Summary
Les modèles animaux pour la pancréatite aiguë sévère permettent l’étude des changements physiopathologiques au stade initial, facilitant l’observation de l’évolution des événements inflammatoires. Nous fournissons ici un protocole pour l’induction de la pancréatite biliaire aiguë sévère par perfusion rétrograde de taurocholate de sodium dans le canal pancréatique de souris C57BL/6 anesthésiées.
Abstract
L’induction de la pancréatite aiguë biliaire par perfusion de taurocholate de sodium a été largement utilisée par la communauté scientifique en raison de la représentation de l’état clinique humain et de la reproduction des événements inflammatoires correspondant à l’apparition de la pancréatite biliaire clinique. La gravité des lésions pancréatiques peut être évaluée en mesurant la concentration, la vitesse et le volume de l’acide biliaire infusé. Cette étude fournit une liste de contrôle mise à jour des matériaux et des méthodes utilisés dans la reproduction du protocole et montre les principaux résultats de ce modèle de pancréatite aiguë (PA). La plupart des publications précédentes se sont limitées à reproduire ce modèle chez le rat. Nous avons appliqué cette méthode chez la souris, ce qui offre des avantages supplémentaires (c’est-à-dire la disponibilité d’un arsenal de réactifs et d’anticorps pour ces animaux ainsi que la possibilité de travailler avec des souches de souris génétiquement modifiées) qui peuvent être pertinents pour l’étude. Pour l’induction de la pancréatite aiguë chez la souris, nous présentons un protocole systématique, avec une dose définie de taurocholate de sodium à 2,5% à une vitesse de perfusion de 10 μL / min pendant 3 min chez les souris C57BL / 6 qui atteint son niveau maximal de gravité dans les 12 heures suivant l’induction et mettons en évidence les résultats avec des résultats qui valident la méthode. Avec la pratique et la technique, le temps total estimé, de l’induction de l’anesthésie à la fin de la perfusion, est de 25 min par animal.
Introduction
Chez l’homme, la présence de calculs biliaires est la cause la plus fréquente de pancréatite due à l’obstruction de la partie terminale du cholédochal, interrompant le flux des sécrétions pancréatiques et provoquant un processus inflammatoire intense dans le pancréas, avec une augmentation de la concentration d’enzymes digestives dans le sérum et les médiateurs inflammatoires1,2.
Deux théories différentes ont été proposées pour expliquer le développement de la pancréatite aiguë (PA). La théorie du « canal commun » suggère que les calculs présents dans la vésicule biliaire obstruent le système des voies biliaires communes distales, permettant à la sécrétion biliaire de s’écouler rétrograde dans le canal pancréatique. La deuxième théorie (la théorie de « l’obstruction des canaux ») suggère que l’obstruction du canal pancréatique par un excès de calculs biliaires provoque un blocage de l’écoulement de la sécrétion pancréatique vers le duodénum, provoquant une hypertension canalaire3. Bien que les mécanismes qui conduisent à la pancréatite biliaire aiguë ne soient pas entièrement compris, le résultat est un processus inflammatoire intense. L’éruption des enzymes digestives et l’auto-digestion du pancréas entraînent des changements histopathologiques, une augmentation des cytokines inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α) dans le liquide ascitique et le sérum, et une augmentation des protéines de phase aiguë4,5,6.
La pancréatite aiguë sévère est une affection qui mérite une attention clinique en raison de l’implication de plusieurs organes et d’un risque de mortalité élevé. Les modèles animaux pour la reproduction de la pancréatite aiguë (PA) sont importants car ils expliquent les mécanismes physiopathologiques de la maladie et aident à surveiller l’évolution des événements inflammatoires, à partir des stades initiaux de la maladie. Cela n’est généralement pas possible dans les cliniques2,7. En outre, l’accès aux tissus pancréatiques est facile dans les études précliniques, favorisant l’élucidation des changements liés aux conditions cliniques8 ainsi que la possibilité de travailler avec des espèces isogéniques, éliminant les variables indésirables et reflétant la similitude clinique avec les résultats observés dans la condition humaine9.
Les modèles biliaires et non biliaires pour l’induction de la pancréatite aiguë chez les espèces de rats et de souris ont été fréquemment étudiés dans la littérature scientifique. Les méthodes non biliaires d’induction comprennent l’administration de doses supramaximales stimulantes du sécrétagogue de la cholécystokinine ou de son analogue cérulérine10; administration de doses presque létales de L-arginine; ou l’administration d’un régime alimentaire déficient en choline complété par de l’éthionine11. Bien que ces méthodes soient faciles à reproduire et entraînent une inflammation pancréatique, elles ne répliquent pas les mécanismes qui, en théorie, déclenchent l’AP (c’est-à-dire le reflux de la sécrétion biliaire dans le canal pancréatique). La technique qui aborde le modèle biliaire est basée sur l’infusion rétrograde d’acides biliaires dans le canal pancréatique et nécessite des chercheurs bien formés pour réaliser ce protocole. Plusieurs études ont été publiées utilisant cette méthode chez le rat (apparemment pour des raisons techniques puisque ces expériences impliquent des interventions chirurgicales)12,13. Cependant, l’approche chez la souris peut offrir des résultats plus intéressants dans l’étude de l’inflammation3,14,15. Dans cette étude, nous montrerons une liste de contrôle des étapes à suivre pour la reproduction de la pancréatite aiguë sévère par perfusion de taurocholate de sodium chez des souris anesthésiées en C57BL/6.
Pour les travaux qui impliquent la nécessité d’expériences avec des anticorps et l’analyse de l’expression des gènes et des protéines, l’utilisation de souris est préférable en raison de l’arsenal plus important de matériaux pour ces animaux et de la possibilité de travailler avec des espèces isogéniques et knock-out, entre autres qui peuvent être utilisées en rapport avec des études16. Souris C57BL/6 est une souche consanguine de souris développée à l’origine pour l’étude de l’activité antitumorale et de l’immunologie. Cette souche est de plus en plus préférée par les chercheurs pour être isogénique, ce qui permet une plus grande reproductibilité des résultats, ce qui peut impliquer l’utilisation d’un plus petit nombre d’animaux dans une expérience et moins de variabilité des résultats entre le même groupe17,18.
Perides et coll. (2010)14 ont publié un protocole pour l’induction de l’AP chez la souris par perfusion de taurocholate de sodium. Ici, nous mettons à jour ce modèle en utilisant une concentration plus élevée de taurocholate de sodium (2,5%) chez les souris C57BL / 6, avec un volume et une vitesse de perfusion définis (Figure 1). Le niveau maximal de gravité est atteint dans les 12 heures suivant l’induction chez la souris. L’élévation de la concentration d’IL-6 à la fois dans le sérum et dans la cavité péritonéale est corrélée à la progression de l’AP. Avec la pratique, le temps total estimé entre l’induction de l’anesthésie et la fin de la perfusion est de 25 min par animal. Il est essentiel qu’un chercheur qualifié mène cette expérience. Pour vous assurer que la solution est correctement injectée dans le canal biliaire commun, effectuez plusieurs séances de formation pilote en utilisant du bleu de méthylène au lieu du taurocholate de sodium.
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Protocol
Ce protocole a été approuvé par le Comité d’éthique pour l’utilisation des animaux de l’USP Medicine School, Num. Projet: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Pour ce protocole, des souris C57BL/6, âgées de 6 semaines, pesant 20 ± 2 g ont été utilisées (n = 9/groupe).
1. Laparotomie
- Anesthésier les animaux avec de la xylazine (10 mg/kg) et une solution de kétamine (80 mg/kg), par voie sous-cutanée (0,1 mL/10 g de poids corporel) à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une aiguille de 13x0,45 mm 26G 1/2. Vérifiez la profondeur d’anesthésie suffisante en pinçant l’orteil. Contrôlez la température corporelle à l’aide de coussinets chauffants. Assurez-vous que tout le matériel chirurgical est stérile.
- Nettoyez la région abdominale avec une solution de povidone-iode à 5% et utilisez une tondeuse pour enlever les poils entre la poitrine et le bas-ventre (environ 2 cm2). Nettoyez la zone chirurgicale avec 70% d’alcool.
- Immobilisez l’animal sur le tableau chirurgical à l’aide de ruban chirurgical. Utilisez des ciseaux pour couper 5 mm de la peau horizontalement, sur la partie supérieure de l’abdomen et 1 cm en dessous du processus xiphoïde. Répétez la coupe sur le péritoine. Cela entraînera une laparotomie avec une exposition minimale de la cavité.
2. Localisation et exposition du pancréas
- À l’aide d’un rétracteur, tirez le foie vers la tête de la souris, à environ 1 cm de l’intestin.
