Summary
מוצג להלן הליך עבור קביעות הניתנות לשחזור ותקפות סטטיסטית של התפלגות גודל גרגירי עמילן, ולציון התפלגות גודל לוגנורמי של גרגירים שנקבעו באמצעות טופס כפול שני פרמטרים. זה ישים לכל ניתוחי גודל גרגירים של דגימות עמילן בקנה מידה גרם למחקר מדעי הצמח והמזון.
Abstract
עמילן מכל מקורות הצמח מורכבים מגורמים במגוון גדלים וצורות בעלי תדרי התרחשות שונים, כלומר, מציגים גודל והתפלגות צורות. נתוני גודל גרגירי עמילן שנקבעו באמצעות מספר סוגים של טכניקות שינוי גודל חלקיקים הם לעתים קרובות בעייתיים בשל רבייה לקויה או חוסר מובהקות סטטיסטית הנובעת מכמה שגיאות שיטתיות בלתי עבירות, כולל רגישות לצורות גרגירים ומגבלות של גדלים מדגם גרגירים. התווינו הליך עבור קביעות ניתנות לשחזור ותקף סטטיסטית של התפלגות גודל גרגירי עמילן באמצעות טכניקת אזור חישה חשמלית, ולציון התפלגות גודל לוגנורמי גרגר נחוש באמצעות טופס כפול שני פרמטרים מאומץ עם דיוק משופר ומזווה. זה ישים לכל ניתוחי גודל גרגירים של דגימות עמילן בקנה מידה גרם, ולכן, יכול להקל על מחקרים על איך גדלי גרנול עמילן מעוצבים על ידי מנגנון ביוסינתזה עמילן ומנגנונים; וכיצד הם משפיעים על תכונות ופונקציונליות של עמילנים לשימושי מזון ותעשייה. תוצאות מייצגות מוצגות מניתוחים משוכפלים של התפלגות גודל גרגירים של דגימות עמילן sweetpotato באמצעות ההליך המתואר. כמו כן דנו בכמה היבטים טכניים מרכזיים של ההליך, במיוחד, המפרט המכפיל של הפצות גודל לוגנורמי גרגר וכמה אמצעים טכניים להתגבר על חסימת צמצם תכופה על ידי אגרגטים גרגירים.
Introduction
גרגירי עמילן הם המבנה הפיזי שבו שני פולימרים הומוגלוקניים מילואים עיקריים בפוטוסינתזה של צמחים ורקמות אחסון, אמילוז ליניארי או מסועף בדלילות והאמילופקטין בעל ההסתעפות, ארוזים בצורה מסודרת יחד עם כמה מרכיבים משניים, כולל שומנים וחלבונים. גרגירי עמילן ממיני צמחים שונים מציגים צורות תלת מימדיות (תלת מימדיות) רבות (הנסקרות ב-ref. 1,2), כולל כדורים, אליפסואידים, פוליהדרונים, טסיות הדם, קוביות, cuboids, ו tubules לא סדיר. אפילו אלה מאותה רקמה או רקמות שונות של אותו מיני צמחים יכולים להיות קבוצה של צורות עם תדרי התרחשות משתנים. במילים אחרות, גרגירי עמילן ממין צמחים עשויים להיות בעלי התפלגות צורה סטטיסטית אופיינית, ולא צורה ספציפית. צורות הגרגר הלא אחידות והלא כדוריות מקשות על מדידה והגדרה של גדלי גרגירים עמילניים. בנוסף, גרגירי עמילן מאותן רקמות של מיני צמחים הם במגוון גדלים עם פרופורציות שונות, כלומר, מציגים התפלגות גודל אופיינית. התפלגות גודל זה מסבכת עוד יותר את הניתוח והתיאור של גדלי גרגירי עמילן.
גדלי גרגירי עמילן נותחו באמצעות מספר קטגוריות של טכניקות שינוי גודל חלקיקים (שנסקרו ב-ref. 3), כולל מיקרוסקופיה, משקעים / שברי זרימת שדה סטריים (Sd / StFFF), עקיפת לייזר ואזור חישה חשמלית (ESZ). עם זאת, טכניקות אלה אינן מתאימות באותה מידה לקביעת גדלי גרגירי עמילן בנוכחות צורת גרגירים והתפלגות גודל. מיקרוסקופיה, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים אור, confocal וסריקה, מצוין למחקרים של מורפולוגיה4,5,6,7, מבנה8,9 ופיתוח10,11 של גרגירי עמילן, אבל בקושי מתאים להגדרת חלוקות הגודל שלהם בשל כמה חסרונות אינהרנטיים. מדידות ישירות של תמונות גרגירים מיקרוסקופיות או ניתוח תמונה בסיוע תוכנה של נתוני מיקרוסקופיה אופטיים (IAOM), אשר שימשו לקביעת גדלי גרגירים של עמילנים ממספר מינים, כולל תירס12, חיטה13,14, תפוח אדמה15 ושעורה16, יכול למדוד רק 1D (בדרך כלל אורך מקסימלי) או 2D (שטח פנים) גדלים של מספרים מוגבלים מאוד (עשרות עד כמה אלפים) של תמונות גרנול עמילן. גדלי דגימת הגרגרים הקטנים המוגבלים מטבעם על ידי הטכניקות יכולים לעתים רחוקות להיות מייצגים סטטיסטית, בהתחשב במספרי הגרגרים העצומים ליחידת משקל של עמילן (~ 120 x 106 לגרם, בהנחה שכל 10 כדורי מיקרומטר בצפיפות של 1.5 גרם לסמ"ק), ולכן, עלולים להוביל לשחזור לקוי של התוצאות. טכניקת Sd/StFFF עשויה להיות במהירות גבוהה וברזולוציה גבוהה, ושברי גודל צרים של גרגירי עמילן17, אך לעתים רחוקות נעשה בה שימוש כנראה משום שדיוקה עלול להיפגע קשות מנזקים, צורות שונות וצפיפות של גרגירי עמילן. טכניקת עקיפת הלייזר היא הנפוצה ביותר, והוחלה על ניתוחי גודל גרגירים עמילניים עבור כל מיני היבולים העיקריים3,14,16. למרות הטכניקה יש יתרונות רבים, זה למעשה לא מתאים קביעות של גדלי גרגירים עמילן בנוכחות התפלגות צורת גרגירים. רוב מכשירי עקיפת הלייזר בו-זמנית מסתמכים על תיאוריית פיזור האור של מי18 עבור חלקיקים כדוריים אחידים ותורת Mie18 ששונתה עבור צורות אחרות של אחידות. הטכניקה היא, אם כן, מטבעה רגישה מאוד לצורות חלקיקים, ולא לגמרי מתאימה אפילו לצורות מסוימות של אחידות19, שלא לדבר על גרגירי עמילן שיש להם קבוצה של צורות בפרופורציות שונות. טכניקת ESZ מודדת את הפרעת השדה החשמלי ביחס לנפח החלקיק העובר דרך פתח. הוא מספק גדלי נפח גרנול, כמו גם את פרטי הפצת מספר ונפח, וכו ', ברזולוציות גבוהות. מאז טכניקת ESZ אינה תלויה בכל תכונות אופטיות של חלקיקים כולל צבע, צורה, הרכב או אינדקס שבירה, והתוצאות הן מאוד לשחזור, הוא מתאים במיוחד לקביעת התפלגות גודל של גרגירי עמילן שיש קבוצה של צורות.
