Summary
Vi beskriver heri en enkel analyse av heterogeniteten til det murinske immun B-cellerommet i bukhinnen, milten og benmargsvevet ved strømningscytometri. Protokollen kan tilpasses og utvides til andre musevev.
Abstract
Omfattende studier har preget utviklingen og differensiering av murine B-celler i sekundære lymfoide organer. Antistoffer utskilt av B-celler har blitt isolert og utviklet til veletablerte terapeutiske behandlinger. Validering av murine B celleutvikling, i sammenheng med autoimmune utsatte mus, eller hos mus med modifisert immunforsvar, er en avgjørende komponent for å utvikle eller teste terapeutiske midler hos mus og er en passende bruk av strømningscytometri. Veletablerte B-cellestrømcytometriske parametere kan brukes til å evaluere B-celleutvikling i murinperitoneum, benmarg og milt, men en rekke beste praksiser må følges. I tillegg bør strømningscytometrisk analyse av B-cellerom også utfylle ytterligere avlesninger av B-celleutvikling. Data generert ved hjelp av denne teknikken kan fremme vår forståelse av vill type, autoimmune utsatte musemodeller samt humaniserte mus som kan brukes til å generere antistoff- eller antistofflignende molekyler som terapeutiske.
Introduction
Monoklonale antistoffer har i økende grad blitt valgterapi for mange menneskelige sykdommer når de blir en del av vanlig medisin1,2. Vi har tidligere beskrevet genmodifiserte mus som effektivt produserer antistoffer som skjuler fullt menneskelige variable regioner med mus IgH-konstanter3,4. Senest har vi beskrevet genetisk konstruerte mus som produserer antistofflignende molekyler som har distinkt antigenbinding5. Antistoffer utskilles av B-celler og danner grunnlaget for adaptiv humoral immunitet. Det finnes to forskjellige typer B-celler, B-1 og B-2. Hos pattedyr stammer B-1-celler fra fosterlever og er beriket i slimhinnevev og pleural- og bukhulen etter fødselen, mens B-2 celler stammer fra fosterlever før fødselen og deretter i benmargen (BM). B-2 celler er beriket i sekundære lymfoide organer, inkludert milten og blodet6,7,8. I BM begynner B-2 hematopoietiske forfedre å skille seg ut til pro-B-celler ved oppstart av Ig mu heavy chain rearrangement9,10. Vellykket omorganisering av Ig tung kjede og dens montering i pre-B celle reseptoren (pre-BCR), sammen med signalering og proliferativ ekspansjon, fører til differensiering til pre-B celler. Etter at før-B-celler omorganiserer Ig kappa (Igκ), eller hvis uproduktive, Ig lambda (Igλ) lyskjeder, parrer de seg med μ tunge kjede, noe som resulterer i overflate IgM BCR-uttrykk. Det er viktig å påpeke at IgM overflateuttrykk er kjent for å bli redusert under forhold med autoreaktivitet, og dermed bidra til selvtoleranse i funksjonelt ikke-responderende eller anergiske B-celler11,12. Umodne B-celler går deretter inn i et overgangsstadium, hvor de begynner å uttrykke IgD og migrere fra BM til milten. I milten øker IgD-uttrykket ytterligere og cellene modnes til en andre fase av overgangs B-celler, etterfulgt av ferdigstillelse av modningsstatus og utvikling i enten marginal sone (MZ) eller follikulære (Fol) celler13,14,15. Hos voksne mus, i en ikke-syk setting, forblir antall modne B-celler konstant til tross for at 10-20 millioner umodne B-celler genereres daglig i BM. Av disse går bare tre prosent inn i bassenget med modne B-celler. Størrelsen på det perifere B-cellerommet er begrenset av celledød, delvis på grunn av flere faktorer, inkludert selvreaktivitet og ufullstendig modning16,17,18. Flow cytometrisk analyse har blitt mye brukt til å karakterisere og liste opp mange immuncelleunderrom hos mennesker og mus. Mens det er noen likheter mellom menneskelige og murine B cellerom, gjelder denne protokollen bare for analyse av murine B-celler. Denne protokollen ble utviklet med det formål å fenotyping genetisk konstruerte mus, for å avgjøre om genetisk manipulasjon ville endre B-celleutviklingen. Flowcytometri har også vært enormt populært i mange andre applikasjoner, inkludert i måling av celleaktivering, funksjon, spredning, syklusanalyse, DNA-innholdsanalyse, apoptose og cellesortering 19,20.
