Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

Published: January 22, 2021 doi: 10.3791/61565
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Regeneron Tech Centers, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 2Regeneron Therapeutic Proteins, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 3Immunology and Inflammation, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

Abstract

מחקרים מקיפים אפיינו את ההתפתחות וההבחנה של תאי מורין B באיברי לימפה משניים. נוגדנים המופרשים על ידי תאי B בודדו ופותחו לטיפולים מבוססים היטב. אימות התפתחות תאי מורינה B, בהקשר של עכברים נוטים לחיסון עצמי, או בעכברים עם מערכת חיסונית שונה, הוא מרכיב חיוני בפיתוח או בדיקה של חומרים טיפוליים בעכברים והוא שימוש מתאים בציטומטריית זרימה. פרמטרים ציטומטריים של זרימת תאי B מבוססים היטב יכולים לשמש להערכת התפתחות תאי B בצפק המורין, במח העצם ובטחול, אך יש לדבוק במספר שיטות עבודה מומלצות. בנוסף, ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי B צריך גם להשלים קריאות נוספות של פיתוח תא B. נתונים הנוצרים בטכניקה זו יכולים לקדם את הבנתנו בסוג פראי, מודלים של עכבר מועד אוטואימוניות, כמו גם עכברים אנושיים שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מולקולות דמויות נוגדנים או נוגדנים כטיפולים.

Introduction

נוגדנים חד שבטיים הפכו יותר ויותר לטיפול הבחירה במחלות אנושיות רבות כאשר הם הופכים לחלק מהרפואה המיינסטרים1,2. תיארנו בעבר עכברים מהונדסים גנטית המייצרים ביעילות נוגדנים המעניקים מחסה לאזורים משתנים אנושיים לחלוטין עם קבועי עכבר IgH3,4. לאחרונה, תיארנו עכברים מהונדסים גנטית המייצרים מולקולות דמויות נוגדנים שיש להן אנטיגן מחייב מובהק5. נוגדנים מופרשים על ידי תאי B ומהוות את הבסיס לחסינות הומוריסטית אדפטיבית. ישנם שני סוגים שונים של תאי B, B-1 ו- B-2. ביונקים, תאי B-1 מקורם בכבד העוברי ומועשרים ברקמות הרירית ובחללים הפלורליים הצפקיים לאחר הלידה, בעוד שתאי B-2 מקורם בכבד העוברי לפני הלידה ולאחר מכן במח העצם (BM). תאי B-2 מועשרים באיברי לימפה משניים כולל הטחול והדם6,7,8. ב- BM, אבות ההמטויאטי B-2 מתחילים להבדיל לתאי פרו-B עם תחילת ארגון מחדש של שרשרת כבדה Ig mu9,10. סידור מחדש מוצלח של שרשרת כבדה Ig והרכבתה לתוך קולטן התא טרום B (טרום BCR), יחד עם איתות והתרחבות שגשוג, מובילים לבידול לתאי טרום B. לאחר שתאי טרום-B מסדרים מחדש את שרשראות האור של Ig kappa (Igκ), או אם הם אינם יצרניים, שרשראות האור של Ig lambda (Igλ), הם משתלבים עם שרשרת μ כבדה, וכתוצאה מכך ביטוי IgM BCR משטחי. חשוב לציין כי ביטוי פני השטח של IgM ידוע להיות מופחת בתנאים של פעילות אוטומטית, ובכך תורם סובלנות עצמית בתאי B לא מגיבים פונקציונלית או אלרגית11,12. תאי B לא בוגרים נכנסים לשלב מעבר, שבו הם מתחילים לבטא IgD ולעבור מה- BM לטחול. בטחול, ביטוי IgD גדל עוד יותר והתאים מבשילים לשלב שני של תאי B מעבר, ולאחר מכן השלמת מצב ההתבגרות שלהם והתפתחות לתוך אזור שולי (MZ) או תאי זקיקים (Fol)13,14,15. בעכברים בוגרים, בסביבה שאינה חולה, מספר תאי B בוגרים נשאר קבוע למרות 10-20 מיליון תאי B לא בוגרים הנוצרים מדי יום ב- BM. מתוכם, רק שלושה אחוזים נכנסים למאגר של תאי B בוגרים. גודל תא B ההיקפי מוגבל על ידי מוות תאי, בין היתר בשל מספר גורמים כולל תגובה עצמית והתבגרות חלקית16,17,18. ניתוח ציטומטרי זרימה שימש בהרחבה כדי לאפיין ולספור תאים רבים של תאי מערכת החיסון בבני אדם ועכברים. אמנם יש כמה קווי דמיון בין תאים אנושיים מורין B, פרוטוקול זה חל רק על ניתוח של תאי מורין B. פרוטוקול זה פותח במטרה פנוטיפינג עכברים מהונדסים גנטית, כדי לקבוע אם מניפולציה גנטית תשנה את התפתחות תאי B. Cytometry זרימה היה גם פופולרי מאוד ביישומים רבים נוספים, כולל במדידת הפעלת התא, פונקציה, התפשטות, ניתוח מחזור, ניתוח תוכן DNA, אפופטוזיס ומיון תאים 19,20.

ציטומטריית זרימה היא הכלי המועדף לאפיין תאי לימפוציטים שונים בעכברים ובבני אדם, כולל באיברים מורכבים כגון הטחול, ה- BM והדם. בשל ריאגנטים נוגדנים ספציפיים לעכבר עבור ציטומטריית זרימה, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור לא רק חלבונים פני התא, אלא גם פוספורוטאין תאיים וציטוקינים, כמו גם קריאות פונקציונליות21. כאן אנו מדגימים כיצד ריאגנטים ציטומטריה זרימה ניתן להשתמש כדי לזהות תת קבוצות תאי B כפי שהם בוגרים להבדיל באיברים לימפואידיים משניים. לאחר אופטימיזציה של תנאי כתמים, טיפול בדגימות, הגדרת מכשיר נכון ורכישת נתונים, ולבסוף ניתוח נתונים, פרוטוקול לניתוח ציטומטרי זרימה מקיף של תא B בעכברים ניתן להשתמש. ניתוח מקיף כזה מבוסס על המינוח בן עשרות השנים שהומצא על ידי הארדי ועמיתיו, שבו ניתן לחלק תאי BM B-2 מתפתחים לשברים שונים (Fraction) בהתאם לביטוי שלהם של B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ו- IgD22. הארדי ואח', הראו כי ניתן לחלק תאי BM BM B B220+ CD43 לארבע קבוצות משנה (שבר A-C') על בסיס ביטוי BP-1 ו- CD24 (30F1), בעוד שתאי B220+ CD43-(עמום עד שלילי) BM B יכולים להיפתר לשלוש קבוצות משנה (שבר D-F) בהתבסס על ביטוי דיפרנציאלי של IgD ו- IgM23 פני השטח. שבר A (תאי טרום-PRO-B) מוגדרים כ- BP-1- CD24 (30F1)-, שבר B (תאים מוקדמים של פרו-B) מוגדרים כ- BP-1- CD24 (30F1)+, שבר C (תאי Pro-B מאוחרים) מוגדרים כ- BP-1+ CD24 (30F1)+, ושבר C' (תאים מוקדמים לפני B) מוגדרים כ- BP-1+ ו- CD24high. יתר על כן, שבר D (תאים לפני B) מוגדרים כתאי B220+ CD43- IgM- B, ו- Fraction E (תאי B שנוצרו לאחרונה, שילוב של תאים לא בוגרים ומעבריים) מוגדרים כתאי B220+ CD43- IgM+ B ו- Fraction F (תאים בוגרים, חוזרים על B) מוגדרים כתאי B220high CD43- IgM + B. לעומת זאת, ניתן לחלק את רוב תאי B הנאיביים שנמצאו בטחול לתאי B בוגרים (B220+ CD93-) B ותאי מעבר (T1, T2, T3) בהתאם לביטוי של CD93, CD23 ו- IgM. ניתן לפתור תאי B בוגרים לתוך אזור שולי ותת-קבוצות זקיקים בהתבסס על ביטוי של IgM ו- CD21/CD35, וניתן לחלק עוד יותר את תת-קבוצות המשנה של הזקיקים לסוג זקיקים בוגרים I ותת-קבוצות תאים מסוג II B מסוג II בהתאם לרמת ביטוי פני השטח IgM ו- IgD24. אוכלוסיות תאי B בטחול אלה מבטאות בעיקר שרשרת אור של איגה. לבסוף, אוכלוסיות תאי B-1 B, שמקורן בכבד העובר ונמצאות בעיקר בחללים הצפקיים והפלורליים של עכברים בוגרים, תוארו בספרות. תאי B צפקיים אלה ניתן להבחין בין תאי B-2 B שתוארו בעבר על ידי חוסר ביטוי CD23 שלהם. לאחר מכן הם מחולקים עוד יותר לאוכלוסיות B-1a או B-1b, כאשר הראשון מוגדר על ידי נוכחות של CD5 והאחרון על ידי היעדרו25. אבות תאי B-1 מצויים בשפע בכבד העוברי, אך אינם נמצאים ב- BM למבוגרים. בעוד תאי B-1a ו- B-1b מקורם באבות צאצא שונים, שניהם זורעים את חללי הצפק והפלורל24. בניגוד לתאי B-2, תאי B-1 מסוגלים באופן ייחודי להתחדשות עצמית ואחראים לייצור נוגדני IgM טבעיים.

פגמים בהתפתחות תאי B יכולים להתעורר במקרים רבים, כולל ליקויים ברכיבי BCR26,27, הפרעות של מולקולות איתות המשפיעות על עוצמת איתות BCR14,28,29, או הפרעה של ציטוקינים המווסתים את הישרדות תאי B30,31 . ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי הלימפה תרם לאפיון של בלוקי פיתוח תאי B בעכברים אלה ורבים אחרים. אחד היתרונות של ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי לימפה הוא שהוא מציע את היכולת לבצע מדידות על תאים בודדים המתקבלים רקמה מנותקת חיה. הזמינות של ריאגנטים במגוון הולך וגדל של פלואורופורים מאפשרת ניתוח סימולטני של פרמטרים מרובים ומאפשרת הערכה של הטרוגניות תאי B. יתר על כן, הספירה של תאי B על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה משלימה בדיקות אימונולוגיות אחרות כגון שיטות אימונוהיסטוכימיה המדמיינת לוקליזציה של תאים בתוך איברי לימפה, זיהוי רמות נוגדנים במחזור כמדד של חסינות הומוריסטית, כמו גם שתי מיקרוסקופיה פוטונית למדידת תגובות תאי B במרחב ובזמן אמיתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל מחקרי העכברים נוהלו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של Regeneron (IACUC). הניסוי נערך על רקמות משלושה עכברים נקבות C57BL/6J (גיל 17 שבועות) ממעבדות ג'קסון. יש לתעד את כל הנוגדנים לפני תחילת הניסוי כדי לקבוע ריכוז אידיאלי. בעת שימוש בחרוזי פיצוי לפיצוי בצבע יחיד, ודא שהם מכתימים בהירים או בהירים יותר מהדגימות שלך. שמור את כל המאגרים, הנוגדנים והתאים על קרח או ב 4 °C (70 °F). לאחר תוספת של צבע הכדאיות, לבצע את כל השלבים ואת הדגירה ב 4°C באור נמוך או בחושך.

