Summary
Dit protocol presenteert een benadering van vingerafdruk en verkent multidimensionale gegevens verzameld door uitgebreide tweedimensionale gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. Speciale algoritmen voor patroonherkenning (template matching) worden toegepast om de chemische informatie te verkennen die is gecodeerd in de extra vierge olijfolie vluchtige fractie (d.w.z. volatilome).
Abstract
Gegevensverwerking en -evaluatie zijn kritieke stappen van uitgebreide tweedimensionale gaschromatografie (GCxGC), met name in combinatie met massaspectrometrie. De rijke informatie versleuteld in de gegevens kan zeer waardevol zijn, maar moeilijk om efficiënt toegang te krijgen. Gegevensdichtheid en complexiteit kunnen leiden tot lange uitwerkingstijden en vereisen moeizame, analistenafhankelijke procedures. Effectieve maar toegankelijke gegevensverwerkingstools zijn daarom essentieel om de verspreiding en acceptatie van deze geavanceerde multidimensionale techniek in laboratoria voor dagelijks gebruik mogelijk te maken. Het in dit werk gepresenteerde data-analyseprotocol maakt gebruik van chromatografische vingerafdrukken en sjabloonmatching om het doel van sterk geautomatiseerde deconstructie van complexe tweedimensionale chromatogrammen in individuele chemische kenmerken te bereiken voor geavanceerde herkenning van informatieve patronen binnen individuele chromatogrammen en in sets chromatogrammen. Het protocol levert een hoge consistentie en betrouwbaarheid met weinig interventie. Tegelijkertijd is analistentoezicht mogelijk in verschillende instellingen en beperkingsfuncties die kunnen worden aangepast om flexibiliteit en capaciteit te bieden om zich aan te passen aan verschillende behoeften en doelen. Sjabloonmatching wordt hier getoond als een krachtige aanpak om extra vergine olijfolie volatilome te verkennen. Cross-alignment van pieken wordt niet alleen uitgevoerd voor bekende doelen, maar ook voor niet-gerichte verbindingen, wat de karakteriseringskracht voor een breed scala aan toepassingen aanzienlijk verhoogt. Voorbeelden worden gepresenteerd om de prestaties aan te bewijs voor de classificatie en vergelijking van chromatografische patronen uit onder vergelijkbare omstandigheden geanalyseerde monstersets.
Introduction
Uitgebreide tweedimensionale gaschromatografie in combinatie met de tijd-van-vlucht massaspectrometrische detectie (GC×GC-TOF MS) is tegenwoordig de meest informatieve analytische benadering voor de chemische karakterisering van complexe monsters1,2,3,4,5. In GC×GC worden kolommen serieel verbonden en verbonden door een modulator (bijv. een thermische of op kleppen gebaseerde scherpstelinterface) die elutingcomponenten uit de kolom van de eerste dimensie (1D) vangt voordat ze opnieuw in de tweede dimensie (2D) kolom worden geïnjecteerd. Deze bewerking wordt uitgevoerd binnen een vaste modulatietijdsperiode (PM), meestal variërend tussen 0,5-8 s. Door thermische modulatie omvat het proces cryo-vang en scherpstellen van de elutingband met enkele voordelen voor het algehele scheidingsvermogen.
Hoewel GC×GC een tweedimensionale scheidingstechniek is, produceert het proces sequentiële gegevenswaarden. De detector analoog-naar-digitaal (A/D) converter verkrijgt de chromatografische signaaluitgang met een bepaalde frequentie. Vervolgens worden gegevens opgeslagen in specifieke eigen formaten die niet alleen de gedigitaliseerde gegevens bevatten, maar ook gerelateerde metagegevens (informatie over de gegevens). De A/D-converter die in GC×GC-systemen wordt gebruikt, helpt bij het in kaart brengen van de intensiteit van het chromatografische signaal naar een digitaal getal (DN) als functie van de tijd in de twee analytische dimensies. Eenkanaalsdetectoren (bv. vlamionisatiedetector (FID), elektronenafvangdetector (ECD), zwavel chemiluminescentiedetector (SCD), enz.) produceren enkelvoudige waarden per bemonsteringstijd, terwijl meerkanaalsdetectoren (bv. massaspectrometrische detector (MS)) meerdere waarden (meestal over een spectraal bereik) produceren per bemonsteringstijd tijdens de analytische uitvoering.
Om 2D-gegevenste visualiseren, begint de uitwerking met rastering van een enkele modulatieperiode (of cyclus) gegevenswaarden als een kolom met pixels (beeldelementen die overeenkomen met detectorgebeurtenissen). Langs de ordinaat (Y-as, van onder naar boven) wordt de 2D-scheidingstijd gevisualiseerd. Pixelkolommen worden opeenvolgend verwerkt, zodat de abscis (X-as, van links naar rechts) 1D-scheidingstijd rapporteert. Deze volgorde presenteert de 2D-gegevens in een rechtshandig Cartesisch coördinatensysteem, met de 1D-retentie ordinaal als de eerste index in de array.
Gegevensverwerking van 2D-chromatogrammen geeft toegang tot een hoger niveau van informatie dan ruwe gegevens, waardoor 2D-piekdetectie, piekidentificatie, extractie van responsgegevens voor kwantitatieve analyse en kruisvergelijkende analyse mogelijk zijn.
De 2D-piekpatronen kunnen worden behandeld als de unieke vingerafdruk van het monster en gedetecteerde verbindingen als minutiae-functies voor effectieve kruisvergelijkingsanalyse. Deze benadering, bekend als template-based fingerprinting6,7, is geïnspireerd op biometrische vingerafdrukken6. Automatische biometrische vingerafdrukverificatiesystemen zijn in feite gebaseerd op unieke vingertopkenmerken: noksplitsingen en -eindes, gelokaliseerd en geëxtraheerd uit geïnkte afdrukken of gedetailleerde afbeeldingen. Deze kenmerken, minutiae-objecten genaamd, worden vervolgens gekruist met beschikbare opgeslagen sjablonen8,9.
Zoals hierboven vermeld, bestaat elk GC×GC-scheidingspatroon uit 2D-pieken die rationeel zijn verdeeld over een tweedimensionaal vlak. Elke piek komt overeen met een enkele analyt, heeft zijn informatieve potentieel en kan worden behandeld als een enkele functie voor vergelijkende patroonanalyse.
Hier presenteren we een effectieve aanpak voor chemische vingerafdrukken door GC×GC-TOF MS met tandemionisatie. Het doel is om functies uit een reeks chromatogrammen uitgebreid en kwantitatief te catalogiseren.
In vergelijking met bestaande commerciële software of interne routines10,11 die een piek-features benadering hanteren, wordt template-gebaseerde fingerprinting gekenmerkt door hoge specificiteit, efficiëntie en beperkte rekentijd. Bovendien heeft het een intrinsieke flexibiliteit die het mogelijk maakt minutia-kenmerken (d.w.z. 2D-pieken) te kruisen tussen ernstig verkeerd uitgelijnde chromatogrammen zoals die verkregen door verschillende instrumentatie of in langlopende kaderstudies12,13,14.
De basisbewerkingen van de voorgestelde methode worden kort beschreven om de lezer te begeleiden naar een goed begrip van de complexiteiten informatiekracht van het 2D-patroon. Vervolgens wordt door het verkennen van de gegevensmatrix voor instrumentuitvoer chemische identificatie uitgevoerd en bekende gerichte analyten die zich boven de tweedimensionale ruimte bevinden. De sjabloon van gerichte pieken wordt vervolgens gebouwd en toegepast op een reeks chromatogrammen die binnen dezelfde analytische batch zijn verkregen. Metagegevens met betrekking tot bewaartijden, spectrale handtekeningen en reacties (absoluut en relatief) worden geëxtraheerd uit opnieuw uitgelijnde patronen van gerichte pieken en aangenomen om compositorische verschillen in de steekproefset te onthullen.
Als een extra, unieke stap van het proces, wordt een gecombineerde niet-gerichte en gerichte (UT) fingerprinting ook uitgevoerd op pre-targeted chromatogrammen om het vingerafdrukpotentieel uit te breiden naar zowel bekende als onbekende analyten. Het proces produceert een UT-sjabloon voor een echt uitgebreide vergelijkende analyse die grotendeels kan worden geautomatiseerd.
Als laatste stap voert de methode de kruisuitlijning van objecten uit in twee parallelle detectorsignalen die worden geproduceerd met hoge en lage elektronenionisatie-energieën (70 en 12 eV).
Het protocol is vrij flexibel in het ondersteunen van analyses van een enkel chromatogram of een reeks chromatogrammen en met variabele chromatografie en/of meerdere detectoren. Hier wordt het protocol gedemonstreerd met een in de handel verkrijgbare GC×GC-softwaresuite (zie materiaaltabel)gecombineerd met een MS-bibliotheek en zoeksoftware (zie Tabel met materialen). Sommige van de benodigde instrumenten zijn beschikbaar in andere software en soortgelijke instrumenten zouden onafhankelijk van beschrijvingen in de literatuur door Reichenbach en collega 's15,16,17,18,19kunnen worden geïmplementeerd . Ruwe gegevens voor de demonstratie zijn afgeleid van een onderzoek naar extra vierge olijfolie (EVO) uitgevoerd in het laboratorium van de auteurs14. Met name de vluchtige fractie (d.w.z. volatilome) van Italiaanse EVO-oliën wordt bemonsterd door headspace solid phase microextraction (HS-SPME) en geanalyseerd door GC×GC-TOF MS om diagnostische vingerafdrukken vast te leggen voor kwaliteit en sensorische kwalificatie van monsters. Nadere bijzonderheden over de monsters, de bemonsteringsvoorwaarden en de analytische opstelling zijn opgenomen in de tabel met materialen.
Stap 1–6 beschrijft de voorbewerking van de chromatogrammen. Stap 7–9 beschrijft de verwerking en analyse van individuele chromatogrammen. In stap 10-12 worden het maken en matchen van sjablonen beschreven, die de basis vormen voor analyse tussen de monsters. Stappen 13-16 beschrijven het toepassen van het protocol op een set chromatogrammen, met stap 14-16 voor UT-analyse.
Protocol
1. Importeren van ruwe gegevens
OPMERKING: Hiermee wordt een tweedimensionale rasterarray gemaakt voor visualisatie en verwerking.
- Start de beeldsoftware.
- Selecteer | Importeren; navigeer naar en kies het onbewerkte gegevensbestand dat is verkregen door gc×GC-TOF MS-systeem met de naam "VIOLIN 101.lsc" (Aanvullend bestand 1); klik vervolgens op Openen. Het chromatogram wordt geopend in deze software.
OPMERKING: Het ruwe gegevensbestandsformaat is afhankelijk van de fabrikant van het instrument. De software importeert een verscheidenheid aan bestandsindelingen die worden vermeld in de gebruikershandleiding. - Stel in het dialoogvenster Importeren de modulatieperiode (PM) in op 3,5 s; klik vervolgens op OK.
OPMERKING: Sommige acquisitiesoftware registreert mogelijk de modulatieperiode niet. - Selecteer | Afbeelding opslaan als; navigeer naar de gewenste map; voer de naam "Oil 1 RAW.gci" (Aanvullend dossier 2) in; klik vervolgens op Opslaan.
2. Verschuiven van de modulatiefase
OPMERKING: Hiermee worden alle pieken in elke modulatiecyclus in dezelfde afbeeldingskolom opgenomen, inclusief de pieken die zich rond het einde van de modulatieperiode omwikkelen in de leegtetijd van de volgende modulatieperiode20.
- Selecteer Verwerking | Ploegenfase.
- Stel in het dialoogvenster Shift-fase het verschuivingsbedrag in op -0,8 s; klik vervolgens op OK.
3. Basislijncorrectie21
- Selecteer Grafisch | Rechthoek tekenen.
- Klik en sleep om een rechthoek in de afbeelding te tekenen waar geen pieken worden gedetecteerd.
- Gereedschap selecteren | Gegevens visualiseren; let op de gemiddelde en standaardafwijking van het detectorsignaal, hier 21.850 ± 1.455 SD-eenheidsloos digitaal nummer (DN); sluit vervolgens het gereedschap.
- Selecteer Verwerking | Juiste basislijn.
4. Kleuren van de chromatografische afbeelding met behulp van een waardekaart en kleurenkaart20
- Selecteer Weergave | Kleuren.
- Selecteer in het dialoogvenster Kleuren het tabblad Importeren/exporteren. selecteer de #AAAA (Aanvullend Bestand 3) aangepaste kleurenkaart verstrekt als aanvullend materiaal; klik vervolgens op Importeren.
- Stel in de besturingselementen Waardetoewijzing het waardebereik in op de minimum- en maximumwaarden. klik vervolgens op OK.
5. 2D pieken (d.w.z. blobs) detectie voor analyten18
- Selecteer Verwerking | Blobs detecteren met de standaardinstellingen; merk dan op dat sommige pieken zijn gesplitst en dat er valse detecties zijn.
- Selecteer | configureren Instellingen | Blob detectie; stel vervolgens Vloeiendheid in op 0,1 voor de eerste dimensie en 2,0 voor de tweede dimensie en stel minimumvolume (d.w.z. drempel voor de opgetelde waarden) in op 1,00 E6; klik vervolgens op OK.
- Selecteer Verwerking | Blobs detecteren met de nieuwe instellingen; observeer vervolgens de verbeteringen.
6. 2D pieken filtratie
OPMERKING: Dit wordt gedaan om betekenisloze detecties automatisch te verwijderen als gevolg van kolom afloopt langs de 1D en stakingen of tailings langs de 2D.
- Selecteer Verwerking | Interactieve blobdetectie.
- Let op de blob detectie-instellingen; klik vervolgens op Detecteren.
- Klik in de opbouwfunctie voor geavanceerd filter op Toevoegen; selecteer vervolgens in het dialoogvenster Nieuwe beperking de optie Retentie II; klik vervolgens op OK.
- Stel in de schuifregelaars Beperking de minimale en maximale 2D-bewaartijden voor het filter in om het aantal valse pieken te verminderen zonder echte pieken te verliezen.
- Klik op Toepassen; klik vervolgens op Ja om op te slaan in de detectie-instellingen met het nieuwe filter.
OPMERKING: Er kunnen meer geavanceerde hulpmiddelen nodig zijn om bepaalde detectieproblemen aan te pakken, zoals ionenpiekdetectie of deconvolutie voor co-elutions19.
7. Lineaire retentie-indexen kalibratie
OPMERKING: Voer deze stap22 (IT) uit voor de specifieke bewaartijden in de set retentie-index (RI) standaarden (meestal n-alkanen).
- Selecteer | configureren RI Tabel | Retentie-index (col I).
- Klik in het dialoogvenster RI-tabelconfiguratie op Importeren; selecteer vervolgens het RI-kalibratiebestand (in CSV-indeling met naam, bewaartijd en retentie-index) met de naam "LRI-tabel.csv" – (Aanvullend bestand 4).
- Selecteer | Afbeelding A opslaan. Navigeer naar de gewenste map; voer de naam "Oil 1 LRI CALIBRATED.gci" (Aanvullend bestand 5) in; klik vervolgens op Opslaan.
8. Zoeken naar de piekspectra in de NIST17 MS-bibliotheek23
- Selecteer | configureren Instellingen | Zoekbibliotheek.
- Stel in het dialoogvenster Zoekbibliotheek type spectrum in op piek MS, intensiteitsdrempel op 100, NIST-zoektype op eenvoudig (gelijkenis), NIST RI-kolomtype op standaardpolair en NIST RI-tolerantie op 10; klik vervolgens op OK. NIST MS Search biedt veel andere instellingen die hier zijn ingesteld op de standaardinstellingen.
- Selecteer Verwerking | Zoek bibliotheek voor alle blobs.
9. Controleer en corrigeer analytidentificaties
- Stel in het gereedschapspalet de cursormodus in op Blob | Selecteer Blobs.
- Klik in de afbeeldingsweergave met de rechtermuisknop op de gewenste piek.
- Inspecteer blob-eigenschappen in het dialoogvenster Blob-eigenschappen. klik vervolgens op Lijst met hits.
- Inspecteer de hitlijst; Als de identificatie onjuist is, schakelt u vervolgens het vinkje naast de juiste identificatie in.
- Voer in het dialoogvenster Blob-eigenschappen de groeps naam in om de chemische klasse en andere gewenste meta gegevens aan te wijzen. klik vervolgens op OK.
- Selecteer | Afbeelding opslaan als; navigeer naar de gewenste map; voer de naam "Oil 1 COLORIZED for Template construction.gci" (Aanvullend Bestand 6) in; klik vervolgens op Opslaan.
OPMERKING: Dit bestand is opgenomen in het aanvullende archief, dat kan worden geopend voor stap 10.
10. Maak een sjabloon met gerichte pieken15
- Selecteer in de afbeeldingsweergave (nog steeds in de modus Blobs selecteren vanaf stap 9.1) de gewenste pieken met een klik op de eerste piek en CTRL + klik op de extra pieken.
- Klik in het gereedschapspalet op de knop Toevoegen aan sjabloon.
- Wanneer de sjabloon is voltooid, selecteert u Bestand | Sjabloon opslaan; geef de map en bestandsnaam op; klik vervolgens op Opslaan.
- Selecteer | Afbeelding sluiten.
OPMERKING: Op dit punt gaan deze instructies verder met de sjabloon die is gemaakt om de gewenste doelpieken op te nemen, beschikbaar als "Gerichte tamplate.bt" (Aanvullend bestand 7).
11. Match en pas het sjabloon toe
OPMERKING: Matching herkent het sjabloonpatroon in de gedetecteerde pieken een nieuw chromatogram. Het toepassen van de overeenkomende sets identificaties en andere metagegevens in het nieuwe chromatogram van de sjabloon.
- Selecteer | Afbeelding openen; navigeer naar en selecteer het chromatogrambestand "Oil 2 COLORIZED.gci"(Aanvullend bestand 8)(dat vooraf is verwerkt); klik vervolgens op Openen.
- Stel in het gereedschapspalet de cursormodus in op Sjabloon | Objecten selecteren.
- Sjabloon | selecteren Sjabloon laden.
- Klik in het dialoogvenster Sjabloon laden op Bladeren; navigeer naar en selecteer de targeted peaks template "Targeted template.bt" ( AanvullendBestand 7); klik vervolgens op Openen.
- Klik in het dialoogvenster Sjabloon laden op Ladenen vervolgens op Negeren.
- Klik in de afbeeldingsweergave met de rechtermuisknop op een sjabloonpiek; inspecteer vervolgens de objecteigenschappen, waaronder de qCLIC en referentie-MS.
- Sjabloon | selecteren Interactieve sjabloon voor matchen en transformeren.
- Klik in de interface Interactieve overeenkomst op Alles vergelijken; Bekijk vervolgens de overeenkomende resultaten, zowel in de tabel als in de afbeelding, waarin elke sjabloonpiek is gemarkeerd met niet-gevulde cirkels en, als er een overeenkomst wordt gemaakt, er een koppeling is naar een gevulde cirkel voor de gedetecteerde piek.
- Bewerk de overeenkomsten naar wens; wanneer u tevreden bent, klikt u op Toepassen om metagegevens over te zetten van de sjabloon naar het chromatogram.
OPMERKING: Overeenkomende beperkingen, zoals de qCLIC, helpen het juiste patroon te matchen tussen de gedetecteerde pieken van het nieuwe chromatogram. Beperkingsparameters omvatten het type MS-handtekening dat wordt gebruikt als sjabloonverwijzing(piek-MS of BLOB MS)en de drempelwaarden voor spectrale gelijkenis (Direct Match Factor (DMF) en Reverse Match Factor (RMF)). Hier worden parameters ingesteld op basis van eerdere studies13,14 om valse negatieve overeenkomsten te beperken: piek MS en DMF en RMF gelijkenisdrempel 700.
12. Transformeer de sjabloon voor wezenlijk verschillende chromatografie
OPMERKING: Deze stap is niet nodig, tenzij de chromatografische omstandigheden aanzienlijk variëren, waardoor de sjabloon verkeerd is uitgelijnd met een nieuw chromatogram, zoals het geval kan zijn bij langetermijnstudies of nadat een nieuwe kolom is geïnstalleerd. In dergelijke gevallen kan de sjabloon geometrisch worden getransformeerd in het chromatografische retentietijdvlak om beter te passen bij het nieuwe chromatogram12,13. In dit voorbeeld zijn de piekpatronen van de sjabloon en het chromatogram vergelijkbaar, maar verschillen ze in de geometrie van de retentietijden, zoals te zien is bij verschillende chromatografische omstandigheden.
- Herhaal stap 11.2–11.5, behalve navigeren naar, selecteren en laden van gerichte sjabloon 2.bt ( Aanvullend bestand9).
- Sjabloon | selecteren Interactieve matchsjabloon; klik vervolgens op Transformatie bewerken.
- Varieer in de interface Sjabloon transformeren de schalen, vertalingen en scharen van 1D en 2D om de sjabloon beter af te stemmen op de gedetecteerde pieken. klik vervolgens op Sjabloon transformeren.
- Klik met de getransformeerde sjabloon op Overeenkomst bewerken; herhaal vervolgens stap 11.8–11.9.
13. Voer gecombineerde niet-gerichte en gerichte analyses uit over een reeks chromatogrammen
OPMERKING: Een gecombineerde niet-gerichte en gerichte (UT)-sjabloon, ook wel functiesjabloon 24,25genoemd, wanneer deze is afgestemd op elk van een set chromatogrammen, zorgt voor correspondentie tussen niet-gerichte en gerichte analyten, waarna consistente cross-sample-functies worden geëxtraheerd voor patroonherkenning.
- Voer voorbewerking (stappen 1-6) en UT-sjabloonmatching (stappen 11.1-11.9) uit voor alle chromatogrammen in de set (d.w.z. 2D-chromatogrammen van oliën). U kunt deze stap ook automatiseren met projectsoftware of vergelijkbare software, die hier niet wordt beschreven.
- Start de Investigator software.
- Selecteer | Open analyse; selecteer vervolgens "Feature Jove su 70 eV.gca" (Aanvullend bestand 10).
- Klik op OK om de resultaten te openen en te bekijken.
- Klik op het tabblad Verbindingen om metrische waarden en statistieken voor specifieke analyten (d.w.z. gerichte analyten met bijbehorende chemische namen) of niet-gerichte analyten met (#) id's die zijn uitgelijnd op alle chromatogrammen te bekijken en voer vervolgens de onderstaande stappen uit.
- Klik op het tabblad Kenmerken om waarden en statistieken voor specifieke metrische gegevens in chromatogrammen te bekijken.
- Klik op het tabblad Overzicht om de overzichtsstatistieken voor zowel verbindingen als functies te bekijken. Als de chromatogrammen van verschillende klassen zijn, zoals in dit geval oliën die zijn geproduceerd uit olijven die in twee verschillende regio's van Italië zijn geoogst, dan bevat het tabblad Samenvatting fisher ratio statistieken (F en FDR), die inzicht geven in kenmerken voor het onderscheid tussen klassen.
- Bekijk verschillende grafieken op alle tabbladen en voer desgewenst Principal Component Analysis (PCA) uit op het tabblad Kenmerken.
14. Wijzig de UT-sjabloon voor parallelle MS-analyse
OPMERKING: De analyse werd uitgevoerd met zowel 70 eV als 12 eV (d.w.z. hoge en lage) elektronenionisatie-energieën26,27.
- Open een van de 12 eV-chromatogrammen, bijvoorbeeld "Oil 1 12 eV RAW.gci" (Aanvullend bestand 11), voer voorbewerking uit (stappen 1-6) en laad de UT-sjabloon "UT-sjabloon 70 relaxed.bt" (Aanvullend bestand 12) zoals beschreven in de stappen 11.1–11.6. Bestanden worden verstrekt als aanvullend materiaal.
- Pas indien nodig de sjabloon aan op de gedetecteerde 12 eV-pieken zoals beschreven in stap 12. Hier is er geen significante verkeerde uitlijning omdat de tandemsignalen zijn gemul veelvoudig. Er moet echter worden opgemerkt dat omdat de verschillende ionisatie-instellingen verschillende fragmentaties veroorzaken, het noodzakelijk is om de beperkingen voor de qCLIC-beperkingen op DMF- en RMF-spectrale gelijkenis te versoepelen (hier niet aangetoond).
- Selecteer | Sjabloon opslaan; de map en bestandsnaam opgeven, bijvoorbeeld "UT-sjabloon 12.bt" (Aanvullend dossier 13); klik vervolgens op Opslaan.
15. Voer gecombineerde niet-gerichte en gerichte analyse uit over 12 eV-chromatogrammen
- Selecteer | Open analyse; selecteer en open vervolgens "Feature Jove su 12 eV.gca" - Aanvullend bestand 14 bestand meegeleverd.
- Klik op OK om de resultaten te openen en te bekijken.
- Klik op het tabblad Verbindingen om metrische waarden te bekijken, raadpleeg 12 eV-antwoorden en statistieken voor specifieke analyten (d.w.z. gerichte analyten met bijbehorende chemische namen) of niet-gerichte analyten met (#) id's uitgelijnd op alle chromatogrammen en voer vervolgens de onderstaande stappen uit.
- Klik op het tabblad Kenmerken om waarden en statistieken voor specifieke metrische gegevens in chromatogrammen te bekijken.
- Klik op het tabblad Samenvatting om de overzichtsstatistieken voor zowel verbindingen als functies bij 12 eV te bekijken. Als de chromatogrammen van verschillende klassen zijn, zoals in dit geval oliën die zijn geproduceerd uit olijven die in twee verschillende regio's van Italië zijn geoogst, dan bevat het tabblad Samenvatting fisher ratio statistieken (F en FDR), die inzicht geven in kenmerken voor het onderscheid tussen klassen.
- Bekijk de verschillende grafieken die beschikbaar zijn op alle tabbladen en voer desgewenst Principal Component Analysis (PCA) uit op het tabblad Kenmerken.
Representative Results
GC×GC-TOF MS patronen van hoogwaardige extra vergine olijfolie volatilome vertonen ongeveer 500 2D pieken boven een signaal-ruisverhouding (SNR) drempel van 100. Een dergelijke drempel werd door eerdere onderzoeken naar vluchtige levensmiddelen14,27 gedefinieerd als het relatieve minimumsignaal boven de drempelwaarde om betrouwbare spectra voor kruisvergelijkende analyse te verkrijgen. Componenten worden verdeeld over de chromatografische ruimte op basis van hun relatieve retentie in de twee chromatografische dimensies, en specifiek gebaseerd op hun volatiliteit / polariteit in de 1D en volatiliteit in de 2D. Hier is kolomcombinatie polair × semipolair (d.w.z. Carbowax 20M × OV1701).
Het 2D-patroon toont een hoge mate van orde. Relatieve retentiepatronen voor homologe reeksen en klassen worden weergegeven in figuur 1A met annotaties (afbeeldingen voor groepen en bellen voor pieken) voor lineaire verzadigde koolwaterstoffen (zwart), onverzadigde koolwaterstoffen (geel), lineaire verzadigde aldehyden (blauw), enkelvoudig onverzadigde aldehyden (rood), meervoudig onverzadigde aldehyden (zalm), primaire alcoholen (groen) en korte-keten vetzuren (cyano).
Gedetecteerde 2D-pieken kunnen vervolgens worden geïdentificeerd door het gemiddelde MS-spectrum te vergelijken dat wordt geëxtraheerd uit de volledige 2D-piek(blobspectrum) of uit het grootste spectrum(apexspectrum). Figuur 2 illustreert de uitvoer van de apex spectrum search naar blob 5 en retourneert een hoge gelijkenis match (eerste 10 hits) voor (E)-2-hexenal. Onderzochte databases zijn databases die vooraf zijn geselecteerd door de analist in stap 8 van de methode.
De identificatie wordt gevalideerd door actieve retentie-indexering. De experimentele IT-waarde werd berekend voor de 2D-pieken, zodat in dit stadium de bibliotheekzoekopdracht prioriteit geeft aan resultaten met coherente waarden van getabelleerde IT. Tolerantievensters kunnen worden aangepast op basis van analistenervaring, betrouwbaarheid van referentiedatabasewaarden volgens stationaire fase en toegepaste analytische omstandigheden. Nieuwe instrumenten voor slimme kalibratie van lineaire retentie-indexen zonder experimentele kalibratie met n-alkanen, zijn onlangs ontwikkeld en besproken in een studie van Reichenbach et al19.
De verzameling van geïdentificeerde 2D-pieken (d.w.z. gerichte pieken) kan worden gebruikt om een sjabloon van gerichte pieken te bouwen om onmiddellijk betrouwbare overeenkomsten tussen dezelfde verbinding tussen alle monsterchromatogrammen vast te stellen. De verzameling van gerichte sjabloonpieken wordt gevisualiseerd in figuur 1B. Rode cirkels komen overeen met de 196 beoogde verbindingen, waaronder twee Internal Standards (IS) gekoppeld aan sjabloonpieken met verbindingslijnen. IS wordt gebruikt voor respons normalisatie en verbindings lijnen helpen om te visualiseren welke van de opgenomen IS zal worden aangenomen om elke 2D piek/blob reactie te normaliseren.
In figuur 1Bgeven gevulde cirkels positieve overeenkomsten aan tussen de sjabloonpiek en het werkelijke patroon, terwijl lege cirkels voor sjabloonpieken zijn waarvoor de correspondentie niet is geverifieerd. Fout-negatieve overeenkomsten kunnen worden beperkt door de juiste selectie van drempelparameters, referentiespectra en beperkingsfuncties13,14,18,19. Voor complexe patronen met meervoudige co-eluties zijn ionenpiekdetectiefuncties die zijn gebaseerd op spectrale deconvolutie aan te raden en kunnen een geldige optie zijn19. Sjabloonpiekmetagegevens worden weergegeven in het vergrote paneel van figuur 1B voor (E)-2-hexenaal.
De specificiteit van template matching is afhankelijk van de mogelijkheid om beperkingsfuncties toe te passen die positieve correspondentie beperken tot die kandidaatpieken die, binnen het zoekvenster van het algoritme, ms spectrale gelijkenis boven een bepaalde drempel hebben. In dit geval werden in stap 11 de gelijkenisdrempels23 vastgesteld op 700 volgens eerdere experimenten die gericht waren op het definiëren van optimale parameters ter beperking van vals-negatieve overeenkomsten14. Gemarkeerde gebieden van de sjabloonpiekeigenschappen in figuur 1B tonen de informatie over de referentie-MS-spectrumreeks en de qCLIC-beperkingsfunctie (d.w.z. (Match("
Door de sjabloon toe te passen op alle chromatogrammen van een set, kan men uitdagende situaties tegenkomen zoals in het geval van gedeeltelijke verkeerde uitlijning van patronen. Dit kan te wijten zijn aan inconsistenties in de oventemperatuur, debiet/drukinstabiliteit van de drager, of door een handmatige interventie op het systeem zoals in het geval van kolomsubstitutie of modulatorlus-capillaire vervanging14,28. Figuur 3 toont een situatie van een gedeeltelijke verkeerde uitlijning tussen de beoogde sjabloon en het werkelijke chromatogram. Voor minimale verkeerde uitlijningen kunnen interactieve sjabloontransformaties(figuur 3,configuratiescherm) sjabloonpieken verplaatsen voor een betere pasvorm. Na herpositionering kan de sjabloon worden gekoppeld om correspondentie vast te stellen. In het voorbeeld komen de pieken van de sjabloon(figuur 3, stap 12) correct overeen met het werkelijke 2D-patroon. In het geval van ernstige verkeerde uitlijningen, die hier niet worden besproken, kan de herhaling van match-transform-update-acties de positie van de sjabloonpieken iteratief aanpassen aan het werkelijke piekpatroon12,13,14.
Hier leveren de beoogde pieken (d.w.z. bekende analyten) ongeveer 40% van het chromatografische resultaat (196 gerichte pieken van gemiddeld ongeveer 500 detecteerbare pieken). De andere 60% van de verbindingen, samen met de informatie die ze opleveren, worden niet in aanmerking genomen bij gerichte analyse. Om het onderzoek echt alomvattend te maken, moet ook een consistente kruislijning van niet-gerichte 2D-pieken worden vastgesteld. De eerste toepassing waarbij de sjabloonmatching werd uitgebreid tot alle detecteerbare analyten, had betrekking op het complexe volatilome van gebrande koffie7. Dit proces wordt geautomatiseerd met een software (bijv. Onderzoeker), die hier in stap 14-15 wordt weergegeven.
In dit proces worden vooraf gerichte beelden die behoren tot de onderzochte steekproef (20 monsters) gebruikt om betrouwbare pieken te definiëren door alle beeldpatronen te kruisen29. Vervolgens wordt een samengesteld chromatogram gebouwd waaruit men UT-betrouwbare pieken en piekgebieden (d.w.z. 2D piekvoetafdruk) kan identificeren in de zogenaamde functiesjabloon17.
Voor analyses die bij 70 eV werden verkregen, bepaalde het proces 144 betrouwbare pieken met ontspannen betrouwbaarheid29, waarvan 76 tot de beoogde piekenlijst behoren. Op basis van deze 144 betrouwbare pieken lijnt het proces alle chromatogrammen consistent af op de gemiddelde retentietijden van de betrouwbare pieken en combineert deze vervolgens om een samengesteld chromatogram te maken. Figuur 4 toont een lijst van alle monsters gelabeld op basis van het productiegebied van de olie (links) en de lijst met betrouwbare pieken/blobvolumes in elk monster (rechts).
De niet-gerichte functiesjabloon bestaat uit 2D-pieken van analyten die zijn gedetecteerd in het samengestelde chromatogram, weergegeven in figuur 5A, die overeenkomen met de sjabloon met betrouwbare pieken (n = 168 – rode cirkels voor gerichte pieken en groene cirkels voor niet-gerichte pieken). De massaspectra van de samengestelde pieken, evenals hun retentietijden, worden geregistreerd in de functiesjabloon zoals weergegeven voor (Z)-3-hexenolacetaat in het vergrote gebied. Piekregio's worden in figuur 5B weergegeven als roodgekleurde afbeeldingen; ze worden in plaats daarvan gedefinieerd door de contouren van alle 2D-pieken die in het samengestelde chromatogram worden gedetecteerd (n = 3578).
Wanneer zonder toezicht patroonherkenning door Principal Component Analysis wordt toegepast op gerichte piekverdeling binnen de 20 geanalyseerde monsters, clusteren Siciliaanse en Toscaanse oliën afzonderlijk wat suggereert dat pedo-klimatologische omstandigheden en terroir de relatieve prevalentie van vluchtige stoffen beïnvloeden. De resultaten zijn weergegeven in figuur 6A en de PCA-resultaten van de betrouwbare piekverdeling zijn weergegeven in figuur 6B. De twee benaderingen kruisen dat oliën uit verschillende geografische gebieden verschillende, terwijl coherente, chemische handtekeningen, al dan niet gericht, in kaart worden gebracht.
Ten slotte maakt de software een snelle en effectieve heruitlijning van patronen over parallelle detectiekanalen mogelijk. In deze toepassing wordt de heruitlijning voorgesteld voor tandemionisatiesignalen. De ionenbron van de MS-multiplexen tussen twee ionisatie-energieën (d.w.z. 70 en 12 eV) met een acquisitiefrequentie van 50 Hz per kanaal30. De twee resulterende chromatografische patronen zijn nauw op elkaar afgestemd , terwijl spectrale gegevens (d.w.z. spectrale handtekeningen en reacties ) aanvullende informatie opleveren met verschillende dynamische responsbereiken26,27. De uitgelijnde patronen maken het mogelijk om objecten(2D-piekenen piekregio's) te extraheren met univocale ID's (d.w.z. chemische namen voor gerichte pieken en unieke nummering # voor niet-gerichte pieken en piekregio's).
Sjabloonmatching maakt effectieve kruisuitlijning mogelijk. In deze situatie is er niet veel verkeerde uitlijning, maar MS-beperkingen moeten worden versoepeld om overeenkomsten voor UT-pieken mogelijk te maken. Aan de andere kant worden UT-piekregio's met UT-piekregio's zonder MS-beperkingen onmiddellijk gematcht zonder valse negatieve overeenkomsten. Figuur 5C toont een vergroot gebied van een 12 eV-chromatogram waarbij de functiesjabloon die is gebouwd op basis van 70 eV-gegevens wordt vergeleken. Betrouwbare UT-pieken worden positief geëvenaard vanwege de verlaagde qCLIC-beperkingen (bijv. DMF-drempel op 600). Om op te merken, bij 12 eV, zijn er minder gedetecteerde pieken als gevolg van de beperkte fragmentatie veroorzaakt door lage ionisatie-energie.
Figuur 1: Bidimensionale contourplot en doelsjabloon. (A) Contourplot van de vluchtige fractie van een extra vergine olijfolie uit Toscane. Geordende patronen van homologe reeksen en klassen worden gemarkeerd met verschillende kleuren en lijnen: lineaire verzadigde koolwaterstoffen (zwarte lijn en 2D contouren) onverzadigde koolwaterstoffen (geel), lineaire verzadigde aldehyden (blauw) mono-onverzadigde aldehyden (rood), meervoudig onverzadigde aldehyden (zalm), primaire alcoholen (groen) en korte keten vetzuren (cyano). (B) Overimposed targeted template van bekende analyten (rood gekleurde cirkels) met verbindingslijnen die interne standaarden (ISs) met elkaar verbinden. Panelen tonen metagegevens van 2D piek-/BLOB-eigenschappen (decanal) of sjabloonpiekeigenschappen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Apex MS search. Uitvoer van de apex MS-zoekopdracht naar blob 5. Lijst met de databasevermeldingen met de hoogste overeenkomst en gerelateerde metagegevens die beschikbaar zijn in de bibliotheek. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Sjabloon herschikking. Werkstroom ter illustratie van de stappen waarmee de sjabloon opnieuw kan worden uitgelijnd door transformatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: GC Investigator interface. Onderzoekspaneel met alle geselecteerde afbeeldingen gelabeld op basis van het productiegebied van de olie (links) en de lijst met betrouwbare pieken/blobvolumes in elk monster (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Doelgerichte en UT-sjabloon. (A) Betrouwbare pieken als gevolg van de geautomatiseerde verwerking in stap 11; rode cirkels komen overeen met bekende analyten, terwijl groene cirkels onbekend zijn. In het deelvenster Boven elkaar worden sjabloonobjecteigenschappen weergegeven voor de (Z)-3-hexenal. (B) Vergroot gebied dat de UT-pieken (rode en groene cirkels) en piekgebieden (rode afbeeldingen) van de UT-sjabloon weergeeft, afgestemd op een monsterolie die is verkregen bij 70 eV ionisatie-energie. (C) UT-sjabloon komt overeen met een monsterolie die is verkregen bij 12 eV ionisatie-energie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: PCA laadpercelen. Ze tonen de natuurlijke conformatie van monsters (oliën uit Toscane en Sicilië) als gevolg van (A) gerichte piekverdeling of (B) UT pieken verdeling. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende bestanden. Klik hier om deze bestanden te downloaden.
