Couble, M. L., et al. Immunodetection of osteoadherin in murine tooth extracellular matrices. Histochemistry and Cell Biology. 121 (1), 47-53 (2004).
  75. Buchaille, R., Couble, M. L., Magloire, H., Bleicher, F. Expression of the small leucine-rich proteoglycan osteoadherin/osteomodulin in human dental pulp and developing rat teeth. Bone. 27 (2), 265-270 (2000).
  76. Salmon, B., et al. Abnormal osteopontin and matrix extracellular phosphoglycoprotein localization, and odontoblast differentiation, in X-linked hypophosphatemic teeth. Connective Tissue Research. 55, SUPPL. 1 79-82 (2014).
  77. Liao, C., Ou, Y., Wu, Y., Zhou, Y., Liang, S., Wang, Y. Sclerostin inhibits odontogenic differentiation of human pulp-derived odontoblast-like cells under mechanical stress. Journal of Cellular Physiology. 234 (11), 20779-20789 (2019).
  78. Deng, X., et al. The combined effect of oleonuezhenide and wedelolactone on proliferation and osteoblastogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Phytomedicine. 153103, (2019).
  79. Choi, H., Kim, T. H., Yun, C. Y., Kim, J. W., Cho, E. S. Testicular acid phosphatase induces odontoblast differentiation and mineralization. Cell and Tissue Research. 364 (1), 95-103 (2016).

Tags

Retraktion utgåva 173 biokompatibilitet biomaterial cellodling cytotoxicitet konditionerat medium extrakt
Tillgång till cytotoxicitet och cellrespons på biomaterial
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho,… More

Paula, A. B., Laranjo, M., Coelho, A. S., Abrantes, A. M., Gonçalves, A. C., Sarmento-Ribeiro, A. B., Ferreira, M. M., Botelho, M. F., Marto, C. M., Carrilho, E. Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials. J. Vis. Exp. (173), e61512, doi:10.3791/61512 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter