Dynamisk cellebilledbehandling i superopløsning af undercellulære strukturer

Summary

Præsenteret her er en protokol for super-opløsning levende celle billeddannelse i intakt væv. Vi har standardiseret betingelserne for billeddannelse en meget følsom voksen stamcellepopulation i sit oprindelige væv miljø. Denne teknik indebærer balancering af tidsmæssige og rumlige opløsning for at give mulighed for direkte observation af biologiske fænomener i levende væv.

Abstract

Der har længe været en afgørende afvejning mellem rumlig og tidsmæssig opløsning i billeddannelse. Billeddannelse ud over lysgrænsen har traditionelt været begrænset til kun at blive brugt på faste prøver eller levende celler uden for væv mærket med stærkt lysstofrør. Nuværende super-opløsning levende celle billeddannelse teknikker kræver brug af særlige fluorescens sonder, høj belysning, flere billedopsamlinger med post-erhvervelse behandling, eller ofte en kombination af disse processer. Disse forudsætninger begrænser i væsentlig grad de biologiske prøver og sammenhænge, som denne teknik kan anvendes på.

Her beskriver vi en metode til at udføre superopløsning (~140 nm XY-opløsning) time-lapse fluorescens levende celle imaging in situ. Denne teknik er også kompatibel med lav fluorescerende intensitet, for eksempel EGFP eller mCherry endogent mærket ved lavt udtrykte gener. Som et principbevis har vi brugt denne metode til at visualisere flere subcellulære strukturer i Drosophila-testis. Under vævsforberedelse opretholdes både cellestrukturen og vævsmorfologien inden for de dissekerede testis. Her bruger vi denne teknik til at afbilde mikrotubuledynamik, samspillet mellem mikrotubuli og den nukleare membran samt fastgørelse af mikrotubuli til centromerer.

Denne teknik kræver særlige procedurer i prøveforberedelse, prøvemontering og immobilisering af prøver. Derudover skal prøverne opbevares i flere timer efter dissektion uden at gå på kompromis med cellulær funktion og aktivitet. Mens vi har optimeret betingelserne for levende super-opløsning billeddannelse specifikt i Drosophila mandlige kønsceller (GSC' er) og stamceller i stamceller i dissekeret testis væv, denne teknik er bredt anvendelig til en række forskellige celletyper. Evnen til at observere celler under deres fysiologiske forhold uden at ofre hverken rumlig eller tidsmæssig opløsning vil tjene som et uvurderligt værktøj for forskere, der søger at løse afgørende spørgsmål i cellebiologi.

Introduction

Visualisering af subcellulære strukturer og proteindynamik i levende celler med opløsning ud over lysets diffraktionsgrænse er typisk meget udfordrende^1-3. Mens flere super-opløsning teknikker såsom stokastisk-optisk-rekonstruktion-mikroskopi (STORM), Foto-Aktiveret-Lokalisering-Mikroskopi (PALM) og Stimuleret-Emission-Depletion (STED)^4,5,6 mikroskopi er blevet udviklet, komplikationer i prøven forberedelse samt behovet for at opretholde levedygtighed og aktivitet ex vivo, begrænse brugen af konventionelle super-opløsning mikroskopi til billedbehandling levende prøver. Konventionel konfokal mikroskopi kan ikke opnå rumlig opløsning ud over ~230 nm XY-opløsning og er ofte utilstrækkelig til at observere indviklede cellulære understrukturer^5,6. Men en nylig udvikling i konfokal mikroskopi, Airyscan super-opløsning billedbehandling, er i stand til at opnå ca 140 nm (XY-opløsning)^7,8 og har en forholdsvis enkel prøve forberedelse, der er kompatibel med levende billedbehandling. Da dette billeddetekteringssystem kræver lang anskaffelsestid, kommer dets høje rumlige opløsning på bekostning af tidsmæssig opløsning⁹. Derfor er der brug for en metode til at sikre, at billeddannelse af levende celler udvides med høj rumlig opløsning.