Discussion
Visualisatie van GC×GC-TOF MS-gegevens is een fundamentele stap voor een passend begrip van de resultaten die worden bereikt door uitgebreide tweedimensionale scheidingen. Beeldplots met aangepaste kleuring stellen analisten in staat om detectorresponsverschillen en dus de differentiële verdeling van monstercomponenten te waarderen. Deze visuele benadering verandert het perspectief van de analisten op de interpretatie en uitwerking van chromatogrammen volledig. Deze eerste stap, ooit begrepen en vol vertrouwen gebruikt door chromatografen, opent een nieuw perspectief in verdere verwerking.
Een ander fundamenteel aspect van gegevensverwerking is de toegankelijkheid van de volledige gegevensmatrix (d.w.z. spectrale gegevens en reacties van de lidstaten) voor alle monsterpunten, die elk overeenkomen met één detectorgebeurtenis. In dit opzicht piekt 2D integratie, zodat het verzamelen van detectorgebeurtenissen die overeenkomen met een enkele analyt een kritieke stap is. In het huidige protocol is detectie van 2D-pieken gebaseerd op het waterscheidingsalgoritme18, met enkele aanpassingen om de detectiegevoeligheid te verbeteren in het geval van gedeeltelijke co-elutingverbindingen. Om dit proces specifieker te maken, moet deconvolutie worden uitgevoerd en moeten er meer geavanceerde procedures worden aangenomen. Dit is mogelijk door een ionenpiekdetectie uit te voeren voor MS-gegevens; het algoritme verwerkt de gegevensarray en isoleert de respons van enkelvoudige analyten op basis van spectrale profielen19,31.
Een belangrijke maar kritieke stap van het protocol en van elk GC×GC-MS-gegevensinterpretatieproces, heeft betrekking op de identificatie van analyten. Deze procedure, voorgesteld in de stappen 8 en 9, bij gebrek aan een bevestigende analyse met authentieke normen, moet zorgvuldig worden uitgevoerd door de analist. Geautomatiseerde acties zijn beschikbaar in alle commerciële software; zij omvatten de evaluatie van de gelijkenis van de ms-spectrale handtekening ten opzichte van de verzamelde referentiespectra (d.w.z. spectrale bibliotheken) en de evaluatie van de karakteristieke verhoudingen tussen kwalificatie-/kwantificeringsionen. Er zijn echter aanvullende bevestigende criteria nodig om de identificatie van isomeren te ontwrichten. Het protocol stelt de goedkeuring voor van lineaire retentie-indexen om prioriteit te geven aan de lijst van kandidaten; de limiet heeft hier betrekking op de beschikbaarheid van bewaargegevens en de consistentie ervan.
Het belangrijkste kenmerk dat deze benadering uniek maakt , is sjabloonmatching12,13,15,29. Sjabloonmatching maakt 2D-patroonherkenningmogelijk op een zeer effectieve, specifieke en intuïtieve manier. Het kan worden ingesteld, in termen van gevoeligheid en specificiteit, door aangepaste drempelwaarden en / of beperkingsfuncties toe te passen, terwijl de analist de procedure kan begeleiden door actief te communiceren met transformatiefunctieparameters. De bijzonderheid van dit proces is afhankelijk van de mogelijkheid om gerichte en niet-gerichte piekinformatie te kruisen tussen monsters van een uniforme partij, maar ook tussen monsters die ondanks een gemiddelde tot ernstige verkeerde uitlijning met dezelfde nominale omstandigheden zijn verkregen. Voordelen van deze bewerking hebben betrekking op de mogelijkheid om alle gerichte analytenidentificaties te behouden, wat een tijdrovende taak is voor de analist, en alle metagegevens die zijn opgeslagen voor gerichte en niet-gerichte pieken van eerdere uitwerkingssessies.
Template matching is ook zeer effectief in termen van rekentijd; MS-gegevensbestanden met lage resolutie bestaan uit ongeveer 1-2 Gb verpakte gegevens, terwijl MS-analyses met hoge resolutie 10-15 Gb per enkele analytische uitvoering kunnen bereiken. Sjabloonmatching verwerkt niet elke keer de volledige gegevensmatrix, maar voert in eerste instantie retentietijduitlijning uit tussen chromatogrammen met behulp van sjabloonpieken en verwerkt vervolgens kandidaatpieken binnen het zoekvenster voor hun gelijkenismatch met verwijzing in de sjabloon. In het geval van ernstige verkeerde uitlijning, de meest uitdagende situatie, presteerden globale tweede-orde polynomiale transformaties beter dan lokale methoden terwijl de rekentijd werd verkort13.
Om de GC×GC-techniek zich wijd te verspreiden buiten de academische wereld en onderzoekslaboratoria, moeten gegevensverwerkingsinstrumenten basisbewerkingen voor visualisatie en chromatogrammeninspectie vergemakkelijken; identificatie van analyten moet de mogelijkheid bieden om gestandaardiseerde algoritmen en procedures toe te passen (bv. NIST-zoekalgoritme en I T-kalibratie); en vergelijkende analyses moeten intuïtief, effectief en ondersteund worden door interactieve instrumenten. De voorgestelde aanpak voldoet aan deze behoeften en biedt geavanceerde opties en tools om complexe situaties aan te pakken, zoals co-elutie van analyten, kalibratie van meerdere analyten, analyse van het groepstype en parallelle detectie-uitlijning.
De literatuur waarnaar wordt verwezen, bestrijkt veel mogelijke scenario's waarin GC×GC en, meer in het algemeen, uitgebreide tweedimensionale chromatografie, unieke oplossingen en betrouwbare resultaten bieden die niet kunnen worden bereikt door 1D-chromatografie in analyse met één run. 5,32,33 Hoewel GC×GC het krachtigste hulpmiddel is dat de scheidingscapaciteit en gevoeligheid verhoogt, zijn er altijd beperkingen aan scheidingsvermogen, gevoeligheid en andere systemische capaciteiten. Naarmate deze systeemlimieten worden benaderd, wordt data-analyse steeds moeilijker. Daarom moeten onderzoek en ontwikkeling de analytische instrumenten waarover wij beschikken blijven verbeteren.
Disclosures
Prof. Stephen E. Reichenbach en Dr. Qingping Tao hebben financiële belangen in GC Image, LLC. Dr. Daniela Peroni is een medewerker van SRA Instruments, een distributeur van GC Image in Italië en Frankrijk. Dr. Federico Stilo, Prof. Chiara Cordero en Prof. Carlo Bicchi verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Het onderzoek werd ondersteund door Progetto Ager − Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare. Project acroniem Viool - Valorisatie van Italiaanse olijfproducten door middel van innovatieve analytische tools (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). GC Image-software is beschikbaar voor een gratis proefperiode voor lezers die het protocol willen demonstreren en testen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
| 2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
| Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
| Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
| Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
| GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
| Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
| Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
| Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
| Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
| Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
| MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
| n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
| n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
| Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
| α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |
References
- Tranchida, P. Q., et al. Potential of comprehensive chromatography in food analysis. Trends in Analytical Chemistry. 52, 186-205 (2013).