גדלי גרגירים עמילן הוגדרו גם באמצעות פרמטרים רבים. לעתים קרובות הם תוארו באופן פשטני על ידי קטרים ממוצעים, אשר במקרים מסוימים היו האמצעי האריתמטי של האורכים המקסימליים הנמדדים מיקרוסקופית של תמונות דו-ממדיות12,20, או ממוצעים של קטרים מקבילים של כדור3. במקרים אחרים, התפלגויות גודל הגרגר צוינו באמצעות טווחי גודל21,22, נפח ממוצע ההתפלגות או קוטר ממוצע (שווה ערך לכדור, משוקלל לפי מספר, נפח או שטח פנים) בהנחה של התפלגות רגילה14,23,24,25,26. מתארים אלה של גדלי גרגירי עמילן מניתוחים שונים הם בעלי אופי שונה בהרבה, ואינם דומים לחלוטין. זה יכול להיות מטעה מאוד אם אלה "גדלים" של גרגירי עמילן ממינים שונים או אפילו את אותן רקמות של אותו מין הושוו ישירות. יתר על כן, הפרמטר כפולה (או צורה) של התפלגויות נורמליות להניח, כלומר, סטיית התקן σ (או סטיית תקן גרפית σg)מדידת רוחב ההתפלגות (כלומר, התפשטות הגדלים), התעלמו ברוב המחקרים.
כדי לפתור את הבעיות הקריטיות הנ"ל הניצבות בפני ניתוחי גודל גרגירי עמילן, התווינו הליך עבור קביעות ניתנות לשחזור ותקף סטטיסטית של התפלגות גודל גרגירים של דגימות עמילן באמצעות טכניקת ESZ, ולציון נכון של התפלגות הגודל הלוגנורמי של גרגיר הגרגרים שנקבעו באמצעות טופס כפול שני פרמטריםמאומץ 27 עם דיוק ושיוויון משופרים. לצורך אימות והדגמה, ביצענו ניתוחי גודל גרנול משכפלים של דגימות עמילן sweetpotato באמצעות ההליך, וציינו את הפרש הלוגינורמלי נפח אחוז שווה ערך כדור קוטר התפלגות באמצעות האמצעים הגיאומטריים הגרפיים שלהם 
סטיות תקן כפולות s* בצורת x/ (להכפיל ולחלק) s* .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת דגימות עמילן
- הכינו שתי (או שלוש) דגימות עמילן משוכפלות בקנה מידה של גרם מרקמות צוברות עמילן של מיני צמחים שונים בעקבות ההליכים שנקבעו (למשל, תפוחי אדמה15, בטטפוטו28, גרגרי חיטה13,29, וגרעיני תירס30, וכו ').
- ביסודיות לשטוף דגימות עמילן עם אצטון או טולואן 3-4x כדי למזער אגרגטים גרגירים ולייבש אותם לחלוטין.
הערה: השתמש בהליכי חילוץ המניבים יותר מ 1 גרם של עמילן לכל הכנה. אחד או שניים 0.5-g aliquots מכל שלוש או שתיים תמציות לשכפל, בהתאמה, נדגמים לניתוח גודל גרגר של תמצית עמילן אחד.
2. הכנת אלקטרוליטים
- הכינו 500 מ"ל של ליתיום כלוריד 50 גרם/ל' במתנול לארבע ריצות שינוי גודל לדגימות עמילן שכפול (100 מ"ל לריצה בתוספת 100 מ"ל נוספים). רצוי, להפוך את האלקטרוליט בקבוצות בנפח גדול, למשל, 4 עד 8 L בכל פעם, כדי למזער את וריאציית הריכוז.
- מצננים את המיכל על קרח או בארון של 4 מעלות צלזיוס כדי להאיץ את פירוק הליתיום כלוריד.
3. הגדרת המנתח
- בחר צינור צמצם עם טווח קוטר חלקיקים המכסה את טווח גודל הגרגר הידוע (בספרות או באמצעות ריצות ניסיון) של דגימות עמילן שיש לנתח, למשל, צמצם של 100 מיקרומטר לעמילנים מתוקים. עבור דגימות עמילן של טווח גודל גרגירים לא ידוע, בחר צמצם מתאים באמצעות ריצות ניסיון באמצעות מספר צינורות צמצם בעלי טווחי קוטר חלקיקים חופפים.
הערה: טווח קוטר החלקיקים של צינור הצמצם הוא טווח הגודל המדויק שלו בין 2 ל -60% ממנו, ועם טווח גודל מורחב עד 80% מקוטר הפתח שלו. טבלה 1 מפרטת מאפיינים של שלושה שפופרות צמצם שימושיות ביותר לשינוי גודל גרגירים של עמילני יבול עיקריים. אם טווח גודל הגרגר של דגימת עמילן רחב יותר מטווח הגודל של צינור צמצם יחיד, בצע ניתוח חפיפה מרובה שפופרות המשלב עד חמש התפלגויות גודל חלקיקים הנמדדות עם פתחים בגדלים שונים. כל פתח מזוהה על ידי קוטרו ומספר החלק שלו המסומן על הצינור. קוטרו ומספרו הסידורי הכלולים בברקוד בצינור ניתן לסרוק לתוכנת המנתח באמצעות קורא הברקוד בלוח הבקרה של המנתח. - בחר אנליטית 100 או 200 מל (מעל cuvettes) לקביעת גדלי גרנול עמילן, ולהגדיר ערבוב אוטומטי (להלן) כדי לשמור על השעיית גרנול טוב במהלך המדידה.
- צרו שיטת הפעלה סטנדרטית (SOM) לציון קביעות הפעלה וקובץ העדפות לניתוח, הצגה והדפסה של התוצאות. שלב את קובץ SOM והעדפות לפרוצדורת הפעלה רגילה (SOP) לפי הצורך.