Flow cytometri er det valgte verktøyet for å karakterisere ulike lymfocyttrom hos mus og mennesker, inkludert i komplekse organer som milten, BM og blod. På grunn av allment tilgjengelige musespesifikke antistoffreagenser for strømningscytometri, kan denne teknikken brukes til å undersøke ikke bare celleoverflateproteiner, men også intracellulære fosfoproteiner og cytokiner, samt funksjonelle avlesninger21. Her viser vi hvordan strømningscytometrireagenser kan brukes til å identifisere B-celler undergrupper når de modnes og differensierer i sekundære lymfoidorganer. Etter optimalisering av fargeforhold, prøvehåndtering, riktig instrumentoppsett og datainnsamling, og til slutt dataanalyse, kan en protokoll for omfattende strømningscytometrisk analyse av B-cellerommet hos mus benyttes. En slik omfattende analyse er basert på en tiår gammel nomenklatur utviklet av Hardy og kolleger, hvor utvikling av BM B-2-celler kan deles inn i forskjellige fraksjoner (Fraction) avhengig av deres uttrykk for B220, CD43, BP-1, CD24, IgM og IgD22. Hardy et al., viste at B220 + CD43 BM B-celler kan deles inn i fire delsett (Brøk A-C') på grunnlag av BP-1 og CD24 (30F1) uttrykk, mens B220 + CD43-(dim to neg) BM B-celler kan løses i tre delsett (Fraction D-F) basert på differensialuttrykk av IgD og overflate IgM23. Brøk A (pre-pro-B celler) er definert som BP-1- CD24 (30F1)-, Brøk B (tidlige pro-B-celler) er definert som BP-1- CD24 (30F1)+, Brøk C (sen pro-B-celler) defineres som BP-1+ CD24 (30F1)+, og Brøk C' (tidlige for-B-celler) defineres som BP-1+ og CD24high. Videre er Brøk D (pre-B-celler) definert som B220+ CD43- IgM- B-celler, og Brøk E (nylig genererte B-celler, kombinasjon av umodne og overgangsceller) er definert som B220+ CD43- IgM + B-celler og Brøk F (modne, resirkulerende B-celler) defineres som B220high CD43- IgM + B-celler. Derimot kan de fleste naive B-celler som finnes i milten deles inn i modne (B220+ CD93-) B-celler og overgangsceller (T1, T2, T3), avhengig av uttrykk for CD93, CD23 og IgM. Eldre B-celler kan løses i marginalsone og follikulære delsett basert på uttrykk for IgM og CD21/CD35, og follikulære delsett kan videre deles inn i moden follikulær type I og follikulær type II B celledelsett avhengig av nivået på deres IgM- og IgD-overflateuttrykk24. Disse splenic B cellepopulasjonene uttrykker overveiende Igκ lyskjede. Til slutt har B-1 B cellepopulasjoner, som stammer fra fosterlever og hovedsakelig finnes i bukhinnen og pleuralhulen til voksne mus, blitt beskrevet i litteraturen. Disse peritoneale B-cellene kan skilles fra de tidligere beskrevne B-2 B-cellene ved mangel på CD23-uttrykk. De blir deretter videre delt inn i B-1a eller B-1b populasjoner, med førstnevnte definert av tilstedeværelsen av CD5 og sistnevnte ved fravær25. B-1 celle forfedre er rikelig i fosterlever, men finnes ikke i voksen BM. Mens B-1a og B-1b celler stammer fra forskjellige forfedre, frø de både peritoneal og pleural hulrom24. I motsetning til B-2 celler er B-1 celler unikt i stand til selvfornyelse og er ansvarlige for produksjon av naturlige IgM-antistoffer.
Defekter i B-celleutvikling kan oppstå i mange tilfeller, inkludert mangler i komponentene i BCR26,27, perturbasjoner av signalmolekyler som påvirker BCR-signalstyrke14,28,29, eller forstyrrelse av cytokiner som modulerer B-celleoverlevelse30,31 . Flow cytometrianalyse av lymfoidrommene har bidratt til karakteriseringen av B-celleutviklingsblokkene i disse musene og mange andre. En fordel med strømningscytometrisk analyse av lymfoide rom er at den gir muligheten til å gjøre målinger på individuelle celler oppnådd fra levende dissosiert vev. Tilgjengeligheten av reagenser i et stadig voksende utvalg av fluoroforer muliggjør samtidig analyse av flere parametere og muliggjør vurdering av B-celle heterogenitet. Videre kompletterer opplisting av B-celler ved strømningscytometrisk analyse andre immunologiske analyser som immunhiistokjemiske metoder som visualiserer cellelokalisering innen lymfoide organer, påvisning av sirkulerende antistoffnivåer som et mål på humoral immunitet, samt to fotonmikroskopi for å måle B-celleresponser i det virkelige rom og tid32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle musestudier ble overvåket og godkjent av Regeneron's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Eksperimentet ble utført på vev fra tre C57BL/6J kvinnelige mus (17 ukers alder) fra Jackson Laboratories. Titrate alle antistoffer før du starter eksperimentet for å bestemme ideell konsentrasjon. Når du bruker kompensasjonsperler for enfarget kompensasjon, må du sørge for at de flekker like lyse eller lysere enn prøvene dine. Hold alle buffere, antistoffer og celler på is eller ved 4 °C. Etter tilsetning av levedyktighetsfarge, utfør alle trinn og inkubasjoner ved 4 °C i enten lite lys eller i mørket.
