Superupplösning Live Cell Imaging av subcellulära strukturer

Summary

Presenteras här är ett protokoll för superupplösning live-cell imaging i intakt vävnad. Vi har standardiserat förutsättningarna för avbildning av en mycket känslig vuxen stamcellspopulation i sin inhemska vävnadsmiljö. Denna teknik innebär balansering av tidsmässig och rumslig upplösning för att möjliggöra direkt observation av biologiska fenomen i levande vävnad.

Abstract

Det har länge varit en avgörande kompromiss mellan rumslig och tidsmässig upplösning i bildbehandling. Avbildning utanför ljusgränsen har traditionellt begränsats till att endast användas på fasta prover eller levande celler utanför vävnaden märkt med stark fluorescerande signal. Nuvarande superupplösta livecellavbildningstekniker kräver användning av speciella fluorescenssonder, hög belysning, flera bildförvärv med bearbetning efter förvärv eller ofta en kombination av dessa processer. Dessa förutsättningar begränsar avsevärt de biologiska prover och sammanhang som denna teknik kan tillämpas på.

Här beskriver vi en metod för att utföra superupplösning (~ 140 nm XY-upplösning) time-lapse fluorescens live cell imaging in situ. Denna teknik är också kompatibel med låg fluorescerande intensitet, till exempel EGFP eller mCherry endogent märkta vid lågt uttryckta gener. Som ett principbevis har vi använt denna metod för att visualisera flera subcellulära strukturer i Drosophila testikel. Under vävnadspreparat upprätthålls både cellstrukturen och vävnadsmorfologin inom den dissekerade testiken. Här använder vi denna teknik för att avbilda mikrotubuledynamik, interaktionerna mellan mikrotubuler och kärnmembranet, liksom fastsättning av mikrotubuli till centromerer.

Denna teknik kräver speciella procedurer vid provberedning, provmontering och immobilisering av prover. Dessutom måste proverna underhållas i flera timmar efter dissekering utan att kompromissa med cellulär funktion och aktivitet. Medan vi har optimerat förutsättningarna för levande superupplösningsavbildning specifikt i Drosophila manliga könsceller (GSCs) och stamceller i dissekerad testikelvävnad, är denna teknik i stort sett tillämplig på en mängd olika celltyper. Förmågan att observera celler under deras fysiologiska förhållanden utan att offra vare sig rumslig eller temporal upplösning kommer att fungera som ett ovärderligt verktyg för forskare som försöker ta itu med viktiga frågor inom cellbiologi.

Introduction

Visualisera subcellulära strukturer och proteindynamik i levande celler med upplösning utöver ljusets diffraktionsgräns är vanligtvis mycket^{utmanande 1-3}. Medan flera superupplösningstekniker som Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy (STORM), Photo-Activated-Localization-Microscopy (PALM) och Stimulated-Emission-Depletion (STED)^4,5,6 mikroskopi har utvecklats, komplikationer i provberedning samt behovet av att upprätthålla livskraft och aktivitet ex vivo, begränsa användningen av konventionella superupplösning mikroskopi för bildbehandling levande prover. Konventionell konfokal mikroskopi kan inte nå rumslig upplösning bortom ~ 230 nm XY-upplösning och är ofta otillräcklig för att observera invecklade cellulära^{understrukturer 5,6}. En ny utveckling inom konfokal mikroskopi, Airyscan superupplösningsavbildning, kan dock uppnå cirka 140 nm (XY-upplösning)⁷,^{8 och}har en relativt enkel provberedning som är kompatibel med levande avbildning. Eftersom detta bildbehandlingsdetekteringssystem kräver en lång förvärvstid, kommer dess höga rumsliga upplösning till priset av temporal upplösning⁹. Därför behövs en metod för att säkerställa att levande cellavbildning utökas med hög rumslig upplösning.

Här utvecklade vi en metod för att observera levande celler i intakt vävnad med optimal upplösning för att dechiffrera subcellulära strukturer med detaljerad rumslig information. Denna metod är utformad som sådan så att prover kan monteras stabilt under en längre tid (~ 10 h) utan att flytta eller degenerera. Livecellmedierna som används i denna teknik kan stödja cellulär funktion och undvika fotoblekning i upp till 10 timmar under ett superupplöst mikroskop. Slutligen minimerar detta protokoll de flesta påfrestningar som orsakas av konstant belysning av lasrar under längre tidsperioder som hypoxi, förändringar i fuktighet och temperatur samt näringsutmattning.

Med hjälp av detta protokoll för att avbilda Drosophila manliga könsceller (GSCs), kunde vi observera hur mikrotubulernas asymmetriska aktivitet möjliggör förmånlig interaktion med epigenetiskt distinkta systerkromatider^10,11,12,13. Dessa typer av cellulära händelser är mycket dynamiska och är mycket svåra att visualisera i levande celler med andra superupplösningsavbildningsmetoder som STORM, PALM eller STED. Vi förväntar oss att denna metod kommer att bli mycket användbar för cellbiologer eftersom de syftar till att förstå de dynamiska subcellulära strukturerna hos levande celler som bor i vävnader. Det finns många områden där denna metod kan tillämpas på, till exempel att studera proteinernas dynamik; förstå cellernas rörelse; och härstamningsspårning och cellulära differentieringsprocesser, bland andra möjliga applikationer.

Protocol

1. Förberedelse av levande cellbildcocktail (levande cellmedia)

1. Komplettera Schneiders Drosophila medium med 15% fetala nötkreatur serum (FBS) och 0,6x penicillin/streptomycin. Justera pH-talet till cirka 7,0.
2. Strax innan du använder mediet, tillsätt insulin till en slutlig koncentration på 200 μg/ml.
   OBS: Detta medium är avgörande för att upprätthålla normal celldelning och utveckling av Drosophila testiklar under timelapse imaging^10,14.

2. Beredning av glasbotten cellkultur skål

1. Använd en poly L-lysinbelagd cellkulturrätt med glasbotten med en diameter på 35 mm för Drosophila testis. Skålens inre brunn har en glasbotten med en diameter på 23 mm och en sida med en höjd av 1 mm (Figur 1A-a).
   OBS: Välj en skål med glasbotten som möjliggör kortare arbetsavstånd, större numerisk bländare och högre förstoringsmål; dessa funktioner är avgörande för att få en superupplösningsbild.
2. Använd ett dialysmembran (MWCO: 12–14 kD) som möjliggör gasformigt utbyte. Skär membranet i små bitar.
   OBS: Membranbitarna ska vara mindre än skålens glasyta men tillräckligt stora för att täcka provet.
3. Blötlägg membranet med 100 μL levande cellmedia i ~5 min. Använd inte ett torrt membran på provet, eftersom det kan skada det. Membran hjälper till att förhindra hypoxisk stress.
4. Förbered 2–3 lätta glas- eller plastbitar för att sätta på membranet så att vävnaden inte flyter. För att göra detta, ta först den yttre ringen på 50 mL centrifugeringsröret och skär det i små bitar. Sterilisera sedan bitarna med 70% etanol före användning.
   OBS: Detta steg säkerställer att provet förblir på ytan under avbildning och inte flyter, vilket är avgörande för att uppnå optimala resultat.
5. Förbered en ring ~ 25 mm i diameter och placera den på den förhöjda sidan av skålen. Sätt ett täckglas på det för att generera två kammare. Bottenkammaren kommer att innehålla provet medan den övre kammaren kommer att fungera som en fuktighetskammare för att förhindra att provet torkar.
   1. För att göra denna ring, skär av den yttre ringen från ett 50 ml centrifugerör, vilket gör att den kan passa säkert på den upphöjda sidan av 35 mm-skålen. En liknande ring kan tillverkas på andra sätt, till exempel genom att använda ett gummiband eller plastvridningsband för att passa på den förhöjda sidan av skålen för att ordentligt hålla täcket utan att störa provet.
      OBS: Detta steg är kritiskt, särskilt för prover som är känsliga för påfrestningar som hypoxiska förhållanden och förändringar i temperatur och fuktighet.

