Summary
본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.
Abstract
광범위한 연구는 이차 림프구 기관에서 뮤린 B 세포의 개발 및 분화를 특징으로합니다. B 세포에 의해 분비된 항체는 고립되고 잘 확립된 치료제로 개발되었습니다. murine B 세포 발달의 검증은 자가 면역 경향이 마우스의 맥락에서, 또는 수정된 면역 계통을 가진 마우스에서, 마우스에 있는 치료에이전트를 개발하거나 시험하는 중요한 분대이고 유동 세포측정의 적당한 사용입니다. 잘 확립된 B 세포 흐름 세포 계발성 파라미터는 뮤린 복막, 골수 및 비장의 B 세포 발달을 평가하는 데 사용될 수 있지만, 다수의 모범 사례를 준수해야 한다. 또한, B 세포 구획의 유동 세포 측정 분석은 또한 B 세포 발달의 추가 판독을 보완해야 한다. 이 기술을 사용하여 생성된 데이터는 항체 또는 항체 와 같은 분자를 치료제로 생성하는 데 사용할 수 있는 인간화된 마우스뿐만 아니라 야생 유형, 자가 면역 경향이 마우스 모델뿐만 아니라 인간화된 마우스에 대한 우리의 이해를 더욱 발전시킬 수 있습니다.
Introduction
단일 클론 항체는 주류 의학의 일부가됨에 따라 점점 많은 인간 질환에 대한 선택 요법이되고있다1,2. 우리는 이전에 마우스 IgH constants3,4를 가진 완전히 인간 변수 지역을 항구하는 항체를 능동하게 생성하는 유전자 조작 마우스를 기술했습니다 3,4. 가장 최근에, 우리는 뚜렷한 항원 결합5가 있는 항체 같이 분자를 생성하는 유전자 조작한 마우스를 기술했습니다5. 항체는 B 세포에 의해 분비되고 적응성 유머 면역의 기초를 형성합니다. B 세포, B-1 및 B-2의 2개의 명백한 모형이 있습니다. 포유동물에서 B-1 세포는 태아 간에서 유래하고 출생 후 점막 조직및 흉막 및 복막 구멍에서 풍부하게 되며, B-2 세포는 출생 전 과 그 이후 골수 (BM)에서 태아 간에서 유래한다. B-2 세포는 비장 과 혈액6,7,8을 포함하여 이차 림프성 기관에서 농축된다. BM에서, B-2 조혈 선조는 Ig mu 무거운 사슬 재배열9,10의 개시에 프로 B 세포를 분화하기 시작합니다. Ig 중형 사슬과 조립을 사전 B세포 수용체(pre-BCR)로 성공적으로 재배열하여 시그널링 및 증식 확장과 함께 사전 B 세포로 분화합니다. 사전 B 세포가 Ig kappa(Igθ)를 재배열하거나 비생산적인 경우 Ig lambda(Igλ) 광 사슬을 재배열한 후 μ 무거운 사슬과 결합하여 표면 IgM BCR 발현이 발생합니다. IgM 표면 발현은 자가 반응성 조건하에서 감소되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 기능적으로 반응성이 없거나 식욕 부진 B cells11,12에서 자기 허용오차에 기여하는 것이 중요하다. 미숙한 B 세포는 전환 단계에 들어가서 IgD를 공동 발현하고 BM에서 비장으로 이동합니다. 비장에서, IgD 발현은 더 증가하고 세포는 과도기 B 세포의 두 번째 단계로 성숙하고, 그들의 성숙 상태 및 한계 영역 (MZ) 또는 여포 (Fol) 세포로 의 발달의 완료에 선행됩니다13,14,15. 성인 마우스에서, 비병 환경에서, 성숙한 B 세포의 수는 BM에서 매일 생성되고 10-20000,000,000미성숙 B 세포에도 불구하고 일정하게 남아 있습니다. 이 중 3%만이 성숙한 B 세포의 풀을 입력합니다. 말초 B 세포 구획의 크기는 세포 사멸에 의해 제한되며, 부분적으로자가 반응성 및 불완전한 성숙을 포함한 여러 가지 요인으로 인해 16,17,18. 유동 세포 측정 분석은 인간과 마우스에 있는 많은 면역 세포 하위 구획을 특성화하고 예매하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 인간과 뮤린 B 세포 구획 사이에 는 몇 가지 유사점이 있지만,이 프로토콜은 뮤린 B 세포의 분석에만 적용됩니다. 이 프로토콜은 유전자 조작이 B 세포 발달을 바꿀 지 여부를 결정하기 위해 유전자 조작 된 마우스를 phenotyping의 목적으로 개발되었습니다. 유동 세포측정은 또한 세포 활성화, 기능, 증식, 사이클 분석, DNA 함량 분석, 세포 분석, 세포 분류 19,20을 측정하는 등 많은 추가 응용 분야에서 큰 인기를 끌고 있다.
유동 세포측정은 비장, BM 및 혈액과 같은 복잡한 장기를 포함하여 마우스와 인간에서 다양한 림프구 구획을 특성화하는 데 선택하는 도구입니다. 유세포측정을 위한 마우스 특이적 항체 시약으로 인해, 이 기술은 세포 표면 단백질뿐만 아니라 세포내 인포단백질 및 사이토카인뿐만 아니라 기능적인 readouts21을 조사하는 데 사용될 수 있다. 본명 우리는 이차 림프구 기관에서 성숙하고 분화할 때 B 세포 하위 집합을 식별하는 데 어떻게 유동 세포 측정 시약을 사용할 수 있는지 보여줍니다. 염색 조건, 시료 처리, 올바른 계측기 설정 및 데이터 수집, 마지막으로 데이터 분석의 최적화 후, 마우스내 B 세포 구획의 포괄적인 유량 세포 측정 분석을 위한 프로토콜을 활용할 수 있다. 이러한 포괄적인 분석은 BM B-2 세포를 개발하는 것이 B220, CD43, BP-1, CD24, IgM 및 IgD22의 발현에 따라 다른 분획 (분수)으로 나눌 수 있는 하디와 동료에 의해 고안된 수십 년 된 명명율을 기반으로 합니다. Hardy 등., B220+ CD43 BM B 세포가 BP-1 및 CD24(30F1) 발현을 기준으로 4개의 하위 집합(분수 A-C')으로 세분화될 수 있는 반면, B220+ CD43-(dim to neg) BM B 셀은 이그3의 상이한 발현을 기반으로 3개의 하위 집합(분수 D-F)으로 해결할 수 있음을 보여주었다. 분수 A(pre-pro-B 세포)는 BP-1-CD24(30F1)-분수 B(초기 프로-B 셀)로 정의되며, 분수 C(초기 프로-B 셀)는 BP-1+ CD24(30F1)++, 및 분수 C(초기 BP-1)로 정의된다. 또한, 분수 D(사전 B 셀)는 B220+ CD43-IgM-B 세포로 정의되며, 분수 E(새로 생성된 B 셀, 미숙한 및 과도기의 조합)는 B220+ CD43-IgM+ B 세포 및 분수 F(성숙하고 재순환하는 B 셀)로 정의됩니다. 대조적으로, 비장에서 발견되는 순진한 B 세포의 대부분은 CD93, CD23 및 IgM의 발현에 따라 성숙한 (B220+ CD93-) B 세포 및 과도기 (T1, T2, T3) 세포로 나눌 수 있다. 성숙한 B 세포는 IgM 및 CD21/CD35의 발현에 기초하여 한계 영역 및 여포 서브세트로 해결될 수 있으며, 여포 서브세트는 그들의 IgM 및 IgD 표면 발현의 수준에 따라 성숙한 여포 타입 I 및 여포형 II B 세포 서브셋으로 더 나눌 수 있다24. 이러한 비장 B 세포 인구는 주로 Igθ 광 사슬을 표현합니다. 마지막으로, 태아 간에서 유래하고 성인 마우스의 복막 및 흉막 구멍에서 주로 발견되는 B-1 B 세포 인구는 문헌에 설명되어 있다. 이러한 회막 B 세포는 CD23 발현의 부족에 의해 이전에 설명된 B-2 B 세포와 구별될 수 있다. 그(것)들은 그 후에 B-1a 또는 B-1b 인구로 더 세분화됩니다, 전자는 CD5의 존재에 의해 정의되고 그것의 부재25에 의해 후자에 의해 정의됩니다. B-1 세포 선조는 태아 간에서 풍부하지만 성인 BM에서는 발견되지 않습니다. B-1a 및 B-1b 세포는 다른 선조에서 유래하는 동안, 둘 다 복막과 흉막 충치를 시드24. B-2 세포와는 달리, B-1 세포는 자기 재생이 유일하게 가능하고 천연 IgM 항체의 생산을 담당합니다.
B 세포 발달의 결함은 BCR26,27의 성분에 있는 결핍, BCR 신호 강도에 영향을 미치는 신호 분자의 동요 14,28,29, 또는 B 세포 생존을 조절하는 사이토카인의 중단을 포함하여 많은 경우에 생길 수 있습니다30,31 . 림프구의 유동 세포 분석은 이들 마우스 및 많은 다른 사람들의 B 세포 발달 블록의 특성화에 기여했다. 림프구의 유동 세포 분석의 한 가지 장점은 살아있는 해리 된 조직에서 얻은 개별 세포에 대한 측정을 할 수있는 능력을 제공한다는 것입니다. 형광의 계속 확장 범위에서 시약의 가용성은 다중 매개 변수의 동시 분석을 허용하고 B 세포 이질성의 평가를 가능하게한다. 더욱이, 유동 세포측정 분석에 의한 B 세포의 열거는 림프구 기관 내에서 세포 국소화를 시각화하는 면역조직화학 방법, 유머 면역의 척도로서 순환 항체 수준을 검출하는 면역학적 분석, 그리고 실제 공간과 시간 32에서 B 세포 반응을 측정하는 2개의 광자 현미경 검사법과 같은 다른 면역학적 분석을 보완한다.
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Protocol
모든 마우스 연구는 Regeneron의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 감독되고 승인되었습니다. 이 실험은 잭슨 연구소에서 3개의 C57BL/6J 암컷 마우스(17주)에서 조직에 대해 수행하였다. 이상적인 농도를 결정하기 위해 실험을 시작하기 전에 모든 항체를 적중시한다. 단일 색상 보정을 위해 보상 구슬을 사용할 때 샘플보다 밝거나 밝은 얼룩이 있는지 확인하십시오. 모든 완충제, 항체 및 세포를 얼음 또는 4°C로 유지합니다. 생존 성 염료를 추가 한 후, 저조도 또는 어둠 속에서 4 ° C에서 모든 단계와 인큐베이션을 수행합니다.