1. קציר תאים צפק ובידוד תא בודד

  1. המתת חסד את העכבר באמצעות CO2 או על פי פרוטוקול שאושר.
  2. הנח את העכבר על גבו, ריסס עם 70% אתנול, וחתוך עור בטן החוצה עם מספריים, נזהר לא לחתוך את צפק.
  3. הזריקו 3 מ"ל של חוצץ כביסה קר כקרח (0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב- DPBS [vol/vol]) לחלל הצפק עם מזרק 3 מ"ל המצויד במחט 25 מד.
  4. יש לעסות בעדינות את הצי בקצות האצבעות.
  5. חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4.
  6. הכנס מזרק 3 מ"ל מצויד מחט 18 G דרך צפק, נזהר כדי למנוע איברים ושומן.
  7. לחלץ את חוצץ לשטוף, עכשיו מכיל תאים צפק, ולהעביר צינור חרוט 15 מ"ל על קרח.
  8. חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4.
  9. חותכים חור קטן בצפק תוך כדי החזקה עם פינצטה.
  10. הכנס פיפטה העברה חד פעמית לתוך החור ולאסוף את חוצץ לשטוף הנותר, שוב הימנעות שומן ואיברים.
  11. העבר את התאים הניטורונים הנותרים שנאספו לצינור החרוט 15 מ"ל על קרח.
    הערה: יש להשליך דגימה אם זיהום הדם ניכר.
  12. לדגור על התאים על הקרח עד הטחול ואת מיצוי העצם הושלמו.
  13. צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.
  14. resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של חוצץ לשטוף.
  15. לסנן את התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל נקי על קרח.
  16. קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.

2. קציר טחול ובידוד תא בודד

  1. הנח את העכבר על בטנו וחתוך דרך צפק על הישבן השמאלי באמצעות מספריים נקיים. חותכים את הטחול, מסירים שומן ורקמת חיבור.
  2. מעבירים את הטחול לצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חוצץ כביסה על קרח.
  3. לדגור את הטחול על הקרח עד מיצוי העצם הושלם.
  4. העבר את הטחול לצינור דיסוציאציה אוטומטי עם 5 מ"ל של חיץ תמה של תאי דם אדומים. מניחים את הצינור על מכשיר דיסוציאטור הרקמה ומנתקים למשך 60 s כדי ליצור השעיה של תא בודד.
    הערה: מותר גם להשתמש בשיטות שגרתיות אחרות של השגת מתלים טחול חד-תאי כגון ניפוץ בין שקופיות זכוכית חלבית במאגר כביסה. אם נעשה שימוש בשיטה אחרת של דיסוציאציה, בצע את הניתוק עם צנטריפוגה, שאיפה, ולאחר מכן resuspension ב 5 מ"ל של מאגר תמוגה של תאי דם אדומים לפני שתמשיך לשלב 2.5.
  5. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
  6. הוסף 10 מ"ל של מאגר כביסה של 4 °C המכיל 2m EDTA.
  7. מעבירים לצינור חרוט נקי 15 מ"ל.
  8. צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.
  9. resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של 4 °C חיץ לשטוף.
  10. לסנן את התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל נקי על קרח.
  11. קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.

3. קציר BM ובידוד תא בודד

  1. הסר את העור מהחצי התחתון של גוף העכבר. לקצץ את השריר עודף מהרגל. הסר את כל הרגל עם מספריים, נזהר לא לחתוך את עצם הירך. נקה את עצם הירך ואת השוקה על ידי הסרת השרירים, השומן והרגליים הנותרים.
  2. העבר את העצמות לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חוצץ לשטוף על קרח.
  3. לנקב את החלק התחתון של צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, משאיר חור קטן מספיק לעצמות הרגל לא לבלוט. הכנס את צינור 0.5 מ"ל לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נקי. חותכים את קצה עצם הירך והשוקה פרוקסימלי לברך ומניחים את הקצוות החתוכים עם הפנים כלפי מטה לתוך צינור 0.5 מ"ל.
  4. צנטריפוגות התאים ב 6,780 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (7 °F).
  5. Resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של חיץ תמה של תאי דם אדומים ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל נוספים של חיץ תמותה של תאי דם אדומים.
  6. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
  7. הוסף 10 מ"ל של מאגר כביסה של 4 °C המכיל 2m EDTA.
  8. צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.
  9. resuspend גלולה התא ב 3 מ"ל של 4 °C חיץ לשטוף.
  10. סנן תאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי 15 מ"ל על קרח.
  11. קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.