3. Dissekering av testikörer från hanflugor och montering

1. Ta ~ 10 unga manliga flugor (2-3 dagar gamla) och dissekera testikorna i levande cellmedia för att få ~ 10 par Drosophila vuxna testikörer.
   1. Dissekera flugorna under ett dissekeringsmikroskop i en dissekeringsform med fina tångar.
      OBS: Drosophila melanogaster (fruktfluga) stam bär UAS-α-Tubulin-GFP transgene drivs av en tidig bakterie cell driver nanos-Gal4.
   2. Generera följande inknölps-Drosophila melanogaster-stammar med CRISPR-Cas9-tekniken: Lamin-mCherry (C-terminal tag) och CENP-A-Dendra2-CENP-A [tagg på den inre platsen (mellan 118: e - 119: e kodon)].
      OBS: Även om endast en testiklar av utmärkt kvalitet behövs för varje experiment, kommer montering av tillräckligt många vävnader (15–20) eller celler att säkerställa att det kommer att finnas minst ett friskt prov med utmärkta fluorescenssignaler för timelapse-avbildning.
2. Tvätta testiklar två gånger i levande cellmedia i dissekeringsformen.
   1. Använd en pipett för att lägga till media följt av att ta bort livecellmedierna som ett tvättsteg.
   2. Ta bort överflödig vävnad med tång. Eventuell extra vävnad stör avbildningen.
      OBS: Använd inte fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för tvätt, eftersom det kan påverka dynamiken hos vissa cellulära komponenter.
3. Tillsätt 100–150 μL levande cellmedier i skålen (beredd i steg 2.1) och sprid den på glasytan med en pipettspets. Om du sprider mediet på ytan kan vävnaden fastna ordentligt på skålen.
4. Överför testikelerna till skålen med fina tångar och för dem till mitten av skålen(figur 1A-b).
   OBS: Undvik att överföra skräp eftersom det kommer att störa avbildningen och kan minska bildens kvalitet.
5. Ta bort överflödiga levande cellmedier (lämna cirka 10 μL media) så att vävnaden kan plattas ut och fastna ordentligt på skålen. Utför detta steg snabbt för att undvika att torka provet.
6. Placera det fört våta membranet (förberett i steg 2.2 och 2.3) ovanpå testikelerna(figur 1A-c).
7. Sätt 2–3 små plastvikter (beredda i steg 2.4) på membranet så att provet inte flyter och snabbt lägger till 100–150 μL levande cellmedia (Figur 1A-d).
   OBS: Om du lägger till media snabbt och försiktigt säkerställs att provet inte torkar ut eller förskjuts.
8. Placera plastringen (beredd i steg 2.5) på skålens förhöjda sida (figur 1B-a).
9. Placera ett 22 mm x 22 mm täckslip ovanpå ringen (bild 1B-b). Detta genererar två kammare.
10. Ta en bit vävnadspapper, fukta det med vatten, snurra det sedan och lägg det på täcket, för att skapa en fuktig kammare (Figur 1B-c). Stäng locket på skålen ( Bild1B-d) och påbörja avbildning av levande celler.
    OBS: Om provet är ljuskänsligt, utför avsnitt 3 i mörker.