1. 회간 세포 수확 및 단일 세포 격리
- CO2또는 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시합니다.
- 마우스를 등에 놓고 70% 에탄올로 스프레이하고 복막을 자르지 않도록 주의하면서 가위로 바깥복부 피부를 잘라냅니다.
- DPBS [vol/vol]에 3mL의 얼음 냉세척 버퍼(0.5% 소 세럼 알부민(BSA)를 복막 구멍에 주입하여 25게이지 바늘이 장착된 3mL 주사기로 복막 구멍에 넣습니다.
- 손끝으로 회대를 부드럽게 마사지하세요.
- 1.3 및 1.4 단계를 반복합니다.
- 회리수통을 통해 18G 바늘이 장착된 3mL 주사기를 삽입하여 장기와 지방을 피하십시오.
- 지금 하중 세포를 포함하는 세척 버퍼를 추출하고 얼음에 15 mL 원뿔 튜브로 전송.
- 1.3 및 1.4 단계를 반복합니다.
- 핀셋을 들고 있는 동안 회리음의 작은 구멍을 잘라냅니다.
- 일회용 이송 파이펫을 구멍에 삽입하고 남은 세척 버퍼를 수집하여 지방과 장기를 다시 피하십시오.
- 수집된 잔류 세포를 얼음 위에 있는 15mL 원뿔관으로 이송한다.
참고: 혈액 오염이 명백한 경우 샘플을 폐기하십시오. - 비장과 뼈 추출이 완료될 때까지 얼음에 세포를 배양합니다.
- 4°C에서 8분 동안 300 x g 의 세포 원심분리기. 상체를 흡인합니다.
- 세척 버퍼의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 70 μM 셀 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 깨끗한 15mL 원피스 튜브로 필터링합니다.
- 세포 카운터 기기 또는 혈혈계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.
2. 비장 수확 및 단일 세포 격리
- 마우스를 배에 놓고 깨끗한 가위를 사용하여 왼쪽 뒤쪽의 복막을 잘라냅니다. 비장을 잘라 지방과 결합 조직을 제거합니다.
- 비장을 얼음 에 1 mL의 세척 버퍼를 포함하는 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
- 뼈 추출이 완료될 때까지 비장을 얼음에 배양합니다.
- 적혈구 용해 버퍼의 5 mL로 자동 해리 튜브로 비장을 이동합니다. 튜브를 조직 해리기 기기에 놓고 60s용 해리를 사용하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
참고: 세척 버퍼에서 서리가 내린 유리 슬라이드 사이를 분쇄하는 것과 같은 단일 셀 비장 현탁액을 얻는 다른 일상적인 방법을 사용하는 것도 허용됩니다. 다른 해리 방법이 사용되는 경우, 2.5 단계로 계속하기 전에 적혈구 용해 완충제의 5 mL에서 원심 분리, 포부 및 재발과 함께 해리를 따르십시오. - 3 분 동안 실온에서 세포를 배양.
- 2mM EDTA를 포함하는 4 °C 세척 버퍼의 10 mL을 추가합니다.
- 깨끗한 15mL 원물 튜브로 옮김합니다.
- 4°C에서 8분 동안 300 x g 의 세포 원심분리기. 상체를 흡인합니다.
- 4°C 세척 버퍼의 5mL에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다.
- 70 μM 셀 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 깨끗한 15mL 원피스 튜브로 필터링합니다.
- 세포 카운터 기기 또는 혈혈계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.
3. BM 수확 및 단일 세포 격리
- 마우스 본체의 하반부에서 피부를 제거합니다. 다리에서 여분의 근육을 손질. 대퇴골을 자르지 않도록 주의하면서 가위로 다리 전체를 제거합니다. 남은 근육, 지방 및 발을 제거하여 대퇴골과 경골을 청소하십시오.
- 뼈를 얼음 에 1 mL의 세척 버퍼를 포함하는 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
- 0.5mL 마이크로센심분리기 튜브의 바닥을 천공하여 다리 뼈가 돌출되지 않을 정도로 작은 구멍을 남깁니다. 0.5 mL 튜브를 깨끗한 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 삽입합니다. 대퇴골과 경골 근위가 무릎에 스니핑하고 0.5 mL 튜브로 아래로 향하는 컷 끝을 놓습니다.
- 4°C에서 2분 동안 6,780 x g 의 세포 원심분리기.
- 적혈구 리시스 완충제의 1mL에서 세포 펠릿을 재연하고 적혈구 리시스 완충제의 추가 3mL를 포함하는 15 mL 원상관으로 이송한다.
- 실온에서 3분 동안 배양하십시오.
- 2mM EDTA를 포함하는 4 °C 세척 버퍼의 10 mL을 추가합니다.
- 4°C에서 8분 동안 300 x g 의 세포 원심분리기. 상체를 흡인합니다.
- 4°C 세척 버퍼의 3mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 70 μM 셀 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 깨끗한 15mL 원피스 튜브로 필터링합니다.
- 세포 카운터 기기 또는 혈혈계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.
4. 스테인 셀 및 보상 준비
- 각 동물에서 96 웰 U 바닥 플레이트에 각 세포 유형의 Aliquot 106 세포.