Her udviklede vi en metode til observation af levende celler i intakt væv ved sin optimale opløsning til at dechifrere subcellulære strukturer med detaljerede rumlige oplysninger. Denne metode er udformet som sådan, så prøverne kan monteres stabilt i en lang periode (~ 10 h) uden at bevæge sig eller degenerere. De levende cellemedier, der bruges i denne teknik, kan understøtte cellulær funktion og undgå fotobleaching i op til 10 timer under et mikroskop i superopløsning. Endelig minimerer denne protokol de fleste belastninger forårsaget af den konstante belysning af lasere over længere tid, såsom hypoxi, ændringer i fugtighed og temperatur samt næringsstofudtømning.

Ved hjælp af denne protokol til at afbilde Drosophila mandlige kønsceller (GSC'er), var vi i stand til at observere, hvordan mikrotubulis asymmetriske aktivitet giver mulighed for præferenceinteraktion med epigenetisk forskellige søsterkromatiderne^10,11,12,13. Disse typer af cellulære hændelser er meget dynamiske og er meget vanskelige at visualisere i levende celler ved hjælp af andre superopløsningsbilleddannelsesmetoder som STORM, PALM eller STED. Vi forventer, at denne metode vil blive meget nyttig for cellebiologer, da de sigter mod at forstå de dynamiske subcellulære strukturer af levende celler, der er bosiddende i væv. Der er mange områder, hvor denne metode kan anvendes til, såsom at studere proteindynamikken; forståelse af cellernes bevægelser og afstamningssporing og cellulære differentieringsprocesser, blandt andre mulige applikationer.

Protocol

1. Forberedelse af levende celle billeddannelse cocktail (levende celle medier)

1. Supplere Schneider's Drosophila medium med 15% føtal kvæg serum (FBS) og 0,6x penicillin / streptomycin. PH-vinduet justeres til ca. 7,0.
2. Lige før du bruger mediet, tilsættes insulin til en endelig koncentration på 200 μg/mL.
   BEMÆRK: Dette medie er afgørende for at opretholde normal celledeling og udvikling af Drosophila-testis under time-lapse imaging^10,14.

2. Fremstilling af glas bund celle kultur parabol

1. Brug en poly L-lysinbelagt cellekulturskål i glasbunden med en diameter på 35 mm til Drosophila-testis. Skålens indre brønd har en glasbund med en diameter på 23 mm og en side med en højde på 1 mm (Figur 1A-a).
   BEMÆRK: Vælg en skål med glasbund, der giver mulighed for en kortere arbejdsafstand, større numerisk blænde og højere forstørrelsesmål; disse funktioner er afgørende for at opnå et billede i superopløsning.
2. Brug en dialysemembran (MWCO: 12-14kD), der giver mulighed for gasformig udveksling. Skær membranen i små stykker.
   BEMÆRK: Membranstykkerne skal være mindre end skålens glasareal, men store nok til at dække prøven.
3. Soak membranen med 100 μL af levende celle medier i ~ 5 min. Brug ikke en tør membran på prøven, da den kan beskadige den. Membranen hjælper med at forhindre hypoksisk stress.
4. Forbered 2-3 letvægtsglas eller plaststykker til at sætte på membranen, så vævet ikke flyder. For at gøre dette skal du først tage den ydre ring af 50 mL centrifugerøret og skære det i små stykker. Steriliser derefter stykkerne med 70% ethanol før brug.
   BEMÆRK: Dette trin sikrer, at prøven forbliver på overfladen under billeddannelse og ikke flyder, hvilket er afgørende for at opnå optimale resultater.
5. Forbered en ring ~ 25 mm i diameter og læg den på den forhøjede side af skålen. Sæt en coverslip på det at generere to kamre. Det nederste kammer vil indeholde prøven, mens det øverste kammer vil fungere som et fugtighedskammer for at forhindre prøven i at tørre.
   1. For at gøre denne ring, afbrød den ydre ring fra en 50 mL centrifuge rør, som vil gøre det muligt at passe sikkert på den forhøjede side af 35 mm parabol. En lignende ring kan laves på andre måder, for eksempel ved hjælp af en elastik eller plast twist slips til at passe på den forhøjede side af skålen til korrekt at holde coverlip uden at forstyrre prøven.
      BEMÆRK: Dette trin er kritisk, især for prøver, der er følsomme over for belastninger som hypoksiske forhold og ændringer i temperatur og fugtighed.

3. Dissektion af testikler fra mandlige fluer og montering

1. Tag ~ 10 unge mandlige fluer (2-3 dage gamle) og dissekere testiklerne i levende celle medier for at opnå ~ 10 par Drosophila voksne testikler.
   1. Disseker fluerne under et dissektionsmikroskop i en dissektionsskål ved hjælp af fine pincet.
      BEMÆRK: Drosophila melanogaster (frugt flyve) stamme bærer UAS-α-Tubulin-GFP transgene drevet af en tidlig kimcelle driver nanos-Gal4.
   2. Generer følgende knock-in Drosophila melanogasterstammer ved hjælp af CRISPR-Cas9-teknologien: Lamin-mCherry (C-terminal-tag) og CENP-A-Dendra2-CENP-A [tag på det interne sted (mellem 118. - 119. codon)].
      BEMÆRK: Mens der kun er behov for én testis af fremragende kvalitet for hvert forsøg, vil montering af tilstrækkeligt mange væv (15-20) eller celler sikre, at der vil være mindst én sund prøve med fremragende fluorescenssignaler til time-lapse-billeddannelse.
2. Vask testiklerne to gange i levende cellemedier i dissektionsskålen.
   1. Brug en pipette til at tilføje medier efterfulgt af at fjerne de levende celle medier som en vask skridt.
   2. Fjern overskydende væv ved hjælp af pincet. Ekstra væv vil forstyrre billeddannelsen.
      BEMÆRK: Brug ikke fosfat-bufferet saltvand (PBS) til vask, da det kan påvirke dynamikken i visse cellulære komponenter.
3. Der tilsættes 100-150 μL levende cellemedier i skålen (tilberedt i trin 2.1) og spred det på glasoverfladen ved hjælp af en pipettespids. Spredning af medier på overfladen vil gøre det muligt for vævet at holde sig korrekt til skålen.
4. Overfør testiklerne til skålen med fine pincet og bring dem til midten af skålen(Figur 1A-b).
   BEMÆRK: Undgå at overføre snavs, fordi det vil forstyrre billeddannelsen og kan reducere billedets kvalitet.
5. Overskydende levende cellemedier fjernes (lad ca. 10 μL medier være) for at gøre det muligt for vævet at flade ud og klæbe ordentligt til skålen. Udfør dette trin hurtigt for at undgå tørring af prøven.
6. Den forsygte membran (tilberedt i trin 2.2 og 2.3) anbringes oven på testiklerne (figur 1A-c).
7. Sæt 2-3 små plastvægte (tilberedt i trin 2.4) på membranen, så prøven ikke flyder, og tilsæt hurtigt 100-150 μL levende cellemedier (Figur 1A-d).
   BEMÆRK: Hvis du tilføjer medier hurtigt og forsigtigt, sikres det, at prøven ikke tørrer ud eller forskydes.
8. Plastringen (tilberedt i trin 2.5) anbringes på den forhøjede side af skålen(figur 1B-a).
9. Placer en 22 mm x 22 mm coverlip oven på ringen (Figur 1B-b). Dette genererer to kamre.
10. Tag et stykke silkepapir, fugt det med vand, og hvæll det derefter og læg det på coverlipet for at skabe et fugtigt kammer(Figur 1B-c). Luk låget på skålen (Figur 1B-d) og begynd at bruge levende cellebilleddannelse.
    BEMÆRK: Hvis prøven er lysfølsom, skal du udføre sektion 3 i mørke.