1. Peritoneal cellehøsting og enkeltcelleisolasjon
- Avlive musen ved hjelp av CO2 eller i henhold til godkjent protokoll.
- Legg musen på ryggen, spray med 70% etanol, og kutt ytre bukhud med saks, vær forsiktig så du ikke kutter bukhinnen.
- Injiser 3 ml iskald vaskebuffer (0,5 % bovint serumalbumin (BSA) i DPBS [vol/vol]) i bukhulen med en 3 ml sprøyte utstyrt med en 25 gauge nål.
- Masser forsiktig bukhinnen med fingertupper.
- Gjenta trinn 1.3 og 1.4.
- Sett inn en 3 ml sprøyte utstyrt med en 18 G nål gjennom bukhinnen, og vær forsiktig med å unngå organer og fett.
- Trekk ut vaskebufferen, som nå inneholder bukceller, og overfør til 15 ml konisk rør på is.
- Gjenta trinn 1.3 og 1.4.
- Klipp et lite hull i bukhinnen mens du holder opp med pinsett.
- Sett inn en engangsoverføringspipette i hullet og samle den gjenværende vaskebufferen, og unngå igjen fett og organer.
- Overfør de innsamlede gjenværende bukhinnecellene til det koniske røret på 15 ml på is.
MERK: Kast prøven hvis blodkontaminering er tydelig. - Inkuber cellene på is til milten og beinutvinningen er fullført.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirer supernatanten.
- Resuspend cellepellet i 1 ml vaskebuffer.
- Filtrer cellene gjennom en 70 μM cellesil i et rent 15 ml konisk rør på is.
- Bestem cellekonsentrasjonen ved hjelp av et celletellerinstrument eller hemocytometer.
2. Milthøsting og enkeltcelleisolasjon
- Legg musen på magen og kutt gjennom bukhinnen på venstre bakside ved hjelp av ren saks. Klipp ut milten, fjern fett og bindevev.
- Overfør milten til et 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder 1 ml vaskebuffer på is.
- Inkuber milten på isen til beinutvinningen er fullført.
- Flytt milten til automatisert dissosiasjonsrør med 5 ml rød blodcellelysbuffer. Plasser røret på vevsdissosiatorinstrumentet og ta avstand i 60 s for å lage en enkelt cellefjæring.
MERK: Det er også tillatt å bruke andre rutinemessige metoder for å oppnå encellede miltsuspensjoner som å knuse mellom frostede glasssklier i vaskebufferen. Hvis en annen dissosiasjonsmetode brukes, følg dissosiasjonen med sentrifugering, aspirasjon og deretter resuspension i 5 ml rødblodcellelysbuffer før du fortsetter til trinn 2,5. - Inkuber cellene ved romtemperatur i 3 min.
- Tilsett 10 ml 4 °C vaskebuffer som inneholder 2 mM EDTA.
- Overfør til et rent 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirer supernatanten.
- Resuspend cellepellet i 5 ml 4 °C vaskebuffer.
- Filtrer cellene gjennom en 70 μM cellesil i et rent 15 ml konisk rør på is.
- Bestem cellekonsentrasjonen ved hjelp av et celletellerinstrument eller hemocytometer.
3. BM-høsting og enkeltcelleisolasjon
- Fjern huden fra den nedre halvdelen av musekroppen. Trim overflødig muskel fra beinet. Fjern hele benet med saks, vær forsiktig så du ikke kutter lårbenet. Rengjør lårbenet og tibia ved å fjerne gjenværende muskler, fett og føtter.
- Overfør beinene til et 1,5 ml mikrosenterrør som inneholder 1 ml vaskebuffer på is.
- Perforer bunnen av et 0,5 ml mikrosenterrør, slik at et hull er lite nok til at benbenene ikke stikker ut. Sett 0,5 ml-røret inn i et rent 1,5 ml mikrosenterrør. Klipp av enden av lårbenet og tibia proksimalt til kneet og plasser de kuttede endene vendt ned i 0,5 ml-røret.
- Sentrifuger cellene ved 6780 x g i 2 min ved 4 °C.
- Resuspend cellepellet i 1 ml rød blodcelle lysis buffer og overføre til en 15 ml konisk rør som inneholder en ekstra 3 ml rød blodcelle lysis buffer.
- Inkuber ved romtemperatur i 3 min.
- Tilsett 10 ml 4 °C vaskebuffer som inneholder 2 mM EDTA.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 8 min ved 4 °C. Aspirer supernatanten.
- Resuspend cellepellet i 3 ml 4 °C vaskebuffer.
- Filtrer celler gjennom en 70 μM cellesil inn i et rent 15 ml konisk rør på is.
- Bestem cellekonsentrasjonen ved hjelp av et celletellerinstrument eller hemocytometer.
4. Flekk celler og forberede kompensasjon
- Aliquot 106 celler av hver celletype fra hvert dyr til en 96 brønn U bunnplate.
