Summary
Este protocolo describe la disección de calvaria de ratón dmp1-topacio neonatal y el aislamiento de osteocitos que expresan la proteína verde fluorescente a través de la digestión celular y el fraccionamiento, además de la preparación de osteocitos para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Abstract
El osteocito, que una vez se pensó que era un residente pasivo del hueso dada la función detrás del escenario de detectar la carga mecánica, ahora se pone en el centro de atención y se ha demostrado que tiene múltiples funciones principales, como modificar activamente la matriz extracelular y formar un órgano endocrino con el sistema lacunocanalicular que lo encierra enviando mensajes a sitios distantes. Debido a los métodos que permitieron probar el osteocito in vitro desde el aislamiento de osteocitos primarios hasta líneas celulares similares a los osteocitos, los osteocitos están experimentando un interés rotundo y una oleada de conocimiento sobre estructura y función. Muchos aspectos de la biología de los osteocitos y la interacción con otros componentes moleculares aún no se han descubierto. En este protocolo, describimos en detalle el aislamiento eficiente de osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal dmp1-topacio, que expresan la proteína verde fluorescente en los osteocitos, mediante fraccionamiento celular y posteriormente adquiriendo cultivos de osteocitos primarios por FACS.
Introduction
Los osteocitos son células terminalmente diferenciadas de progenitores osteoblásticos que se incrustaron en su matriz secretada1. Son las células más abundantes y longevas entre las poblaciones de células óseas. Residen dentro de lagunas y tienen una morfología estrellada característica con dendritas que se extienden a través de canales llamados canalículos formando una extensa red de comunicación e intercambio metabólico con su entorno circundante y la superficie ósea2. Los osteocitos coreografian tanto osteoblastos como osteoclastos en la remodelación ósea, son las células mecanosensoriales primarias que confieren adaptación a la carga mecánica3, intervienen en la homeostasis del fosfato4 y en la mineralización de la matriz ósea5, y junto con el sistema lacunocanalicular, actúan como órgano endocrino que señala tejidos distantes6.
Los osteocitos están situados dentro de una matriz mineralizada, lo que limita la accesibilidad y dificulta su aislamiento, lo que dificulta la investigación in vitro. Uno de los primeros métodos de aislamiento describió osteocitos aislados de calvaria de pollo utilizando un anticuerpo monoclonal específico de osteocitos (OB7.3)7 que más tarde se supo que era la variante aviar de PHEX (gen regulador de PHosphate con homología a endopeptidasas en el cromosoma X)8. Otros investigadores utilizaron la digestión secuencial de huesos largos de rata 9 o ratón 10 para obtener fracciones ricas en osteocitos en las que se informó que la pureza de los osteocitos era de alrededor del70%9. Las limitaciones de este procedimiento incluyen la pureza subóptima de los cultivos contaminados con otros tipos de células además de los osteocitos y que los osteocitos podrían ser potencialmente sobrecultivados por otras células en cultivo ya que los osteocitos han perdido la capacidad de dividirse. Estos desafíos restringen la usabilidad de las culturas a largo plazo.
Para superar estas limitaciones, se desarrollaron diferentes líneas celulares de osteocitos. La línea celular MLO-Y411 y la línea celular MLO-A512 son, en particular, las líneas celulares más estudiadas que son útiles para el estudio de los osteocitos en etapa temprana; sin embargo, son menos útiles para estudiar la señalización de osteocitos maduros, ya que expresan bajos niveles de esclerostina y FGF2313, los cuales son marcadores de osteocitos maduros. Otras líneas celulares, incluidas IDG-SW314 y Ocy45415, expresan altos niveles de esclerostina y FGF23 y son útiles para estudiar la etapa tardía de osteocitos. Las líneas celulares demuestran ser herramientas de investigación útiles; Sin embargo, no vienen sin limitaciones, ya que no representan completamente la biología de la célula primaria. Diferentes líneas celulares representan diferentes etapas de desarrollo del espectro de madurez de los osteocitos, y las líneas celulares no representan la heterogeneidad de los osteocitos primarios16,17.