- 전체 얼룩, 형광 -마이너스 - 원 (FMO), 얼룩이없는, 마지막으로 사용되는 각 형광에 대한 선택적 단일 색상 보상을 포함하여 모든 샘플 및 컨트롤에 대한 충분한 우물을 포함해야합니다.
- BM 성숙 패널 및 비장 성숙 패널의 경우, 각 전체 얼룩 샘플에 대해 2 개의 우물, 106 개의 세포로 알리쿼트 세포를 넣습니다. 단일 색상 보정 실행 가능성 컨트롤의 경우 각 셀 유형의 2 x 106 셀을 개별 우물에 추가합니다.
- 4 °C에서 2 분 동안 845 x g 에서 플레이트를 원심 분리합니다. 재빨리 접시를 뒤집어 싱크대에 쓸어 넘기고 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의함으로써 상체를 제거합니다.
- DPBS의 200 μL에서 세포를 다시 일시 중지합니다(BSA 또는 FBS 제외). 이 단계는 아민 반응성 생존성 염료로 염색하기 전에 단백질을 제거하는 것이 중요합니다.
- 4.2 및 4.3 단계를 반복합니다.
- 4.2 단계를 반복합니다.
- DPBS에서 1:1,000을 희석한 100 μL 생존성 염료에서 세포를 다시 중단합니다.
참고: 단일 색상 보정을 위해 셀을 사용하는 경우 해당 우물에 생존 성 염료를 추가하지 마십시오.- 각 얼룩 세트에 대해 완전히 얼룩지지 않은 샘플과 필요할 수 있는 기타 컨트롤에 대해 얼룩이 없는 여러 우물을 남겨 둡니다.
- 각 얼룩 세트에 대해 생존 가능성 FMO 제어를 위해 추가미염색을 잘 남깁니다.
- 단일 색상 생존 가능성 보정 컨트롤: 2x 106 셀을 다시 일시 중단, 단계 4.1에서 알리인용, 200 μL에서 희석 된 생존 성 염료. 세포의 100 μL을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고, 65°C에서 5분 동안 열세포를 가열하고, 100 μL의 살아있는 세포를 본래우물로 다시 이송한다.
- 4°C에서 세포를 30분 동안 빛으로부터 보호합니다.
- 4 °C에서 2 분 동안 845 x g 에서 플레이트를 원심 분리합니다. 재빨리 접시를 뒤집어 싱크대에 쓸어 넘기고 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의함으로써 상체를 제거합니다.
- DPBS의 200 μL에서 세포를 다시 일시 중지합니다(BSA 또는 FBS 제외).
- 4.8 및 4.9 단계를 반복합니다.
- 4.8 단계를 반복합니다.
- 분동블록의 50μL에서 세포를 스테인 버퍼(DPBS에서 0.5% BSA[vol/vol])로 희석하였다.
- 회중 세포의 경우 - 또한 비특이적 얼룩을 줄이기 위해 5 μL의 단핵 차단제를 추가합니다.
- 4°C에서 세포를 배양하여 빛으로부터 보호하여 15분 동안 배양합니다.
- 106셀당 100 μl의 최종 부피를 위해 얼룩 버퍼에 전체 얼룩 마스터 믹스와 FmOs를 준비합니다. 항체 목록에 대한 표 1 표 4를 참조하십시오.
참고: FmOs는 모든 항체를 얼룩 세트에 포함시킴으로써 만들어집니다. 얼룩 세트에 각 항체에 대한 FMO를 준비합니다. 얼룩 세트에 여러 개의 화려한 염료가 포함되어 있는 경우, 샘플당 얼룩 버퍼에 대한 50 μL의 화려한 얼룩 버퍼를 대체합니다. - Fc 블록을 제거하지 않고 선택한 우물에 전체 얼룩 믹스와 FmOs 100 μL을 추가합니다.
- 얼룩 세트의 각 항체에 대한 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다.
- 보상 구슬을 사용하는 경우 사용시 제조의 지시를 따릅니다.
- 세포를 사용하는 경우, 100 μL 얼룩 버퍼에서 생존 성염없이 4.6.1 단계에서 이전에 예약 된 106 세포에 적정 항체를 추가하십시오. 시료의 모든 세포가 특정 마커에 대해 양성인 경우, 유동 세포계에 대한 보상 데이터를 획득할 때 사용할 스테인드되지 않은 세포를 따로 둡니다.
- 세포와 구슬을 빛으로부터 보호하여 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 4 °C에서 2 분 동안 845 x g 에서 플레이트를 원심 분리합니다. 재빨리 접시를 뒤집어 싱크대에 쓸어 넘기고 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의함으로써 상체를 제거합니다.
- 얼룩 버퍼의 200 μL에서 셀과 구슬을 다시 중단합니다.
- 4.18 및 4.19 단계를 두 번 반복합니다.
- 4.18 단계를 반복합니다.
- 48h 내의 분석을 위해 샘플을 수정하려면 DPBS에서 2 % 파라 포름알데히드의 200 μL에서 세포와 구슬을 재일시 중단합니다.
주의: 파라포말데히드는 심각한 건강 상의 위험과 인화성입니다. 사용하기 전에 Safty 데이터 시트를 참조하십시오. - 세포와 구슬을 빛으로부터 보호하여 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 4.18 및 4.19 단계를 두 번 반복합니다.