4. Levende cellebilleddannelse af Drosophila mandlige kønsceller (GSR) in situ

1. Placer skålen under superopløsningsmikroskopet, og fastgør den med sceneklemmerne.
   1. Åbn billedbehandlingssoftwaren, tænd det transmitterede lys, og brug 63x mål for at fokusere på testisvævet med fokusknappen.
      BEMÆRK: Hvis det er vanskeligt at finde en prøve med 63x-målet, skal du først bruge målet 40x eller 20x, før du skifter til 63x.
   2. Tænd for laserne, klik på Live, og find GSR med den optimale position og tilstand. Undgå testikler, der har et lavt fluorescenssignal, eller få navet (nichen) væk fra overfladen.
      BEMÆRK: I Drosophila-testikler er GSC'erne fastgjort til hubben.
2. Juster fokus for GSC'erne, og identificer de rigtige indstillinger for prøven, herunder laserkraft, EM-forstærkning (electron-multiplying), gennemsnit og zoom til Airyscan-tilstanden. Brug følgende indstillinger som et eksempel for Drosophila-testikler, der udtrykker EGFP-mærkede α-tubulin i tidlige kimceller.
   1. Angiv rammestørrelsen mellem 512 x 512 pixel og 1024 x 1024 pixel ved at klikke på Rammestørrelse.
   2. Angiv rammegennemsnittet til 1 eller 2 ved at klikke på Gennemsnit.
      BEMÆRK: Hvis rammestørrelsen (>1024 x 1024 pixel) øges, og der opnås et gennemsnit (dvs. mere end 2), kan det resultere i fotobleaching eller fototoksicitet.
   3. Indstil lasereffekten til 1%-2 % ved at klikke på Lasere.
      BEMÆRK: Øget lasereffekt kan også føre til fotobleaching eller fototoksicitet.
   4. Indstil EM-gevinsten under det anbefalede niveau (< 800) ved at klikke på Master Gain.
      BEMÆRK: En højere EM gevinst kan generere artefakter.
   5. Zoom ind på det område eller den celle, der er af interesse, for at reducere billederhvervelsestiden og reducere fotobleaching. Dette gør det også muligt for prøven at overleve i længere tid.
3. Start time-lapse-billedoptagelsen ved hjælp af airyscan-tilstanden ved at klikke på Start eksperiment.
   1. Før du klikker på Start eksperiment, skal du kontrollere, at anskaffelsen er konfigureret optimalt.
   2. Hvis der vises en advarsel med meddelelsen "Airyscan acquisition is not configured optimalt", skal du klikke på Optimal i rammestørrelsesafsnittet, klikke på Optimal i z-stack-sektionen og klikke på Optimal for scanningsområdesektion (der kræves mindst 1,3 zoom til billedbehandling med superopløsning).
4. Optimer tidsintervallet, antallet af z-skiver og varigheden af time-lapse-billeddannelsen i henhold til forsøgsdesignet og prøvetypen, så billedets kvalitet ikke kompromitteres, og cellerne ikke vil blive arresteret på bestemte stadier af cellecyklussen.
   1. F.eks. vises parametrene for time-lapse-billeddannelse af Drosophila-testikler, der udtrykker EGFP-mærkede α-tubulin i den tidlige kimlinje, i følgende trin.
   2. For mere end 5 timer time-lapse billedbehandling, billede på en 10 min interval med 1% laserkraft og tage op til 30 z-skiver på hvert tidspunkt.
   3. For meget dynamiske cellulære processer, såsom mikrotubule dynamik, der er en 2 min interval mellem tidspunkter, udføre 1-2 timer time-lapse imaging på 1% laserkraft, og tage op til 30 z-skiver på hvert tidspunkt.
   4. For sjældne cellulære begivenheder, såsom anafase til tidlig telophase chromatin dynamik (2-3 min begivenheder), sæt levende celle billeddannelse med en 1 min interval mellem tidspunkter, udføre 30 min time-lapse imaging på 1% laser magt, og tage op til 30 z-skiver på hvert tidspunkt.
      BEMÆRK: Disse parametre kan variere for forskellige prøver, så der er behov for ændring for at opnå optimal brug for den specifikke prøve.
5. Udfør enten time-lapse-billedbehandling eller live snapshotbilleddannelse, afhængigt af prøvens følsomhed og forsøgsdesignet.
   BEMÆRK: En kort film er 15-30 min, og en lang film er mere end 5 timer.
6. Hvis prøven er meget følsom og ikke kan undersøges ved time-lapse-billeddannelse med et mikroskop i superopløsning, som det ofte er tilfældet med Drosophila mandlige GSC'er, skal du udføre et live snapshot (SRLS) i superopløsning af prøven i forskellige cellecyklusstadier (som vist i figur 2, Figur 3, Figur 4).
   1. Hvis en sjælden celle biologiske begivenhed er ved at blive fanget eller protein af interesse har lavt udtryksniveau, derefter udføre SRLS.
   2. For SRLS skal du finde en celle i det specifikke cellecyklusstadie, du er interesseret i. For eksempel, hvis fokus på mikrotubules-kinetochore binding, så brug en celle på prometaphase eller metafase.
      BEMÆRK: Dette vil bidrage til at sikre, at du får et billede af den pågældende celle af høj kvalitet på det rigtige tidspunkt uden at risikere fototoksicitet for prøven eller blegning af fluoroferne, hvilket kan forekomme under en længere film.
   3. Hvis du bruger SRLS, skal du afbilde forskellige cellecyklusstadier af interesse på tværs af flere celler og arrangere disse billeder i kronologisk rækkefølge.
      BEMÆRK: Dette kan bruges til at konstruere en tidsmæssig rækkefølge af hændelser, samtidig med at signal- og vævssundheden maksimeres, for at opnå fremragende tidsmæssig opløsning af hændelsen for særligt følsomme prøver eller prøver med lavt signal.