Para obtener cultivos puros de osteocitos primarios, los investigadores aprovecharon el modelo de ratón cre en el que se utiliza el promotor dmp1 de 8 kb para impulsar la expresión de proteína fluorescente verde (GFP) en osteocitos18,19. Para obtener poblaciones de osteocitos se han utilizado ratones transgénicos duales (pOB-Col 2.3-GFP-cian y DMP1-GFP-topaz) por Paic et al.19 y ratones transgénicos dmp1-topacio por Nakashima et al.20. En el que emplearon digestión secuencial y FACS de osteocitos que expresan GFP para adquirir cultivos de osteocitos primarios19,20. Se demostró que la dirección de cre en el ratón reportero dmp1 de 10 kb Ai9, que activa la proteína tdTomato, está presente en osteocitos, osteoblastos, músculos y células dentro de la médula ósea. El promotor dmp1 de 8 kb tenía el mismo patrón de expresión, pero sólo una proporción de osteoblastos y células de médula ósea expresaba la proteína, lo que indica que el promotor dmp1 de 8 kb es más específico21. A pesar de esto, los resultados obtenidos utilizando el promotor dmp1 de 8 kb deben interpretarse con precaución, y los perfiles de expresión génica deben llevarse a cabo de forma rutinaria utilizando marcadores específicos de osteocitos frente a osteoblastos para garantizar que la población obtenida sea de pureza lo suficientemente alta.
Los marcadores de osteoclastos OSCAR y Dcstamp se encontraron en poblaciones hematopoyéticas de osteocitos no agotados frente a poblaciones de osteocitos agotados, este hallazgo llevó a los autores a concluir que los digerios obtenidos del fraccionamiento de la calvaria neonatal de 8 kb dmp1-topacio y la clasificación de GFP están contaminados con células hematopoyéticas. La contaminación con células hematopoyéticas podría haberse mitigado apretando la puerta de clasificación de GFP, ya que las células hematopoyéticas positivas para GFP tenían una intensidad de GFP razonablemente menor que las células mesenquimales positivas para GFP (osteocitos)22.
Los métodos para estudiar los osteocitos in vitro han contribuido a la reciente riqueza de información sobre la biología de los osteocitos. Sin embargo, el aislamiento de osteocitos sigue siendo un procedimiento laborioso y prolongado con bajos rendimientos celulares. El método descrito de digestión ósea utilizando colagenasa y EDTA a menudo hasta la fracción 823, toma varias horas en las que se grava la viabilidad de los osteocitos. Los investigadores han reportado el uso de fracciones (2-20125) para la clasificación celular 20, y han demostrado que el perfil de expresión de genes asociados con los osteocitos frente a los de los osteoblastos confirma el éxito de aislar poblaciones de osteocitos puros20. En este artículo, describimos el proceso de obtención de fracciones (2-0125), y comparamos el rendimiento de los osteocitos de cada fracción comenzando con la fracción 1 a la 8 para determinar el retorno de los osteocitos en cada fracción. También describimos la disección de la calvaria del ratón dmp1-topacio recién nacido y la digestión calvarial utilizando colagenasa y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), así como la preparación de células para FACS.
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Protocol
Todos los procedimientos y el cuidado de los animales se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Universidad de Tohoku.
1. Disección de calvaria de ratón dmp1-topacio recién nacido
- Para este protocolo, use cachorros de 6 a 27 días de edad de ratones C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasia a los ratones con inhalación de isoflurano al 5% y luego transfiera los cachorros al etanol al 70%.
- Transfiera el cachorro sacrificado a un plato de cultivo no tratado.
- Usando tijeras y pinzas, agarre la piel en la base del cráneo y haga una incisión.
- Usando la primera incisión como punto de partida, corte en ambos lados laterales del cráneo frente a las orejas, retire la piel y exponga la calvaria.
- Sostenga la cabeza desde el puente nasal y corte la calvaria a lo largo de la sutura lambdoidea. Corte a lo largo de los bordes laterales de los huesos parietales y extiéndalo para incluir la parte frontal.
- Separe la calvaria del tejido cerebral subyacente.
NOTA: Para asegurar una calvaria ósea limpia con una unión mínima de tejidos blandos, no corte profundamente en el hueso; Como referencia, uno debería poder ver la sombra de las tijeras debajo del hueso. - Transfiera la calvaria a solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4 durante todo el protocolo). Asegúrese de que la parte cóncava esté orientada hacia arriba.
2. Fraccionamiento de calvaria de ratón recién nacido
- Transfiera hasta 5 calvarias a un tubo cónico de 50 ml que contenga 5 ml de solución de colagenasa de 2 mg/ml. Use una solución fresca de colagenasa preparada justo antes de usar.
- Para preparar una solución fresca de colagenasa, agregue polvo de colagenasa al tampón de aislamiento (70 mM de NaCl, 10 mM de NaHCO 3, 60 mM de sorbitol,3 mM K 2 HPO4, 1 mM de CaCl 2, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), 5 mg/ml de glucosa y 25 mM de HEPES) a2mg/ml. Disuelva el polvo de colagenasa en un agitador magnético.
- Pase la solución de colagenasa a través de una unidad de filtro estéril de 0,22 μm en un tubo de 50 ml y manténgala en hielo durante todo el protocolo.
- Incubar la calvaria a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm para obtener la fracción 1.
- Deseche la digestión de la fracción 1, lave la calvaria con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y deseche el lavado.
- Incubar la calvaria en 5 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 5 mM que contenga 1 mg/ml de BSA en PBS, pH 7,4 a 37 °C durante 15 min en un agitador a 300 rpm.
- Recoja el digest en un tubo cónico de 50 ml. Lave la calvaria con 5 ml de PBS y agregue la solución de lavado al digerido.
NOTA: En cada punto de recolección del digest y lavado, pipetear los huesos en su solución para separar las células del hueso y evitar dobletes y agregados celulares. - Para obtener la fracción 2, centrifugar el digest a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 8 ml de medio esencial mínimo (MEM) de α que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI / ml de penicilina G y 100 μg / ml de estreptomicina. Semilla en una placa de cultivo de 10 cm. Incubar la fracción 2 a 37 °C bajo 5% deCO2.
- Incubar la calvaria en 5 ml de solución de colagenasa a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm.
- Para recopilar la fracción 3, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 3 a 37 °C bajo 5% deCO2.
NOTA: En este punto, los huesos se harán más pequeños y se reducirán a fragmentos. Para asegurarse de que ningún hueso se aspire accidentalmente en los digeridos, lo que conduce a la pérdida de células en el proceso, use una pipeta de punta pequeña para recolectar los resúmenes (puntas de pipeta de 1000-200 μL). - Incubar la calvaria en 5 ml de solución de colagenasa a 37 °C durante 20 min en un agitador a 300 rpm.
- Para recopilar la fracción 4, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 4 a 37 °C bajo 5% deCO2.
- Incubar la calvaria en 5 ml de 5 mM EDTA que contengan 1 mg/ml de BSA en PBS (pH 7,4) a 37 °C durante 15 min en un agitador a 300 rpm.
- Para recopilar la fracción 5, repita los pasos 2.5\u20122.6. Incubar la fracción 5 a 37 °C bajo 5% deCO2. Los osteocitos pueden prepararse para la clasificación el mismo día o cultivarse hasta 24 h antes de la clasificación.
3. Preparación de osteocitos para la clasificación celular activada por fluorescencia
- Aspirar el medio de cada fracción celular y lavar suavemente con 10 ml de PBS dos veces.
- Añadir 5 ml de tripsina-EDTA al 0,5% en PBS e incubar las células durante 5 min a 37 °C. Agregue 5 ml de FBS al 10% α-MEM y pipete para separar las células suavemente. Combine las células en cada fracción tamizando a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml.
- Lave las células con 10 ml de PBS y recójalas tamizando a través de un filtro celular de 40 μm en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.
- Aspire el sobrenadante y agregue un 10% de FBS α-MEM al pellet. Ajustar la concentración celular a aproximadamente 1 x 107 células/ml.
- Filtre las celdas en un tubo tapado de malla de nylon de 35 μm. Las células ya están listas para el sistema de control del control de los bienes sobre el terreno.
- Para este protocolo, utilice una boquilla de tamaño de 100 μm. El fluido de recolección debe consistir en un 10% de FBS α-MEM. Conservar la muestra que se está clasificando en agitación y, si es posible, a 4 °C durante toda la clasificación.
- Antes de la clasificación, optimice la activación para eliminar artefactos y celdas ajustando el área de dispersión lateral (SSC) y el área de dispersión directa (FSC). Elimine los dobletes ajustando SSC-width vs SSC-Height y FSC-area vs FSC-width. Los osteocitos GFP negativos deben utilizarse como control para ajustar los parámetros del instrumento de clasificación.
- Una vez completada la recolección de células, centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Lave las celdas con PBS. Centrifugar las células a 300 x g a 4 °C durante 5 min.