- Cordero, C., Kiefl, J., Reichenbach, S. E., Bicchi, C. Characterization of odorant patterns by comprehensive two-dimensional gas chromatography: A challenge in omic studies. Trends in Analytical Chemistry. 113, 364-378 (2019).
- Cordero, C., Kiefl, J., Schieberle, P., Reichenbach, S. E., Bicchi, C. Comprehensive two-dimensional gas chromatography and food sensory properties: potential and challenges. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 169-191 (2015).
- Adahchour, M., Beens, J., Vreuls, R. J. J., Brinkman, U. A. T. Recent developments in comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC × GC) - Introduction and instrumental set-up. Trends in Analytical Chemistry. 25 (5), 438-454 (2006).
- Prebihalo, S. E., et al. Multidimensional gas chromatography: Advances in instrumentation, chemometrics, and applications. Analytical Chemistry. 90 (1), 505-532 (2018).
- Cordero, C., et al. Profiling food volatiles by comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with mass spectrometry: advanced fingerprinting approaches for comparative analysis of the volatile fraction of roasted hazelnuts (Corylus Avellana L.) from different origins. Journal of Chromatography A. 1217, 5848-5858 (2010).
- Cordero, C., et al. Targeted and non-targeted approaches for complex natural sample profiling by GC×GC-QMS. Journal of Chromatography Sciences. 48 (4), 251-261 (2010).
- Maio, D., Maltoni, D. Direct gray-scale minutiae detection in fingerprints. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 19 (1), 27-40 (1997).
- Jain, A. K., Hong, L., Pankanti, S., Bolle, R. An identity-authentication system using fingerprints. Proceedings of IEEE. 85 (9), 1365-1388 (1997).
- Parsons, B. A., et al. Tile-based fisher ratio analysis of comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (GC × GC-TOFMS) data using a null distribution approach. Analytical Chemistry. 87 (7), 3812-3819 (2015).
- Pierce, K. M., Kehimkar, B., Marney, L. C., Hoggard, J. C., Synovec, R. E. Review of chemometric analysis techniques for comprehensive two dimensional separations data. Journal of Chromatography A. 1255, 3-11 (2012).
- Reichenbach, S. E., et al. Alignment for comprehensive two-dimensional gas chromatography with dual secondary columns and detectors. Analytical Chemistry. 87 (19), 10056-10063 (2015).
- Rempe, D. W., et al. Effectiveness of global, low-degree polynomial transformations for GCxGC data alignment. Analytical Chemistry. 88 (20), 10028-10035 (2016).
- Stilo, F., et al. Untargeted and targeted fingerprinting of extra virgin olive oil volatiles by comprehensive two-dimensional gas chromatography with mass spectrometry: challenges in long-term studies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (18), 5289-5302 (2019).
- Reichenbach, S. E., Carr, P. W., Stoll, D. R., Tao, Q. Smart templates for peak pattern matching with comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 1216 (16), 3458-3466 (2009).
- Reichenbach, S. E., et al. Informatics for cross-sample analysis with comprehensive two-dimensional gas chromatography and high-resolution mass spectrometry (GCxGC-HRMS). Talanta. 83 (4), 1279-1288 (2011).
- Reichenbach, S. E., Tian, X., Cordero, C., Tao, Q. Features for non-targeted cross-sample analysis with comprehensive two-dimensional chromatography. Journal of Chromatography A. 1226, 140-148 (2012).
- Latha, I., Reichenbach, S. E., Tao, Q. Comparative analysis of peak-detection techniques for comprehensive two-dimensional chromatography. Journal of Chromatography A. 1218 (38), 6792-6798 (2011).
- Reichenbach, S. E., Tao, Q., Cordero, C., Bicchi, C. A data-challenge case study of analyte detection and identification with comprehensive two-dimensional gas chromatography with mass spectrometry (GC×GC-MS). Separations. 6 (3), 38 (2019).
- Reichenbach, S. E. Chapter 4 Data Acquisition, Visualization, and Analysis. Comprehensive Analytical Chemistry. , 77-106 (2009).
- Reichenbach, S. E., Ni, M., Zhang, D., Ledford, E. B. Image background removal in comprehensive two-dimensional gas chromatography. Journal of Chromatography A. 985 (1-2), 47-56 (2003).
- Kratz, P. A Generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal of Chromatography A. 11, 463-471 (1963).
- NIST Mass Spectrometry Data Center. NIST Standard Reference Database 1A: NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library (NIST 08) and NIST Mass Spectral Search Program (Version 2.0f). National Institute of Standards and Technology (NIST). , Gaithersburg MD. (2005).
- Magagna, F., et al. Combined untargeted and targeted fingerprinting with comprehensive two-dimensional chromatography for volatiles and ripening indicators in olive oil. Analytica Chimica Acta. 936, 245-258 (2016).
- Reichenbach, S. E., et al. Benchmarking machine learning methods for comprehensive chemical fingerprinting and pattern recognition. Journal of Chromatography A. 1595, 158-167 (2019).
- Cialiè Rosso, M., et al. Adding extra-dimensions to hazelnuts primary metabolome fingerprinting by comprehensive two-dimensional gas chromatography combined with time-of-flight mass spectrometry featuring tandem ionization: insights on the aroma potential. Journal of Chromatography A. 1614 (460739), 1-11 (2020).
- Cordero, C., et al. Comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with time of flight mass spectrometry featuring tandem ionization: challenges and opportunities for accurate fingerprinting studies. Journal of Chromatography A. 1597, 132-141 (2019).
- Ni, M., Reichenbach, S. E., Visvanathan, A., TerMaat, J., Ledford, E. B. Peak pattern variations related to comprehensive two-dimensional gas chromatography acquisition. Journal of Chromatography A. 1086, 165-170 (2005).
- Reichenbach, S. E., et al. Reliable peak selection for multisample analysis with comprehensive two-dimensional chromatography. Analytical Chemistry. 85 (10), 4974-4981 (2013).
- Markes International. Select-EV: The next Generation of Ion Source Technology. Technical Note. , (2016).
- Tao, Q., Reichenbach, S. E., Heble, C., Wu, Z. New investigator tools for finding unique and common components in multiple samples with comprehensive two-dimensional chromatography. Chromatography Today. , February-March (2018).
- Seeley, J. V., Seeley, S. K. Multidimensional gas chromatography: fundamental advances and new applications. Analytical Chemistry. 85 (2), 557-578 (2013).
- Tranchida, P. Q., Aloisi, I., Giocastro, B., Mondello, L. Current state of comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry with focus on processes of ionization. Trends in Analytical Chemistry. 105, 360-366 (2018).