5. Airyscan behandling af levende celle billeder

1. Når du har anskaffet billedopsamling med billedsoftwaren, skal du vælge Behandling, klikke på Batchog derefter vælge Airyscan Processing.
   1. Vælg de billeder, der skal behandles, og klik derefter på Kør/Indlæs for at hente billederne i superopløsning.
   2. Udfør behandlingen ved hjælp af standardindstillingen.
      BEMÆRK: Airyscan-behandling fungerer kun, hvis billedbehandlingsindstillingerne er korrekt etableret for Airyscan-billedbehandling.

Representative Results

Live celle billeddannelse ud over diffraktion grænse i Drosophila væv, især for GSC'er, giver mulighed for at undersøge dynamikken i subcellulære begivenheder i forbindelse med cellecyklus progression. For nylig har en undersøgelse, der bruger denne protokol, vist, at mikrotubule-aktiviteter hos moderen centrær versus datterens centrsome er tidsmæssigt asymmetriske i GSC'er¹⁰. Moderen centrobiøse udstråler mikrotubuli ca 4 timer før mitotiske indrejse, mens datteren centrobik kun udstråler mikrotubuli ved starten af mitose. De meget aktive mikrotubuli fra moderkremulidet interagerer med atommembranen og fremkalder polariseret nuklear kuvertnedbrud (NEBD). Den lokale NEBD er proksimal til hub og tillader mikrotubuli fra moderen centrobiøse at komme ind i kernen og fortrinsvis tillægger den stærkere søster kinetochore og søster centromere at sikre, at de adskilles til den fremtidige stamcelle. Disse observationer tyder på, at der findes en asymmetrisk mitotisk akse, hvor mikrotubuli, atommembran, kinetochore og centromerer interagerer på en spatiotemporally kontrolleret måde for at sikre korrekt nonrandom kromosomadskillelse i sidste ende^10,11,12.