4. Levande cellavbildning av Drosophila manliga könsceller (GSC) på plats

1. Placera skålen under superupplösningsmikroskopet och fäst den med scenklämmorna.
   1. Öppna bildframställningsprogrammet, tänd det överförda ljuset och använd 63x-målet för att fokusera på testikväven med fokusratten.
      OBS: Om det finns svårt att hitta ett prov med 63x-målet, använd först 40x- eller 20x-målet innan du byter till 63x.
   2. Slå på lasrarna, klicka på Liveoch hitta GSC med optimal position och skick. Undvik testiklar som har en låg fluorescenssignal eller har navet (nischen) borta från ytan.
      OBS: I Drosophila-testiklar är GSCs anslutna till navet.
2. Justera fokus för GSCs och identifiera rätt inställningar för provet, inklusive laserkraft, elektron-multiplicerande (EM) vinst, genomsnitt och zoom för Airyscan-läget. Använd följande inställningar som exempel för Drosophila-testikörer som uttrycker EGFP-märkt α-tubulin i tidiga könsceller.
   1. Ange bildrutestorleken mellan 512 x 512 pixlar och 1 024 x 1 024 pixlar genom att klicka på Bildstorlek.
   2. Ange bildrutegenomsnittet till 1 eller 2 genom att klicka på Medelvärde.
      OBS: Om du ökar bildstorleken (>1024 x 1 024 pixlar) och utför mer medelvärde (dvs. mer än 2) kan det leda till fotografering eller fototoxicitet.
   3. Ställ in lasereffekten på 1%–2% genom att klicka på Lasrar.
      OBS: Att öka lasereffekten kan också leda till fotoblekning eller fototoxicitet.
   4. Ställ in EM-förstärkningen under den rekommenderade nivån (< 800) genom att klicka på Bakgrundsvinst.
      Obs: En högre EM-vinst kan generera artefakter.
   5. Zooma in på den region eller cell som är av intresse för att minska bildförvärvstiden och minska fotoblekningen. Detta gör det också möjligt för provet att överleva under en längre tid.
3. Starta timelapse-bildinspelningen med airyscan-läget genom att klicka på Starta experiment.
   1. Innan du klickar på Starta experimentkontrollerar du att förvärvet är optimalt konfigurerat.
   2. Om den visar en varning med meddelandet "Airyscan-förvärvet är inte optimalt konfigurerat", klicka sedan på Optimal i bildrutestorleksavsnittet, klicka på Optimal i z-stack-avsnittet och klicka på Optimal för skanningsområdesavsnitt (minst 1,3 zoom krävs för superupplösningsavbildning).
4. Optimera tidsintervallet, antalet z-skivor och varaktigheten för timelapse-avbildningen enligt den experimentella designen och typen av prov, så att bildens kvalitet inte äventyras och cellerna inte kommer att arresteras i vissa stadier av cellcykeln.
   1. Som ett exempel visas parametrarna för timelapse-avbildning av Drosophila-testiklar som uttrycker EGFP-märkt α-tubulin i tidig bakterielinje i följande steg.
   2. För mer än 5 timmars timelapse-avbildning, bild med 10 minuters intervall med 1% laserkraft och ta upp till 30 z-skivor vid varje tidpunkt.
   3. För mycket dynamiska cellulära processer, till exempel mikrotubuledynamik, ställ in ett 2 minuters intervall mellan tidpunkter, utför 1–2 timmars timelapse-avbildning med 1 % lasereffekt och ta upp till 30 z-skivor vid varje tidpunkt.
   4. För sällsynta cellulära händelser, såsom anafas till tidig telophase chromatin dynamik (2-3 min händelser), ställa in levande cell imaging med en 1 min intervall mellan tidpunkter, utföra 30 min timelapse imaging vid 1% laserkraft och ta upp till 30 z-skivor vid varje tidpunkt.
      OBS: Dessa parametrar kan variera för olika prover, så ändringar kommer att behövas för optimal användning för det specifika provet.
5. Utför antingen timelapse-avbildning eller live snapshot imaging, beroende på provets känslighet och den experimentella designen.
   OBS: En kortfilm är 15-30 min, och en lång film är mer än 5 h.
6. Om provet är mycket känsligt och inte kan studeras genom timelapse-avbildning med ett superupplöst mikroskop, vilket ofta är fallet med Drosophila manliga GSCs, utför en högupplöst live ögonblicksbild (SRLS) av provet i olika cellcykelstadier (som visas i figur 2, figur 3, figur 4).
   1. Om en sällsynt cell biologisk händelse fångas eller proteinet av intresse har låg uttrycksnivå, utför sedan SRLS.
   2. För SRLS hittar du en cell i det specifika cellcykelstadiet som du är intresserad av. Om du till exempel fokuserar på mikrotubules-kinetochore-bindning, använd sedan en cell vid prometafas eller metafas.
      OBS: Detta hjälper till att säkerställa att du får en högkvalitativ bild av den cell som är av intresse vid rätt tidpunkt utan att riskera fototoxicitet till provet eller blekning av fluorforerna, vilket kan uppstå under en längre film.
   3. Om du använder SRLS kan du avbilda olika cellcykelstadier av intresse över flera celler och ordna dessa bilder i kronologisk ordning.
      OBS: Detta kan användas för att konstruera en tidsmässig ordning av händelser samtidigt maximera signal- och vävnadshälsa, för att erhålla utmärkt temporal upplösning av händelsen för särskilt känsliga prover eller prover med låg signal.

5. Airyscan-bearbetning av levande cellbilder

1. När du har valt Bearbetning efter bildförvärv med bildprogrammetklickar du på Batchoch väljer sedan Airyscan Processing.
   1. Markera de bilder som ska bearbetas och klicka sedan på Kör/Process för att hämta superupplösningsbilderna.
   2. Utför bearbetningen med standardinställningen.
      OBS: Airyscan-bearbetning fungerar bara om avbildningsinställningarna är korrekt etablerade för Airyscan-avbildning.