- 필터 플레이트를 깨끗한 96 개의 U-바닥 플레이트 위에 놓습니다. 멀티 파이펫을 사용하여 각 샘플을 필터 플레이트의 우물로 옮기습니다.
- 원심분리기 필터 플레이트-96 U-바닥 플레이트 셋업 845 x g 에서 2분 동안 4°C. 필터 플레이트를 제거하고 신속하게 반전하고 싱크대에 접시를 가볍게 하여 상체를 데칭, 우물을 교차 오염하지 않도록주의.
- BM 및 비장 성숙 패널의 경우 얼룩 버퍼의 100 μL에서 완전히 얼룩진 세포를 재연합니다. 각 동물의 2개의 우물을 1개의 우물로 잘 섞습니다. 나머지 패널, FmOs 및 컨트롤을 200μL의 얼룩 버퍼로 다시 일시 중지합니다.
- 4°C에서 고정 셀과 구슬을 배양하여 밤새 빛으로부터 보호합니다.
5. 흐름 세포 측정 데이터 수집
- 제조업체 지침에 따라 흐름 사이토미터를 초기화하고 QC를 지정합니다.
- 각 패널에 대해 템플릿을 특정로드합니다.
- 데이터를 기록하기 전에 각 샘플의 모든 이벤트가 크기가 조정되고 점 플롯에 표시되는지 확인합니다.
- 4.16 단계에서 준비된 단일 얼룩 보정을 사용하여 각 얼룩 패널에 대한 보상 컨트롤을 기록합니다. 각 샘플에 대해 양수 및 음수 게이트를 설정합니다. 소프트웨어가 보상 행렬을 계산합니다.
- 첫 번째 샘플을 획득하기 시작하고 게이트가 적절하게 설정되었는지 확인합니다.
- 간막 B 세포 패널및 비장 Igθ 및 Igλ 패널에 대한 적어도 50,000 B 세포 이벤트를 기록하도록 기계를 설정; BM 성숙 패널을 위한 150,000 B 세포 이벤트; 및 비장 성숙 패널에 대한 300,000 B 세포 이벤트.
- 각 얼룩 패널에 대해 각 동물, 스테인드되지 않은 샘플 및 FmOs에 대해 완전히 얼룩진 샘플을 실행하고 기록합니다.
6. 데이터 분석
- 유동 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 진행합니다. 그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4에 설명된 게이팅 전략을 따르십시오.
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Representative Results
여기서 우리는 마우스 복막, BM 및 비장의 B 세포 발달을 특성화하기위한 게이팅 전략을 제시합니다. 분석의 기초는 생존 염료로 염색의 개념을 중심으로 형성되고, 전방 분산 영역 (FSC-A) 및 전방 분산 높이 (FSC-H)에 따라 두 배를 게이팅하고, 마지막으로 FSC-A 및 측면 분산 영역 (SSC-A) 특성에 따라 세포를 선택하여 이물질을 제거하여 이물질을 제거합니다. 관심있는 인구에 게이팅하기 전에.
복막 B 세포의 흐름 세포 측정 분석은 표 1에 설명된 염색 패널을 사용하여 실행 가능한 복막 세포, 총 B 세포, B-1 및 B-2 서브세트뿐만 아니라 C57BL/6J 마우스에서 B-1a 및 B-1b 세포의 주파수를 나타낸다. 이러한 주파수의 평균 절대 셀 수는 표 5에 표시됩니다. B-1 세포내의 변투는 세포 주파수 또는 마우스당 절대 세포 수에 의해 세포 하위 집합의 분포에 의해 설명될 수 있었다.
BM B 세포의 유동 세포 측정 분석은 실행 가능한 BM 세포의 주파수를 나타내며, 총 B 세포, 분획 A(pre-pro-B 세포 및 오염 림프구), 프리 프로-B 세포, 분획 B, 분획 C, 분획 C', 분수 D, 미성숙(분수 E의 하위 집합), 과도(분수 E의 하위 집합), C57BL/6J 마우스의 분수 F B 세포(그림 2) 표 에 설명된 스테인링 패널을 사용하여. 이러한 주파수의 평균 절대 셀 수는 표 6에 표시됩니다. BM B 세포의 변투는 세포 주파수 또는 다리 당 절대 세포 수에 의해 세포 하위 집합의 분포에 의해 설명될 수 있었습니다.
비장 B 세포의 유동 세포 측정 분석은 실행 가능한 비장의 주파수를 나타내며, 총 B 세포, 과도기 B 세포, T1, T2, T3 세포, 성숙한 B 세포, 여포 I 세포 (Fol I), 여포 II (Fol II) 세포, 한계 영역 (MZ) 전구세포, 성숙한 MZ 세포 및 C57BL/6J 마우스에서 B-1 세포 (도 3), 표 에 설명 된 염색 패널을 사용하여 3. 이러한 주파수의 평균 절대 셀 수는 표 7에 표시됩니다. 비장 B 세포의 변투는 세포 주파수 또는 비장 당 절대 세포 수에 의해 세포 하위 집합의 분포에 의해 설명 될 수 있습니다.
유사하게, 비장의 흐름 세포 측정 분석은 표 4에 설명된 염색 패널을 사용하여 C57BL/6J 마우스(그림 4)에서 Igθ+ 및 Igλ+ B 세포의 주파수를 나타낸다. 이러한 주파수의 평균 절대 셀 수는 표 8에 표시됩니다. Igθ+ 및 Igλ+ Bcells의 변투는 비장 당 세포 주파수 또는 절대 세포 수에 의해 세포 하위 집합의 분포에 의해 설명될 수 있었습니다.
| 항체 | 플루오로포레 | 클론 |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| IgM | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD11b | BV711 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
표 1: 수막 B 세포 패널
| 항체 | 플루오로포레 | 클론 |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| IgM | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | 1B11 |
| CD24 (HSA) | PE | 30-F1 |
| C 키트 | BUV395 | 2B8 |
| BP-1 | BV786 | BP-1 |
| CD93 | BV711 | AA4.1 |
| 덤프 채널 | ||
| CD3 | AF700 | 17-A2 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| GR1 (Ly6C/6G) | AF700 | RB6-8C5 |
| 테르119 | AF700 | TER-119 |
표 2: 골수 성숙 패널
| 항체 | 플루오로포레 | 클론 |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| IgM | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD21/35 | BV421 | 7G6 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
| CD93 | PE | AA4.1 |
표 3: 비장 성숙 패널
| 항체 | 플루오로포레 | 클론 |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| IgM | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD3 | PB | 17-A2 |
| 카파 | FITC | 187.1 |
| 람다 | PE | RML-42 |
표 4: 비장 이그스렌 및 이그λ 패널
그림 1: 회막에서 B 세포 집단의 특성화. 실행 가능한 단일 세포, 크기 게이트 복막 B 세포는 먼저 IgM+ 세포에 게이팅하여 오염 세포로부터 분리된다. B-1 및 B-2 세포는 CD23(B-2)의 부재(B-1) 또는 존재에 의해 서로 구별된다. 다음 CD5 발현은 B-1b 세포(CD5-)로부터 B-1a 세포(CD5+)를 묘사하는 데 사용된다. FmOs는 게이트를 그릴 위치를 경험적으로 결정하는 데 사용되었습니다. 숫자는 동일한 밀도 플롯 내의 각 집단의 백분율입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: BM에서 B 셀 하위 집합의 특성화. 실행 가능한 단일 세포, 크기 게이트 BM B 셀은 B220+ 덤프-(덤프가 CD3/GR-1/CD11b/TER119를 의미하는 경우) 세포에서 게이팅하여 비B 세포로부터 분리된다. CD43 및 B220 표현식은 하디 분수 A-C(CD43+ B220+) 및 하디 분수 D-F(CD43low/neg B220+++++++)를 정의합니다. 분획 A-C'는 BP-1 및 CD24의 발현에 의해 더 분리됩니다. 분획 A(BP-1-CD24-)는 오염 세포와 함께 사전 프로 B 세포에 해당한다. 분획 A에서 세포오염으로부터 사전 프로-B 세포를 분리하기 위해 CD93의 발현 및 CD19의 부재가 활용된다. 분수 B(BP-1-CD24int) 및 분수 C(BP-1+ CD24int)는 각각 조기 및 후기 프로-B 세포에 해당하며 분수 C(BP-1+/-CD24+)는 초기 B 전 세포에 해당한다. 분획 D-F를 분리하려면 IgM 및 IgD의 표현이 활용됩니다. 분수 D는 늦은 사전 B 세포 (IgM/낮은 IgD-)에 해당; 분수 E (블루 게이트, IgMint/높은 IgD-) 모두 미숙한 (Imm, IgMint IgD-) 및 과도기 (트란, IgMhigh IgD-) B 세포; 및 분수 F (IgMint / 높은 IgD +) 성숙한 B 세포를 재순환. FmOs는 게이트를 그릴 위치를 경험적으로 결정하는 데 사용되었습니다. 숫자는 동일한 밀도 플롯 내의 각 집단의 백분율입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 비장 B 세포 성숙의 특성화. 실행 가능한, 단일 세포, 크기 게이트 비장 B 세포는 B220+ 세포에 게이팅에 의해 비 B 세포로부터 분리된다. B-1 서브세트를 식별하기 위해 CD23-CD19+ 셀은 CD43의 발현에 의해 식별되고 정의된다. B-2 모집단을 분류하기 위해 CD19+ 셀은 과도기(CD93+ B220+) 및 성숙한(CD93-B220+) B 셀로 분리됩니다. 과도(CD93+ B220+) 셀은 T1(IgM+ CD23-), T2(IgM+ CD23+), T3(IgMint CD23+) 집단으로 더 나뉩니다. 성숙한 (CD93- B220+) 세포는 한계 영역 (CD21/35+ IgM+) 및 여포 (CD21/35int IgMint/+) B 세포로 분리됩니다. CD23의 발현은 더 성숙한 MZ (CD23- B220+) 세포에서 MZ 전구체 (CD23 + B220+) 세포를 분리하는 데 더 사용됩니다. 여포 인구는 다음 Fol I (IgD + IgMint) 및 Fol II (IgD + IgM+) 세포로 묘사됩니다. FmOs는 게이트를 그릴 위치를 경험적으로 결정하는 데 사용되었습니다. 숫자는 동일한 밀도 플롯 내의 각 채우기의 백분율입니다.