Hvert af disse resultater blev støttet ved hjælp af den SRLS-tilgang, der er skitseret her. Ved at udføre levende cellebilleddannelse af Drosophila-testikler, der udtrykker α-tubulin-GFP i tidlige kimceller, var vi i stand til at identificere tidsmæssig asymmetri i mikrotubuleaktivitet i GSC 'er (Figur 2). Vi var også i stand til at se den asymmetriske intensitet af GFP signaler på de to centrosomer som et lysere signal på moderen centrobiøse og en relativt svagere signal på datteren centreksom side ved hjælp af en roterende disk konfokal mikroskop(Figur 2A). Forskellen i lysstyrke afspejles sandsynligvis af den tidsmæssige asymmetri i mikrotubulekerner, men den detaljerede morfologi og mængden af mikrotubbuler kunne ikke løses ved hjælp af roterende diskkonfokal mikroskopi (Figur 2A). I modsætning hertil tillod levende celle super-opløsning billeddannelse os, at visualisere morfologi og kvantificere antallet af mikrotubuli (Figur 2B). Dens forbedrede opløsning afslørede mønstre af asymmetrisk mikrotubulekernedannelse, forlængelse og øget interaktion med atommembranen (Figur 2B). Som eksempler er time-lapse-filmene af α-tubulin-GFP-udtryk GSC'er blevet offentliggjort i et primært forskningspapir (Videoer S3 og Video S5)¹⁰.

Dernæst udførte vi live cellebilleddannelse på Drosophila-testikler, der udtrykker enten α-Tubulin-GFP med Lamin-mCherry eller α-Tubulin-mCherry med Lamin-GFP i tidlige stadier af kimceller. Vores resultater viser, at asymmetrisk mikrotubuleaktivitet faldt sammen med asymmetrisk NEBD i GSC'er (Figur 3). Ved hjælp af spinding-disk konfokale mikroskop, kunne vi visualisere den asymmetriske nukleare membran invagination, men ikke de enkelte mikrotubuli, der direkte kom ind i kernen (Figur 3A). I modsætning hertil gav denne live celle super-opløsning teknik os mulighed for direkte at observere disse begivenheder ved billeddannelse både mikrotubuli og den nukleare lamina samtidig (Figur 3B).

Dernæst udførte vi live cellebilleddannelse på Drosophila-testikler, der udtrykte α-Tubulin-mCherry og CENP-A-Dendra2 eller CENP-A-GFP (Centromere Protein A) i tidlige kimceller. For bedre at visualisere mikrotubule og centromere vedhæftede fil, vi lever afbildet dem ved en lavere temperatur (~ 18 °C) for at stabilisere deres vedhæftede fil. Hvis det er nødvendigt, kan prøven kortvarigt køles med is eller iskolde levende celle medier i 4-5 minutter for at stabilisere mikrotubule-centromere vedhæftet fil og depolymerisere enhver løsrevet mikrotubule. Vores resultater viser, at de mikrotubuli, der stammer fra den tidlige aktive mor centrobisome fortrinsvis tillægger den stærkere søster centromere (Figur 4). Ved hjælp af spinding-disk confocal mikroskop, viste α-Tubulin-mCherry signaler en asymmetrisk lysstyrke nær de to centrosomer. Vi kunne også registrere begge søster centromerer som et signal, som vist i figur 4A (metafase), men var ikke i stand til at visualisere mikrotubule-centromere vedhæftet fil (Figur 4A, metafase). I modsætning hertil gav superopløsnings live imaging os mulighed for at visualisere den mikrotubule-centromere vedhæftede fil (Figur 4B). Vores resultater viser, at mor centrobisome-stammer mikrotubuli tillægger centromere forud for datter centrosom-stammer mikrotubuli(Figur 4B, tidlig prophase).