הערה: לניתוחים שאינם ניתנים לתקנון, השתמש ב- SOM כדי להפעיל את הניתוחים והתאם את הגדרות ה- SOM בין הפעלות דרך חלון עריכת ה- SOM (ראה להלן) לפי הצורך. לאחר השלמת ההפעלה, נתח, הצג והדפס את תוצאות ההפעלה על-ידי שינוי ההעדפות כרצונך. לניתוחי גודל גרגירים סטנדרטיים, השתמש ב- SOP כדי להפעיל את הניתוחים.- הפעל את תוכנת המנתח. במאנו הראשי, לחץ על SOP | צור אשף SOM או ערוך את ה- SOM, או בלוח המצב, לחץ על ערוך SOM. השתמש באשף או בחלון עריכת ה- SOM כדי לבחור הגדרות עבור SOM. הגדרות המשמשות בדרך כלל לשינוי גודל גרגירים של דגימות עמילן sweetpotato מסוכמות בטבלה 2.
- שמור את ה- SOM שנוצר בקובץ בחלון אשף ההגדרות של SOM, או בחלון עריכת ה- SOM.
- במאנו הראשי, לחץ על SOP | אשף יצירת העדפות או עריכת העדפות. השתמשו באשף או בכרטיסיות בחלון העריכה 'העדפות' לבחירת קביעות העדפה כמו אלה שבטבלה 3 או באחרות לפי הצורך.
- שמרו את ההעדפות שנבחרו בקובץ בחלון 'צור העדפות' באשף-סיכום ההגדרות או בחלון 'עריכת העדפות'.
- בתפריט הראשי, לחץ על SOP | צור אשף SOP. לאחר קו היישור שלב אחר שלב של האשף, הזן תיאור, בחר בקובץ SOM והעדפות כדי ליצור ולשמור SOP.
4. ניתוחי גודל גרנול של דגימות עמילן
- הכנת המנתח
- הפעל את המנתח, פתח את התוכנה במחשב ואמת את המצב מוכן בחלק העליון של לוח המצב לאחר החיבור האוטומטי שלו למנתח.
- ממלאים את צנצנת האלקטרוליטים באלקטרוליט, מרוקנים את צנצנת הפסולת במידת הצורך.
- התקן ואבטח כראוי את צינור הצמצם שנבחר בעקבות המדריך במדריך למשתמש. עבור צינור פתח חדש שלא כויל, כייל אותו בהתאם למדריך שלב אחר שלב תחת כיול | כייל את הצמצם בתפריט הראשי. עבור צינור פתח מכויל, ודא את הכיול בהתאם למדריך שלב אחר שלב של אשף החלפת שפופרת הצמצם תחת | הפעלה או כיול אמת כיול פתח בתפריט הראשי.
- בטל את נעילת פלטפורמת ההסמכה על-ידי דחיפת סרטון שחרור הנעילה (בחזית האמצעית של קיר תא הדגימה השמאלי) והורד ידנית את הפלטפורמה לתחתית. מניחים אנליטית המכילה 100 מל של אלקטרוליט על הפלטפורמה, מעבירים את האסטר לתנוחה המרגשת ומעלים ידנית את הפלטפורמה למיקום העליון של הנעילה העצמית כדי לטבול את צינור הצמצם ולערבב באלקטרוליט.
- לחץ על מילוי בסרגל הכלים של המכשיר התחתון כדי שהמנתח ימלא את המערכת באופן אוטומטי באלקטרוליט ולחץ על Flush כדי שהמנתח ירוקן את המערכת באופן אוטומטי.
- טען את ה- SOM על-ידי לחיצה על SOP | טען SOM בתפריט הראשי והשתמש ב- SOM כדי להפעיל ניתוח ללא קובץ העדפות. לחלופין, טען SOP על-ידי לחיצה על SOP | טען SOP בתפריט הראשי או טען SOP בלוח המצב והשתמש ב- SOP כדי להפעיל ניתוח.
- אם אתם משתמשים ב-SOP, לחצו על SOP | פרטי SOM או על 'פרטי העדפה' בתפריט הראשי כדי לאמת את ההגדרות 'SOM' ו'העדפה'. לחץ על | לדוגמה הזן מידע לדוגמה בתפריט הראשי או ערוך מידע בלוח המצב כדי להזין את המידע לדוגמה עבור ההפעלה.
- הכנת דגימת עמילן-מתנול והשעיית גודל
- לשקול שתיים או אחת 0.5 g מדגם מכל שתיים או שלוש תמציות עמילן לשכפל, בהתאמה.
- הוסף כל אחד aliquots עמילן 0.5 גרם כדי 5 מ"ל מתנול בצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל, ולפזר באופן מלא גרגירי עמילן באמצעות מספר פולסים של אולטרסאונד בעוצמה נמוכה (12-24 W / cm2) ממעבד קולי.
- באמצעות פיפטה העברה חד פעמית, להחיל טיפה אחת קטנה של השעיית עמילן-מתנול (~ 0.2 מ"ל) כדי 100 מ"ל של 50 g / L LiCl מתנול אלקטרוליט תחת ערבוב מתמיד בכומתה. סגור את דלת תא הדגימה.
- ביצוע הפעלת שינוי גודל
- לחץ על תצוגה מקדימה בסרגל הכלים התחתון של הכלי כדי להתחיל הפעלת תצוגה מקדימה. בלוח המצב, ודא שסרגל הריכוז המוצג באופן דינמי הוא בירוק, ומציג טווח ריכוז נומינלי של 5 עד 8% עבור המתלה.
- לחץ על עצור בסרגל הכלים התחתון כדי לעצור את הפעלת התצוגה המקדימה. במידת הצורך, לדלל את ההשעיה עמילן-אלקטרוליט על ידי החלפת aliquot של המתלה עם אלקטרוליט, ולאחר מכן לחזור על תצוגה מקדימה לרוץ.
הערה: טווח הריכוז הנומינלי של 5% עד 8% של המתלה הוא קריטי להשלמת ריצה ללא הפסקה עקב חסימת פתח על ידי גרגירים מצטברים. במידת הצורך, להתאים את גודל המדגם טיפה, ו / או את הריכוז של השעיית עמילן-מתנול כדי להפוך השעיה עמילן אלקטרוליט חדש שיש את הריכוז הנומינלי בטווח האופטימלי. - לאחר האימות, לחץ על התחל בסרגל הכלים התחתון כדי להתחיל את ההפעלה. המנתח משלים באופן אוטומטי את ההפעלה לאחר שהספירה הכוללת של גרגירים בגודל, המוצגת יחד עם זמן הריצה בלוח המצב בריצה, מגיעה לספירת הסכום המוגדרת (125,000 או 250,000) על-ידי מצב הבקרה של ה- SOM. בהתאם לריכוז המתלים (בטווח של 5-8% ומטה), ריצה אחת אורכת 2 עד 5 דקות או יותר.