- Sørg for å inkludere nok brønner for alle prøver og kontroller, inkludert full flekk, fluorescens-minus-en (FMO), unstained, og til slutt valgfri enkeltfargekompensasjon for hver fluorofor som brukes.
- For BM modningspanelet og miltmodningspanelet, aliquot celler i 2 brønner, 106 celler per brønn, for hver full flekk prøve. Legg til 2 x 106 celler av hver celletype i individuelle brønner for synlighetskontrollene for én fargekompensasjon.
- Sentrifuger platen ved 845 x g i 2 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten ved raskt å invertere og flikke platen over en vask, og vær forsiktig så du ikke krysser forurensende brønner.
- Resuspend cellene i 200 μL av DPBS (uten BSA eller FBS). Dette trinnet er viktig for å fjerne protein før farging med amin-reaktivt levedyktighetsfargestoff.
- Gjenta trinn 4.2 og 4.3.
- Gjenta trinn 4.2.
- Resuspend cellene i 100 μL levedyktighet fargestoff fortynnet 1:1,000 i DPBS.
MERK: Hvis du bruker celler for enfarget kompensasjon, må du ikke tilsette levedyktighetsfargestoffer i disse brønnene.- For hvert flekksett, la flere unstained brønner for en helt unstained prøve og andre kontroller du måtte trenge.
- For hvert flekksett, la en ekstra unstained brønn for levedyktighet FMO kontroll.
- For ytelseskontrollene for enfarges levedyktighet: Resuspend de 2 x 106 cellene, aliquoted i trinn 4.1, i 200 μL fortynnet levedyktighet fargestoff. Overfør 100 μL celler til et 1,5 ml mikrosenterrør, varmeceller i 5 min ved 65 °C, og overfør de 100 μL varme drepte cellene tilbake til den opprinnelige brønnen med de 100 μL gjenværende levende cellene.
- Inkuber celler ved 4 °C, beskyttet mot lys, i 30 minutter.
- Sentrifuger platen ved 845 x g i 2 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten ved raskt å invertere og flikke platen over en vask, og vær forsiktig så du ikke krysser forurensende brønner.
- Resuspend cellene i 200 μL av DPBS (uten BSA eller FBS).
- Gjenta trinn 4.8 og 4.9.
- Gjenta trinn 4.8.
- Resuspend cellene i 50 μL av Fc blokk fortynnet 1:50 (endelig konsentrasjon = 10 μg / ml) i flekkbuffer (0,5% BSA i DPBS [vol / vol]).
- For bukhinneceller - legg også til 5 μL monocyttblokker for å redusere ikke-spesifikk farging.
- Inkuber cellene ved 4 °C, beskyttet mot lys, i 15 minutter.
- Forbered full flekkmasterblandinger og FMOer i flekkbuffer for et sluttvolum på 100 μl per 106 celler. Se tabell 1-tabell 4 for antistofflistene.
MERK: FMOer er laget ved å inkludere alle antistoffer i et flekksett unntatt ett. Forbered en FMO for hvert antistoff i et flekksett. Når et flekksett inneholder flere strålende fargestoffer, erstatter du 50 μL strålende flekkbuffer for flekkbuffer per prøve - Uten å fjerne Fc-blokken, tilsett 100 μL fulle flekkblandinger og FMOer til utvalgte brønner.
- Forbered kompensasjonskontroller med én farge for hvert antistoff i et flekksett.
- Hvis du bruker kompensasjonsperler, følg produsentens bruksanvisninger.
- Hvis du bruker celler, tilsett titrert antistoff til 106 celler, reservert tidligere i trinn 4.6.1 uten levedyktighetsfargestoff, i 100 μL flekkbuffer. Hvis alle cellene i utvalget er positive for en bestemt markør, setter du til side ubegrunnet celler som skal brukes ved henting av kompensasjonsdata på strømningscytometeret.
- Inkuber cellene og perlene ved 4 °C, beskyttet mot lys, i 30 minutter.
- Sentrifuger platen ved 845 x g i 2 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten ved raskt å invertere og flikke platen over en vask, og vær forsiktig så du ikke krysser forurensende brønner.
- Resuspend cellene og perlene i 200 μL flekkbuffer.
- Gjenta trinn 4.18 og 4.19 to ganger.
- Gjenta trinn 4.18.
- For å fikse prøvene for analyse innen 48 timer, resuspend celler og perler i 200 μL av 2% paraformaldehyd i DPBS.
FORSIKTIG: Parafomaldehyd er en alvorlig helsefare og brannfarlig. Se Safty Data Sheet før bruk. - Inkuber cellene og perlene ved 4 °C, beskyttet mot lys, i 30 minutter.
- Gjenta trinn 4.18 og 4.19 to ganger.
- Plasser en filterplate over en ren U-bunnplate på 96 brønn. Bruk en multipipette, overfør hver prøve til en brønn på filterplaten.