4. כתם תאים ולהכין פיצוי

  1. Aliquot 106 תאים של כל סוג תא מכל חיה לצלחת תחתית 96 גם U.
    1. הקפד לכלול מספיק בארות עבור כל הדגימות והפקדים, כולל כתם מלא, פלואורסצנטיות-מינוס אחד (FMO), לא נגוע, ולבסוף את הפיצוי האופציונלי בצבע יחיד עבור כל פלואורופור בשימוש.
    2. עבור לוח ההתבגרות BM ולוח ההתבגרות הטחול, תאי aliquot לתוך 2 בארות, 106 תאים לבאר, עבור כל דגימת כתם מלאה. עבור פקדי הכדאיות של פיצוי בצבע יחיד, הוסף 2 x 106 תאים מכל סוג תא לבארות בודדות.
  2. צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.
  3. resuspend התאים ב 200 μL של DPBS (ללא BSA או FBS). שלב זה חשוב להסרת חלבון לפני הכתמתו בצבע כדאיות תגובתי לאמין.
  4. חזור על שלבים 4.2 ו- 4.3.
  5. חזור על שלב 4.2.
  6. resuspend התאים ב 100 μL צביעת הכדאיות מדולל 1:1,000 ב- DPBS.
    הערה: אם אתם משתמשים בתאים לפיצוי של צבע בודד, אל תוסיפו צבע כדאיות לבארות אלה.
    1. עבור כל ערכת כתמים, השאירו מספר בארות לא נגועות לדגימה לא מוכתמת לחלוטין ולכל פקד אחר שתצטרכו.
    2. עבור כל ערכת כתמים, להשאיר באר נוספת לא מוכתמת עבור בקרת FMO הכדאיות.
    3. עבור פקדי פיצוי הכדאיות של צבע יחיד: Resuspend 2 x 106 תאים, aliquoted בשלב 4.1, ב 200 μL של צבע קיימא מדולל. העבר 100 μL של תאים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, תאי חום במשך 5 דקות ב 65 °C (65 °F), ולהעביר את 100 μL של תאים מוכי חום בחזרה לבאר המקורית עם 100 μL הנותרים תאים חיים.
  7. תאי דגירה ב 4 °C (50 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.
  8. צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.
  9. resuspend התאים ב 200 μL של DPBS (ללא BSA או FBS).
  10. חזור על שלבים 4.8 ו- 4.9.
  11. חזור על שלב 4.8.
  12. resuspend התאים ב 50 μL של בלוק Fc מדולל 1:50 (ריכוז סופי = 10 מיקרוגרם / מ"ל) במאגר כתמים (0.5% BSA ב- DPBS [vol/vol]).
    1. עבור תאים צפק - גם להוסיף 5 μL של חוסם מונוציטים כדי להפחית כתמים לא ספציפיים.
  13. לדגור על התאים ב 4 °C (55 °F), מוגן מפני אור, במשך 15 דקות.
  14. הכן תערובות מאסטר כתמים מלאות ו- FMOs במאגר כתמים לנפח סופי של 100 מיקרול לכל 106 תאים. עיין בטבלה 1-טבלה 4 עבור רשימות הנוגדנים.
    הערה: FMOs מיוצרים על ידי הכללת כל הנוגדנים בערכת כתמים למעט אחת. הכן FMO לכל נוגדן בערכת כתמים. כאשר ערכת כתמים מכילה צבעים מבריקים מרובים, החלף 50 μL של חיץ כתמים מבריק עבור חיץ כתמים לכל דגימה
  15. מבלי להסיר בלוק Fc, הוסף 100 μL של תערובות כתמים מלאות ו- FMOs לבארות נבחרות.
  16. הכן פקדי פיצוי בצבע יחיד עבור כל נוגדן בערכת כתמים.
    1. אם אתם משתמשים חרוזי פיצוי, עקבו אחר הוראות הייצור לשימוש.
    2. אם אתם משתמשים בתאים, מוסיפים נוגדן ציצי ל-106 תאים, השמורים בעבר בשלב 4.6.1 ללא צבע כדאיות, במאגר כתמים של 100 μL. אם כל התאים במדגם חיוביים עבור סמן מסוים, להפריש תאים לא נגועים לשמש בעת רכישת נתוני פיצוי על cytometer הזרימה.
  17. לדגור על התאים והחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.
  18. צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.
  19. resuspend התאים והחרוזים ב 200 μL של חוצץ כתמים.
  20. חזור על שלבים 4.18 ו- 4.19 פעמיים.
  21. חזור על שלב 4.18.
  22. כדי לתקן את הדגימות לניתוח בתוך 48 שעות, resuspend תאים וחרוזים ב 200 μL של 2% paraformaldehyde ב- DPBS.
    זהירות: Parafomaldehyde הוא סכנה בריאותית חמורה ודליק. עיין בגליון הנתונים של Safty לפני השימוש.
  23. לדגור על התאים והחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.
  24. חזור על שלבים 4.18 ו- 4.19 פעמיים.
  25. מניחים צלחת מסנן על צלחת U-תחתית נקייה 96. באמצעות ריבוי פיפטות, מעבירים כל דגימה לבאר של צלחת המסנן.
  26. צנטריפוגה צלחת המסנן-96 היטב הגדרת צלחת U-התחתון ב 845 x g במשך 2 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את צלחת המסנן ואת decant supernatant על ידי היפוך מהיר והבהבה של הצלחת מעל כיור, נזהר לא לחצות לזהם בארות.
  27. עבור BM ולוחות התבגרות טחול מחדש את התאים מוכתמים לחלוטין 100 μL של חוצץ כתמים. מערבבים את 2 בארות עבור כל חיה לתוך 1 היטב. תגדיל מחדש את הלוחות הנותרים, את ה- FMOs והפקדים ב- 200 מיקרו-אל של מאגר כתמים.
  28. דגירה תאים קבועים וחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, לילה.

5. רכישת נתונים ציטומטריים זרימה

  1. אתחל ו- QC את ציטומטר הזרימה בהתאם להוראות היצרן.
  2. טען את התבנית הספציפית לכל חלונית.
  3. לפני הקלטת נתונים, ודא שכל האירועים עבור כל מדגם הם בקנה מידה וגלויים על התוויות הנקודות.
  4. הקלט בקרות פיצוי עבור כל לוח כתמים באמצעות פיצויי כתמים בודדים שהוכנו בשלב 4.16. הגדר שערים חיוביים ושליליים עבור כל מדגם. יש התוכנה לחשב את מטריצת הפיצוי.
  5. התחל לרכוש את המדגם הראשון, והבטח שהשערים נקבעים כראוי.
  6. הגדר את המכונה כדי להקליט לפחות 50,000 B אירועים תא עבור לוח תא B הצפק ולוח טחול Igκ ו Igλ; 150,000 אירועי תאי B עבור לוח ההבשלה BM; ו-300,000 אירועי תאי B עבור לוח ההתבגרות של הטחול.
  7. עבור כל לוח כתמים, הפעל והקלט את הדגימות המוכתמות במלואן עבור כל בעל חיים, מדגם לא נגוע וה- FMOs.