הערה: כאשר המנתח מזהה באופן אוטומטי חסימת פתח לכל הגדרות זיהוי חסימה של ה- SOM, הוא יבטל את ההפעלה, ירוק כדי לבטל את חסימת הצמצם ולהתחיל הפעלה חדשה. פעולת חסימה זו מוגדרת לחזור באופן מרבי במשך ארבע פעמים לפני שהמנתח מבטל את פעולת ההפעלה. ניתן להתגבר על בעיית חסימה זו באמצעות שתי שיטות טכניות כפי שצוין בטבלה 2 ומפורט בדיון. - במידת הצורך, בצע הפעלה חוזרת טכנית (ראה טבלה 2 ומפורטת בדיון) באמצעות אותה השעיית עמילן-אלקטרוליטים פשוט על-ידי לחיצה על התחל או חזור בסרגל הכלים התחתון.
- לאחר השלמת ריצה או ריצות חוזרות, רוקן את הכומתה, שטף אותה במתנול ומלא אותה בתמיסת אלקטרוליטים טריים של 100 מ"ל להפעלה הבאה.
- במהלך ריצה, אם מופיעה תיבת דו-שיח של דיווח על טווח גודל מורחב כאשר ספירת הגרגרים הגדולה מ- 60 מיקרומטר חורגת מ- 0.1% מהספירה הכוללת (לפי הגדרת SOM), לחץ על הפעל 60% עד 80% להפעלת טווח גודל דינמי מורחב עד 80% מקוטר הצמצם.
הערה: ההגדרה טווח גודל מורחב שולטת בפעולות עבור גרגירים הגדולים מ- 60% מקוטר הצמצם (100 מיקרומטר, במקרה זה). ההגדרה ב- SOM מציינת הכללה של גרגירי עמילן הגדולים מ- 60 מיקרומטר כאשר הספירה שלהם מגיעה ליותר מ- 0.1% מהספירה הכוללת. השלמת הריצה עדיין נשלטת על ידי הספירה הכוללת, ועשויה להימשך מעט פחות זמן מאשר אחרת ללא הכללת הגרגרים הגדולים יותר בהיקף של פחות מ- 0.1% (סכום לא משמעותי באופן סטטי) של הספירה הכוללת.
- ניתוח תוצאות ההפעלה
- אם נעשה שימוש ב- SOM כדי לשלוט בריצות, בחרו 'קביעות העדפות' לפי הצורך להצגה, הדפסה וניתוח סטטיסטי של התוצאות באמצעות אשף יצירת העדפות או אשף עריכת העדפות תחת ה-SOP בתפריט הראשי.
- שכבת-על נובעת מהפעלות מרובות בגרף יחיד להשוואה.
- לחץ על שכבת-על בסרגל הכלים הראשי או | הקובץ הראשי שכבת-על בתפריט הראשי כדי לגשת לחלון שכבת-העל. נווט אל קבצי התוצאות הרצויים מרובים ובחר אותם בתיבה קבצים, לחץ על הוסף כדי להעביר אותם לתיבה קבצים נבחרים ולחץ על אישור כדי לכסות את התוצאות שנבחרו בתרשים יחיד.
- כדי להוסיף קובץ לשכבת-על פתוחה, לחץ על קובץ הפעלה | פתח את האפשרות שכבת-על בתפריט הפעלה כדי לגשת לחלון שכבת-העל, נווט אל הקובץ הרצוי ולחץ כדי להוסיף.
- תוצאות ממוצעות מניתוחים של שכפול (2 תמציות x 2 דגימת עמילן או 3 תמציות x דגימת עמילן 1), ולהציג או להדפיס את ההתפלגות והסטטיסטיקה הממוצעות של גודל גרנול ברשימה או בגרף.
- בתפריט הראשי, לחץ על קובץ | קובץכדי | ממוצע לפתיחת החלון הממוצע. נווט אל קבצי התוצאות הרצויים מרובים ובחר אותם בתיבה קבצים, לחץ על הוסף כדי להעביר אותם לתיבה קבצים נבחרים ולחץ על אישור כדי לממוצע התוצאות שנבחרו ולהציג את הממוצע בתרשים יחיד.
- כדי לכלול קובץ תוצאות נוסף בהתפלגות ממוצעת, בתפריט הפעלה, לחץ על קובץ הפעלה | פתח והוסף לממוצע כדי לפתוח את החלון הוסף לממוצע, נווט אל הקובץ והוסף אותו. הממוצע החדש מופיע בגרף בחלון הפעלה (תוצאה) או ברישום.
5. ציון ההתפלגות הממוצעת
- בחלון תפריט הפעלה המציג את ההתפלגות הממוצעת, לחץ על חשב | סטטיסטיקה ממוצעת בתפריט הפעלה כדי לפתוח את חלון סיכום הסטטיסטיקה, המציג את הסטטיסטיקה הממוצעת בשורות ואת סטטיסטיקת הגרף עבור ההתפלגות הממוצעת בעמודות.
- השתמש בממוצע הגיאומטרי הגרפי (
) ו- S.D.(s*) בעמודה סטטיסטיקת גרף כדי לציין את ההתפלגות הממוצעת בטופס x/ s* . חשב את וריאציות מדידת קורות החיים בין התפלגויות השכפול הממוצעות על-ידי חלוקת הממוצע (μ, זהה לממוצע ההתפלגות) של האמצעים הגיאומטריים של ההתפלגויות הממוצעות עם ממוצע S.D. (σ) המפורט בשורת הסטטיסטיקה הממוצעת.
הערה: ממוצע S.D. (עבור μ) הערכת וריאציות בין האמצעים של התפלגויות שכפול שונה S.D. הגיאומטרית הגרפית (עבור ) מדידת התפשטות ההתפלגות הממוצעת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאמת את ההליך, ולהפגין שחזור של התפלגות גודל הגרגר שנקבע, ביצענו ניתוחי גודל משוכפלים של דגימות עמילן sweetpotato. הכנו דגימות עמילן משוכפלות (S1 ו- S2) מממתקים שגודלו בשדה של קו רבייה SC1149-19 בגיל התפתחותי דומה באמצעות הליך שתואר קודם לכן28. מכל תמצית עמילן, שני aliquots 0.5 גרם (a ו- b) נדגמו, מושעה ב 5 מ"ל של מתנול sonicated עם כמה פולסים של אולטרסאונד באנרגיה נמוכה כדי לשבור אגרגטים. כל אחד משני זוגות של השעיות עמילן-מתנול היה טיפה-דגימה כדי להפוך את השעיית עמילן אלקטרוליט, אשר היה אז בגודל פעמיים (ריצות חזרה טכנית) באמצעות SOM שתואר לעיל עבור ספירה כוללת של 125,000 גרגירים כל אחד. עבור כל ריצת שינוי גודל בודדת, לאחר שהספירה הכוללת מגיעה ויותר מ- ~ 65,000 ו- ~ 125,000, ה- S.D. הגיאומטרי הגרפי(s*) והכוונה הגיאומטרית ( ) של התפלגות גודל הנפח הדיפרנציאלי המוצגת אינם משתנים עוד באופן משמעותי, בהתאמה. כל זוג ריצות חוזרות באמצעות השעיית עמילן-מתנול אחת מוזג לאחר השלמת ספירת גודל כוללת של 250,000.
איור 1 מציג התפלגויות דיפרנציאליות של קוטר נפח שווה ערך לכדור (S1a, S1b, S2a ו- S2b) עבור ארבעת ניתוחי שינוי הגודל המשוכפלים של דגימות עמילן sweetpotato והתפלגותן הממוצעת. קורות החיים של הממוצע של האמצעים הגיאומטריים של ארבע התפלגויות השכפול היה 3.75 %, הממחיש שחזור מצוין של תוצאות הגודל. כל אחת מארבע התפלגויות השכפול נקבעה מגודל דגימה גדול מאוד של 250,000 גרגירים, הרבה מעבר לספירות המינימליות (~ 65,000 ו - ~ 125,000) שמעליה הגיאומטרי הגרפי S.D.(s*) והמשמעות הגיאומטרית ( ) של התפלגות גודל הנפח הדיפרנציאלי המוצגת בריצת גודל אחת כבר לא משתנה באופן משמעותי. לכן, ההתפלגויות שנקבעו בגודל אמצעי אחסון היו חוקיות סטטיסטית. לדיוק טוב יותר ולהשלמה (נדון להלן) של המפרט של התפלגות גודל גרנול lognormal נקבע, כל ההפצות הללו צוינו באמצעות האמצעים הגיאומטריים הגרפיים שלהם ( ) ו S.D.(s*) בצורת x/ (להכפיל ולחלק) s* כמפורט בגרף. אנא שימו לב כי התפלגות גודל הגרגר של עמילן sweetpotato הותאמה בקפדנות להיות לוגנורמלית כפי שתואר קודם לכן28.
איור 1: התפלגות גודל שווה-ערך של נפח באחוז נפח לוגי-אחוזים משכפול ניתוחי גודל של דגימות עמילן sweetpotato. ערכת הדגימה עבור ארבעת ניתוחי שינוי גודל השכפול פורטו בתוצאה. ארבע ההפצות (S1a, S1b, S2a ו- S2b) מניתוחים משוכפלים והממוצע שלהם היו מכוסים וצוינו באמצעות הטופס x/ (להכפיל ולחלק) s* . לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 מציג את ההתפלגויות המצטברות (או הממוצעות) המצטברות (<) וגודל אחוזי הנפח של ארבעת ניתוחי שינוי גודל השכפול, שהיו תצוגות המרה של התפלגות גודל הנפח-אחוז הדיפרנציאלית הממוצעת. ההשוואה בין המספר המצטבר לבין אחוזי הנפח של גרגירי עמילן הראתה כי גרגירים בעלי קטרים קטנים יותר של כדור שווה ערך לנפח היוו אחוזים גדולים בהרבה מהספירה הכוללת. לדוגמה, המספרים של גרגירים בעלי קטרים שווה ערך נפח כדור קטן יותר או שווה ל 9.976 מיקרומטר היוו 48.53% מכלל הספירה, עדיין רק 5.854% מכלל הנפח.
איור 2: התפלגות ממוצעת מצטברת (<) וגודל אחוזי נפח של גרגירי עמילן מארבעת ניתוחי שינוי גודל השכפול של דגימות עמילן sweetpotato. שתי ההתפלגויות הן תצוגות שינוי צורה של התפלגות הגודל הממוצע באיור 1. הגרף משווה את המספר המצטבר (<) (ציר Y שמאלי) לאחוזי עוצמת הקול (ציר Y הימני) של גרגירי עמילן בעלי גדלי כדור שווה ערך לנפח נמוכים יותר או שווים לסלים בגודל מסוים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| קוטר צמצם (מיקרומטר) | טווח קוטר חלקיקים (μm) | טווח נפח חלקיקים (μm3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0.524 - 33.5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
טבלה 1: שלושה שפופרות צמצם שימושיות ביותר לשינוי גודל גרגירים של עמילנים ממיני יבולים.
| הגדרות SOM | בחירה | |
| תיאור | תיאור SOM | גודל גרגירי עמילן |
| מחבר SOM | - | |
| תיאור לדוגמה | דגימות עמילן סוויטפוטו | |
| אלקטרוליט (100 ק"מ | 50 גר' L-1 ליתיום כלוריד | |
| פיזור | לא | |
| צמצם | 100 מיקרומטר | |
| מצב בקרה | מצב בקרה | ספירה כוללת [250,000] או [125,000]a |
| מיכל פסולת | כאשר 80% מלא | |
| הפעל הגדרות | הזן מידע לדוגמה | כן |
| מספר ריצות | 1 (או 2, עבור ריצות חוזרות) | |
| רוקן צינור צמצם לפני הריצה | כן | |
| רוקן צינור צמצם לאחר ריצה | כן | |
| שמור קובץ | כן, כולל נתוני דופק | |
| ייצוא נתונים | כן | |
| הדפס דוח | כן | |
| השווה למפרטים לדוגמה | לא | |
| הצג | גודל | |
| הגדרות סטירר | דוגמת דוגמת דוגמה | 100 מ"ל מולטי-מיזר 4 ST |
| השתמש מערבב | כן | |
| מהירות | [15], CW (מבחינת שעון) | |
| מיקום סטירר | אוטומטי | |
| סף, נוכחי ורווח | סף שינוי גודל | 2 מיקרומטר |
| זרם פתח | 1600 mA | |
| רווח דגימה מראש | 2 | |
| טווח גודל מורחב b | בעת ספירה [> 0.1%] של הספירה הכוללת | |
| הגדרות דופק לגודל | סלים בגודל | 400 |
| טווח גודל | 2 עד 60 מיקרומטר | |
| מרווח בין סלים | קוטר יומן רישום | |
| תיקון צירוף מקרים | כן | |
| עריכת דופק | לא | |
| ריכוז | סכום לדוגמה | 0.2 מ"ל |
| צפיפות | - | |
| השתמש בגורם טרום דילול | - | |
| אמצעי אחסון אנליטי | - | |
| נפח אלקטרוליטים | 100 מ"ל | |
| השתמש בגורם דילול | לא | |
| חסימה | זיהוי חסימה | אוטומטי (מתחילת ההפעלה) |
| זיהוי חסימות המוגדר כברירת מחדל: כאשר שיעור הספירה <20%, שיעור הצמצם >40%, או עליית הריכוז >40%. | ||
| פעולת חסימה | ביטול, ביטול חסימה והפעלה מחדש,עד [4] פעמים | |
| הצג סמל | כן | |
| צג חסימה | שיעור ספירה | |
| a : אם ביטול חסימה והפעלהמחדש חוזרים ונשנים לא הצליחו להשלים את הריצה בעלת הספירה הגדולה יותר, בצע שתי ריצות חוזרות של שינוי גודל של ספירה כוללת נמוכה יותר של 125,000 כל אחת מאותה השעיית עמילן-אלקטרוליטים, ומזג את תוצאות הריצות החוזרות באמצעות [MergeRuns] תחת [FileTools] של [קובץ] בתפריט הראשי. לחלופין, החלף את השעיית עמילן-אלקטרוליט עם אחד חדש בעל ריכוז נומינלי נמוך יותר (2-5%). בעת הכנת השעיה חדשה של עמילן-אלקטרוליט מדגם טיפה, דופק-sonicate השעיית עמילן-מתנול שוב כדי לשבור אגרגטים יותר. | ||
| b: טווח הגודל המורחב שולט בפעולות עבור גרגירים הגדולים מ- 60% קוטר הצמצם (100 מיקרומטר ב- SOM זה). ההגדרה מציינת הכללה של גרגירי עמילן הגדולים מ- 60 מיקרומטר כאשר הספירה שלהם גדולה מ- 0.1% מהספירה הכוללת. | ||
טבלה 2: הגדרות SOM אופייניות לשליטה בריצות שינוי גודל עבור דגימות עמילן sweetpotato.
| הגדרות העדפה | בחירה | |
| דוחות מודפסים | מידע לדוגמה | מדגם, מספר הפעלה, סלים בגודל, ספירות כוללות |
| תרשימי גודל | נפח דיפרנציאלי %, ציר יומן X, חלק לפי קבוצות של שבעה | |
| סטטיסטיקת גודל | אמצעי אחסון, אחוז אמצעי אחסון | |
| סטטיסטיקה ממוצעת | סכום כולל, ממוצע, S.D. | |
| סטטיסטיקת שכבת-על | סכום כולל, ממוצע, S.D. | |
| רישום | עמודות: מספר סל, קוטר סל (מרכז), Diff. מספר, Diff. מספר%, Diff. נפח %. | |
| קיבוץ סלים: גודל קבוצת סלים 7, כל הסלים, סלים בסכום בקבוצה. | ||
| סטטיסטיקה | סוג | גיאומטרי a |
| טווח | כל | |
| תוצאות להדפסה | טווח, סכום כולל, ממוצע, S.D., 95% מגבלות ביטחון | |
| תוצאות בגרף | טווח: הכל, סכום כולל, ממוצע, S.D. | |
| ממוצע ומגמה | שקלול ממוצעb | % אמצעי אחסון |
| הפצהג' | דיפרנציאלית | |
| מגבלות | 2 אס.די. | |
| ממוצע דופק | השתמש בהמרת פולסים לטווח גודל | |
| ייצוא | פריטי נתונים | מידע לדוגמה, סטטיסטיקה, סטטיסטיקה ממוצעת, רישום גודל |
| הרחבת ייצוא | .xls | |
| תבנית מספר | 123456.78 | |
| תבנית נתונים | מופרד באמצעות טאבים | |
| יצא תיקיה | תיקיה נוכחית | |
| הגדרת עמוד | כלול כותרת מותאמת אישית, הדפסת גרפים באמצעות תאריך כלילת צבע מסך | |
| גודל גרף: | חצי עמוד | |
| אפשרות גרף | להציג: | מדפסת מסך וצבע |
| צבע קו | (ברירת מחדל) תיבת הדו-צבע | |
| סגנון קו | (ברירת מחדל) תיבת הדו-צבע | |
| אגדה | ימני עליון | |
| גודל | (ברירת מחדל) תיבת הדו-צבע | |
| סגנון גרף | שלב | |
| הגבל סגנון | עקומת | |
| גופנים וצבעים | גופני ברירת מחדל וצבעי ברירת מחדל או לפי הצורך. | |
| אפשרויות תצוגה | תצוגת ברירת מחדל | גודל, גרף |
| ציר גודל X | קוטר | |
| מדידה | חלקיקים | |
| סימן ליטר | L (מ"ל, μL, fL) | |
| נתוני פולסים של ריבוי משתתפים | גרף בכל היותר 5010 פולסים, רשימה לפחות 5010 פולסים | |
| יחידות אמצעי אחסון | מיקרומטר3 | |
| מספרים | 123456.78 | |
| a: הממוצע הגיאומטרי וסטטיסטיקת S.D. שצוינו להלן הם סטטיסטיקות גרפיות המגדירות את קנה המידה והצורה של התפלגות גודל כדור שווה ערך של אחוזי נפח דיפרנציאליים שנקבעו. הם משמשים לציון ההתפלגות הלוג-נורמלית בטופס x ̅* x/ s* . | ||
| b: המשקל הממוצע מתייחס לאופן שבו תוצאות מריצות מרובות ממוצעות על-ידי אפשרויות שקלול שונות. שנה הגדרות אלה בתפריט הפעלה לקבלת אפשרויות ממוצע ותצוגה שונות. | ||
| ג: בחר [חשב] כדי לפתוח [ סטטיסטיקה ממוצעת] ב [תפריט הפעלה] כדי לראות את הסטטיסטיקה הממוצעת בשורות, סטטיסטיקת הגרף עבור ההתפלגות הממוצעת בעמודה "ממוצע". | ||
טבלה 3: הגדרות העדפה אופייניות לתצוגה, ניתוח והדפסה של תוצאות מגודל פועל עבור דגימות עמילן sweetpotato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך המתואר פתר כמה בעיות קריטיות במספר שיטות קיימות לניתוחי גודל גרגירי עמילן, כולל שינוי גודל לא הולם של גרגרי תלת-ממד או דו-ממדיים, עיוות מדידות שינוי גודל עקב צורות גרגירים לא אחידות, יכולת רבייה ירודה ותוקף סטטיסטי מפוקפק עקב גדלים מוגבלים של דגימת גרגירים, מפרט לא מדויק או לא תקין (במיוחד השימוש בגודל הממוצע) של גדלי גרגירים בנוכחות התפלגות גודל גרגירים וגודל לא נורמלי. היא משתמשת בטכניקת ESZ המודדת גדלים תלת-ממדיים (נפח) של גרגירי עמילן ולא מגיבה לצורות גרגירים. העיצוב כדי להפיק את התפלגות גודל הגרגר הממוצע מניתוחים לשכפל בעל גודל גדול מאוד גרנול מדגם (4 x 250,000) לא רק הופך את התוצאה סטטיסטית חוקית יותר לשחזור, אלא גם מבחינה טכנית מפחית עיוותי מדידה על ידי גרגירים מצטברים ופגומים כדי לשפר את דיוק שינוי הגודל (מוסבר להלן). כפי שמודגם בתוצאות הייצוגיות, קורות החיים עבור הממוצע של אמצעים גיאומטריים של התפלגויות שכפול שנקבעו באמצעות ההליך הוא בדרך כלל קטן מ 5%, המציין רבייה משביעת רצון של התוצאות. יתר על כן, המפרט המכפיל של קנה המידה ( ) והצורה(s*) של התפלגות גודל הגרגר הלוגינורמלי שווה ערך לכדור מתאר בצורה מדויקת יותר את האופי האמיתי של גדלי גרגירים מבוזרים במדגם עמילן, והוא פשוט לשימוש ודומה באופן אוניברסלי בין ניתוחי גודל גרגירים של עמילנים ממקורות זהים או שונים. לכן, ההליך מאפשר קביעה מדויקת יותר, הניתנת לשחזור ותקפה סטטיסטית של גדלי גרגירי עמילן, ומפרט נכון של התפלגות גודל לוגנורמית גרגר נחושה. הוא ישים לכל ניתוחי גודל הגרגר של דגימות עמילן בקנה מידה גרם, והוא יכול להיות כלי חיוני למחקרים על איך מידות גרגירים עמילן מעוצבים על ידי מנגנון biosynthesis עמילן ומנגנונים ברקמות עמילן-צובר צמחים, וכיצד הם משפיעים על תכונות ופונקציונליות של עמילנים עבור מזון ושימושים תעשייתיים.
גרגירי עמילן הם חלקיקי סטריאו בעלי צורות לא כדוריות בעיקר כך הגדלים שלהם חייב להיות מוגדר ונמדד במונחים 3D. לכן, כמויות של גרגירי עמילן בצורה הטובה ביותר להגדיר את הגדלים שלהם, ואת קוטר כדור שווה ערך נפח הוא הפרמטר היחיד בגודל 1D שניתן להשתמש בהם כדי לתאר כראוי את גדלי 3D גרגיר מאז אין אובייקטים סטריאו מלבד כדור ניתן להגדיר עם פרמטר גודל 1D יחיד. יתר על כן, גרגירי עמילן מכל מיני הצמחים יש קבוצה של צורות עם תדרי התרחשות שונים. בנוכחות התפלגות צורה כזו, כל טכניקות שינוי גודל החלקיקים המגיבות לצורות חלקיקים, למשל, טכניקת עקיפת הלייזר, אינן מתאימות לקביעה ניתנת לשחזור ותקפה סטטיסטית של התפלגות גודל גרגירי עמילן, שכן לא ניתן לתקן בקלות את שגיאת המערכת הטבועה בטכניקות אלה באמצעות גורם צורה. למעשה, שיעור השגיאה (CV) בקרב ניתוחי שכפול של גדלי גרגירים מאותה דגימת עמילן sweetpotato באמצעות טכניקת עקיפת לייזר יכול להגיע גבוה ככל 15-20%28, המציין תוצאות גודל לשחזור גרוע מאוד. למרבה הצער, ההשפעה של צורות גרגירים על גודל גרגירי עמילן התעלמו בעיקר, אשר הביא גוף גדול של נתונים מפוקפקים בגודל גרגיר עמילן שנרכשו באמצעות טכניקות שינוי גודל חלקיקים מגיבים צורה בספרות.
המפרט המכפיל שני הפרמטרים מגדיר הן את קנה המידה ( ) והן את הצורה(s*) של התפלגויות לוג-נורמליות, ולכן הוא הרבה יותר מדויק ומשמעותי ממתאר יחיד בגודל ממוצע או טווח גודל26. כפול x/ s*, x/(s*)2, ו x/(s*)3 מרווחים, המתאים 
± s, ± 2s, ו ± 3s מרווחים של התפלגות נורמלית, מכסה כ 68.3%, 95.5%, ו 99.7% מרווחי ביטחון של התפלגות lognormal, בהתאמה27. הממוצע הגיאומטרי ( ) ו- S.D. ( s* ) של התפלגות גודל גרנול לוג-נורמלי תואם למשמעות הגיאומטרית הגרפית ול- S.D. של עקומת התפלגות הגודל, המחושבות על-ידי תוכנת המנתח וניתן לבחור להציגן בגרף הגודל על המסך במהלך ריצת שינוי גודל או ניתוח של תוצאות. זה, אם כן, די נוח, ופשוט להשתמש במפרט הכפל. בנוסף, ו s* הוכחו יש השלכות פיזיולוגיות שונות הקשורות מנגנון ביוסינתזה עמילן28. התפלגות נפח גרגירים של עמילנים ממיני צמחים שונים עשויה להיות כל lognormal מאז היווצרות של גרגירי עמילן ברקמות עמילן הצמח צובר נופל לתוך מערכת מורכבת מתפתחת ללא הגבלה31 או רשת תגובה קטליטיתאית 32 אופייני של התפלגות lognormal. התפלגות גודל הגרגר הדו-מודאלי של עמילנים ממיני צמחים מסוימים, כגון אלה מחיטה13,14, יכולה להיחשב כשתי תפוצות לוגנורמיות. לכן, המפרט המכפיל של התפלגות גודל נפח-שווה-ערך-כדור גרנול עשוי גם לאפשר השוואה אוניברסלית תקפה סטטיסטית של גדלי גרגירים שנקבעו מעמילנים ממקורות צמחיים שונים ובמדידות שונות, שכן הוא בצורה של קוטר נפח שווה ערך לכדור ו- s* הוא חסר מינון.
ספירת גודל גרגר כוללת מתאימה לניתוח מדגם עמילן (במתנול), המייצג את גודל דגימת הגרגר, היא הקריטית ביותר לקביעה מוצלחת של התפלגות גודל הגרגר של מובהקות סטטיסטית עבור מדגם העמילן. במקרה של דגימות עמילן sweetpotato, פעם הספירה הכוללת בריצה אחת מגיע מעל ~ 65,000 ו ~ 125,000, S.D. הגיאומטרי הגרפי (s*) ו ממוצע גיאומטרי ( ) של עקומת התפלגות גודל נפח דיפרנציאלי המוצג כבר לא משתנה באופן משמעותי, בהתאמה, המציין ספירות מינימליות עבור s* ו מובהקות סטטיסטית. יתירות הדגימה בגודל 250,000 גרגירים לדגימת עמילן-מתנול בהליך נועדה להוזיל על הגרגרים המצטברים והפגומים בבריכת הגרגרים בגודל. אפילו בהנחה שהגרגרים המצטברים, הפגומים או השבורים היוו 50% מהספירה הכוללת של 250,000 גרגירים בריצה שהושלמה או שתי ריצות חוזרות ממוזגות, ה- S.D. הגיאומטרי הגרפי והמשמעות של ההתפלגות הנחושה לא היו מושפעים באופן משמעותי מכיוון שהם היו מעוגנים על ידי הגרגרים השלמים של מחצית מהספירה הכוללת. יתר על כן, הפחתת נפח גדול יותר של גרגירים פגומים או שבורים, פחות השפעה יש להם על ההתפלגות. הסיבה לכך היא שגרגריים קטנים יותר לוקחים אחוזי מספר גדולים יותר, אך אחוזי נפח קטנים יותר של הגרגרים בגודל הכולל. כפי שהוכח בהשוואה בין התפלגות מצטברת של מספר ונפח עבור אותה התפלגות ממוצעת באיור 2, גרגירי עמילן בקוטר שווה ערך לכדור קטן או שווה ל- 9.967 מיקרומטר היוו כ- 48.53% מהמספר הכולל, אך רק 5.854% מהנפח הכולל. לכן, כל גרגרי פגום או שבור למטה פחות מ 10 מיקרומטר תהיה השפעה קטנה מאוד על התפלגות גודל נפח דיפרנציאלי אחוז. עבור דגימות עמילן של מקורות צמחיים אחרים, ספירה כוללת מתאימה לניתוחי הגודל שלהם יכולה להיות זו שמכפילה את הספירה המינימלית שעליה הממוצע הגיאומטרי הגרפי ( ) של התפלגות הגודל המוצגת בהפעלת ניסיון כבר לא משתנה באופן משמעותי.
מבחינה טכנית, הצעד הקריטי ביותר עבור ריצת גודל הוא לרדת כמות נאותה של השעיית עמילן-מתנול לאלקטרוליט לטווח אופטימלי של 5 עד 8% ריכוז נומינלי עבור השעיית עמילן-אלקטרוליטים. כדי להגיע למטרה, גודל הירידה ואת הריכוז של השעיית עמילן-מתנול ייתכן שיהיה צריכה להיות מותאמת באמצעות ריצות ניסיון. ריכוזים של השעיות עמילן-אלקטרוליטים גבוהים יותר מהטווח האופטימלי מגבירים את הסיכונים לדיוק גודל מופחת, וחסימות צמצם תכופות המובילות להפעלת הפלות, מה שעלול להקשות מאוד על השלמת ריצה. אבל, ריכוז נמוך מדי (למשל <2%) של השעיית עמילן-אלקטרוליטים עשוי להאריך ריצה יותר מדי, ולעוות תדרים של גרגירים בפחים בגודלים שונים עקב דגימה לא אקראית של גרגירים, אשר יכול להוביל שיעור שגיאה בלתי מתקבל על הדעת (קורות חיים ממוצעים > 5%) לניתוח שכפול. הספירה הכוללת עבור ריצת גודל יש גם השפעה גדולה על הריכוז האופטימלי של השעיית עמילן אלקטרוליט, ומכאן על כמות וריכוז של עמילן-מתנול הוסיף. ככל שהספירה הכוללת לריצה גדולה יותר, כך הזמן להשלמת הריצה ארוך יותר, ולכן הסיכונים לחסימות צמצם מובילים להפעלת הפלות. הבעיה של חסימת צמצם על ידי אגרגטים מחמירה כאשר צינורות צמצם של קטרים קטנים יותר משמשים גרגירי עמילן בגדלים קטנים יותר, מה שמקשה מאוד לנתח גרגירי עמילן קטנים (< 2 מיקרומטר). זהו אכן החיסרון העיקרי או המגבלה של ההליך. ניתן להקל במידה מסוימת על בעיית חסימת הצמצם באמצעים טכניים מסוימים. אפשר להשתמש יותר sonication כדי לשבור אגרגטים (באופן בלתי נמנע גרגירים פגומים יותר גם כן) בהשעיית עמילן-מתנול, ו /או השעיה עמילן אלקטרוליט מדולל ב 2-5% ריכוזים נומינליים. לחלופין, ניתן להשתמש בריצות חוזרות טכניות של שינוי גודל הספירה הכוללת המינימלית עבור s* יציב של התפלגות גודל עבור סוג עמילן (למשל כ 125,000 ספירות עבור עמילן sweetpotato) מאותה השעיית עמילן אלקטרוליטים, ולמזג את התוצאות של ריצות חוזרות. כל אחת מארבע ההפצות המשוכפלות (S1a, S1b, S2a ו-S2b) שהוצגו באיור 1 היו משתי ריצות חוזרות טכניות ממוזגות של 125,000 גרגירים כל אחת מאותה השעיה של עמילן-אלקטרוליט. שתי השיטות צריכות להיבדק היטב, שכן הן עשויות להגדיל את שיעור שגיאות השכפול לרמה בלתי קבילה (כלומר, קורות החיים הממוצעים > 5%).
ניתוחי שינוי גודל טכניים וביולוגיים של דגימות עמילן ממקורות צמחיים בתנאים פיזיולוגיים דומים משפרים את השחזור והדיוק של התפלגות גודל הגרגר הממוצעת שנקבעה. למעשה, שלושה או ארבעה משכפלים ביולוגיים של דגימות עמילן עשויים להיות מופקים באופן עצמאי מאותה רקמה במצב מסוים. אבל, מצאנו בעבר כי לא היה הבדל משמעותי בשיעורי השגיאות (CV ושגיאות סטנדרטיות עבור הממוצע), ו- s* בין התפלגות גודל הגרגר הממוצעת הנגזרת מהתפלגויות של ארבעה משכפלים ביולוגיים (כלומר, אחד בגודל x השעיה אחת x 4 תמציות) לבין זה של שתי דגימות טכניות כל אחת משני שכפולים ביולוגיים (כלומר, אחד בגודל x 2 עמילן-מתנול מתלי x2תמציות) לכן, דגימות משכפל ביולוגי יכול להיות מופחת לשניים, לפחות עבור עמילן sweetpotato. שלבים אחרים ופרמטרים טכניים שניתן לשנות או להתאים צוינו במפורש מתחת לכל אחד מהשלבים או לפרמטר המסוים בהליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי המרכז לחקר החקלאות השיתופית, ומרכז מחקר משולב לביטחון תזונתי של המכללה לחקלאות ומדעי האדם, אוניברסיטת Prairie View A&M. אנו מודים להואה טיאן על תמיכתו הטכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