- Sentrifuger filterplaten-96 brønn U-bunnplateoppsett ved 845 x g i 2 min ved 4 °C. Fjern filterplaten og dekanter supernatanten ved raskt å invertere og flikke platen over en vask, og vær forsiktig så du ikke krysser forurensende brønner.
- For BM- og miltmodningspanelene resuspenderer de fullt fargede cellene i 100 μL flekkbuffer. Kombiner de 2 brønnene for hvert dyr i 1 brønn. Resuspend de resterende panelene, FMOene og kontrollene i 200 μL flekkbuffer.
- Inkuber faste celler og perler ved 4 °C, beskyttet mot lys, over natten.
5. Innsamling av cytometriske data for flow
- Initialiser og QC flytcytometeret i henhold til produsentens instruksjoner.
- Last inn malen som er spesifikk for hvert panel.
- Før du registrerer data, må du sørge for at alle hendelser for hver prøve er i stor skala og synlige på prikkplottene.
- Registrer kompensasjonskontroller for hvert flekkpanel ved hjelp av enkeltflekkkompensasjoner utarbeidet i trinn 4.16. Angi positive og negative porter for hver prøve. Få programvaren til å beregne kompensasjonsmatrisen.
- Begynn å anskaffe den første prøven, og sørg for at portene er riktig innstilt.
- Angi at maskinen skal registrere minst 50 000 B-cellehendelser for peritoneal B-cellepanelet og milten Igκ- og Igλ-panelet. 150 000 B-cellehendelser for BM-modningspanelet; og 300 000 B-cellehendelser for miltmodningspanelet.
- For hvert flekkpanel kjører og registrerer du de fullt fargede prøvene for hvert dyr, en uoppdaget prøve og FMOene.
6. Analysere data
- Fortsett med dataanalyse ved hjelp av programvare for flytcytometrianalyse. Følg gatingstrategiene som er beskrevet i figur 1, figur 2, figur 3, figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi gating strategien for karakterisering B celle utvikling i musen peritoneum, BM og milt. Grunnlaget for analysen er dannet rundt begrepet farging med levedyktighetsfargestoff, og deretter gating ut dobler basert på Forward-Scatter-Area (FSC-A) og Forward-Scatter-Height (FSC-H), og til slutt gating ut rusk ved å velge celler i henhold til deres FSC-A og Side-Scatter-Area (SSC-A) egenskaper, referert til her som størrelsesporten, som reflekterer relativ cellestørrelse og cellegranularitet, før gating på befolkning av interesse.
Flow cytometrisk analyse av peritoneale B-celler viser frekvensene til levedyktige bukhinneceller, totale B-celler, B-1- og B-2-delsett, samt B-1a- og B-1b-celler i C57BL/6J-mus (figur 1), ved hjelp av et fargepanel skissert i tabell 1. Gjennomsnittlig absolutt cellenummer for disse frekvensene vises i tabell 5. Perturbasjoner i B-1-celler kan avgrenses ved distribusjon av celledelsett, enten etter cellefrekvens eller absolutt celletall per mus.
Strømningscytometrisk analyse av BM B-celler viser frekvensene til levedyktige BM-celler, B-celler, Brøk A (pre-pro-B-celler og forurensende lymfocytter), pre-pro-B-celler, Brøk B, Brøk C, Brøk C', Brøk D, umoden (delsett i Brøk E), overgang (delsett i Brøk E) og Brøk F B-celler i C57BL/6J-mus (figur 2), ved hjelp av et fargepanel som er skissert i tabell 2. Gjennomsnittlig absolutt cellenummer for disse frekvensene vises i tabell 6. Perturbasjoner i BM B-celler kan avgrenses ved distribusjon av celledelsett, enten etter cellefrekvens eller absolutt celletall per ben.
Strømningscytometrisk analyse av miltniske B-celler viser frekvensene til levedyktige miltceller, totalt B-celler, overgangsB-celler, T1, T2, T3-celler, modne B-celler, follikulære I-celler (Fol I), follikulære II(Fol II)-celler, marginalsoneceller (MZ), modne MZ-celler og B-1-celler i C57BL/6J-mus (figur 3), ved hjelp av et fargepanel skissert i tabell 3. Gjennomsnittlig absolutt cellenummer for disse frekvensene vises i tabell 7. Perturbasjoner i miltniske B-celler kan avgrenses ved distribusjon av celledelsett, enten etter cellefrekvens eller absolutt celletall per milt.