6. ניתוח נתונים

  1. המשך בניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה. עקבו אחר אסטרטגיות הגטינג המתוארות באיור 1, איור 2, איור 3,איור 4. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מציגים את אסטרטגיית הגינג לאפיון התפתחות תאי B בצפק העכבר, BM והטחול. הבסיס של הניתוח נוצר סביב הרעיון של הכתמה עם צבע קיימא, ואז gating החוצה מכפילים המבוססים על אזור פיזור קדימה (FSC-A) ו קדימה-פיזור-גובה (FSC-H), ולבסוף gating פסולת על ידי בחירת תאים על פי המאפיינים FSC-A וצד-פיזור-אזור (SSC-A) שלהם, המכונה כאן שער הגודל, אשר משקפים את גודל התא היחסי ואת גרגריות התא, לפני גטינג על אוכלוסייה של עניין.

ניתוח ציטומטרי של תאי B צפק מראה את התדרים של תאי צפק קיימא, תאי B כוללים, קבוצות משנה B-1 ו- B-2, כמו גם תאי B-1a ו- B-1b בעכברים C57BL / 6J (איור 1), באמצעות לוח כתמים המתואר בטבלה 1. מספר התא המוחלט הממוצע של תדרים אלה מוצג בטבלה 5. ניתן לתווג בהתנגדויות בתאי B-1 על-ידי התפלגות של קבוצות משנה של תאים, לפי תדירות תאים או לפי מספר תאים מוחלטים לכל עכבר.

ניתוח ציטומטרי של זרימה של תאי BM B מראה את התדרים של תאי BM בני קיימא, תאי B בסך הכל, שבר A (תאי טרום-B ולימפוציטים מזהמים), תאים טרום-B, שבר B, שבר C, שבר C', שבר D, לא בוגר (קבוצת משנה בשבר E), מעבר (קבוצת משנה בשבר E) ותאי שבר F B בעכברים C57BL/6J (איור 2), באמצעות לוח מכתים המתואר בטבלה 2. מספר התא המוחלט הממוצע של תדרים אלה מוצג בטבלה 6. ניתן לתווג מוטרדים בתאי BM B על-ידי התפלגות של קבוצות משנה של תאים, לפי תדירות תאים או לפי מספר תאים מוחלט לכל רגל.

ניתוח ציטומטרי של זרימה של תאי B בטחול מציג את התדרים של תאי טחול ברי קיימא, תאי B כוללים, תאי B מעבר, T1, T2, תאי T3, תאי B בוגרים, תאי I זקיקים (Fol I), תאי זקיקים II (Fol II), תאים קודמים של אזור שולי (MZ), תאי MZ בוגרים ותאי B-1 בעכברים C57BL/6J (איור 3), באמצעות לוח מכתים המתואר בטבלה 3. מספר התא המוחלט הממוצע של תדרים אלה מוצג בטבלה 7. ניתן לתוות את ההסתבפויות בתאי הטחול B על-ידי התפלגות של תת-קבוצות תאים, לפי תדירות תאים או לפי מספר תאים מוחלט לטחול.

באופן דומה, ניתוח ציטומטרי של הטחול בזרימה מראה את התדרים של תאי Igκ+ ו- Igλ+ B בעכברים C57BL/6J (איור 4), באמצעות לוח כתמים המתואר בטבלה 4. מספר התא המוחלט הממוצע של תדרים אלה מוצג בטבלה 8. ניתן לתייג את ההסתייגויות ב- Igκ+ וב- Igλ+ Bcells על-ידי התפלגות של תת-קבוצות תאים, לפי תדירות תאים או לפי מספר תאים מוחלטים לכל טחול.

נוגדן פלואורופור שיבוט
CD19 נגמ"ש-H7 1D3
B220 נגמ"ש RA3-6B2
IgM פססי7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC S7
CD23 BUV395 B3B4
CD11b BV711 M1/70
CD5 BV605 53-7.3

טבלה 1: לוח תאי B צפקי

נוגדן פלואורופור שיבוט
CD19 נגמ"ש-H7 1D3
B220 נגמ"ש RA3-6B2
IgM פססי7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC 1B11
CD24 (HSA) PE 30-F1
C-Kit BUV395 2B8
BP-1 BV786 BP-1
CD93 BV711 AA4.1
ערוץ dump
CD3 AF700 17-A2
CD11b AF700 M1/70
GR1 (Ly6C/6G) AF700 RB6-8C5
טר119 AF700 TER-119

טבלה 2: לוח התבגרות מח עצם

נוגדן פלואורופור שיבוט
CD19 נגמ"ש-H7 1D3
B220 נגמ"ש RA3-6B2
IgM פססי7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD43 FITC S7
CD23 BUV395 B3B4
CD21/35 BV421 7G6
CD11b AF700 M1/70
CD5 BV605 53-7.3
CD93 PE AA4.1

טבלה 3: לוח התבגרות טחול

נוגדן פלואורופור שיבוט
CD19 נגמ"ש-H7 1D3
B220 נגמ"ש RA3-6B2
IgM פססי7 II/41
IgD PerCpCy5.5 11-26c.2a
CD3 PB 17-A2
קאפה FITC 187.1
למדא PE RML-42