그림 4: 비장 B 세포의 Igθ 및 Igλ 발현. 실행 가능한, 단일 세포, 크기 게이트 비장 B 세포는 B220+ CD3 세포에 게이팅에 의해 비 B 세포로부터 분리된다. B 세포는 그 때 Igλ와 Igθ의 발현에 의해 구별됩니다. 숫자는 동일한 밀도 플롯 내의 각 집단의 백분율입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 절대 셀 번호 | |||||
| 동물 번호 | 실행 가능한 수막 세포 | B 셀 | B-1a 세포 | B-1b 세포 | B-2 세포 |
| 1 | 1.02E+07 | 4.67E+06 | 1.28E+06 | 8.95E+05 | 2.35E+06 |
| 2 | 9.92E+06 | 4.52E+06 | 1.49E+06 | 9.60E+05 | 1.91E+06 |
| 3 | 1.15E+07 | 4.56E+06 | 1.71E+06 | 9.19E+05 | 1.78E+06 |
| 평균의 | 1.05E+07 | 4.58E+06 | 1.49E+06 | 9.25E+05 | 2.01E+06 |
표 5: 복막 B 셀 하위 집합의 절대 셀 번호
| 절대 셀 번호 | |||||||||||
| 동물 번호 | 실행 가능한 골수 세포 | B 셀 | 분수 A | 프리 프로 | 분수 B | 분수 C | 분수 C' | 분수 D | 미 숙 | 전환 | 분수 F |
| 1 | 5.05E+07 | 9.70E+06 | 1.13E+06 | 1.95E+05 | 2.22E+05 | 9.14E+04 | 6.31E+05 | 1.59E+06 | 4.56E+05 | 7.81E+05 | 4.03E+06 |
| 2 | 5.39E+07 | 1.03E+07 | 1.14E+06 | 2.29E+05 | 2.89E+05 | 1.22E+05 | 8.40E+05 | 2.11E+06 | 5.39E+05 | 8.07E+05 | 3.67E+06 |
| 3 | 5.93E+07 | 1.01E+07 | 1.10E+06 | 2.12E+05 | 2.84E+05 | 1.05E+05 | 9.02E+05 | 2.72E+06 | 5.94E+05 | 7.62E+05 | 2.59E+06 |
| 평균의 | 5.46E+07 | 1.00E+07 | 1.12E+06 | 2.12E+05 | 2.65E+05 | 1.06E+05 | 7.91E+05 | 2.14E+06 | 5.29E+05 | 7.83E+05 | 3.43E+06 |
표 6: 골수 B 셀 하위 집합의 절대 세포 수
| 절대 셀 번호 | ||||||||||||
| 동물 번호 | 실행 가능한 비장 세포 | B 셀 | 과도기 B 셀 | T1 셀 | T2 셀 | T3 셀 | 성숙한 B 세포 | 여포 I 세포 | 여포 II 세포 | 전구체 한계 영역 셀 | 성숙한 한계 영역 셀 | B-1 셀 |
| 1 | 9.16E+07 | 4.61E+07 | 3.66E+06 | 1.55E+06 | 1.10E+06 | 7.16E+05 | 4.06E+07 | 2.39E+07 | 5.27E+06 | 2.17E+06 | 3.98E+06 | 8.83E+05 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.18E+07 | 4.88E+06 | 1.97E+06 | 1.57E+06 | 1.00E+06 | 4.49E+07 | 2.68E+07 | 7.33E+06 | 3.42E+06 | 3.84E+06 | 8.15E+05 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.34E+07 | 4.64E+06 | 1.98E+06 | 1.41E+06 | 8.54E+05 | 4.62E+07 | 2.81E+07 | 5.84E+06 | 3.58E+06 | 4.02E+06 | 1.01E+06 |
| 평균의 | 9.77E+07 | 5.04E+07 | 4.39E+06 | 1.83E+06 | 1.36E+06 | 8.58E+05 | 4.39E+07 | 2.63E+07 | 6.15E+06 | 3.06E+06 | 3.94E+06 | 9.02E+05 |
표 7: 비장 B 셀 하위 집합의 절대 세포 수
| 절대 셀 번호 | ||||
| 동물 번호 | 실행 가능한 비장 세포 | B 셀 | 이그θ+ B 셀 | 이그λ+ B 셀 |
| 1 | 9.16E+07 | 4.97E+07 | 4.51E+07 | 2.46E+06 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.63E+07 | 5.08E+07 | 3.16E+06 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.91E+07 | 5.33E+07 | 3.24E+06 |
| 평균의 | 9.77E+07 | 5.50E+07 | 4.97E+07 | 2.95E+06 |
표 8: 이그λ B 셀 서브셋의 절대 세포 번호
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Discussion
림프및 비 림프구 조직의 흐름 세포 분석은 1980 년대 이후 마우스와 인간에서 B 세포 하위 집단의 동시 식별 및 열거를 가능하게했다. 그것은 유머 면역의 척도로 사용되었으며 B 세포 기능을 평가하기 위해 더 적용 할 수 있습니다. 이 방법은 희귀 한 집단에서도 B 세포 이질성의 평가를 가능하게하는 다중 매개 변수의 동시 분석을 통해 마우스와 인간에서 B 세포 성숙의 다른 단계를 평가하기 위해 시약 가용성을 활용합니다. 복잡한 이종성 샘플을 측정하는 데 사용되는 경우 개별 셀33에서 몇 분 안에 하위 집단을 감지할 수 있습니다. 흐름 사이토메트릭 분석에 가장 자주 적용되는 순차 적 게이팅 분석 전략은 특정 인구를 식별해야 할 때 간단하고 직관적일 수 있습니다34. 마지막으로, 흐름 세포 측정의 또 다른 장점은 숙련 된 사용자의 지도하에, 대부분의 학술 실험실에서 쉽게 적응 할 수 있다는 것입니다. 우리의 프로토콜은 성공적으로 B-1 인구를 설명하고 열거하고 B-2 프로 B 세포, 전 B 세포, 미숙, 과도기 및 성숙한 B 세포의 발달로 탐구하고, Igθ 또는 Igλ 광 사슬의 그들의 표면 발현으로 탐구하여, 마우스의 복막, BM 및 비장의 B 세포 집단의 평가를 성공적으로 설명합니다. 유동 세포측정법은 마우스에서 B 세포 발달을 조사할 때 가장 널리 사용되고 가장 쉬운 방법으로 적용합니다.