- Vuelva a suspender las celdas y ajuste el número como desee utilizando 10% FBS α-MEM.
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Representative Results
El propósito de este protocolo es demostrar el proceso de obtención de cultivos de osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal dmp1-topacio a través de un proceso de fraccionamiento utilizando colagenasa para degradar la matriz de colágeno y EDTA para la quelación del calcio, después de lo cual las células se preparan para FACS para separar los osteocitos de otras poblaciones celulares.
Los métodos para obtener osteocitos primarios de calvaria de ratón neonatal a menudo describen el uso de fracciones (1-1-20128) para clasificar23. Para probar la eficiencia de este método, comparamos el rendimiento de los osteocitos obtenidos de un calvario de ratón dmp1-topacio, a partir de las fracciones 1 a 8. Las fracciones 1-128 se clasificaron por separado para determinar el porcentaje y el rendimiento de los osteocitos de cada fracción. Después de la clasificación, cultivamos osteocitos durante 24 h en una placa de 96 pocillos para comparar la densidad de las células sembradas. Se muestra que la densidad de los osteocitos en las fracciones 2-0125 es mayor que la de la fracción 1, y la densidad de osteocitos comienza a disminuir notablemente en las fracciones 6, 7 y 8 (Figura 1A).
Aunque el porcentaje de osteocito obtenido entre todas las fracciones no es estadísticamente significativo (Figura 1B), la densidad de los osteocitos difiere dramáticamente. Los investigadores20 han reportado el uso de fracciones 2-0125 para aislar osteocitos a través de FACS, y mostramos en la Figura 1 que el uso de fracciones 2-u20125 optimiza el proceso para obtener osteocitos y disminuye el tiempo de la clase.
La Figura 2 muestra el número de células y la estrategia de compuerta practicada para aislar células GFP-positivas de GFP-negativas en las que se utilizaron como control células obtenidas mediante fraccionamiento de calvaria de ratón GFP-negativa. Los osteocitos obtenidos a través de este método se analizaron para la expresión génica de Dmp1 y SOST, que son marcadores conocidos de osteocitos. Las expresiones de ARNm de Dmp1 y SOST son más altas en los osteocitos en comparación con la fracción 2 de preclasificación, que se conoce como fracción osteoblástica alta (Figura 3A). La Figura 3B muestra la morfología de un osteocito GFP positivo que conserva una forma estrellada con dendritas que se extienden desde el cuerpo celular cultivado durante 24 h en una placa de cultivo de plástico post sort.
Figura 1: Eficiencia del fraccionamiento de osteocitos. (A) Imágenes microscópicas de la densidad de los osteocitos de las fracciones 1-1-128 sembradas en una placa de 96 pocillos capturada después de 24 h del tipo. Las fracciones 2\u20125 tienen una densidad celular mayor que las fracciones 1 y 6\u20128. Barra de escala = 100 μm. (B) Porcentaje de osteocitos obtenidos de fracciones 1\u20128 medido por el software del citómetro de flujo. Los resultados se derivan de tres experimentos representativos separados. Los datos se presentan como una media ± desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Aislamiento de osteocitos GFP positivos mediante clasificación celular activada por fluorescencia. El panel superior representa células aisladas de calvaria C57Bl/6J C57Bl/6J negativas para GFP como control del umbral de GFP. El panel inferior representa el número de células y el control de compuerta practicado para aislar osteocitos GFP positivos de células GFP negativas en la fracción 2 obtenidas de calvarios de ratón dmp1-topacio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de osteocitos post sort. (A) Expresión relativa de ARNm de Dmp1 y SOST de células de fracción 2 cultivadas durante 24 h y osteocitos cultivados durante 24 h después de la clasificación. Los datos se presentan como una media ± desviación estándar. Las diferencias estadísticas se detectaron mediante la prueba t de Student: * p < 0,05, **p < 0,01. (B) Imagen microscópica de una dendritas de retención de osteocitos que se extiende hacia afuera desde el cuerpo celular cultivado durante 24 h después de la clasificación. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El primer osteocito aislado fue de una calvaria de pollo 7 aislada mediante el uso (OB7.3) o la variante aviantede PHEX; Sin embargo, este método está limitado por la disponibilidad de anticuerpos viables, ya que se deben fabricar anticuerpos específicos de osteocitos que también son específicos de la especie. Los investigadores utilizaron una modificación diferente del proceso enzimático secuencial para obtener osteocitos de huesos largos de ratón y rata; La pureza reportada de estas culturas se fijó en alrededor del 70%9. El desarrollo del modelo de ratón cre permitió la ingeniería de osteocitos, que expresan GFP en su superficie. Este modelo de ratón, junto con FACS, se utilizó para obtener cultivos puros de osteocitos primarios20.