טבלה 4: טחול איגה ופאנל איגה

Figure 1
איור 1: אפיון אוכלוסיות תאי B בצפק. תאי B צפקים מגודרים בגודלם מופרדים תחילה תחילה מתאים מזהמים על ידי גינג על תאי IgM+. תאי B-1 ו- B-2 נבדלים זה מזה בהיעדרות (B-1) או בנוכחות CD23 (B-2). ביטוי CD5 הבא משמש לתאי B-1a (CD5+) מוגדרים בתאי B-1b (CD5-). FMOs שימשו כדי לקבוע אמפירית היכן לצייר שערים. המספרים הם אחוזים מכל אוכלוסייה באותה התפלגות צפיפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אפיון תת-קבוצות של תאי B ב- BM. תאי BM B מגודרים בגודלם מופרדים מתאים שאינם B על-ידי gating ב- B220+ dump- (כאשר dump מתייחס לתאי CD3/GR-1/CD11b/TER119). ביטוי CD43 ו- B220 מגדיר עוד יותר את השבר הארדי A-C' (CD43+ B220+) ואת שבר הארדי D-F (CD43low/neg B220+/++ ). שבר A-C' מופרד עוד יותר באמצעות ביטוי של BP-1 ו- CD24. שבר A (BP-1- CD24-) מתאים לתאי טרום-B יחד עם תאים מזהמים. כדי להפריד בין תאים מלפנים-B לבין תאים מזהמים בשבר A, הביטוי של CD93 והיעדר CD19 מנוצלים. שבר B (BP-1- CD24int) ושבר C (BP-1+ CD24int) תואמים לתאי Pro-B מוקדמים ומאוחרים, בהתאמה, ושבר C' (BP-1+/- CD24+) מתאים לתאי טרום-B מוקדמים. כדי להפריד את שבר D-F, ביטוי של IgM ו- IgD מנוצלים. שבר D מתאים לתאי טרום-B מאוחרים (IgM-/IgD-נמוך); שבר E (שער כחול, IgMint /IgD גבוה-) הן לא בוגרות (Imm, IgMint IgD-) והן מעבר (טראן, IgMhigh IgD-) תאי B; ושבר F (IgMint/IgD גבוה+) לחישוב מחדש של תאי B בוגרים. FMOs שימשו כדי לקבוע אמפירית היכן לצייר שערים. המספרים הם אחוזים מכל אוכלוסייה באותה התפלגות צפיפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אפיון התבגרות תאי B בטחול. תאי טחול B בעלי קיימא, תא יחיד, בגודל מגודר מופרדים מתאים שאינם B על-ידי ג'יטינג בתאי B220+. כדי לזהות את קבוצת המשנה B-1, תאי CD23- CD19+ מזוהים ומוגדרים על-ידי ביטוי של CD43. כדי לסווג אוכלוסיות B-2, תאי CD19+ מופרדים לתאי מעבר (CD93+ B220+) ותאי B בוגרים (CD93- B220+). תאי מעבר (CD93+ B220+) מחולקים עוד יותר לאוכלוסיות T1 (IgM+ CD23-), T2 (IgM+ CD23+) ו- T3 (IgMint CD23+). תאים בוגרים (CD93- B220+) מופרדים לתאי B של אזור שולי (CD21/35+ IgM+) ולזקיקים (CD21/35int IgMint/+). הביטוי של CD23 משמש עוד יותר להפרדת תאי מבשר MZ (CD23+ B220+) מתאי MZ בוגרים יותר (CD23- B220+). לאחר מכן, אוכלוסיות זקיקים מתויגות לתאי Fol I (IgD+ IgMint) ו-Fol II (IgD+ IgM+). FMOs שימשו כדי לקבוע אמפירית היכן לצייר שערים. מספרים הם אחוזים מכל אוכלוסייה באותה התוויית צפיפות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ביטוי איגה ואיגה של תאי טחול B. תאי B מגודרים בגודל טחול בגודל שאינם B מופרדים מתאי B שאינם B על-ידי התזת תאי B220+ CD3. תאי B נבדלים לאחר מכן על ידי הביטוי של איגה ואיגה. המספרים הם אחוזים מכל אוכלוסייה באותה התפלגות צפיפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מספר תא מוחלט
מספר בעלי חיים תאים צפקיים קיימא תאי B תאי B-1a תאי B-1b תאי B-2
1 1.02E+07 4.67E+06 1.28E+06 8.95E+05 2.35E+06
2 9.92E+06 4.52E+06 1.49E+06 9.60E+05 1.91E+06
3 1.15E+07 4.56E+06 1.71E+06 9.19E+05 1.78E+06
ממוצע 1.05E+07 4.58E+06 1.49E+06 9.25E+05 2.01E+06

טבלה 5: מספרי תאים מוחלטים של קבוצות משנה של תאי B צפקיים

מספר תא מוחלט
מספר בעלי חיים תאי מח עצם קיימא תאי B שבר A טרום-פרו שבר B שבר C שבר ג' שבר D ילדותי המעבר שבר F
1 5.05E+07 9.70E+06 1.13E+06 1.95E+05 2.22E+05 9.14E+04 6.31E+05 1.59E+06 4.56E+05 7.81E+05 4.03E+06
2 5.39E+07 1.03E+07 1.14E+06 2.29E+05 2.89E+05 1.22E+05 8.40E+05 2.11E+06 5.39E+05 8.07E+05 3.67E+06
3 5.93E+07 1.01E+07 1.10E+06 2.12E+05 2.84E+05 1.05E+05 9.02E+05 2.72E+06 5.94E+05 7.62E+05 2.59E+06
ממוצע 5.46E+07 1.00E+07 1.12E+06 2.12E+05 2.65E+05 1.06E+05 7.91E+05 2.14E+06 5.29E+05 7.83E+05 3.43E+06