Figur 1: Ordning for forberedelse og montering af Drosophila-testis.  (A) Top view: glasbundet cellekulturskål (A-a), overfør Drosophila-testis mod midten af skålen (A-b), læg en dialysemembran på toppen af testis (A-c), læg tre plastvægte på dialysemembranen (A-d). (B) Sideudsigt: Placer plastringen på den forhøjede side af skålen (B-a), placer en 22 mm × 22 mm coverslip på plastringen (B-b), læg et hvirvel og vådt silkepapir på dækslet (B-c), luk skålen med låget (B-d). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Time-lapse-billeddannelse med superopløsning af mikrotubuledynamik i Drosophila-væv (testikler), der udtrykker α-tubulin-GFP (A) Konventionel konfokal mikroskopi live cellebillede, der viser mikrotubuledynamik i midten af G2-fasen til metafase. (B) Airyscan mikroskop levende celle billede, der viser asymmetrisk mikrotubule stammer fra mor versus datter centrosomer i midten af G2 fase til metafase, med detaljerede strukturelle oplysninger. En tegneserie skildrer Drosophila mandlige kønsceller stamcelle. Skalastang: 5μm; stjerne: hub (niche); grøn pil: mor centraf etsom (stamcelleside [M]); rød pil: datter centraf etsomt (differentierende dattercelleside [D]); gul pil: centraf etsom i cellen spermatogonia (stamceller af stamceller uden stamceller) magenta pil: mikrotubule stikke i kernen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Time-lapse-billeddannelse af mikrotubule-poking-in-aktivitet og asymmetrisk nuklear kuvertnedbrydning i Drosophila-væv (testikler), der er medudnævnte Lamin-mCherry og α-Tubulin-GFP. (A) Konventionel konfokal mikroskopi levende celle billede, der viser mikrotubule dynamik fra G2-M fase til mitose. Billede, der viser højere α-Tubulin-GFP intensitet ved stamcellesiden og dens interaktion med atommembranen. (B) Luftfoto af luftfoto af mikroskoper, der viser mikrotubule-stikning og asymmetrisk NEBD ved stamcellesiden. Skalastang: 5μm; stjerne: hub (niche); orange pil: sted for mikrotubule stikke i atommembran; magentapil: mikrotubuli, der stikker ind på stamcellesiden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Time-lapse-billeddannelse med superopløsning af mikrotubule og centromeretilbehør i Drosophila-væv (testikler), der udtrykker α-Tubulin-mCherry og CENP-A-Dendra2. (A) Konventionel konfokal mikroskopi levende celle billede, der viser mikrotubule og centromere interaktion fra tidlig profase til metafase. Billede, der viser højere α-Tubulin-mCherry intensitet ved stamcelle side og CENP-A-GFP signal. (B) Airyscan mikroskop levende celle billede, der viser mikrotubuli stammer fra moderen centrobial og tilknytning til de stærkere centromerer i begyndelsen af prophase. Ved metafase er centromerer fastgjort til modsatte pol (bi-orientering). Skalastang: 5μm; stjerne: hub (niche); magenta pil: kinetochore fiber eller K-fiber (mikrotubuli knyttet til centromere). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Mikroskopimetoder med superopløsning giver rumlig opløsning helt op til 10'erne af nanometer^4,5,6. STORM- og PALM-mikroskopimetoderne tillader opløsning på op til 20 til 50 nm (XY-opløsning), mens STED-mikroskopi giver en opløsning på 20 til 100 nm (XY-opløsning). Sim-mikroskopiens rumlige opløsning er begrænset til 100 til 130 nm¹⁵. Men på grund af sin høje fotontæthed og lange anskaffelsestid er det ekstremt udfordrende at bruge disse teknikker til live cellebilleddannelse.