유동 세포측정은 귀중한 데이터를 생성하는 동안, 면역 B 세포 구획의 이질성을 조사하는 데 사용될 때 이 기술에 몇몇 한계가 있습니다. 10색 염색을 통해 1,024개 이상의 다른 세포 집단34를 인식할 수 있기 때문에 거대한 데이터 세트는 압도적일 수 있습니다. 하나는 일부 일반적으로 사용 되는 림프 구 세포 마커 원래 생각 보다 덜 특이 한 것으로 입증 된 고려 해야 합니다. 이것은 원하는 인구에 게이팅을 확인하기 위해 수많은 세포 표면 마커를 사용하여 해결할 수 있습니다. 흐름 세포 측정 분석은 간단하고 직관적일 수 있지만, 순환 측정 을 흐름하는 또 다른 제약 조건은 일반적으로 t-SNE와 같은 데이터 시각화 도구를 사용하여 높은 파라미터 흐름 세포 측정법을 사용할 때 셀 집단을 보다 효율적으로 클러스터링할 수 있지만 일반적으로 한 번에 두 개의 매개 변수를 시각화할 수 있다는 것입니다. 또 다른 중요한 제한사항은 인수 및 분석 중에 사용되는 게이트가 때때로 연산자의 주관성에 의존한다는 것입니다.
이 프로토콜을 성공적으로 조정하거나 복제하려면 고려해야 할 몇 가지 중요한 매개 변수가 있습니다35. 패널 디자인과 불소 크롬 선택에 주의해야 합니다. 희미한 또는 중요한 항원과 밝은 불소 크롬을 페어링하는 것이 필수적입니다. 항체 적정은 비구체적으로 세포에 과도한 항체 결합을 피하기 위해 수행되어야하며, 잠재적으로 배경 염색 및 감소 해상도를 증가시면 가능합니다. 항체 적정은 항체의 농도가 감소하는 공지된 수의 세포를 염색하여 수행되며, 최상의 분리 지수36을 결정한다. 이것은 항체의 모든 많은 것을 위해 반복되어야 합니다. 샘플 준비 및 염색 하는 동안, Ca++와 Mg++를 피해 단일 셀 현탁액을 보장 하는 것이 중요 하다. 또한 EDTA를 첨가하면 항체 매개 자극 및 표지된 마커의 내재화로 이어질 수 있는 세포 응집 및 효소 활동을 방지할 수 있습니다. 데이터 수집에 앞서 샘플을 제대로 일시 중단, 필터링 및 집계가 없어야 합니다. 한 매개 변수에서 다른 매개 변수로 신호의 유출은 단일 스테인드 셀 또는 시판 가능한 보상 비즈35의 형태로 보상 제어를 사용하여 해결됩니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 각 실험에서 적절한 컨트롤을 갖는 것입니다. 얼룩이 없는 세포는 자동 형광의 기준선을 설정합니다. 동종 형 컨트롤은 더 이상 비특이적 바인딩으로 인해 게이팅에 적합한 컨트롤로 간주되지 않습니다. 정확한 게이트를 만드는 데 가장 중요한 단계는 FMO 컨트롤을 사용하는 것입니다. FMO 대조군에서, 모든 공자 항체는 통제되는 것을 제외하고는 얼룩에 존재한다. FMO 컨트롤을 사용하면 모든 형광이 누락된 채널로 확산되는 것을 측정할 수 있으므로 그에 따라 게이트를 설정할 수 있습니다. 추가 된 정확도를 위해 충분한 셀을 획득하는 것이 중요합니다. 일반적으로 관심 있는 인구의 최소 2,000개의 이벤트를 수집해야 합니다. 마지막으로, 비드나 세포등 보상 컨트롤은 활용되는 형광과 정확히 일치해야 하며, 대조군은 적어도 실험 샘플37만큼 밝아야 합니다.
전반적으로, B 세포 구획의 낮은 세포 측정 분석은 면역학 분야에서 널리 이용된다. 이 기술은 비 질병 상태에서 그리고 면역학 도전에 따라 야생 모형 및 유전자 변형한 마우스 둘 다에 있는 유머 면역에 있는 동요를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
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Disclosures
모든 저자는 Regeneron 제약, Inc.의 직원 및 주주입니다.
Acknowledgments
원고를 비판적으로 읽어주신 매튜 슬리먼에게 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구를 지원해 준 Regeneron의 Vivarium 운영 및 플로우 세포측정 핵심 부서에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
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