Omitimos el uso de fracciones 1 y fracciones 6-128 ya que pequeñas cantidades de osteocitos se desprenden en estas fracciones. El uso de fracciones 2\u20125 da el mejor rendimiento posible de osteocitos en el menor tiempo de procesamiento; Esto limita el tiempo de manipulación de los osteocitos y trabaja para prevenir la muerte celular o una posible alteración en la señalización celular como resultado del estrés al que está sometida la célula durante el fraccionamiento. También cultivamos osteocitos durante 24 h pre-clasificación, lo que por defecto, excluye las células de suspensión no adherentes (células hematopoyéticas) durante la preparación de la clasificación. Esto minimiza la contaminación por células hematopoyéticas que expresan GFP22. El flujo de trabajo proporcionado en este protocolo aprovecha los métodos publicados anteriormente23 y acorta el tiempo de clasificación, lo que permite una recuperación eficiente y rápida de los osteocitos con una contaminación mínima.
Los pasos críticos en el protocolo incluyen la obtención de una calvaria ósea limpia y el recorte de tejido blando del cerebro o tejido conectivo unido al hueso para limitar la contaminación de las células adherentes (fibroblastos y células neurales). Además, el pipeteo de las células durante los pasos que incluyen la obtención y el lavado de los digerios es crucial, ya que los agregados celulares y los dobletes se leen como desechos durante la clasificación y contribuirán a un bajo rendimiento de osteocitos.
Los osteocitos se pueden clasificar sin cultivo previo. Sin embargo, esto significa que se debe clasificar un mayor número de células, lo que aumenta el tiempo de clasificación y aumenta la posibilidad de contaminación hematopoyética. Esto se puede mitigar aplicando pre-clasificación de agotamiento de células hematopoyéticas. Sin embargo, esto es agotador y no se recomienda para análisis de laboratorio de rutina y por lotes22. Pueden surgir problemas durante la clasificación debido a la presencia de agregados de celdas grandes y dobletes que obstruyen el flujo de fluidos de la máquina de clasificación. En nuestro protocolo, esto no ha sido un problema, pero esto se puede resolver reduciendo el contenido FBS del búfer de clasificación (menos del 10%).
Este protocolo no viene sin limitaciones. Este método utiliza osteocitos de ratón, que no se parecen completamente a los osteocitos humanos. Esto restringe la extensión de los resultados obtenidos mediante el estudio de osteocitos murinos a resultados clínicos significativos. Se han descrito protocolos para el aislamiento de osteocitos humanos24, y se alienta a los investigadores a utilizar las especies celulares que mejor sirvan a sus objetivos. Al igual que con otros protocolos, las cantidades de osteocitos obtenidas utilizando este protocolo son limitadas, y se requiere un gran número de ratones para el análisis a gran escala, sin embargo, al disminuir el tiempo necesario para preparar y clasificar los osteocitos, se pueden adquirir mayores cantidades de células en un solo período de tiempo.
Los osteocitos obtenidos a través de este proceso se pueden utilizar para cultivos y cocultivos adicionales, análisis de expresión génica, análisis posterior de activación / inhibición de sustratos, sondeo molecular y aplicaciones de tinción. Las células primarias también se pueden utilizar para construir un modelo de matriz de osteocitos 3D que se asemeje al entorno osteocítico nativo para el estudio de la mecanotransducción y la mecanodetección.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención JSPS KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (No. 19K10397 a H.K. y No. 18K09862 a I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Data aquisition and analysis | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 μm nylon mesh. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Japan | 034-22363 | 0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Japan | 5mM EDTA prepared with 0.1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biowest, Nuaillé, France | ||
| Isolation buffer | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES | ||
| Millex Sterile Filter Unit | Merck Millipore, Ireland | SLGV033RS | 0.22μm |
| Nylon cell strainer | FALCON, NY, USA | 40μm | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0.5% x10. diluted to x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Japan | Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 μg/ml streptomycin |
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