På samme måte viser strømningscytometrisk analyse av milten frekvensene til Igκ+ og Igλ+ B-celler i C57BL/6J-mus (figur 4), ved hjelp av et fargepanel skissert i tabell 4. Gjennomsnittlig absolutt cellenummer for disse frekvensene vises i tabell 8. Perturbasjoner i Igκ+ og Igλ+ Bcells kan avgrenses ved distribusjon av celledelsett, enten etter cellefrekvens eller absolutt celletall per milt.
| Antistoff | Fluorofor | klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD11b | BV711 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
Tabell 1: Peritoneal B-cellepanel
| Antistoff | Fluorofor | klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | 1B11 |
| CD24 (HSA) | PE | 30-F1 |
| C-sett | BUV395 | 2B8 |
| BP-1 | BV786 | BP-1 |
| CD93 | BV711 | AA4.1 |
| dump kanal | ||
| CD3 | AF700 | 17-A2 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| GR1 (Ly6C/6G) | AF700 | RB6-8C5 |
| Ter119 | AF700 | TER-119 |
Tabell 2: Benmargsmodningspanel
| Antistoff | Fluorofor | klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD43 | FITC | S7 |
| CD23 | BUV395 | B3B4 |
| CD21/35 | BV421 | 7G6 |
| CD11b | AF700 | M1/70 |
| CD5 | BV605 | 53-7.3 |
| CD93 | PE | AA4.1 |
Tabell 3: Miltmodningspanel
| Antistoff | Fluorofor | klon |
| CD19 | APC-H7 | 1D3 |
| B220 | APC | RA3-6B2 |
| Igm | PeCy7 | II/41 |
| IgD | PerCpCy5.5 | 11-26c.2a |
| CD3 | PB | 17-A2 |
| Kappa | FITC | 187.1 |
| Lambda | PE | RML-42 |
Tabell 4: Milten Igκ og Igλ Panel
Figur 1: Karakterisering av B-cellepopulasjoner i bukhinnen. Levedyktige, enkeltcellede, størrelse inngjerdede peritoneale B-celler skilles først fra forurensende celler ved å gating på IgM + celler. B-1- og B-2-celler skilles deretter fra hverandre ved fravær (B-1) eller tilstedeværelse av CD23 (B-2). Neste CD5-uttrykk brukes til å avgrense B-1a-celler (CD5+) fra B-1b-celler (CD5-). FMOer ble brukt til empirisk å bestemme hvor portene skal tegnes. Tall er prosenter av hver populasjon innenfor samme tetthetstegning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av B-celledelsett i BM. Levedyktige, enkeltcellede, størrelse inngjerdede BM B-celler skilles fra ikke-B-celler ved å gating på B220+ dump- (hvor dump refererer til CD3 / GR-1 / CD11b / TER119) celler. CD43- og B220-uttrykket definerer Hardy Fraction A-C' (CD43+ B220+) og Hardy Fraction D-F (CD43low/neg B220+/++). Brøk A-C' er ytterligere atskilt med uttrykk for BP-1 og CD24. Brøk A (BP-1- CD24-) tilsvarer pre-pro-B celler sammen med forurensende celler. For å skille pre-pro-B celler fra forurensende celler i Brøk A, brukes uttrykket av CD93 og fraværet av CD19. Brøk B (BP-1- CD24int) og Brøk C (BP-1+ CD24int) tilsvarer henholdsvis tidlige og sene pro-B-celler, og Brøk C' (BP-1+/- CD24+) tilsvarer tidlige pre-B-celler. Uttrykk for IgM og IgD brukes for å skille Brøk D-F. Brøk D tilsvarer sen pre-B celler (IgM-/lav IgD-); Brøk E (blå port, IgMint/høy IgD-) til både umodne (Imm, IgMint IgD-) og overgangsceller (Tran, IgMhigh IgD-) B; og Brøk F (IgMint/høy IgD+) for resirkulering av modne B-celler. FMOer ble brukt til empirisk å bestemme hvor portene skal tegnes. Tall er prosenter av hver populasjon innenfor samme tetthetstegning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av milt B-cellemodning. Levedyktige, enkeltcellede, størrelse inngjerdede milniske B-celler skilles fra celler som ikke er B-celler, ved å stirre på B220+-celler. For å identifisere B-1-delsettet identifiseres og defineres CD23- CD19+-cellene av uttrykk for CD43. For å klassifisere B-2-populasjoner er CD19+-celler delt inn i overgangsceller (CD93+ B220+) og modne celler (CD93- B220+). Overgangsceller (CD93+ B220+) er videre delt inn i T1-populasjoner (IgM+ CD23-), T2 (IgM+ CD23+) og T3 (IgMint CD23+). Eldre celler (CD93- B220+) er delt inn i marginalsoneceller (CD21/35+ IgM+) og follikulære celler (CD21/35int IgMint/+). Uttrykket av CD23 brukes videre til å skille MZ forløperceller (CD23+ B220+) fra mer modne MZ-celler (CD23- B220+). Follikulære populasjoner avgrenses deretter til Fol I-celler (IgD+ IgMint) og Fol II-celler (IgD+ IgM+). FMOer ble brukt til empirisk å bestemme hvor portene skal tegnes. Tall er prosenter av hver populasjon innenfor samme tetthetsplott Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Igκ- og Igλ-uttrykk for milt B-celler. Levedyktige, enkeltcellede, størrelse inngjerdede splenic B-celler er skilt fra ikke-B-celler ved å gating på B220 + CD3-celler. B-celler preges deretter av uttrykket av Igλ og Igκ. Tall er prosenter av hver populasjon innenfor samme tetthetstegning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Absolutt cellenummer | |||||
