Summary
Detta protokoll presenterar en metod för fingeravtryck och utforska flerdimensionella data som samlats in av omfattande tvådimensionell gaskromatografi i kombination med masspektrometri. Dedikerade mönsterigenkänningsalgoritmer (mallmatchning) tillämpas för att utforska den kemiska information som krypterats i den flyktiga fraktionen för extra jungfruolja (dvs. volatilome).
Abstract
Databehandling och utvärdering är kritiska steg för omfattande tvådimensionell gaskromatografi (GCxGC), särskilt när de är kopplade till masspektrometri. Den omfattande informationen som krypteras i data kan vara mycket värdefull men svår att komma åt effektivt. Datadensitet och komplexitet kan leda till långa utarbetandetider och kräva mödosamma, analytikerberoende procedurer. Effektiva men tillgängliga databehandlingsverktyg är därför avgörande för att möjliggöra spridning och acceptans av denna avancerade flerdimensionella teknik i laboratorier för daglig användning. Data analys protokollet som presenteras i detta arbete använder kromatografisk fingeravtryck och mall matchning för att uppnå målet om högautomatisk dekonstruktion av komplexa tvådimensionella kromatogram i enskilda kemiska funktioner för avancerad erkännande av informativa mönster inom enskilda kromatogram och över uppsättningar av kromatogram. Protokollet ger hög konsekvens och tillförlitlighet med liten intervention. Samtidigt är analytikertillsyn möjlig i en mängd olika inställningar och begränsningsfunktioner som kan anpassas för att ge flexibilitet och kapacitet att anpassa sig till olika behov och mål. Mallmatchning visas här vara ett kraftfullt tillvägagångssätt för att utforska extra jungfruolja volatilome. Korsjustering av toppar utförs inte bara för kända mål, men också för omålade föreningar, vilket avsevärt ökar karakteriseringskraften för ett brett spektrum av applikationer. Exempel presenteras för att bevisa prestandan för klassificering och jämförelse av kromatografiska mönster från provuppsättningar som analyseras under liknande förhållanden.
Introduction
Omfattande tvådimensionell gaskromatografi i kombination med tiden för flygningen massa spektrometrisk detektion (GC×GC-TOF MS) är idag den mest informativa analytiska metoden för kemisk karakterisering av komplexa prover1,2,3,4,5. I GC×GC ansluts och samverkas kolumnerna seriellt med en modulator (t.ex. ett termiskt eller ventilbaserat fokuseringsgränssnitt) som fångar upp eluterande komponenter från den första dimensionen(1D) innan de återinjektes till den andra dimensionen(2D) kolumnen. Denna operation görs inom en fast moduleringstid (PM), i allmänhet mellan 0,5-8 s. Genom termisk modulering inkluderar processen kryofångst och fokusering av elutingbandet med vissa fördelar för den totala separationskraften.
Även om GC×GC är en tvådimensionell separationsteknik, producerar processen sekventiella datavärden. Detektorn analog-till-digital (A/D) omvandlare erhåller kromatografisk signalutgång vid en viss frekvens. Sedan lagras data i specifika proprietära format som inte bara innehåller digitaliserade data utan även relaterade metadata (information om data). A/D-omvandlaren som används i GC×GC-system hjälper till att kartlägga intensiteten hos den kromatografiska signalen till ett digitalt tal (DN) som en funktion av tiden i de två analytiska dimensionerna. Enkanalsdetektorer (t.ex. flamjoniseringsdetektor (FID), elektronavskiljningsdetektor (ECD), svavel chemiluminescensdetektor (SCD), etc.) ger enstaka värden per provtagningstid, medan flerkanalsdetektorer (t.ex. masspektrometrisk detektor (MS)) ger flera värden (vanligtvis över ett spektralområde) per provtagningstid längs den analytiska körningen.
För att visualisera 2D-data börjar utarbetandet med rastrering av ett enda datavärden för moduleringsperioden (eller cykeln) som en kolumn med pixlar (bildelement som motsvarar detektorhändelser). Längs ordinaten (Y-axeln, nedifrån och upp) visualiseras 2D-separationstiden. Pixelkolumner bearbetas sekventiellt så att abscissa (X-axel, vänster till höger) rapporterar 1D separationstid. Den här ordningen presenterar 2D-datai ett högerhänt kartesiskt koordinatsystem, med 1D kvarhållningsordningen som det första indexet i matrisen.
Databehandling av 2D-kromatogram ger tillgång till en högre informationsnivå än rådata, vilket möjliggör 2D toppdetektering, toppidentifiering, extraktion av svarsdata för kvantitativ analys och jämförande analys.
Toppmönstren på 2D kan behandlas som provets unika fingeravtryck och detekteras som minutiae-funktioner för effektiv korskonparativ analys. Detta tillvägagångssätt, känt som mallbaserad fingeravtryck6,7,inspirerades av biometriska fingeravtryck6. Automatiska biometriska fingeravtrycksverifieringssystem förlitar sig i själva verket på unika fingertoppsegenskaper: åsbifurcations och ändelse, lokaliserade och extraherade från bläckade intryck eller detaljerade bilder. Dessa egenskaper, med namnet minutiae-funktioner, matchas sedan med tillgängliga lagrademallar 8,9.
Som nämnts ovan består varje GC×GC-separationsmönster av 2D-toppar rationellt fördelade över ett tvådimensionellt plan. Varje topp motsvarar en enda analyt, har sin informativa potential och kan behandlas som en enda funktion för jämförande mönsteranalys.
Här presenterar vi ett effektivt tillvägagångssätt för kemisk fingeravtryck av GC×GC-TOF MS med tandemjonisering. Målet är att helt och kvantitativt katalogisera funktioner från en uppsättning kromatogram.
Jämfört med befintlig kommersiell programvara eller interna rutiner10,11 som använder en toppfunktioner strategi, mall-baserade fingeravtryck kännetecknas av hög specificitet, effektivitet och begränsad beräkningstid. Dessutom har den en inneboende flexibilitet som möjliggör korsjustering av minutiafunktioner (dvs. 2D-toppar) mellan allvarligt felriktade kromatogram som de som förvärvats genom olika instrumentering eller i långtidsstudier12,13,14.
Den föreslagna metodens grundläggande åtgärder beskrivs kortfattat för att vägleda läsaren till en god förståelse av 2 D-mönstretskomplexitet och informationskraft. Sedan, genom att utforska instrumentets utmatningsdatamatris, utförs kemisk identifiering och kända riktade analyter som ligger över det tvådimensionella utrymmet. Mallen med riktade toppar byggs sedan och tillämpas på en serie kromatogram som förvärvats inom samma analysparti. Metadata relaterade till kvarhållningstider, spektralsignaturer och svar (absoluta och relativa) extraheras från omjusterade mönster av riktade toppar och används för att avslöja kompositionsskillnader i provuppsättningen.
Som ett ytterligare, unikt steg i processen utförs också en kombinerad obefläckad och riktad (UT) fingeravtryck på förriktade kromatogram för att utöka fingeravtryckspotentialen till både kända och okända analyter. Processen producerar en UT-mall för en verkligt omfattande jämförande analys som till stor del kan automatiseras.
Som ett sista steg utför metoden korsjustering av funktioner i två parallelldetektorsignaler som produceras med hög och låg elektronjoniseringsenergi (70 och 12 eV).
Protokollet är ganska flexibelt när det gäller att stödja analyser av ett enda kromatogram eller en uppsättning kromatogram och med variabel kromatografi och/eller flera detektorer. Här demonstreras protokollet med en kommersiellt tillgänglig GC×GC Software suite (se Table of materials)kombinerat med ett MS-bibliotek och sökprogramvara (se Materialförteckning). Några av de nödvändiga verktygen finns i annan programvara och liknande verktyg kan implementeras oberoende av beskrivningar i litteraturen av Reichenbach och medarbetare15,16,17,18,19. Rådata för demonstrationen kommer från en forskningsstudie om olja som inte är jungfruolja (EVO) och som utförts i författarnas laboratorium14. I synnerhet provtas den flyktiga fraktionen (dvs. volatilome) av italienska EVO-oljor genom mikroextraktion i huvudutrymmet (HS-SPME) och analyseras av GC×GC-TOF MS för att fånga diagnostiska fingeravtryck för kvalitet och sensorisk kvalificering av prover. Närmare uppgifter om prover, provtagningsförhållanden och analytiska uppsättningar finns i materialförteckningen.
Steg 1–6 beskriver förbearbetning av kromatogrammen. Steg 7–9 beskriver bearbetning och analys av enskilda kromatogram. Steg 10–12 beskriver mallskapande och matchning, som ligger till grund för korsprovsanalys. Steg 13–16 beskriver hur protokollet tillämpas på en uppsättning kromatogram, med steg 14–16 för UT-analys.
Protocol
1. Import av rådata
Obs: Detta skapar en tvådimensionell rastermatris för visualisering och bearbetning.
- Starta bildprogramvaran.
- Välj | Import. navigera till och välja den rådatafil som förvärvats av GC×GC-TOF MS-system med namnet "VIOLIN 101.lsc" (Kompletterande fil 1); Klicka sedan på Öppna. Kromatogrammet öppnas i den här programvaran.
OBS: Raw data filformat beror på instrumenttillverkaren. Programvaran importerar en mängd olika filformat som anges i användarhandboken. - I dialogrutan Importera anger du moduleringsperioden(PM)till 3,5 s. Klicka sedan på OK.
Vissa förvärvsprogram kanske inte registrerar moduleringsperioden. - Välj | Spara bild som; navigera till önskad mapp; ange namnet "Olja 1 RAW.gci" (kompletterande akt 2), Klicka sedan på Spara.
2. Förskjutning av moduleringsfasen
OBS: Detta placerar alla toppar i varje moduleringscykel i samma bildkolumn, inklusive topparna som omsluter slutet av moduleringsperioden till ogiltigtiden för nästa moduleringsperiod20.
- Välj | Skiftfas.
- Ange skiftbeloppet till -0,8 s i dialogrutan Skiftfas. Klicka sedan på OK.
3. Baslinjekorrigering21
- Välj Grafisk | Rita rektangel.
- Klicka och dra om du vill rita en rektangel i bilden där inga toppar identifieras.
- Välj Verktyg | Visualisera data; notera detektorsignalens medelvärde och standardavvikelse, här, 21.850 ± 1.455 SD enhetsfritt digitalt nummer (DN); stäng sedan verktyget.
- Välj | Korrigera originalplan.
4. Färga den kromatografiska bilden med hjälp av en värdekarta och färgkarta20
- Välj Visa | Färglägga.
- Välj fliken Importera/exportera i dialogrutan Färglägga. Välj den #AAAA (Kompletterande fil 3) anpassad färgkarta som tillhandahålls som kompletterande material; Klicka sedan på Importera.
- På kontrollerna Värdemappning anger du värdeintervallet till minimi- och maximivärdena. Klicka sedan på OK.
5. 2D toppar (dvs. blobbar) identifiering för analyter18
- Välj | Identifiera blobbar med standardinställningarna. observera sedan att vissa toppar är uppdelade och det finns falska upptäckter.
- Välj Konfigurera | Inställningar | Blob identifiering; Ställ sedan in Utjämning till 0,1 för den första dimensionen och 2,0 för den andra dimensionen och ställ in minsta volym (dvs. tröskelvärde för summerade värden) till 1,00 E6; Klicka sedan på OK.
- Välj | Identifiera blobbar med de nya inställningarna. observera sedan förbättringarna.
6. 2D toppar filtrering
OBS: Detta görs för att automatiskt ta bort meningslösa detekter på grund av kolonnavfalllängs 1 D och slag eller tailings längs 2D.
- Välj | Interaktiv blobidentifiering.
- Observera inställningarna för blobidentifiering. Klicka sedan på Identifiera.
- Klicka på Lägg till i den avancerade filterbyggaren. Välj sedan Kvarhållning II i dialogrutan Nytt villkor. Klicka sedan på OK.
- I skjutreglagen Begränsning anger du de lägsta och högsta kvarhållningstiderna på 2D för filtret för att minska antalet falska toppar utan att förlora verkliga toppar.
- Klicka på Använd; Klicka sedan på Ja för att spara i identifieringsinställningarna med det nya filtret.
OBS: Mer avancerade verktyg kan krävas för att hantera särskilda detekteringsproblem, såsom jontoppenektering eller dekonvolution för samutspädningar19.
7. Kalibrering av linjära retentionsindex
OBS: Utför det härsteg 22 (IT) för de specifika kvarhållningstiderna för RI-standarderna (vanligtvis n-alkaner).
- Välj Konfigurera | RI-tabell | Kvarhållningsindex (kol I).
- Klicka på Importera i dialogrutan RI-tabellkonfiguration. Välj sedan RI-kalibreringsfilen (i CSV-format med namn, retentionstid och kvarhållningsindex) med namnet "LRI table.csv" – (Kompletterande fil 4).
- Välj | Spara bild A. Navigera till önskad mapp; ange namnet "Olja 1 LRI KALIBRERAD.gci" (Kompletterande akt 5), Klicka sedan på Spara.
8. Söker efter toppspektrat i NIST17 MS-biblioteket23
- Välj Konfigurera | Inställningar | Sök i biblioteket.
- I dialogrutan Sökbibliotek ställer du in Typ av spektrum på Peak MS, Intensitetströskel till 100, NIST-söktyp till Enkel (likhet), NIST RI-kolumntyp till Standard Polar och NIST RI-tolerans till 10; Klicka sedan på OK. NIST MS Search erbjuder många andra inställningar som är inställda på standardvärdena här.
- Välj | Sök i biblioteket efter alla blobbar.
9. Granska och korrigera annalytidentifiering
- Ställ in markörläget på Blob-| Välj Blobbar.
- Högerklicka på önskad topp i bildvyn.
- Inspektera blobegenskaper i dialogrutan Blobegenskaper. Klicka sedan på Träfflista.
- Inspektera träfflistan. Om identifieringen är felaktig väljer du bocken bredvid rätt identifiering.
- I dialogrutan Blobegenskaper anger du gruppnamnet för att ange kemisk klass och andra önskade metadata. Klicka sedan på OK.
- Välj | Spara bild som; navigera till önskad mapp; ange namnet "Olja 1 FÄRGAD för mallkonstruktion.gci" (Kompletterande fil 6); Klicka sedan på Spara.
Obs: Den här filen ingår i det kompletterande arkivet, som kan öppnas för steg 10.
10. Skapa en mall med riktade toppar15
- I bildvyn (fortfarande i läget Välj blobbar från steg 9.1) väljer du önskade toppar med ett klick på den första toppen och CTRL + klicka på de ytterligare topparna.
- Klicka på knappen Lägg till i mall på verktygspaletten.
- När mallen är klar väljer du | Spara mall; ange mapp och filnamn. Klicka sedan på Spara.
- Välj | Stäng bild.
Obs: Vid denna tidpunkt fortsätter dessa instruktioner med mallen skapad för att inkludera önskade måltoppar, tillgängliga som "Riktad tamplate.bt" (Kompletterande fil 7).
11. Matcha och tillämpa mallen
OBS: Matchning känner igen mallmönstret i de identifierade topparna ett nytt kromatogram. Använda matchande uppsättningar identifieringar och andra metadata i det nya kromatogrammet från mallen.
- Välj | Öppna bild; navigera till och välja kromatogramfilen "Oil 2 COLORIZED.gci"(Kompletterande fil 8)(som är förbehandling); Klicka sedan på Öppna.
- Ställ in markörläget på Mall på verktygspaletten | Markera objekt.
- Välj Mall | Läs in mall.
- Klicka på Bläddra i dialogrutan Läs in mall. navigera till och välja den riktade toppmallen "Riktad template.bt" ( Kompletterandefil 7); Klicka sedan på Öppna.
- Klicka på Läs in i dialogrutan Läs inmall och sedan på Ignorera.
- Högerklicka på en malltopp i bildvyn. kontrollera sedan dess objektegenskaper, inklusive qCLIC och referens MS.
- Välj Mall | Interaktiv matchnings- och transformeringsmall.
- Klicka på Matcha alla i gränssnittet Interaktiv matchning. Granska sedan matchningsresultaten både i tabellen och i bilden, där varje malltopp är markerad med ofyllda cirklar och om en matchning görs finns det en länk till en fylld cirkel för den identifierade toppen.
- Redigera matchningarna efter önskemål. När du är nöjd klickar du på Använd för att överföra metadata från mallen till kromatogrammet.
Matchande begränsningar, till exempel qCLIC, hjälper till att matcha rätt mönster bland de identifierade topparna i det nya kromatogrammet. Villkorsparametrar inkluderar den typ av MS-signatur som används som mallreferens(topp MS eller blob MS)och tröskelvärdena för spektral likhet (Direct Match Factor (DMF) och Reverse Match Factor (RMF)). Här ställs parametrar in baserat på tidigare studier13,14 för att begränsa falska negativa matchningar: topp MS och DMF och RMF likhetströskel 700.
12. Omvandla mallen för väsentligt annorlunda kromatografi
OBS: Det här steget är inte nödvändigt om inte kromatografiska förhållanden varierar avsevärt, vilket gör att mallen är feljusterad med ett nytt kromatogram, till exempel kan vara fallet över långsiktiga studier eller efter att en ny kolumn har installerats. I sådana fall kan mallen geometriskt omvandlas i det kromatografiska retentionstidsplanet för att bättre passa det nya kromatogrammet12,13. I det här exemplet är mallens och kromatogrammets toppmönster likartade, men skiljer sig åt i geometrin för retentionstider, till exempel för olika kromatografiska förhållanden.
- Upprepa steg 11.2–11.5, förutom att navigera till, markera och läsa in målmallen 2.bt (Kompletterande fil 9).
- Välj Mall | Mall för interaktiv matchning; Klicka sedan på Redigera omformning.
- I gränssnittet Transform template varierar du skalor,översättningar och salar på 1D och 2 D för att bättre anpassa mallen till de identifierade topparna. Klicka sedan på Omforma mall.
- Klicka på Redigera matchning med den transformerade mallen. upprepa sedan steg 11,8–11,9.
13. Utför kombinerad obelamatiserad och riktad analys över en uppsättning kromatogram
OBS: En kombinerad mall för ej målinriktad och riktad (UT), även kallad funktionsmall 24,25, när den matchas med var och en av en uppsättning kromatogram, upprättar korrespondens mellan obefläckade och riktade analyter, då extraheras konsekventa korsprovsfunktioner för mönsterigenkänning.
- Utför förbehandling (steg 1–6) och MATCHNING AV UT-mall (steg 11.1–11.9) för alla kromatogram i uppsättningen (dvs. 2D kromatogram av oljor). Alternativt kan du automatisera det här steget med projektprogramvara eller liknande programvara, som inte beskrivs här.
- Starta investigator-programvaran.
- Välj | Öppen analys; välj sedan och öppna "Feature Jove su 70 eV.gca" (Kompletterande fil 10).
- Klicka på OK för att öppna och undersöka resultaten.
- Klicka på fliken Föreningar för att granska måttvärden och statistik för specifika analyter (dvs. riktade analyter med associerade kemiska namn) eller oriktiga analyter med (#) identifierare justerade över alla kromatogram och utför sedan stegen nedan.
- Klicka på fliken Attribut för att granska värden och statistik för specifika mått i kromatogram.
- Klicka på fliken Sammanfattning för att granska sammanfattningsstatistiken för både föreningar och funktioner. Om kromatogrammen kommer från olika klasser, som i detta fall oljor som framställts av oliver som skördats i två olika regioner i Italien, listar fliken Sammanfattning fisher ratio statistics (F och FDR), som ger insikter om egenskaper för diskriminering mellan klasser.
- Visa olika diagram på alla flikar och, om så önskas, utföra PCA (Principal Component Analysis) på fliken Attribut.
14. Ändra UT-mallen för parallell MS-analys
OBS: Analysen utfördes med både 70 eV och 12 eV (dvs. hög och låg) elektronjoniseringsenergier26,27.
- Öppna ett av de 12 eV relaxed.bt-kromatogrammen, t.ex. Filer tillhandahålls som kompletterande material.
- Justera vid behov mallen så att den passar de detekterade 12 eV-topparna enligt beskrivningen i steg 12. Här finns det ingen betydande feljustering eftersom tandemsignalerna multiplexeras. Det bör dock noteras att eftersom de olika joniseringsinställningarna ger olika fragmenteringar är det nödvändigt att lätta på begränsningarna för qCLIC-begränsningarna för DMF- och RMF-spektrallikhet (visas inte här).
- Välj | Spara mall; Ange mappen och filnamnet,t.ex12.bt. Klicka sedan på Spara.
15. Utför kombinerad obelamatiserad och riktad analys över 12 eV-kromatogram
- Välj | Öppen analys; välj och öppna sedan "Feature Jove su 12 eV.gca" - Kompletterande fil 14 fil tillhandahålls.
- Klicka på OK för att öppna och undersöka resultat.
- Klicka på fliken Föreningar för att granska metriska värden, se 12 eV-svar och statistik för specifika analyter (dvs. riktade analyter med associerade kemiska namn) eller oriktiga analyter med (#) identifierare justerade över alla kromatogram och utför sedan stegen nedan.
- Klicka på fliken Attribut för att granska värden och statistik för specifika mått i kromatogram.
- Klicka på fliken Sammanfattning för att granska sammanfattningsstatistiken för både föreningar och funktioner vid 12 eV. Om kromatogrammen kommer från olika klasser, som i detta fall oljor som framställts av oliver som skördats i två olika regioner i Italien, listar fliken Sammanfattning fisher ratio statistics (F och FDR), som ger insikter om egenskaper för diskriminering mellan klasser.
- Visa de olika diagram som är tillgängliga på alla flikar och, om så önskas, utföra huvudkomponentanalys (PCA) på fliken Attribut.
Representative Results
GC×GC-TOF MS-mönster av högkvalitativ extra jungfruolja volatilome uppvisar cirka 500 2D toppar över en signal-till-brus-tröskel (SNR) på 100. Ett sådant tröskelvärde definierades genom tidigare undersökningar av flyktiga livsmedelsprodukter14,27 somden minsta relativa signalen över tröskelvärdet för att erhålla tillförlitliga spektra för jämförande analys. Komponenterna fördelas över det kromatografiska utrymmet beroende på deras relativa retention i de två kromatografiska dimensionerna, och särskilt baserat på deras volatilitet/polaritet i 1D och volatilitet i 2D. Här är kolumnkombinationen polar × halvpolär (dvs Carbowax 20M × OV1701).
2D-mönstret visar en hög grad av ordning. Relativa retentionsmönster för homologa serier och klasser visas i figur 1A med anteckningar (grafik för grupper och bubblor för toppar) för linjära mättade kolväten (svarta), omättade kolväten (gula). linjära mättade aldehyder (blå), enkelomättade aldehyder (röda), fleromättade aldehyder (lax), primäralkoholer (gröna) och kortkedjiga fettsyror (cyano).
Detekterade 2D-toppar kan sedan identifieras genom att jämföra det genomsnittliga MS-spektrumet som extraherats från hela 2D-toppen (blobspektrum) eller från det största spektrumet(apexspektrum). Bild 2 illustrerar utdata från apex-spektrumsökningen efter blob 5 och returnerar en matchning med hög likhet (de första 10 träffarna) för (E)-2-hexenal. Databaser som utforskas är de som valts ut av analytikern i steg 8 av metoden.
Identifieringen valideras genom aktiv retentionsindexering. Det experimentella IT-värdet beräknades för 2D-topparna, så att bibliotekssökningen i detta skede prioriterar resultat med sammanhängande värden för tabellerade IT. Toleransfönster kan anpassas baserat på analytikererfarenhet, tillförlitligheten hos referensdatabasvärden enligt stationär fas och analytiska villkor som tillämpas. Nya verktyg för smart kalibrering av linjära retentionsindex utan experimentell kalibrering med n-alkaner, har nyligen utvecklats och diskuterats i en studie av Reichenbach et al19.
Insamlingen av identifierade 2D-toppar (dvs. riktade toppar) kan antas för att bygga en mall med riktade toppar för att snabbt upprätta tillförlitliga korrespondenser mellan samma förening över alla exempelkromatogram. Samlingen av riktade malltoppar visualiseras i figur 1B. Röda cirklar motsvarar de 196 riktade föreningarna, inklusive två interna standarder (IS) kopplade till malltoppar med anslutningslinjer. IS används för svarsnormalisering och anslutningslinjer hjälper till att visualisera vilken av de inkluderade IS som ska antas för att normalisera varje 2D-topp/blob-svar.
I figur 1B angerfyllda cirklar positiva matchningar mellan malltoppen och det faktiska mönstret medan tomma cirklar är för malltoppar för vilka korrespondensen inte verifierades. Falska negativa matchningar kan begränsas genom lämpligt urval av tröskelvärdesparametrar, referensspektra ochbegränsningsfunktioner 13,14,18,19. För komplexa mönster med flera samemittioner är jontoppdetekteringsfunktioner som baseras på spektraldekonvolution tillrådliga och kan vara ett giltigt alternativ19. Metadata för malltoppar visas på den förstorade panelen i figur 1B för ( E)-2-hexenal.
Mallmatchningens specificitet bygger på möjligheten att tillämpa begränsningsfunktioner som begränsar positiv korrespondens till de kandidattoppar som, inom algoritmens sökfönster, har MS-spektral likhet över ett visst tröskelvärde. I det här fallet, i steg 11, fastställdes likhetströsklarna23 till 700 enligt tidigare experiment som syftade till att definiera optimala parametrar som begränsar falska negativamatchningar 14. Markerade områden i malltoppens egenskaper i figur 1B visar informationen om referenssträngen MS spectrum och funktionen qCLIC constraint (dvs. (Match("
Genom att tillämpa mallen på alla kromatogram i en uppsättning kan man stöta på utmanande situationer som vid partiell feljustering av mönster. Detta kan bero på inkonsekvenser i ugnstemperaturen, transportgasflöde/tryckinstabiliteter eller på grund av en manuell intervention på systemet som vid kolonnersättning eller byte av modulatorslinga14,28. Figur 3 visar en situation med en partiell feljustering mellan den riktade mallen och det faktiska kromatogrammet. För minimala feljusteringar kan interaktiva malltransformeringar(bild 3, kontrollpanelen) flytta malltoppar för en bättre passform. När mallen har flyttats kan den matchas för att upprätta korrespondens. I exemplet toppar mallen(bild 3, steg 12) korrekt med det faktiska 2 D-mönstret. Vid allvarliga feljusteringar, som inte diskuteras här, kan upprepningen av match-transform-update-åtgärder iterativt anpassa malltopparna till det faktiskatoppmönstret 12,13,14.
Här ger de riktade topparna (dvs. kända analyter) cirka 40% av det kromatografiska resultatet (196 riktade toppar på cirka 500 detekterbara toppar i genomsnitt). De andra 60 procenten av föreningarna, tillsammans med den information de för med sig, beaktas inte i den riktade analysen. För att göra undersökningen verkligt omfattande bör man också upprätta en konsekvent korsjustering av oriktade 2D-toppar. Den första ansökan där mallmatchning utvidgades till alla detekterbara analyter handlade om den komplexa volatilome av rostat kaffe7. Denna process automatiseras med en programvara (t.ex. Investigator), som visas här i steg 14–15.
I denna process används förriktade bilder som tillhör det prov som anges under studie (20 prover) för att definiera tillförlitliga toppar genom korsmatchning av alla bildmönster29. Därefter byggs ett sammansatt kromatogram från vilket man kan identifiera UT-tillförlitliga toppar och toppregioner (dvs. 2D toppar fotavtryck) i den så kallade funktionsmallen17.
För analyser som förvärvats vid 70 eV bestämde processen 144 tillförlitliga toppar med avslappnadtillförlitlighet 29, varav 76 tillhör den riktade topplistan. Baserat på dessa 144 tillförlitliga toppar justerar processen alla kromatogram konsekvent med de genomsnittliga retentionstiderna för de tillförlitliga topparna och kombinerar dem sedan för att skapa ett sammansatt kromatogram. Figur 4 visar en lista över alla prover märkta enligt oljans produktionsregion (vänster) och listan över tillförlitliga toppar/blobvolymer i varje prov (höger).