Imaging subcellulære strukturer, såsom cytoskeleton, kromosomer, og organeller i levende celler i væv, kræver, at teknikken til at være både ultrasensitive og noninvasive mens du stadig har en høj rumlig opløsning. Den Airyscan super-opløsning teknik præsenteret her kombinerer konfokale billeddannelse med en 0,2 Airy Unit pinhole, sammen med pixel omplacering og dekonvolution. Denne teknik kan opnå en 1,7 x højere opløsning end konventionel konfokal mikroskopi⁷. Den ~ 220-230 nm opløsning af konventionelle confocal mikroskopi er begrænset af diffraktion grænse for lys, men denne billedbehandling teknik er i stand til at opnå ca 140 nm XY-opløsning, hvilket kan sammenlignes med andre udbredte super-opløsning teknikker, såsom SIM (opløsning på 110-120 nm)¹⁶.

Tilpasningsevnen og alsidigheden af Airyscan konfokal mikroskopi vil gøre det muligt for denne protokol at kunne anvendes på forskellige andre typer væv og celler til at studere et varieret antal cellebiologiske processer^7,16. Ved hjælp af denne teknik kan forskere få time-lapse-billeder på et superopløsningsniveau for at visualisere cellulær dynamik med hidtil uset spatiotemporal detaljer.

Det kritiske trin i denne teknik er at montere prøven på skålen, så den ikke bevæger sig eller flyder under time-lapse billeddannelse. Det er afgørende at holde prøven tæt på eller fast på billedfladen (dvs. skålens glasbund) for at få billeder i superopløsning og opretholde det optimale mikromiljø for prøven. Dette sikrer, at prøven ikke stresses på grund af forhold som hypoxi og ændringer i temperatur eller fugtighed.

På trods af nytten af denne protokol er der et par forbehold. Time-lapse billeddannelse med Airyscan mode er en forholdsvis langsom proces i forhold til konventionelle konfokale mikroskop billeddannelse. Derfor kan selv det mindste fysiske skift i prøven resultere i dårlig opløsning. Denne situation kan forebygges ved at anvende en immobiliseringsmetode til at klæbe prøverne til billedfladen (f.eks. poly L-lysinbelægning eller anden belægning, der er kompatibel med prøven). Også at placere en dialysemembran oven på vævet og tilføje et par små vægte som beskrevet i denne protokol hjælper med at forhindre vævsbevægelse eller flydende, samtidig med at der gives mulighed for gasformig udveksling. Time-lapse billedceller, der er placeret dybt inde i vævet med super-opløsning tilstand kræver høj belysning og kan forårsage photobleaching. Dette kan minimeres ved at justere antallet af z-skiver, belysningseffekt og gennemsnitsalgoritme for at opnå de optimale indstillinger for prøven. Hvis cellen eller vævet er følsomt over for lasertoksicitet, hypoxi eller anden stress under billeddannelse, kan der forekomme anholdelse af cellecyklus. Også, hvis et protein har et ekstremt lavt udtryk, kort halveringstid eller lavt fluorescenssignal, kan der forekomme fotobleaching, hvilket vil resultere i et billede med dårlig kvalitet. Dette kan undgås ved at tage en SRLS, lave en kort film eller skyde med lange intervaller mellem fortløbende tidspoint. Derudover skal mikroskopindstillingen og time-lapse-billedparameteren (som beskrevet i denne protokol) optimeres, så den passer til prøven.

Da det er vigtigt, at prøven ikke bevæger sig eller degenererer under processen, kan langvarig time-lapse-billedbehandling, der varer natten over eller mere end en dag uden at gå på kompromis med billedopløsningen, være udfordrende.

De eksisterende metoder fokuserer primært på at optimere superopløsningsmikroskopi og time-lapse billeddiagnostiske parametre separat^1,9. Disse metoder giver imidlertid ikke nærmere oplysninger om prøveforberedelses- eller monteringsparametre, som er afgørende for at sikre prøvens levedygtighed og mikroskopets tilpasningsevne for at opnå den ønskede superopløsning under time-lapse-billeddannelse. I denne metode har vi optimeret billedparametrene, prøveforberedelses- og monteringsparametrene, så time-lapse-billedbehandling kan udføres i en længere periode for at erhverve billeder i superopløsning uden at risikere både degenerationen af prøven og opløsningen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A