| Dyr Nummer | Levedyktige bukhinneceller | B celler | B-1a celler | B-1b celler | B-2 celler |
| 1 | 1.02E+07 | 4.67E+06 | 1.28E+06 | 8.95E+05 | 2.35E+06 |
| 2 | 9.92E+06 | 4.52E+06 | 1.49E+06 | 9.60E+05 | 1.91E+06 |
| 3 | 1.15E+07 | 4.56E+06 | 1.71E+06 | 9.19E+05 | 1.78E+06 |
| Gjennomsnitt | 1.05E+07 | 4.58E+06 | 1.49E+06 | 9.25E+05 | 2.01E+06 |
Tabell 5: Absolutte cellenumre for peritoneale B-celledelsett
| Absolutt cellenummer | |||||||||||
| Dyr Nummer | Levedyktige benmargceller | B celler | Brøk A | Pre-pro | Brøk B | Brøk C | Brøk C' | Brøk D | Umoden | Overgangs | Brøk F |
| 1 | 5.05E+07 | 9.70E+06 | 1.13E+06 | 1.95E+05 | 2.22E+05 | 9.14E+04 | 6.31E+05 | 1.59E+06 | 4.56E+05 | 7.81E+05 | 4.03E+06 |
| 2 | 5.39E+07 | 1.03E+07 | 1.14E+06 | 2.29E+05 | 2.89E+05 | 1.22E+05 | 8.40E+05 | 2.11E+06 | 5.39E+05 | 8.07E+05 | 3.67E+06 |
| 3 | 5.93E+07 | 1.01E+07 | 1.10E+06 | 2.12E+05 | 2.84E+05 | 1.05E+05 | 9.02E+05 | 2.72E+06 | 5.94E+05 | 7.62E+05 | 2.59E+06 |
| Gjennomsnitt | 5.46E+07 | 1.00E+07 | 1.12E+06 | 2.12E+05 | 2.65E+05 | 1.06E+05 | 7.91E+05 | 2.14E+06 | 5.29E+05 | 7.83E+05 | 3.43E+06 |
Tabell 6: Absolutte cellenumre for benmarg B-celledelsett
| Absolutt cellenummer | ||||||||||||
| Dyr Nummer | Levedyktige miltceller | B celler | Overgang B-celler | T1-celler | T2-celler | T3-celler | Eldre B-celler | Follikulære I-celler | Follikulære II-celler | Forløper marginale soneceller | Eldre marginalsoneceller | B-1 celler |
| 1 | 9.16E+07 | 4.61E+07 | 3.66E+06 | 1.55E+06 | 1.10E+06 | 7.16E+05 | 4.06E+07 | 2.39E+07 | 5.27E+06 | 2.17E+06 | 3.98E+06 | 8.83E+05 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.18E+07 | 4.88E+06 | 1.97E+06 | 1.57E+06 | 1.00E+06 | 4.49E+07 | 2.68E+07 | 7.33E+06 | 3.42E+06 | 3.84E+06 | 8.15E+05 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.34E+07 | 4.64E+06 | 1.98E+06 | 1.41E+06 | 8.54E+05 | 4.62E+07 | 2.81E+07 | 5.84E+06 | 3.58E+06 | 4.02E+06 | 1.01E+06 |
| Gjennomsnitt | 9.77E+07 | 5.04E+07 | 4.39E+06 | 1.83E+06 | 1.36E+06 | 8.58E+05 | 4.39E+07 | 2.63E+07 | 6.15E+06 | 3.06E+06 | 3.94E+06 | 9.02E+05 |
Tabell 7: Absolutte cellenumre for spleniske B-celledelsett
| Absolutt cellenummer | ||||
| Dyr Nummer | Levedyktige miltceller | B celler | Igκ+ B-celler | Igλ+ B-celler |
| 1 | 9.16E+07 | 4.97E+07 | 4.51E+07 | 2.46E+06 |
| 2 | 9.97E+07 | 5.63E+07 | 5.08E+07 | 3.16E+06 |
| 3 | 1.02E+08 | 5.91E+07 | 5.33E+07 | 3.24E+06 |
| Gjennomsnitt | 9.77E+07 | 5.50E+07 | 4.97E+07 | 2.95E+06 |
Tabell 8: Absolutte cellenumre for Igκ- og Igλ B-celledelsett
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flow cytometrisk analyse av lymfoide og ikke-lymfoide vev har muliggjort samtidig identifisering og opplisting av B-celleunderpopulasjoner hos mus og mennesker siden 1980-tallet. Den har blitt brukt som et mål på humoristisk immunitet og kan brukes videre for å evaluere B-cellefunksjonalitet. Denne metoden utnytter reagenstilgjengelighet for å vurdere ulike stadier av B-cellemodning hos mus og mennesker, ved hjelp av samtidig analyse av flere parametere som muliggjør vurdering av B-celle heterogenitet, selv i sjeldne populasjoner. Hvis det brukes til å måle komplekse heterogene prøver, kan det oppdage underpopulasjoner i løpet av få minutter, på individuelle celler33. Sekvensiell gatinganalysestrategi, oftest anvendt på strømningscytometrisk analyse, kan være enkel og intuitiv når en bestemt populasjon må identifiseres34. Til slutt er en annen fordel med flowcytometri at den lett kan tilpasses i de fleste akademiske laboratorier, mens den er under veiledning av erfarne brukere. Vår protokoll beskriver vellykket vurdering av B-cellepopulasjoner i bukhinnen, BM og milt av mus, ved å beskrive og liste opp B-1-populasjoner og dykke ned i utviklingen av B-2 pro-B-celler, pre-B-celler, umodne, overgangs- og modne B-celler, samt deres overflateuttrykk av Igκ- eller Igλ-lyskjeder. Flowcytometri er den mest brukte og enkleste metoden å bruke når man undersøker B-celleutvikling hos mus.