Den obefläckade funktionsmallen består av 2D-toppar från analyter som detekteras i det sammansatta kromatogrammet, som visas i figur 5A, som matchas av mallen reliable-peaks (n = 168 – röda cirklar för riktade toppar och gröna cirklar för oriktade toppar). Masspektrat för de sammansatta topparna, liksom deras retentionstider, registreras i funktionsmallen som visas för (Z)-3-hexenolacetat i det utvidgade området. Toppregioner visas i figur 5B som rödfärgad grafik. De definieras i stället av konturerna för alla 2D-toppar som detekteras i det sammansatta kromatogrammet (n = 3578).
När oövervakad mönsterigenkänning genom huvudkomponentanalys tillämpas på riktad toppfördelning inom de 20 analyserade proverna, kluster av sicilianska och toskanska oljor separat vilket tyder på att pedoklimatiska förhållanden och terroir påverkar den relativa prevalensen av flyktiga ämnen. Resultaten visas i figur 6A och PCA-resultaten från den tillförlitliga toppfördelningen visas i figur 6B. De två metoderna kors validerar att oljor från olika geografiska områden har olika, medan sammanhängande kemiska signaturer, oavsett om de är riktade eller oriktiga föreningar, eller båda, kartläggs.
Slutligen möjliggör programvaran snabb och effektiv omjustering av mönster över parallella detekteringskanaler. I den här applikationen föreslås omjusteringen för tandemjoniseringssignaler. Jonkällan för MS multiplexer mellan två joniseringsenergier (dvs. 70 och 12 eV) med en förvärvsfrekvens på 50 Hz per kanal30. De två resulterande kromatografiska mönstren är nära anpassade medan spektraldata (dvs. spektralsignaturer och svar) ger kompletterande information med olika dynamiska insatsområde26,27. De justerade mönstren gör det möjligt attextrahera funktioner (2D-toppar och toppregioner) med univocal ID (dvs. kemiska namn för riktade toppar och unik numrering # för oriktiga toppar och toppregioner).
Mallmatchning möjliggör effektiv korsjustering. I den här situationen finns det inte mycket feljustering, men MS-begränsningar måste mjukas upp för att tillåta matchningar för UT-toppar. Å andra sidan matchas ut-toppregioner, som inte har några MS-begränsningar, snabbt utan några falska negativa matchningar. Figur 5C visar ett förstorat område med ett kromatogram på 12 eV där funktionsmallen byggd av 70 eV-data matchas. Tillförlitliga UT-toppar matchas positivt på grund av de sänkta qCLIC-begränsningarna (t.ex. DMF-tröskelvärdet vid 600). För att notera, vid 12 eV, finns det färre upptäckta toppar på grund av den begränsade fragmenteringen inducerad av låg joniseringsenergi.
Figur 1: Tvådimensionell konturdiagram och målmall. A)Konturdiagram över den flyktiga fraktionen av en extra jungfruolja från Toscana. Beställda mönster av homologserier och klasser markeras med olika färger och linjer: linjära mättade kolväten (svarta linjer och 2D-konturer) omättade kolväten (gula), linjära mättade aldehyder (blå) enkelomättade aldehyder (röda), fleromättade aldehyder (lax), primäralkoholer (gröna) och kortkedjiga fettsyror (cyano). (B) Överimposerad målmall med kända analyter (rödfärgade cirklar) med anslutningslinjer som länkar samman interna standarder (ISs). Panelerna visar metadata för 2D-topp-/blobegenskaper (Decanal) eller Malltoppen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Apex MS-sökning. Utdata från apex MS-sökningen efter blob 5. Lista över databasposter med den högsta likhetsmatchningen och relaterade metadata som finns tillgängliga från biblioteket. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Omjustering av mall. Arbetsflöde som illustrerar de steg som möjliggör omjustering av mallen genom omvandling. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: GC Investigator-gränssnittet. Undersökningspanelen med alla valda bilder märkta enligt oljans produktionsregion (vänster) och listan över tillförlitliga toppar/blobvolymer i varje prov (höger). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: Mål- och UT-mall. a)Tillförlitliga toppar till följd av den automatiska bearbetningen i steg 11. röda cirklar motsvarar kända analyter medan gröna cirklar är okända. På den överliggande panelen visas mallobjektegenskaper för (Z)-3-hexenal. (B) Utvidgat område som visar UT-topparna (röda och gröna cirklar) och toppregioner (röd grafik) i UT-mallen som matchas på en provolja som förvärvats med 70 eV joniseringsenergi. C)UT-mallen matchad på en provolja som förvärvats med 12 eV joniseringsenergi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: PCA-lastningsdiagram. De visar den naturliga konformationen av prover (oljor från Toscana och Sicilien) som de resulterar i (A) riktad toppfördelning eller (B) UT toppar distribution. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner dessa filer.
Discussion
Visualisering av GC×GC-TOF MS-data är ett grundläggande steg för en lämplig förståelse av de resultat som uppnås genom omfattande tvådimensionella separationer. Bilddiagram med anpassad färgläggning gör det möjligt för analytiker att uppskatta detektorresponsskillnader och därmed differentierad fördelning av provkomponenter. Detta visuella tillvägagångssätt förändrar helt analytikernas perspektiv på tolkning och utarbetande av kromatogram. Detta första steg, som en gång förstods och självsäkert användes av kromatografer, öppnar ett nytt perspektiv vid vidare bearbetning.
En annan grundläggande aspekt av databehandlingen är tillgängligheten till den fullständiga datamatrisen (dvs. MS-spektraldata och svar) för alla exempelpunkter, som var och en motsvarar en enda detektorhändelse. I detta avseende toppar 2D integrationen, så att insamlingen av detektorhändelser som motsvarar en enda analyt utgör ett kritiskt steg. I det nuvarande protokollet baseras 2D-toppar på vattendelaralgoritmen18 med vissa anpassningar inkluderade för att förbättra detektionskänsligheten vid partiella samutspädande föreningar. För att göra denna process mer specifik måste decentralisering ske och mer sofistikerade förfaranden antas. Detta är möjligt genom att utföra en jon topp identifiering för MS-data; algoritmen bearbetar datamatrisen och isolerar svaret från enstaka analyter baserat på spektralprofilerna19,31.
Ett viktigt men kritiskt steg i protokollet, och av alla GC×GC-MS-datatolkningsprocess, avser analytesidentifiering. Detta förfarande, som föreslås i steg 8 och 9, i avsaknad av en bekräftande analys med autentiska standarder, måste genomföras noggrant av analytikern. Automatiserade åtgärder är tillgängliga i alla kommersiella program; De omfattar en bedömning av medlemsstaternas spektralsignatur mot det insamlade referensspektrat (dvs. spektralbibliotek) och utvärdering av karakteristiska förhållanden mellan kvalificerings-/kvantifierarejoner. Ytterligare bekräftande kriterier behövs dock för att dölja identifieringen av isomerer. I protokollet föreslås antagandet av linjära bevarandeindex för att prioritera listan över kandidater. Gränsen här gäller tillgången till lagringsdata och dess enhetlighet.
Den viktigaste egenskapen som gör detta tillvägagångssätt unikt ärmallmatchning 12,13,15,29. Mallmatchning möjliggör 2D-mönsterigenkänning på ett mycket effektivt, specifikt och intuitivt sätt. Det kan ställas in, när det gäller känslighet och specificitet, genom att tillämpa anpassade tröskelvärden och/eller begränsningsfunktioner medan analytikern kan övervaka proceduren genom att aktivt interagera med transformeringsfunktionsparametrar. Denna processs särdrag bygger på möjligheten att korsjustera riktad och oriktad toppinformation mellan prover av ett enhetligt parti men också mellan prover som förvärvats med samma nominella förhållanden trots medelhög till allvarlig feljustering. Fördelarna med denna operation gäller möjligheten att bevara alla riktade analyteridentifieringar, vilket är en tidskrävande uppgift för analytikern, och alla metadata som sparats för riktade och oberiktade toppar från tidigare utarbetande sessioner.
Mallmatchning är också mycket effektivt när det gäller beräkningstid; MS-datafiler med låg upplösning består av cirka 1–2 Gb packade data medan högupplösta MS-analyser kan nå 10–15 Gb per enskild analyskörning. Mallmatchning bearbetar inte den fullständiga datamatrisen varje gång, men utför först justering av kvarhållningstid mellan kromatogram med malltoppar då, bearbetar kandidattoppar i sökfönstret för deras likhetsmatchning med referens i mallen. Vid allvarlig feljustering, den mest utmanande situationen, presterade globala andra ordningens polynomtransformer bättre än lokala metoder samtidigt som beräkningstiden13 minskade.
För att GC×GC-tekniken ska spridas brett utanför den akademiska världen och forskningslaboratorier måste databehandlingsverktyg underlätta grundläggande åtgärder för visualisering och kromatograminspektion. Identifiering av analyter bör ge möjlighet att anta standardiserade algoritmer och förfaranden (t.ex. NIST-sökalgoritm och IT-kalibrering). och jämförande analys bör vara intuitiv, effektiv och stödjas av interaktiva verktyg. Den föreslagna metoden tillgodoser dessa behov samtidigt som den erbjuder avancerade alternativ och verktyg för att hantera komplexa situationer som analyter sam-eluering, flera analyter kalibrering, grupp typ analys och parallell identifiering justering.
Den refererade litteraturen täcker väl många möjliga scenarier där GC×GC och, mer allmänt, omfattande tvådimensionell kromatografi, erbjuder unika lösningar och tillförlitliga resultat som inte kan uppnås genom 1D-kromatografi i enkörningsanalys. 5,32,33 Även om GC×GC är det mest kraftfulla verktyget som ökar separationskapaciteten och känsligheten, finns det alltid begränsningar för separationskraft, känslighet och annan systemisk kapacitet. När dessa systemgränser närmar sig blir dataanalysen allt svårare. Därför måste forskning och utveckling fortsätta att förbättra de analysverktyg som står till vårt förfogande.
Disclosures
Prof. Stephen E. Reichenbach och Dr. Qingping Tao har ekonomiska intressen i GC Image, LLC. Dr. Daniela Peroni är anställd på SRA Instruments, distributör av GC Image i Italien och Frankrike. Dr Federico Stilo, professor Chiara Cordero och professor Carlo Bicchi förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Forskningen stöddes av Progetto Ager − Fondazioni i rete per la ricerca agroalimentare. Projekt akronym Violin - Valorisering av italienska olivprodukter genom innovativa analysverktyg (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). GC Image-programvara är tillgänglig för en gratis provperiod för läsare som vill demonstrera och testa protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
| 2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
| Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
| Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
| Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
| GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
| Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
| Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
| Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
| Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
| Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
| MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
| n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
| n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
| Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
| α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |
References
- Tranchida, P. Q., et al. Potential of comprehensive chromatography in food analysis. Trends in Analytical Chemistry. 52, 186-205 (2013).
- Cordero, C., Kiefl, J., Reichenbach, S. E., Bicchi, C. Characterization of odorant patterns by comprehensive two-dimensional gas chromatography: A challenge in omic studies. Trends in Analytical Chemistry. 113, 364-378 (2019).
- Cordero, C., Kiefl, J., Schieberle, P., Reichenbach, S. E., Bicchi, C. Comprehensive two-dimensional gas chromatography and food sensory properties: potential and challenges. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 169-191 (2015).
- Adahchour, M., Beens, J., Vreuls, R. J. J., Brinkman, U. A. T. Recent developments in comprehensive two-dimensional gas chromatography (GC × GC) - Introduction and instrumental set-up. Trends in Analytical Chemistry. 25 (5), 438-454 (2006).
- Prebihalo, S. E., et al. Multidimensional gas chromatography: Advances in instrumentation, chemometrics, and applications. Analytical Chemistry. 90 (1), 505-532 (2018).
- Cordero, C., et al. Profiling food volatiles by comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with mass spectrometry: advanced fingerprinting approaches for comparative analysis of the volatile fraction of roasted hazelnuts (Corylus Avellana L.) from different origins. Journal of Chromatography A. 1217, 5848-5858 (2010).
- Cordero, C., et al. Targeted and non-targeted approaches for complex natural sample profiling by GC×GC-QMS. Journal of Chromatography Sciences. 48 (4), 251-261 (2010).
- Maio, D., Maltoni, D. Direct gray-scale minutiae detection in fingerprints. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 19 (1), 27-40 (1997).
- Jain, A. K., Hong, L., Pankanti, S., Bolle, R. An identity-authentication system using fingerprints. Proceedings of IEEE. 85 (9), 1365-1388 (1997).
- Parsons, B. A., et al. Tile-based fisher ratio analysis of comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry (GC × GC-TOFMS) data using a null distribution approach. Analytical Chemistry. 87 (7), 3812-3819 (2015).
- Pierce, K. M., Kehimkar, B., Marney, L. C., Hoggard, J. C., Synovec, R. E. Review of chemometric analysis techniques for comprehensive two dimensional separations data. Journal of Chromatography A. 1255, 3-11 (2012).
- Reichenbach, S. E., et al. Alignment for comprehensive two-dimensional gas chromatography with dual secondary columns and detectors. Analytical Chemistry. 87 (19), 10056-10063 (2015).
- Rempe, D. W., et al. Effectiveness of global, low-degree polynomial transformations for GCxGC data alignment. Analytical Chemistry. 88 (20), 10028-10035 (2016).
- Stilo, F., et al. Untargeted and targeted fingerprinting of extra virgin olive oil volatiles by comprehensive two-dimensional gas chromatography with mass spectrometry: challenges in long-term studies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (18), 5289-5302 (2019).
- Reichenbach, S. E., Carr, P. W., Stoll, D. R., Tao, Q. Smart templates for peak pattern matching with comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 1216 (16), 3458-3466 (2009).
- Reichenbach, S. E., et al. Informatics for cross-sample analysis with comprehensive two-dimensional gas chromatography and high-resolution mass spectrometry (GCxGC-HRMS). Talanta. 83 (4), 1279-1288 (2011).
- Reichenbach, S. E., Tian, X., Cordero, C., Tao, Q. Features for non-targeted cross-sample analysis with comprehensive two-dimensional chromatography. Journal of Chromatography A. 1226, 140-148 (2012).
- Latha, I., Reichenbach, S. E., Tao, Q. Comparative analysis of peak-detection techniques for comprehensive two-dimensional chromatography. Journal of Chromatography A. 1218 (38), 6792-6798 (2011).
- Reichenbach, S. E., Tao, Q., Cordero, C., Bicchi, C. A data-challenge case study of analyte detection and identification with comprehensive two-dimensional gas chromatography with mass spectrometry (GC×GC-MS). Separations. 6 (3), 38 (2019).
- Reichenbach, S. E. Chapter 4 Data Acquisition, Visualization, and Analysis. Comprehensive Analytical Chemistry. , 77-106 (2009).
- Reichenbach, S. E., Ni, M., Zhang, D., Ledford, E. B. Image background removal in comprehensive two-dimensional gas chromatography. Journal of Chromatography A. 985 (1-2), 47-56 (2003).
- Kratz, P. A Generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal of Chromatography A. 11, 463-471 (1963).
- NIST Mass Spectrometry Data Center. NIST Standard Reference Database 1A: NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library (NIST 08) and NIST Mass Spectral Search Program (Version 2.0f). National Institute of Standards and Technology (NIST). , Gaithersburg MD. (2005).
- Magagna, F., et al. Combined untargeted and targeted fingerprinting with comprehensive two-dimensional chromatography for volatiles and ripening indicators in olive oil. Analytica Chimica Acta. 936, 245-258 (2016).
- Reichenbach, S. E., et al. Benchmarking machine learning methods for comprehensive chemical fingerprinting and pattern recognition. Journal of Chromatography A. 1595, 158-167 (2019).
- Cialiè Rosso, M., et al. Adding extra-dimensions to hazelnuts primary metabolome fingerprinting by comprehensive two-dimensional gas chromatography combined with time-of-flight mass spectrometry featuring tandem ionization: insights on the aroma potential. Journal of Chromatography A. 1614 (460739), 1-11 (2020).
- Cordero, C., et al. Comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled with time of flight mass spectrometry featuring tandem ionization: challenges and opportunities for accurate fingerprinting studies. Journal of Chromatography A. 1597, 132-141 (2019).
- Ni, M., Reichenbach, S. E., Visvanathan, A., TerMaat, J., Ledford, E. B. Peak pattern variations related to comprehensive two-dimensional gas chromatography acquisition. Journal of Chromatography A. 1086, 165-170 (2005).
- Reichenbach, S. E., et al. Reliable peak selection for multisample analysis with comprehensive two-dimensional chromatography. Analytical Chemistry. 85 (10), 4974-4981 (2013).
- Markes International. Select-EV: The next Generation of Ion Source Technology. Technical Note. , (2016).
- Tao, Q., Reichenbach, S. E., Heble, C., Wu, Z. New investigator tools for finding unique and common components in multiple samples with comprehensive two-dimensional chromatography. Chromatography Today. , February-March (2018).
- Seeley, J. V., Seeley, S. K. Multidimensional gas chromatography: fundamental advances and new applications. Analytical Chemistry. 85 (2), 557-578 (2013).
- Tranchida, P. Q., Aloisi, I., Giocastro, B., Mondello, L. Current state of comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry with focus on processes of ionization. Trends in Analytical Chemistry. 105, 360-366 (2018).