Representative Results

Levande cell imaging utöver diffraktion gränsen i Drosophila vävnad, särskilt för GSCs, ger en möjlighet att undersöka dynamiken i subcellulära händelser i samband med cell cykeln progression. Nyligen har en studie som använder detta protokoll visat att mikrotubule aktiviteter vid modern centrrum jämfört med dottern centrosom är temporalt asymmetriska i GSCs¹⁰. Modern centrosom emanates microtubules cirka 4 timmar före mitotiska posten, medan dottern centrosome bara utstrålar mikrotubuler vid uppkomsten av mitos. De mycket aktiva mikrotubulerna från modercentrosomen interagerar med kärnmembranet och inducerar polariserade nukleära kuvertbrytning (NEBD). Den lokala NEBD är proximal till navet och tillåter mikrotubuler från modercentrosomen att komma in i kärnan och företrädesvis fästa vid den starkare syster kinetochore och syster centromere för att säkerställa att de separerar till den framtida stamcellen. Dessa observationer tyder på att en asymmetrisk mitotisk axel finns där mikrotubuler, kärnmembran, kinetochore och centromerer interagerar på ett spatiotemporally kontrollerat sätt, för att säkerställa korrekt nonrandom kromosom segregering^{slutligen 10,11,12}.

Vart och ett av dessa resultat stöddes med hjälp av SRLS-metoden som beskrivs här. Genom att utföra levande celltomografi av Drosophila-testiklar som uttrycker α-tubulin-GFP i tidiga könsceller kunde vi identifiera temporal asymmetri i mikrotubuleaktivitet i GSCs (Figur 2). Vi kunde också se den asymmetriska intensiteten hos GFP-signaler vid de två centrrosomerna som en ljusare signal vid moderns centrosom och en relativt svagare signal på dottercentrosomsidan med hjälp av ett snurrande diskkonfokalt mikroskop (Figur 2A). Skillnaden i ljusstyrka återspeglas sannolikt av den temporala asymmetrin hos mikrotubulekärnan, men den detaljerade morfologin och mängden mikrotubuli kunde inte lösas med hjälp av snurrande diskkonfokal mikroskopi (Figur 2A). Däremot tillät högupplöst bildbehandling av levande celler oss, för att visualisera morfologin och kvantifiera antalet mikrotubuli (figur 2B). Dess förbättrade upplösning visade mönster av asymmetrisk mikrotubule nukleation, förlängning och ökad interaktion med kärnmembranet (Figur 2B). Som exempel har timelapse-filmerna från α-tubulin-GFP-uttryckande GSCs publicerats i en primär forskningsuppsats (Videos S3 och Video S5)¹⁰.

Därefter utförde vi levande cell imaging på Drosophila testiklar co-uttrycker antingen α-Tubulin-GFP med Lamin-mCherry eller α-Tubulin-mCherry med Lamin-GFP i tidiga skeden könsceller. Våra resultat visar att asymmetrisk mikrotubuleaktivitet sammanföll med asymmetrisk NEBD i GSC (figur 3). Med hjälp av det konfokala mikroskopet med spinnskiva kunde vi visualisera den asymmetriska nukleära membraninvaginationen men inte de enskilda mikrotubuli som direkt kom in i kärnan (figur 3A). Däremot tillät denna livecell superupplösningsteknik oss att direkt observera dessa händelser genom att avbilda både mikrotubuli och nukleära lamina samtidigt (Figur 3B).

Därefter utförde vi levande cell imaging på Drosophila testiklar uttrycker α-Tubulin-mCherry och CENP-A-Dendra2 eller CENP-A-GFP (Centromere Protein A) i tidiga könsceller. För att bättre visualisera mikrotubule och centromerfäste, vi live imaged dem vid en lägre temperatur (~ 18 °C) för att stabilisera deras fastsättning. Vid behov kan provet kylas kort med is eller iskallt levande cellmedier i 4–5 minuter för att stabilisera mikrotubule-centromerfästet och depolymerisera eventuell obunden mikrotubule. Våra resultat visar att mikrotubulerna som härrör från den tidiga aktiva modercentrosomen företrädesvis fäster vid den starkare systercentromere (Figur 4). Med hjälp av det konfokala mikroskopet med spinnskiva visade α-Tubulin-mCherry-signalerna en asymmetrisk ljusstyrka nära de två centrrosomerna. Vi kunde också upptäcka båda systercentromererna som en signal, som visas i figur 4A (metafas), men kunde inte visualisera mikrotubule-centromerfästet (Figur 4A, metafas). Däremot gjorde den superupplösta livebilderna det möjligt för oss att visualisera mikrotubule-centromere-tillbehöret (Figur 4B). Våra resultat visar att mor centrrosom-emanating mikrotubuler fäster på centromere före dottern centrosom-emanating mikrotubuler (Figur 4B, tidig prophase).

Figur 1: System för beredning och montering av Drosophila testis. (A) Överst: cellkulturrätten med glasbotten (A-a), överför Drosophila-testikel mot mitten av skålen (A-b), placera ett dialysmembran ovanpå testikel (A-c), placera tre plastvikter på dialysmembranet (A-d). B)Sidovy: Placera plastringen på skålens förhöjda sida (B-a), placera ett 22 mm × 22 mm täckglas på plastringen (B-b), sätt ett virvel- och våtpapper på täckglaset (B-c), stäng skålen med locket (B-d). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Superupplösningstidsavbildning av mikrotubuledynamiken i Drosophila-vävnad (testiklar) som uttrycker α-tubulin-GFP (A) Konventionell konfokal mikroskopi levande cellbild som visar mikrotubuledynamik i mitten av G2-fasen till metafas. B)Luftyskanna mikroskop levande cellbild som visar asymmetrisk mikrotubule som härrör från mor mot dotter centrrosomer i mitten av G2 fas till metafas, med detaljerad strukturell information. En tecknad film föreställer Drosophila manliga könsceller. Skalstång: 5μm; asterisk: nav (nisch); grön pil: modercentrerom (stamcellssidan [M]); röd pil: dottercentrering (differentierande dottercellssida [D]); gul pil: centrrosom i spermatogoniacell (stamceller som inte är stamgroddar); magentapil: mikrotubule som sticker i kärnan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 3: Superupplösningstidsavbildning av mikrotubule poking-in aktivitet och asymmetrisk nedbrytning av kärnhöljet i Drosophila-vävnad (testiklar) som uttrycker Lamin-mCherry och α-Tubulin-GFP. (A) Konventionell konfokal mikroskopi levande cellbild som visar mikrotubule dynamik från G2-M fas till mitos. Bild som visar α-Tubulin-GFP-intensiteten på stamcellssidan och dess interaktion med kärnmembranet. B)Luftig mikroskop levande cellbild som visar mikrotubule poking-in och asymmetrisk NEBD vid stamcellssidan. Skalstång: 5μm; asterisk: nav (nisch); orange pil: platsen för mikrotubule petning i kärnmembran; magentapil: mikrotubuler som sticker in på stamcellssidan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4: Superupplösningstidsavbildning av mikrotubule och centromerfäste i Drosophila-vävnad (testiklar) som uttrycker α-Tubulin-mCherry och CENP-A-Dendra2. (A) Konventionell konfokal mikroskopi levande cellbild som visar mikrotubule och centromer interaktion från tidig profas till metafas. Bild som visar α-Tubulin-mCherry intensitet vid stamcellssidan och CENP-A-GFP signal. (B) Luftyskan mikroskop levande cellbild som visar mikrotubuli som härrör från modern centrosom och fäst vid de starkare centromererna i tidig profas. Vid metafas är centromerer fästa vid motsatt pol (biorientering). Skalstång: 5μm; asterisk: nav (nisch); magentapil: kinetochorefiber eller K-fiber (mikrotubuli fästa vid centromer). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

Superupplösta mikroskopimetoder ger rumslig upplösning så hög som 10s nanometer^4,5,6. Storm- och PALM-mikroskopimetoderna möjliggör upplösning upp till 20 till 50 nm (XY-upplösning), medan STED-mikroskopi ger upplösning på 20 till 100 nm (XY-upplösning). Sim-mikroskopin har en rumslig upplösning på 100 till 130 nm¹⁵. Men på grund av dess höga fotontäthet och långa förvärvstid är det extremt utmanande att använda dessa tekniker för levande cellavbildning.

Imaging subcellulära strukturer, såsom cytoskeleton, kromosomer och organeller i levande celler i vävnader, kräver tekniken att vara både ultrasensitiv och noninvasive samtidigt som den har en hög rumslig upplösning. Airyscan superupplösningsteknik som presenteras här kombinerar konfokal avbildning med ett 0,2 Airy Unit pinhole, tillsammans med pixelomtilldelning och dekonvolution. Denna teknik kan uppnå en 1,7x högre upplösning än konventionell konfokal mikroskopi⁷. ~ 220-230 nm upplösning av konventionell konfokal mikroskopi begränsas av ljusdiffraktionsgränsen, men denna bildteknik kan uppnå cirka 140 nm XY-upplösning, vilket kan jämföras med andra allmänt använda superupplösningstekniker, såsom SIM (upplösning vid 110-120 nm)¹⁶.

Anpassningsförmågan och mångsidigheten hos Airyscan konfokal mikroskopi gör det möjligt att tillämpa detta protokoll på olika andra typer av vävnader och celler för att studera ett varierat antal cellbiologiska^{processer 7,16}. Med hjälp av denna teknik kan forskare få timelapse-bilder på superupplösningsnivå för att visualisera cellulär dynamik med oöverträffad spatiotemporal detalj.

Det kritiska steget i denna teknik är att montera provet på skålen så att det inte rör sig eller flyter under timelapse-avbildning. Att hålla provet nära eller fast vid avbildningsytan (dvs. skålens glasbotten) är avgörande för att förvärva superupplösningsbilder och upprätthålla den optimala mikromiljön för provet. Detta säkerställer att provet inte betonas på grund av tillstånd som hypoxi och förändringar i temperatur eller fuktighet.

Trots nyttan av detta protokoll finns det några varningar. Timelapse imaging med Airyscan-läget är en relativt långsam process jämfört med konventionell konfokal mikroskopavbildning. Därför kan även den minsta fysiska förskjutningen av provet resultera i dålig upplösning. Denna situation kan förhindras genom att använda en immobiliseringsmetod för att fästa provexemplar på avbildningsytan (t.ex. poly L-lysinbeläggning eller annan beläggning som är kompatibel med provet). Att placera ett dialysmembran ovanpå vävnaden och lägga till några små vikter enligt beskrivningen i detta protokoll hjälper också till att förhindra vävnadsrörelser eller flytande samtidigt som det möjliggör gasformigt utbyte. Timelapse-bildceller som ligger djupt i vävnaden med superupplösningsläget kräver hög belysning och kan orsaka fotoblekning. Detta kan minimeras genom att justera antalet z-skivor, belysningskraft och genomsnittsalgoritm för att uppnå optimala inställningar för exemplet. Om cellen eller vävnaden är känslig för lasertoxicitet, hypoxi eller annan stress under avbildningen kan cellcykelförstrãing uppstå. Om ett protein har ett extremt lågt uttryck, kort halveringstid eller låg fluorescenssignal, kan fotoblekning uppstå vilket resulterar i en bild med dålig kvalitet. Detta kan undvikas genom att ta en SRLS, göra en kort film eller skjuta med långa intervaller mellan på varandra följande tidpunkter. Dessutom måste mikroskopinställningen och tidsfördröjningsparametern (enligt beskrivningen i det här protokollet) optimeras för att passa provet.

Eftersom det är viktigt att provet inte flyttas eller degenereras under processen kan långvarig timelapse-avbildning som varar över natten eller mer än en dag utan att kompromissa med bildupplösningen vara utmanande.

De befintliga metoderna fokuserar främst på att optimera superupplösningsmikroskopi och timelapse-bildparametrar^{separat 1,9}. Dessa metoder innehåller dock inga detaljer om provberednings- eller monteringsparametrar, som är avgörande för att säkerställa provets livskraft och mikroskopets anpassningsförmåga för att uppnå önskad superupplösning vid timelapse-avbildning. I den här metoden har vi optimerat bildparametrarna, provberednings- och monteringsparametrarna så att timelapse-avbildning kan utföras under en längre tid för att förvärva superupplösningsbilder utan att riskera både degenerering av provet och upplösningen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A