Mens strømningscytometri genererer uvurderlige data, er det noen grenser for denne teknologien når den brukes til å undersøke heterogeniteten til immun B-cellerommet. Store datasett kan være overveldende fordi 10 fargefarging tillater anerkjennelse av mer enn 1024 forskjellige cellepopulasjoner34. Man må ta hensyn til at noen ofte brukte lymfoidcellemarkører har vist seg å være mindre spesifikke enn opprinnelig antatt. Dette kan løses ved å bruke en rekke celleoverflatemarkører for å fastslå gating på ønskede populasjoner. Selv om strømningscytometrisk analyse kan være enkel og intuitiv, er en annen begrensning for å flyte cytometrisk analyse at den vanligvis tillater visualisering av bare to parametere om gangen, selv om datavisualiseringsverktøy som t-SNE kan brukes til å klynge cellepopulasjoner mer effektivt når du bruker høyparameterflytcytometri. En annen viktig begrensning er at portene som brukes under både oppkjøpet og analysen noen ganger er avhengige av operatørens subjektivitet.
For vellykket tilpasning eller replikering av denne protokollen, er det flere kritiske parametere som må tas i betraktning35. Det må tas nøye hensyn til paneldesign og fluorokromvalg. Det er viktig å parre svake eller viktige antigener med lyse fluorokromer. Antistofftitrering må utføres for å unngå overflødig antistoffbinding til celler som ikke er spesifikt, noe som potensielt kan øke bakgrunnsfarging og synkende oppløsning. Antistofftitrering utføres ved å fargelegge et kjent antall celler med synkende konsentrasjoner av antistoffer, for å bestemme den beste separasjonsindeksen36. Dette bør gjentas for alle antistoffer. Under prøvepreparering og farging er det viktig å sikre en enkelt celle suspensjon ved å unngå Ca ++ og Mg ++. I tillegg kan tilsetning av EDTA bidra til å forhindre celleaggregering og enzymatisk aktivitet som kan føre til antistoffmediert stimilulering og internalisering av merkede markører. Før datainnsamlingen må prøvene suspenderes, filtreres og frigjøres på riktig måte. Utslipp av signal fra en parameter til en annen løses ved hjelp av kompensasjonskontroller, i form av enkeltfargede celler eller kommersielt tilgjengelige kompensasjonsperler35. Et annet viktig hensyn er å ha riktige kontroller i hvert eksperiment. Unstained celler etablere grunnlinjen for autofluorescence. Isotype-kontroller anses ikke lenger som passende kontroller for gating på grunn av ikke-spesifikk binding. Det viktigste trinnet for å bidra til å lage nøyaktige porter er bruken av FMO-kontroller. I en FMO-kontroll er alle konjugerte antistoffer til stede i flekken bortsett fra den som kontrolleres for. FMO-kontroller muliggjør måling av spredningen av alle fluoroforene inn i den manglende kanalen og tillater dermed å sette opp porter deretter. Det er viktig at nok celler er anskaffet for ekstra nøyaktighet. Som en tommelfingerregel bør minst 2000 hendelser av interessepopulasjonen samles inn. Til slutt bør kompensasjonskontroller, enten perler eller celler, tilpasses nøyaktig fluorokromene som brukes, og kontrollene må være minst like lyse som de eksperimentelle prøvene37.
Totalt sett er lav cytometrisk analyse av B-cellerom mye brukt i immunologifeltet. Denne teknikken kan brukes til å undersøke perturbasjoner i humoristisk immunitet hos både vill type og genetisk modifiserte mus, under ikke-sykdomstilstander og ved immunologisk utfordring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte og aksjonærer i Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Acknowledgments
Vi takker Matthew Sleeman for kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker også avdelingene Vivarium Operations og Flow Cytometry Core i Regeneron for å støtte denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
References
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H.
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S.
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M.
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S.
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K.
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P.
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B.