טבלה 6: מספרי תאים מוחלטים של ערכות משנה של תאי מח עצם B

מספר תא מוחלט
מספר בעלי חיים תאי טחול קיימא תאי B תאי מעבר B תאי T1 תאי T2 תאי T3 תאי B בוגרים תאי זקיקים I תאי זקיקים II מבשר תאי אזור שולי תאים בוגרים של אזור שולי תאי B-1
1 9.16E+07 4.61E+07 3.66E+06 1.55E+06 1.10E+06 7.16E+05 4.06E+07 2.39E+07 5.27E+06 2.17E+06 3.98E+06 8.83E+05
2 9.97E+07 5.18E+07 4.88E+06 1.97E+06 1.57E+06 1.00E+06 4.49E+07 2.68E+07 7.33E+06 3.42E+06 3.84E+06 8.15E+05
3 1.02E+08 5.34E+07 4.64E+06 1.98E+06 1.41E+06 8.54E+05 4.62E+07 2.81E+07 5.84E+06 3.58E+06 4.02E+06 1.01E+06
ממוצע 9.77E+07 5.04E+07 4.39E+06 1.83E+06 1.36E+06 8.58E+05 4.39E+07 2.63E+07 6.15E+06 3.06E+06 3.94E+06 9.02E+05

טבלה 7: מספרי תאים מוחלטים של ערכות משנה של תאי Splenic B

מספר תא מוחלט
מספר בעלי חיים תאי טחול קיימא תאי B Igκ+ תאי B Igλ+ תאי B
1 9.16E+07 4.97E+07 4.51E+07 2.46E+06
2 9.97E+07 5.63E+07 5.08E+07 3.16E+06
3 1.02E+08 5.91E+07 5.33E+07 3.24E+06
ממוצע 9.77E+07 5.50E+07 4.97E+07 2.95E+06

טבלה 8: מספרי תאים מוחלטים של ערכות משנה של תאי Igκ ו- Igλ B

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח ציטומטרי זרימה של רקמות לימפה ולא לימפואידים אפשר זיהוי והספירה בו זמנית של תת-אוכלוסיות תאי B בעכברים ובני אדם מאז שנות השמונים. זה שימש כמדד של חסינות הומוריסטית והוא יכול להיות מיושם עוד יותר כדי להעריך פונקציונליות תא B. שיטה זו מנצלת את זמינות ריאגנט כדי להעריך שלבים שונים של התבגרות תאי B בעכברים ובבני אדם, באמצעות ניתוח סימולטני של פרמטרים מרובים המאפשרים הערכה של הטרוגניות תאי B, אפילו באוכלוסיות נדירות. אם משתמשים בו כדי למדוד דגימות הטרוגניות מורכבות, הוא יכול לזהות אוכלוסיות משנה בתוך דקות, על תאים בודדים33. אסטרטגיית ניתוח גטינג רציף, המיושמת לרוב לניתוח ציטומטרי של זרימה, יכולה להיות פשוטה ואינטואיטיבית כאשר יש לזהות אוכלוסייה ספציפית34. לבסוף, יתרון נוסף של ציטומטריית זרימה הוא כי הוא ניתן להתאמה בקלות ברוב המעבדות האקדמיות, תוך הדרכה של משתמשים מנוסים. הפרוטוקול שלנו מתאר בהצלחה הערכה של אוכלוסיות תאי B בצפק, BM וטחחול של עכברים, על ידי תיאור והספירה של אוכלוסיות B-1 והתעמקות בפיתוח של תאי B-2 פרו-B, תאים טרום B, לא בוגרים, מעבר, ושרשראות B בוגרות, כמו גם ביטוי פני השטח שלהם של שרשראות אור Igκ או Igλ. ציטומטריית זרימה היא השיטה הנפוצה ביותר, והקלה ביותר ליישום, בעת חקירת התפתחות תאי B בעכברים.

בעוד ציטומטריית זרימה מייצרת נתונים שלא יסולא בפז, ישנם כמה מגבלות לטכנולוגיה זו כאשר נעשה שימוש כדי לחקור את ההטרוגניות של תא החיסון B. ערכות נתונים ענקיות יכולות להיות מכריעות מכיוון ש-10 כתמי צבע מאפשרים הכרה ביותר מ-1,024 אוכלוסיות תאים שונות34. יש לקחת בחשבון כי כמה סמני תאי לימפה נפוצים הוכיחו להיות פחות ספציפי ממה שחשבו במקור. זה יכול להיפתר על ידי שימוש בסמני שטח תאים מרובים כדי לברר את הגינגינג על האוכלוסיות הרצויות. בעוד ניתוח ציטומטרי זרימה יכול להיות פשוט ואינטואיטיבי, אילוץ נוסף לזרום ניתוח ציטומטרי הוא שזה בדרך כלל מאפשר הדמיה של שני פרמטרים בלבד בכל פעם, אם כי כלי הדמיית נתונים כגון t-SNE ניתן להשתמש כדי אשכול אוכלוסיות תאים ביעילות רבה יותר בעת שימוש cytometry זרימת פרמטר גבוהה. מגבלה חשובה נוספת היא שהשערים המשמשים הן במהלך הרכישה והן הניתוח תלויים לעיתים בסובייקטיביות של המפעיל.