- Localisez la région du pancréas qui sera injectée avec du taurocholate de sodium (tête du pancréas). Localisez le duodénum en référence au foie - sous le foie, sur le côté droit (à gauche lorsque la souris est vue). Le duodénum est la première partie de l’intestin grêle et est relié à la dernière partie de l’estomac.
- À l’aide de pinces, soulevez le foie vers la tête de l’animal et tirez doucement la partie de l’intestin grêle. Fixez les deux extrémités latérales de l’intestin grêle avec une suture en polypropylène 6-0 pour mieux voir la partie distale du canal biliaire commun.
3. Induction de la pancréatite aiguë sévère
- Obstruer temporairement le canal biliaire commun proximal avec un clip de microvaisseau pour empêcher la perfusion rétrograde de s’infiltrer dans le foie. Le canal biliaire commun peut être vu sur le côté hépatique du duodénum et sa jonction avec le duodénum apparaîtra blanche. Exposez l’organe hors de la cavité abdominale.
- Perforer la région périampullaire (partie blanchâtre de la paroi de l’intestin grêle) pour accéder au canal biliaire commun avec une aiguille de 0,4 mm reliée à un tube en polyéthylène de 0,54 mm.
- Faire une occlusion temporaire du canal biliaire commun distal avec 8-0 suture pour empêcher la solution de taurocholate de sodium de s’infiltrer dans le duodénum.
- Démarrez la pompe à perfusion et programmez une perfusion de solution de taurocholate de sodium à 2,5 % (diluée dans une solution saline à 0,9 %) à une vitesse constante de 10 μL/10 g de poids corporel pendant 3 min.
- Après la perfusion, retirez le clip du microvaisseau, le 8-0 temporaire suture, et l’aiguille d’injection du canal pancréatique biliaire pour reconstituer le flux physiologique de la bile.
- À la fin, suturez l’abdomen avec 6-0 suture de polypropylène monofilament non absorbant. Le temps entre la laparotomie et la suture d’extrémité doit être d’un maximum de 30 minutes (voir figure 1).
- Après la chirurgie, hébergez les animaux dans des boîtes en polyéthylène bordées de copeaux de bois et d’eau et de nourriture ad libitum.
- Traiter les souris témoins de la même manière que les souris expérimentales, mais s’assurer que l’infusat est constitué uniquement de solution saline. Effectuer l’intervention chirurgicale et la perfusion d’une solution saline (10 mL/min, pendant 3 min) dans un groupe témoin (SHAM) afin d’éliminer le biais inflammatoire causé par la chirurgie et la canulation.
- Utiliser le tramadol 12,5 mg / kg par voie sous-cutanée toutes les 8 heures, à partir de la récupération post-chirurgicale.
4. Méthodes d’analyse
- À 12 h après l’induction de l’AP, anesthésier les animaux avec de la xylazine (10 mg/kg) et de la kétamine (80 mg/kg) pour prélever environ 250 μL de sang via le plexus orbitaire.
- Tenez doucement la peau sur le dos, favorisant une légère saillie du globe oculaire, et positionnez-la avec l’œil tourné vers le haut.
- Instillez une goutte de pommade pour les yeux contenant un anesthésique local dans l’œil de l’animal.
- Placez l’extrémité du tube capillaire dans le coin médian de l’œil et insérez-la doucement sous le globe oculaire, avec un angle d’environ 30 ° à 45 °. Faites pivoter le tube capillaire jusqu’à ce que le flux sanguin commence. Rappelez-vous qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser la force pour la procédure.
- Une fois la collecte terminée, assurez-vous de l’homéostasie en gardant les paupières fermées par une légère compression avec la gaze. Jetez le tube capillaire dans le récipient pour objets tranchants19.
- Centrifuger le sérum (700 x g, 15 min) et stocker le surnageant pour le dosage de l’amylase et de l’IL-6 (étapes 4.7 et 4.8).
- Euthanasier les souris par asphyxie au CO2 .
- Utilisez une aiguille de 27 G pour injecter 4 mL de PBS glacé 1x dans la cavité péritonéale. Tenez la peau abdominale et assurez-vous que l’aiguille est poussée lentement dans le péritoine pour ne pas percer d’organes. Après l’injection, massez doucement le péritoine pendant 10 s pour éliminer les cellules adhérées au péritoine.
- À l’aide de ciseaux et de pinces à épiler, faites une petite coupe (0,5 cm) sur l’intérieur de la peau et la musculature pour exposer la cavité abdominale. Insérez une pipette à bulbe dans le péritoine et collectez le liquide. Veillez à ne pas aspirer les tissus adipeux ou d’autres organes.
- Recueillez autant de liquide que possible et déposez la suspension cellulaire recueillie dans des tubes maintenus sur la glace. Jetez la pipette à ampoule dans le récipient pour objets tranchants20. Centrifuger le liquide péritonéal (250 x g, 5 min) et stocker le surnageant pour le dosage de l’IL-6 (étape 4.9).
- Recueillir la région du pancréas adjacente au duodénum (<5mm).
- Traiter le pancréas en le fixant à 10% de formol et l’incorporer dans la paraffine.
- Tassez les lames avec de l’hématoxyline et de l’éosine pour des analyses histopathologiques en microscopie optique. Utilisez le protocole de Schmidt21 (œdème pancréatique, cellule acineuse, blessure/nécrose, inflammation pancréatique) pour évaluer l’étendue de l’AP.
- Mesurez l’amylase (U/dL) à l’aide de kits disponibles dans le commerce conformément aux recommandations du fabricant.
- Mesurez l’IL-6 par des tests Luminex à l’aide de kits commerciaux conformément aux recommandations du fabricant.
- Conserver le sérum et le liquide péritonéal surnageant obtenus aux étapes 4.1 et 4.4 dans un congélateur à -80 °C si nécessaire.
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Representative Results
La gravité de la pancréatite a été notée entre 0-3 selon l’échelle de Schmidt21 où zéro correspond à l’absence, 1 correspond à une présence légère (<25%), 2 correspond à une présence modérée (entre 25 et 50%) et 3 correspond à une présence intense (> 50%) (tableau 1). Les mesures effectuées étaient l’activité plasmatique de l’amylase, l’œdème pancréatique, la cellule acineuse, la lésion / nécrose, l’inflammation pancréatique (par analyse histologique des sections colorées H & E) et la concentration de cytokines IL-6 dans le sérum et le liquide PerC. Après 12 h d’AP sévère, le groupe APTA a montré une augmentation de la concentration sérique d’amylase (6194 ± 336,7 U/dL), par rapport au groupe simulé (3845 ± 135,7 U/dL). Dans le même temps, le groupe APTA a montré une augmentation de la concentration de cytokines IL-6 dans le sérum et le liquide PerC (Figure 2). La figure 3 montre une coloration représentative de l’hématoxyline-éosine du groupe sham et APTA .
Figure 1 : Schémas de l’induction d’une pancréatite aiguë sévère par taurocholate de sodium à 2,5 % chez des souris C57BL/6. (A) vésicule biliaire; B) voie biliaire commune; C) canal pancréatique; D) veine porte; E) clip de microvaisseau; F) site de ponction (aiguille fixée à un tube en polyéthylène et reliée à une pompe à perfusion); G) fixation temporaire de l’aiguille dans le canal biliaire commun. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats représentatifs après 12 h de pancréatite aiguë sévère. (A) Concentration sérique d’amylase (U/dL) chez l’animal. (B) Concentration de cytokines IL-6 dans le sérum et le liquide PerC. Les différences entre les groupes ont été évaluées par une analyse de test t non appariée * p <0,05 si l’APTA ≠ simulacre (n = 9 / groupe). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Œdème interstitiel | Infiltration inflammatoire | Nécrose du parenchyme | Hémorragie du parenchyme | |
| FEINTE | 1±0* | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| L' | 3±0* | 3±0 | 3±0 | 3±0 |
| *P<0,05 si SHAM≠APTA. |
Tableau 1 : Changements histologiques dans le tissu pancréatique après 12 h de PA sévère. Le pancréas a été traité et analysé selon l’échelle de Schmidt21. Les résultats ont été exprimés en moyenne ± SEM et les différences entre les groupes ont été évaluées par le test Student t. * p <0,05 si APTA ≠ SHAM; (n=9/groupe).
Figure 3 : Coloration représentative de l’héméthasoxyline-éosine dans le tissu pancréatique après 12 h de PA sévère. Changements histologiques dans le tissu pancréatique (A) SHAM et (B) APTA (coloration hématoxyline-éosine - grossissement 40x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode d’induction de la pancréatite aiguë par perfusion rétrograde de taurocholate de sodium a déjà été démontrée chez le rat22,23,24. Trois ouvrages similaires, publiés en 2008, 2010 et 2015, ont servi de référence pour le protocole3,14,15. Dans ce travail, nous énumérons toutes les étapes critiques pour reproduire cette méthode chez les souris C57BL/6 et quelques possibilités de validation.
Une étape critique de ce test consiste à bloquer le canal biliaire au niveau du hile à l’aide d’un clip de microvaisseau (étape 3.1) pour éviter le reflux du taurocholate de sodium dans le foie. Cette étape nécessite beaucoup d’attention, car la veine porte est à côté du conduit (Figure 1D), il faut donc veiller à ne pas la bloquer ensemble. L’aiguille ne doit être insérée que dans la partie la plus distale du canal. S’il est introduit profondément dans le conduit, il peut provoquer une rupture avec l’acide débordant vers le parenchyme glandulaire et/ou vers d’autres canaux14. Vérifiez que le tube en polyéthylène contient de l’air pour éviter l’obstruction du canal biliaire commun.
Ce modèle nécessite une incision dans l’abdomen de la souris. L’insertion de la canule à travers l’orifice du canal pancréatique nécessite de l’expérience, mais cela peut être réalisé avec un entraînement15,25. Il est important de souligner que la gravité de la pancréatite dans ce modèle dépend proportionnellement de la concentration, du volume de la perfusion, de la pression de la perfusion et du moment de l’induction de l’AP. Ainsi, une machine à perfusion constante avec un volume et une pression contrôlés doit être utilisée.
Pour cette étude, nous avons normalisé une concentration de 2,5%, avec une vitesse de perfusion de 10 μL/min, pour 3 min et une pression constante. À 12 h d’AP, une augmentation des paramètres inflammatoires et une nécrose des tissus pancréatiques ont été observées, les animaux mourant dans les 16 heures suivant l’induction de l’AP.
Bien que les principales causes de l’AP soient la consommation d’alcool ou les calculs biliaires, ces modèles ne sont pas reproductibles expérimentalement26. Actuellement, le protocole le plus utilisé pour l’induction de l’AP chez la souris implique 7 injections intrapéritonéales de céruléine (50 μg / kg de poids corporel) à des intervalles de 1 h27. La céruléine a également été utilisée pour induire une pancréatite aiguë légère ou modérée. La variabilité de ce modèle limite son utilisation dans l’étude des effets destructeurs de la maladie, qui confèrent la morbidité clinique et la mortalité10. Les modèles qui déclenchent une mortalité élevée en peu de temps sont pertinents pour l’étude de l’AP sévère (nécrosante), car ils peuvent évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments ou interventions. Parmi ces modèles figurent l’induction hémorragique de l’AP chez les jeunes rongeurs femelles (entre 4 et 6 semaines) par un régime alimentaire déficient en choline28 et l’induction de la L-arginine (par exemple, 3 x 3 g / kg ou 2 x 4 g / kg) à base de pancréatite aiguë chez la souris, mais le dosage approprié de L-arginine pour induire l’AP doit être testé par chaque laboratoire et dans chaque souche de souris29. En 2015, une étude a montré qu’une perfusion intra-canalaire de taurocholate suivie d’une ligature distale commune des voies biliaires conduit à un modèle grave et nécrotique de pancréatite chez la souris3. Cependant, ce modèle n’est pas utile pour tester l’efficacité des médicaments et les interventions en raison de son état irréversible.
Les résultats trouvés dans cette étude sont en corrélation avec la littérature récente telle que l’élévation de la concentration sérique d’amylase et l’IL-6 étant associée à la progression de la maladie. Il est possible qu’à l’avenir, la mesure de protéines telles que le TNF-α, l’IL-1β et la myéloperoxydase soit un paramètre pronostique clinique pour la pancréatite aiguë sévère30,31,32.
En conclusion, le protocole utilisé dans la présente étude pour induire l’AP chez la souris par perfusion de taurocholate de sodium directement dans le canal biliaire commun entraîne une pancréatite aiguë sévère avec nécrose du tissu pancréatique qui peut être observée même à 12 h après l’induction avec élévation de la cytokine IL-6 dans le sérum et le liquide péritonéal et avec une létalité élevée (mortalité de 100% en 16 h, données non affichées).
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs grâce au programme de post-diplôme de la clinique médicale de l’Université de São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) et École de médecine de l’Université de São Paulo (FMUSP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | - |
| Styrofoam block | - | - | - |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | - |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
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