לצורך התאמה מוצלחת או שכפול של פרוטוקול זה, ישנם מספר פרמטרים קריטיים שיש לקחת בחשבון35. יש לקחת בחשבון זהיר את עיצוב הפאנל ואת בחירת פלואורוכרום. זה הכרחי כדי לזווג אנטיגנים עמומים או חשובים עם פלואורוכרום בהיר. טיטציה נוגדנים חייבת להתבצע כדי למנוע עודף נוגדנים מחייב לתאים לא ספציפית, פוטנציאל להגדיל את כתמי הרקע והפחתת רזולוציה. טיטציה נוגדנים מתבצעת על ידי מכתים מספר ידוע של תאים עם ריכוזים יורדים של נוגדנים, כדי לקבוע את אינדקס ההפרדה הטוב ביותר36. זה צריך לחזור על עצמו עבור כל הרבה נוגדנים. במהלך הכנת מדגם והכתמה, חשוב להבטיח השעיה של תא יחיד על ידי הימנעות Ca ++ ו Mg ++. בנוסף, תוספת של EDTA יכולה לסייע במניעת צבירת תאים ופעילות אנזימטית אשר יכול להוביל סטימיליה בתיווך נוגדנים והפנמה של סמנים מסומנים. לפני רכישת נתונים, יש להשעות, לסנן ולשחרר צבירה של דגימות כראוי. גלישת אות מפרמטר אחד למשנהו נפתרת באמצעות פקדי פיצוי, בצורה של תאים מוכתמים בודדים או חרוזי פיצוי זמינים מסחרית35. שיקול חשוב נוסף הוא שיהיו בקרות מתאימות בכל ניסוי. תאים לא נגועים קובעים את הבסיס של פלואורסצנטיות אוטומטית. פקדי Isotype אינם נחשבים עוד לפקדים מתאימים עבור gating עקב איגוד לא ספציפי. הצעד החשוב ביותר בסיוע בהערת שערים מדויקים הוא השימוש בבקרות FMO. בבקרת FMO, כל הנוגדנים הצמודים נמצאים בכתם מלבד זה הנשלט. פקדי FMO מאפשרים את מדידת התפשטות כל הפלורופורים לערוץ החסר ולכן מאפשרים הקמת שערים בהתאם. זה קריטי כי מספיק תאים נרכשים עבור דיוק נוסף. ככלל אצבע, יש לאסוף לפחות 2,000 אירועים של אוכלוסיית העניין. לבסוף, בקרות פיצוי, בין אם חרוזים או תאים, צריך להיות מותאם בדיוק פלואורוכרום בשימוש פקדים חייב להיות בהיר לפחות כמו דגימות ניסיוניות37.

בסך הכל, ניתוח ציטומטרי נמוך של תאי B נמצא בשימוש נרחב בתחום החיסונים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור הפרעות בחסינות הומוריסטית הן בסוג פראי והן בעכברים מהונדסים גנטית, תחת מצבים שאינם מחלות ועל אתגר חיסוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים הם עובדים ובעלי מניות של Regeneron תרופות, Inc.

Acknowledgments

אנו מודים למת'יו סלימן על הקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים גם למחלקות הליבה של ויווריום וציטומטריה זורמת ברגנרון על תמיכתם במחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes Eppendorf  22363611 0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes  Eppendorf  22364111 1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes  Corning  352097 15 mL conical tube
18 gauge needle BD 305196
25 gauge needle BD  305124
3 mL syringe BD 309657
70 mM MACS SmartStrainer  Miltenyi Biotec  130-110-916  70 mM cell strainer
96 well U bottom plate  VWR 10861-564
ACK lysis buffer  GIBCO  A1049201 red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate Pall Corporation 8027 filter plate
B220 eBiosciences 17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ BD 552843 compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ BD 552844 compensation beads
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A8577 BSA
BP-1 BD 740882
Brilliant Stain Buffer BD 566349 brilliant stain buffer
C-Kit BD 564011
CD11b BD 563168
CD11b BioLegend 101222
CD19 BD 560143
CD21/35 BD 562756
CD23  BD 740216
CD24 (HSA) BioLegend 138504
CD3 BD 561388
CD3 BioLegend 100214
CD43 BD 553270
CD43 BioLegend 121206
CD5 BD 563194
CD93 BD 740750
CD93 BioLegend 136504
DPBS (1x) ThermoFisher 14190-144 DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 ThermoFisher 65-0866-14 viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette Samco 233 disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer BD custom order flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) BD 553142 Fc block
FlowJo Flowjo flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes  Miltenyi Biotec  130-096-334 automated dissociation tube 
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters  Miltenyi Biotec  130-095-937 tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G) BioLegend 108422
IgD BioLegend 405710
IgM eBiosciences 25-5790-82
Kappa BD 550003
Lambda BioLegend 407308
paraformaldehyde, 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714
Ter119 BioLegend 116220
True-Stain Monocyte Blocker BioLegend 426103 monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575038 EDTA
Vi-CELL XR Beckman Coulter 731050 cell counter instrument 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220 (2017).
  2. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
  3. Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
  4. Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
  5. Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
  6. Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
  7. Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
  8. Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
  9. Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
  10. von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
  11. Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
  12. Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
  13. Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
  14. Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
  15. Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
  16. Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
  17. Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
  18. Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
  19. McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
  20. Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
  21. Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
  22. Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
  23. Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
  24. Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
  25. Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
  26. Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
  27. Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
  28. Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
  29. Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
  30. Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
  31. Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
  32. Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
  33. Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
  34. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
  35. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
  36. Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21 (2007).
  37. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 167 תאי B לימפוציטים התפתחות בידול צפק מח עצם טחול ציטומטריית זרימה עכברים
אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harris, F. M., Meagher, K. A.,… More

Harris, F. M., Meagher, K. A., Zhong, M., Daniel, B. J., Eckersdorff, M., Green, J. A., Voronina, V., Guo, C., Limnander, A., Macdonald, L. E. Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development. J. Vis. Exp. (167), e61565, doi:10.3791/61565 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter