Summary
Здесь представлена процедура воспроизводимых и статистически обоснованных определений распределения размера гранул крахмала, а также для определения определенных логнормальных размеров гранул с использованием двух параметров мультипликативной формы. Это применимо ко всем гранул размеров анализ грамматических образцов крахмала для исследований растительной и пищевой науки.
Abstract
Крахмал из всех растительных источников состоит из гранул в различных размерах и формах, имеющих различные частоты возникновения, т.е. с размером и распределениемформы. Данные о размере гранул крахмала, определяемые с использованием нескольких типов методов размеров частиц, часто являются проблематичными из-за плохой воспроизводимости или отсутствия статистической значимости в результате некоторых непреодолимых систематических ошибок, включая чувствительность к формам гранул и пределы размеров гранул-образца. Мы наметили процедуру воспроизводимых и статистически обоснованных определений распределения размеров гранул крахмала с использованием метода зоны электрического зондирования, а также для определения определенных распределения логнормальных размеров гранул с использованием принятой двух параметрной мультипликативной формы с улучшенной точностью и сопоставимостью. Это применимо ко всем гранулам размеров анализ грамматических образцов крахмала, и, следовательно, может облегчить исследования о том, как размеры гранул крахмала формируются крахмал биосинтеза аппарата и механизмов; и как они влияют на свойства и функциональность крахмала для пищевых и промышленных целей. Репрезентативные результаты представлены на основе реплицированного анализа распределения размеров гранул образцов крахмала sweetpotato с использованием изложенной процедуры. Мы также обсудили несколько ключевых технических аспектов процедуры, в частности, мультипликативную спецификацию распределения размеров гранул и некоторые технические средства преодоления частой блокировки диафрагмы гранулами.
Introduction
Крахмал гранулы физической структуры, в которой два основных резерва homoglucan полимеров в растительном фотосинтезе и хранения тканей, линейные или редко разветвленной амилозы и высоко разветвленной амилопектина, упорядоченно упакованы вместе с некоторыми незначительными компонентами, в том числе липидов и белков. Крахмал гранулы из различных видов растений проявляют много трехмерных (3D) формы (рассмотрены в ref.1,2), в том числе сферы, эллипсоиды, полихедры, тромбоциты, кубики, кубоиды, и нерегулярные трубоушки. Даже те из той же ткани или различных тканей одного и того же вида растений может иметь набор форм с различными частотами возникновения. Другими словами, гранулы крахмала из видов растений могут иметь характерное статистическое распределение формы, а не конкретную форму. Необучные и несферические формы гранул затрудняет правильное измерение и определение размеров гранул крахмала. Кроме того, гранулы крахмала из тех же тканей видов растений имеют различные размеры, т.е. обладают характерным распределением размеров. Такое распределение размеров еще больше усложняет анализ и описание размеров гранул крахмала.
Размеры гранул крахмала были проанализированы с использованием нескольких категорий методов размеров частиц(рассмотрены врефери 3 ), включая микроскопию, осадочные/стерические фракционирования полевых потоков (Sd/StFFF), лазерную дифракцию и зону электрического зондирования (ЭСЗ). Тем не менее, эти методы не в равной степени подходят для определения размеров гранул крахмала в присутствии формы гранул и распределения размера. Микроскопия, включая световую, конфокаленную и сканирующую электронную микроскопию, отлично подходит дляисследований морфологии 4,5,6,7,структуры 8,9 и развития10,11 крахмальных гранул, но вряд ли подходит для определения их распределения размеров из-за некоторых присущих недостатков. Прямые измерения микроскопических изображений гранул или программный анализ изображений данных оптической микроскопии (IAOM), которые использовались для определения размеров гранул крахмала от нескольких видов, в томчисле кукуруза 12,пшеница 13,14, картофель15 и ячмень 16, может измерять только 1D (обычно максимальной длины) или 2D (площадь поверхности) размеры очень ограниченное число (десятки до нескольких тысяч) крахмала гранул изображения. Небольшие размеры выборки гранул, которые по своей сути ограничены методами, редко могут быть статистически репрезентативными, учитывая огромные цифры гранул на единицу крахмала (120 х 106 на грамм, предполагая, что все сферы 10 мкм при плотности 1,5 г/см3) и, следовательно, могут привести к плохой воспроизводимости результатов. Техника Sd/StFFF может иметь высокую скорость и разрешение, а также узкие фракции крахмалагранул 17, но редко используется, вероятно, потому, что его точность может серьезно зависеть от повреждений, различных форм и плотности крахмала гранул. Техника лазерной дифракции является наиболее широко используемой, и была применена для анализа размера гранул крахмала для всехосновных видов сельскохозяйственных культур 3,14,16. Хотя техника имеет много преимуществ, она на самом деле не подходит для определения размеров гранул крахмала в присутствии распределения формы гранул. Большинство параллельных лазерных дифракционных приборов полагаются на теорию рассеяниясвета Mie 18 для однородных сферических частиц и модифицированную теориюMie 18 для некоторых других форм единообразия. Техника, таким образом, по своей сути очень чувствительна к формам частиц, и не совсем подходит даже для определенныхформ однородности 19, не говоря уже о крахмала гранулы, имеющие набор форм различных пропорций. Техника ЭСЗ измеряет нарушение электрического поля пропорционально объему частицы, проходящей через диафрагму. Он обеспечивает размеры объема гранул, а также количество и объем распределения информации и т.д., при высоком разрешении. Так как техника ЭСЗ не зависит от каких-либо оптических свойств частиц, включая цвет, форму, состав или рефракционный индекс, и результаты очень воспроизводимы, он особенно подходит для определения распределения размеров крахмала гранул, имеющих набор форм.
Размеры гранул крахмала также были определены с помощью многих параметров. Они часто были упрощенно описаны средними диаметрами, которые в некоторых случаях были арифметическими средствами микроскопически измеренных максимальных длин 2Dизображений 12,20,или средних эквивалентных диаметровсферы 3. В других случаях распределение размера гранул было указано с помощьюдиапазонов размеров 21,22,среднего объема распределения или среднего диаметра (эквивалент сферы, взвешенный по количеству, объему или площади поверхности) приусловии нормального распределения 14,23,24,25,26. Эти дескрипторы размеров гранул крахмала из различных анализов имеют совершенно иной характер, и не строго сопоставимы. Это может быть очень вводит в заблуждение, если эти "размеры" крахмала гранулы из разных видов или даже те же ткани одного и того же вида были непосредственно сопоставлены. Кроме того, в большинстве исследований был проигнорирован параметр спреда (или формы) предполагаемых нормальных распределений, т.е. стандартное отклонение σ (или графическое стандартное отклонение σг),измеряя ширину распределения (т.е. распространение размеров).
Для решения вышеупомянутых критических вопросов, стоящих перед анализом размеров гранул крахмала, мы наметили процедуру воспроизводимых и статистически обоснованных определений распределения размеров гранул образцов крахмала с использованием метода ЭСЗ, а также для правильного указания определенных логнормальных размеров гранул с использованием принятой двух параметрноймультипликативной формы 27 с улучшенной точностью и сопоставимостью. Для проверки и демонстрации мы провели анализ размеров гранул образцов крахмала sweetpotato с помощью процедуры, и указали логнормальный дифференциальный объем-процентный объем-эквивалент-сфера диаметр распределения с использованием их графических геометрических средств и мультипликативных стандартных 
отклонений sв форме x/(умножить и разделить) s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образцов крахмала
- Подготовка двух (или трех) граммовых образцов крахмала из крахмалосохукомитных тканей различных видов растений в соответствии с установленными процедурами(например, картофель 15,сладости28,пшеничные зерна 13,29иядра кукурузы 30и т.д.).
- Тщательно мыть образцы крахмала с ацетоном или толуолом 3-4x, чтобы свести к минимуму гранулы агрегатов и высушить их полностью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте процедуры экстракции, которые дают более 1 г крахмала на препарат. Один или два 0,5-г aliquots из каждого из трех или двух экстрактов репликации, соответственно, пробы для гранул размер анализа одного экстракта крахмала.
2. Электролитная подготовка
- Приготовьте 500 мл 50 г/л хлорида лития в метаноле для четырех размеров для репликации образцов крахмала (100 мл на пробег плюс дополнительные 100 мл). Предпочтительно сделать электролит в больших объемах партий, например, от 4 до 8 л в то время, чтобы свести к минимуму изменение концентрации.
- Охладить контейнер на льду или в шкафу с 4 градусами Цельсия, чтобы ускорить растворение хлорида лития.
3. Настройка анализатора
- Выберите трубку диафрагмы с диапазоном диаметра частиц, охватывающую известный (в литературе или через пробные запуски) диапазон размеров гранул образцов крахмала, которые будут проанализированы, например, диафрагма 100 мкм для крахмала sweetpotato. Для образцов крахмала неизвестного диапазона размеров гранул выберите соответствующую диафрагму с помощью пробных проб с использованием нескольких трубок диафрагмы, имеющих перекрывающиеся диапазоны диаметров частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон диаметра частиц трубки диафрагмы является его точный диапазон размеров от 2 до 60% от, и с расширенным диапазоном размеров до 80% от его диаметра отверстия. В таблице 1 перечислены свойства трех наиболее полезных трубок диафрагмы для размеров гранул основных крахмалов. Если диапазон размеров гранул образца крахмала шире, чем диапазон размеров одной трубки диафрагмы, выполните многотрубный анализ перекрытия, сочетающий до пяти распределений размера частиц, измеренных с отверстиями разных размеров. Каждая диафрагма идентифицируется по диаметру и номеру части, помеченной на трубке. Его диаметр и серийный номер, содержащийся в штрих-коде на трубке, можно отсканировать в программное обеспечение анализатора с помощью Bar Code Reader на панели управления анализатора. - Выбрав аналитический стакан 100 или 200 мл (более кюветов) для определения размеров гранул крахмала, и навелит автоматическое перемешивание (см. ниже) для поддержания хорошей подвески гранул во время измерения.
- Создайте стандартный метод работы (SOM) для определения настроек запуска и файл Предпочтений для анализа, просмотра и печати результатов. Объедините файл SOM и Preferences в стандартную операционную процедуру (SOP) по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для нестандартизированных анализов используйте SOM для пользования анализом и при необходимости отрегулируйте настройки SOM между пробегами через окно Edit the SOM (см. ниже). После завершения выполнения проанализируйте, просмотрите и распечатайте результаты выполнения, изменив предпочтения по желанию. Для стандартизированного анализа размеров гранул используйте SOP для проведения анализа.- Запустите программное обеспечение для анализа. На главном Ману нажмите soP | Создайте SOM Wizard или отредактировать SOM,или на панели состояния, нажмите Edit SOM. Используйте мастер или редактировать окно SOM, чтобы выбрать настройки для SOM. Настройки, обычно используемые для размера гранул образцов крахмала sweetpotato, обобщены в таблице 2.
- Сохраните созданный SOM в файле в окне SOM Wizard-Summary of Settings или в окне Edit the SOM.
- На главном Ману нажмите soP | Создавайте предпочтения Мастера или Редактируйте Предпочтения. Используйте мастера или вкладки в окне редактирования Предпочтений, чтобы выбрать настройки предпочтений, как в таблице 3 или другие по желанию.
- Сохраните выбранные Предпочтения файлу в окне Create Preferences Wizard-Summary of Settings или в окне настроек редактирования.
- В главном меню нажмите soP | Создайте SOP Мастера. Следуя пошаговому руководству мастера, введите описание, выберите файл SOM и Preferences для создания и сохраненияSOP.
4. Анализ размеров гранул образцов крахмала
- Подготовка анализатора
- Включите анализатор, откройте программное обеспечение в компьютере и проанализируйте состояние Ready в верхней части панели состояния после автоматического подключения к анализатору.
- Заполните банку электролита электролитом, опорожните банку отходов, если это необходимо.
- Правильно установите и защитите выбранную трубку диафрагмы, следуя руководству пользователя. Для некалиброванной новой трубки диафрагмы откалибровать ее после пошагового руководства по калибровке | Калибруйте диафрагму в главном меню. Для откалиброванной трубки диафрагмы проявите калибровку пошаговому руководству Мастера трубки переменной диафрагмы под запуском или калибровкой | Проверить калибровку диафрагмы в главном меню.
- Разблокив платформу анализа, нажав клип блокировки-релиз (на средней передней части левой стены отсека образца) и вручную опустите платформу на дно. Поместите аналитический стакан, содержащий 100 мл электролита на платформе, переместите мешалку в положение перемешивания и вручную поднимите платформу в самофиксающееся верхнее положение, чтобы погрузить трубку диафрагмы и мешалку в электролит.
- Нажмите Заполните нижнюю панель инструмента, чтобы анализатор автоматически заполнил систему электролитом и нажмите Flush, чтобы анализатор автоматически промыл систему.
- Загрузите SOM, нажав soP | загрузите SOM в главномменю и используйте SOM для пользования анализом без файла Предпочтений. Кроме того, загрузите SOP, нажав на SOP | Загрузите SOP в основное меню или загрузите SOP на панели состояния и используйте SOP для работать с анализом.
- При использовании SOP нажмите SOP | soM Info или Preference Info в главном меню для проверки настроек SOM и Preference. Нажмите Пример | Введите пример информации в главном меню или отредактировать информацию в панели состояния, чтобы ввести информацию о выборке для запуска.
- Подготовка образца крахмала метанола и подвесок размеров
- Взвесить два или один образец 0,5 г из каждого из двух или трех экстрактов крахмала, соответственно.
- Добавьте каждый из 0,5 г крахмала aliquots до 5 мл метанола в 50 мл конической центрифуги трубки, и полностью разогнать крахмал гранулы с помощью нескольких импульсов низкой интенсивности ультразвука (12-24 Вт /см 2) от ультразвукового процессора.
- Используя одноразовый перенесите пипетку, нанесите одну небольшую каплю подвески крахмала-метанола (0,2 мл) на 100 мл электролита метанола 50 г/л под постоянным перемешиванием в стакане. Закройте дверь образца отсека.
- Выполнить запуск размеров
- Нажмите Предварительный просмотр в нижней панели инструментов, чтобы начать предварительный запуск. В Группе по статусу убедитесь, что динамически отображаемая концентрация находится в зеленом цвете, и показывает номинальный диапазон концентрации подвески от 5 до 8%.
- Нажмите Остановитесь на нижней панели инструментов, чтобы остановить запуск предварительного просмотра. При необходимости разбавьте крахмал-электролитную подвеску, заменив алицит подвески электролитом, а затем повторите предварительный запуск.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон номинальной концентрации подвески от 5% до 8% имеет решающее значение для завершения пробега без остановки из-за блокировки диафрагмы агрегированными гранулами. При необходимости отрегулируйте размер дроп-образца и/или концентрацию суспензии крахмала-метанола, чтобы сделать новую крахмально-электролитную подвеску с номинальной концентрацией в оптимальном диапазоне. - После проверки нажмите Кнопку «Начать на нижней панели инструментов», чтобы начать запуск. Анализатор автоматически завершает запуск после того, как общее количество размерных гранул, которое отображается вместе с временем выполнения на панели состояния в запуске, достигает установленного общего числа (125 000 или 250 000) режимом управления SOM. В зависимости от концентрации подвески (в пределах 5-8% диапазона или ниже), один запуск занимает от 2 до 5 минут или более.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда анализатор автоматически обнаруживает блокировку диафрагмы в настройках обнаружения блокировки SOM, он прерывает запуск, флеш, чтобы разблокировать диафрагму и начать новый запуск. Это действие блокировки будет максимально повторяться в течение четырех раз, прежде чем анализатор отменит операцию запуска. Эта проблема блокировки может быть решена с помощью двух технических методов, отмеченных в таблице 2 и подробно описанных в обсуждении. - При необходимости выполните технический повторный запуск (см. таблицу 2 и подробно описанную в обсуждении) с использованием той же крахмало-электролитной подвески, просто нажав кнопку «Начало» или повторите на нижней панели инструментов.
- После завершения пробега или повторных пробежек опорожните стакан, промойте его метанолом и заполните свежим электролитом 100 мл для следующего запуска.
- Во время запуска, если диалог уведомлений Extended Size Range появляется, когда количество гранул, превышающих 60 мкм, превышает 0,1% от общего количества (в настройках SOM), нажмите Run от 60% до 80% для запуска расширенного динамического диапазона размеров до 80% диаметра диафрагмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка расширенного диапазона размеров контролирует действия гранул, больше 60% диаметра диафрагмы (100 мкм, в данном случае). Установка в SOM определяет включение гранул крахмала больше, чем 60 мкм, когда их количество достигает более 0,1% от общего количества. Завершение выполнения по-прежнему контролируется общим количеством, и может занять немного меньше времени, чем в противном случае без включения больших гранул на общую сумму менее 0,1% (предположительно статично незначительное количество) от общего числа.
- Анализ результатов работать
- Если SOM использовался для управления трассами, выберите настройки Предпочтений по желанию для просмотра, печати и статистического анализа результатов с помощью Мастера предпочтений создания или предпочтений редактирования в соответствии с SOP в главном меню.
- Наложение результатов нескольких запусков на одном графике для сравнения.
- Нажмите Наложение на главной панели инструментов или файловых | Наложение на главное меню для доступа к окну наложения. Перейдите к нескольким желаемым файлам результатов в поле Файлов, нажмите Добавить, чтобы переместить их в поле Избранные файлы, и нажмите OK, чтобы наложить выбранные результаты на одном графике.
- Чтобы добавить файл к открытой накладке, нажмите RunFile | Откройте для наложения в меню Run доступ к окну Overlay, перейдите к нужному файлу и нажмите, чтобы добавить.
- Средние результаты анализа репликации (2 экстракта x 2 крахмала или 3 экстракта x 1 крахмал-выборка), а также просмотр или печать среднего распределения размера гранул и статистики в списке или графике.
- В главном меню нажмите на файл | FileTool | Средний, чтобы открыть среднее окно. Перейдите к и выберите несколько желаемых файлов результата в поле файлов, нажмите Добавить, чтобы переместить их в поле Избранные файлы, и нажмите OK, чтобы усреднеть выбранные результаты и отображать среднее значение на одном графике.
- Чтобы включить дополнительный файл результата в среднее распределение, в меню Run, нажмите RunFile | Open и добавьте в средний, чтобы открыть окно Add to Average, перейдите и добавьте файл. Новое среднее значение отображается на графике в окне (результате) Run или в объявлении.
5. Определение среднего распределения
- В окне Run-Menu, отображая среднее распределение, щелкните Calculate | Усредная статистика в меню Run, чтобы открыть окно сводки статистики, которое отображает среднюю статистику в строках, и статистику графика для среднего распределения в столбцах.
- Используйте графическое геометрическое среднее значение
() и S.D.(ы)в столбце статистики графика, чтобы указать среднее распределение в формеx/s. Рассчитайте изменения CV, измеряя изменения среди усредненых дистрибутивов репликации, разделив среднее (μ, то же самое, что и среднее распределение) геометрических средств усредненых дистрибутивов со средним S.D. (σ), перечисленным в строке средней статистики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Средний S.D. (для μ) оценки вариаций между средствами репликации дистрибутивов отличается от графического геометрического S.D. (для) измерения распространения среднего распределения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проверить процедуру и продемонстрировать воспроизводимость распределения размера определяется гранул, мы провели анализ размеров репликации образцов крахмала sweetpotato. Мы подготовили реплицировать (S1 и S2) образцы крахмала из выращенных на местах сладостей селекционной линии SC1149-19 в аналогичном возрасте развития с использованием ранее описаннойпроцедуры 28. Из каждого экстракта крахмала были отобраны два алицита 0,5 г (а и б), подвешенные в 5 мл метанола и соникированные несколькими импульсами низкоэнергетного ультразвука для распада агрегатов. Каждая из двух пар суспензий крахмала-метанола была отобрана для производства крахмала-электролитной подвески, которая затем была размером в два раза (технические повторные пробежки) с использованием вышеуказанного SOM для общего количества 125 000 гранул каждая. Для каждого запуска размеров, как только общее количество достигает более 65 000 и 125 000 фунтов стерлингов, графический геометрический S.D.(ы)и геометрическое среднее () от отображаемого дифференциального распределения объема больше не существенно меняются, соответственно. Каждая пара повторных пробежек с использованием одной подвески крахмал-метанола была объединена после завершения для общего количества размеров 250 000.
На рисунке 1 показаны дифференциальные распределения объема-равноценного объема-сферы-диаметра (S1a, S1b, S2a и S2b) для четырех анализов размеров репликации образцов крахмала sweetpotato и их среднего распределения. Резюме для среднего геометрического средства четырех дистрибутивов репликации составило 3,75%, демонстрируя отличную воспроизводимость результатов размеров. Каждое из четырех дистрибутивов репликации определялось из очень большого размера выборки в 250 000 гранул, что намного превышало минимальные подсчеты (65 000 и 125 000 евро), над которыми графический геометрический S.D.(ы)и геометрическое среднее () отображение дифференциального распределения объема в одном масштабе пробега больше существенно не меняются. Таким образом, определяемые распределения объема репликации были статистически достоверными. Для лучшей точности и сопоставимости (обсуждается ниже) спецификации определенных дистрибутивов размера логнормальных гранул, все эти распределения были указаны с помощью их графических геометрических средств () и S.D.(ы) в формеx/(multiply and divide) s,указанной на графике. Пожалуйста, обратите внимание, что распределение размера гранул крахмала sweetpotato была тщательно установлена, чтобы быть lognormal как ранее описанные28.
Рисунок 1: Распределение размера логнормального дифференциального объема в процентах от распределения размеров репликации размеров образцов крахмала sweetpotato. Схема выборки для анализа размеров репликации четырех репликаций была подробно описана в результате. Четыре дистрибутива (S1a, S1b, S2a и S2b) из анализов репликации и их среднее значение были наложены и указаны с помощью формыx/(multiply and divide). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
На рисунке 2 показаны средние (или средние) кумулятивные (lt;) распределения размеров числа и объема четырех анализов размеров репликаций, которые были представлениями трансформации среднего дифференциального распределения размера объема. Сравнение кумулятивного числа и процентного объема гранул крахмала показало, что на гранулы, имеющие меньшие диаметры эквивалентной объему сферы, приходится гораздо больший процент от общего количества, чем общий объем. Например, на долю гранул, имеющих диаметр эквивалентной объему сферы меньше или равен 9,976 мкм, приходится 48,53% от общего количества, но только 5,854% от общего объема.
Рисунок 2: Среднее кумулятивное (Lt;) распределение размеров и объема крахмала гранул из четырех анализов размеров размеров образцов крахмала sweetpotato. Эти два распределения являются представлениями преобразования среднего распределения размеров на рисунке 1. На графике сравнивается кумулятивное (lt;) число (слева Y-оси) с объемом (справа Y-оси) процентов крахмала гранулы, имеющие объем эквивалентных размеров сферы ниже или равна определенному размеру бункеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Диаметр диафрагмы (мкм) | Диапазон диаметра частиц (мкм) | Диапазон объема частиц (м3) |
| 50 | 1.0 - 40 | 0,524 - 33,5 x 103 |
| 70 | 1.4 - 56 | 1.44 - 92.0 x 103 |
| 100 | 2.0 - 80 | 4.19 - 268 x 103 |
Таблица 1: Три наиболее полезные трубки диафрагмы для размеров гранул крахмала от видов сельскохозяйственных культур.
| Настройки SOM | Выбор | |
| Описание | Описание SOM | Гранулы размерного крахмала |
| Автор SOM | - | |
| Описание образца | Образцы крахмала Sweetpotato | |
| Электролита | 50 г Л-1 хлорид лития | |
| Диспергатор | Нет | |
| Диафрагмы | 100 мкм | |
| Режим управления | Режим управления | Общий счет (250 000) или 125 000евро в |
| Танк отходов | Когда 80% полный | |
| Настройки работать | Введите пример информации | Да |
| Количество пробежек | 1 (или 2, для повторных запусков) | |
| Флеш диафрагмы трубки перед запуском | Да | |
| Флеш диафрагмы трубки после запуска | Да | |
| Сохранить файл | Да, включая данные о пульсе | |
| Данные по экспорту | Да | |
| Печатный отчет | Да | |
| Сравните со спецификациями выборки | Нет | |
| Вид | Размер | |
| Настройки стирера | Образец стакана | 100 мл Мультисейзер 4 ST |
| Использование мешалки | Да | |
| Скорость | (часы мудрые) | |
| Положение стирера | Автоматически | |
| Порог, ток и прибыль | Порог размера | 2 мкм |
| Диафрагма тока | 1600 мА | |
| Преампер выгоды | 2 | |
| Расширенный диапазон размеров b | При подсчете 0,1% от общего количества | |
| Импульс к настройкам размера | Размер бункеров | 400 |
| Диапазон размеров | от 2 до 60 мкм | |
| Бин интервалы | Диаметр журнала | |
| Коррекция совпадений | Да | |
| Импульсная редактировать | Нет | |
| Концентрации | Сумма образца | 0,2 мл |
| Плотность | - | |
| Использование фактора предварительного разбавления | - | |
| Аналитический объем | - | |
| Объем электролита | 100 мл | |
| Использование фактора разбавления | Нет | |
| Блокировки | Обнаружение блокировки | Автоматическое (с начала бега) |
| Обнаружение блокировки по умолчанию: при подсчете ставки lt;20%, скорость диафрагмы (40% ) или всплеск концентрации (40%). | ||
| Действия по блокировке | Отмена, разблокировка и перезагрузка, до 4 раз | |
| Показать значок | Да | |
| Монитор блокировки | Скорость подсчета | |
| a: Если повторное разблокирование и перезагрузка не смогли получить более крупный счет запуска завершена, сделать два повторных работает размеров ниже общего числа 125000 каждый изтой же крахмал-электролитной подвески, и объединить результаты повторных запусков с помощью Кроме того, замените крахмало-электролитную подвеску на новую с более низкой номинальной концентрацией (2-5%). При подготовке нового дроп-образца крахмала-электролитной подвески, пульс-sonicate крахмал-метанол подвески снова разбить больше агрегатов. | ||
| b: Расширенный диапазон размеров контролирует действия гранул, больше 60% диаметра диафрагмы (100 мкм в этом SOM). Параметр определяет включение гранул крахмала больше 60 мкм, когда их количество больше, чем 0,1% от общего количества. | ||
Таблица 2: Типичные настройки SOM для управления размерами для образцов крахмала sweetpotato.
| Настройки предпочтений | Выбор | |
| Печатные отчеты | Пример информации | Образец, Номер запуска, Размер Бинс, Всего подсчетов |
| Графики размера | Дифференциальный объем%, ось журнала X, гладкая по группам семь | |
| Статистика размера | Объем, объем % | |
| Средняя статистика | Общая сумма, средняя, S.D. | |
| Статистика наложения | Общая сумма, средняя, S.D. | |
| Листинге | Колонки: Bin Number, Bin Diameter (в центре), Diff. Number, Diff. Number%, Diff. Volume%. | |
| Bin Grouping: Bin Group Size 7, All Bins, Sum Bins in Group. | ||
| Статистика | Тип | Геометрическиеa |
| Диапазон | Все | |
| Результаты для печати | Диапазон, Общая сумма, Средний, S.D., 95% Пределы доверия | |
| Результаты на графике | Диапазон: Все, Общая сумма, Средний, S.D. | |
| Усреднение и тренд | Среднее взвешиваниеb | Объем % |
| Распределениеc | Дифференциальный | |
| Ограничения | 2 С.Д. | |
| Усреднение пульса | Используйте импульсы преобразования в диапазон размеров | |
| Экспорт | Элементы данных | Выборка Информация, Статистика, Средняя статистика, Список размеров |
| Расширение экспорта | .xls | |
| Формат номера | 123456.78 | |
| Формат данных | Вкладка Делимитированная | |
| Экспортная папка | Текущий папка | |
| Настройка страницы | Включите пользовательское название, графики печати с использованием цвета экрана включают дату | |
| Размер графика: | Половина страницы | |
| Вариант графика | Отображения: | Экран и цветной принтер |
| Цвет линии | (По умолчанию) | |
| Стиль строки | (По умолчанию) | |
| Легенда | Вверху справа | |
| Размер | (По умолчанию) | |
| Графический стиль | Шаг | |
| Стиль ограничения | Кривой | |
| Шрифты и цвета | По умолчанию шрифты и цвета по умолчанию или по желанию. | |
| Параметры просмотра | Представление по умолчанию | Размер, График |
| Размер оси X | Диаметр | |
| Измерения | Частиц | |
| Символ литра | L (мл, йл, дл) | |
| Данные импульса мультисайзера | График не более 5010 импульсов, список не более 5010 импульсов | |
| Объемные единицы | м3 | |
| Числа | 123456.78 | |
| a: Статистика геометрического среднего и S.D., указанная здесь, являются графическими, которые определяют масштаб и форму определяемого дифференциального распределения размера эквивалентного размера сферы. Они используются для звучного распределения в форме x ̅ x/s. | ||
| b: Средний вес относится к тому, как результаты нескольких запусков усредняться различными вариантами взвешивания. Измените эти настройки в меню Run для различных вариантов усреднения и представления. | ||
| c: Выберите «Вычислить»для открытия « Средняястатистика» в меню«Беги»,чтобы увидеть среднюю статистику в строках, статистику графика для среднего распределения в столбце «Средний». | ||
Таблица 3: Типичные настройки предпочтений для просмотра, анализа и печати результатов размеров для образцов крахмала sweetpotato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изложенная процедура решила некоторые критические вопросы в нескольких существующих методах анализа размера гранул крахмала, включая неуместный 1D или 2D размер 3D гранул, искажение размеров измерений из-за однородных форм гранул, плохую воспроизводимость и сомнительную статистическую достоверность из-за ограниченных размеров гранул-образца, неточной или неправильной спецификации (особенно использование среднего размера) размеров гранул в наличии. Он использует метод ES, который измеряет 3D размеры (объем) гранул крахмала и не реагирует на гранулы формы. Конструкция для получения среднего распределения размера гранул из анализов репликации, имеющих очень большой размер гранул-образца (4 х 250 000), не только делает результат статистически действительным и более воспроизводимым, но и технически смягчает искажения измерений агрегированными и поврежденными гранулами для повышения точности размеров (объясняется ниже). Как показано в репрезентативных результатах, резюме для средних геометрических средств распределения репликации, определяемых с помощью процедуры, обычно меньше 5%, что свидетельствует о удовлетворительной воспроизводимости результатов. Кроме того, мультипликативная спецификация как шкалы () так и формы(ы)распределения объема логнормальных гранул, эквивалентных сфере, более точно отражает истинную природу распределенных размеров гранул в образце крахмала и проста в использовании и универсально сопоставима между анализами размеров гранул крахмала из одного и того же или различных источников. Таким образом, процедура позволяет более точное, воспроизводимое и статистически обоснованное определение размеров гранул крахмала, а также надлежащую спецификацию определенных распределения логнормальных размеров гранул. Это применимо ко всем гранул размеров анализ грамматических образцов крахмала, и может стать важным инструментом для исследований о том, как крахмал гранул размеры формируются крахмал биосинтеза аппарата и механизмов в растительных крахмала накопления тканей, и как они влияют на свойства и функциональность крахмала для пищевых и промышленных целей.
Крахмал гранулы стерео частиц, имеющих в основном не сферические формы, так что их размеры должны быть определены и измерены в 3D терминах. Таким образом, объемы гранул крахмала лучше всего определяют их размеры, а диаметр объема-эквивалента сферы является единственным параметром 1D размера, который может быть использован для правильного описания размеров гранул 3D, так как никакие стерео-объекты, кроме сферы, не могут быть определены с одним параметром размера 1D. Кроме того, гранулы крахмала всех видов растений обладают набором форм с различными частотами возникновения. При наличии такого распределения формы любые методы размеров частиц, реагирующие на формы частиц, например, метод лазерной дифракции, не подходят для воспроизводимых и статистически обоснованных определений распределения размеров гранул крахмала, поскольку системная ошибка, присущая этим методам, не может быть легко исправлена с помощью форм-фактора. В самом деле, уровень ошибок (CV) среди репликации анализов размеров гранул из того же образца крахмала sweetpotato с использованием лазерной дифракции техника может достигать 15-20%28, что свидетельствует о очень плохо воспроизводимых размеров результатов. К сожалению, влияние гранул формы на размер крахмала гранулы были в основном упускается из виду, в результате чего большое количество сомнительных данных размеров крахмала гранулы, полученные с использованием формы реагировать методы размера частиц в литературе.
Двух параметров мультипликативной спецификации определяет как шкалу ( ) иформу (ы)логнормальных дистрибутивов, и до сих пор гораздо более точным и значимым, чем один дескриптор среднего размера или диапазонразмеров 26. Умножение x/s, x/(s)2, и x/ (s)3 интервала, 
соответствующие ± s, ± 2s, и ± 3 s интервалы нормального распределения, охватывает приблизительно 68,3%, 95,5% и 99,7% доверия интервалы логнормального распределения, соответственно27. Геометрическое среднее () и S.D. (s)распределения размера логнормальных гранул соответствует графическому геометрическому среднему и S.D. кривой распределения размера, которые рассчитываются программным обеспечением анализатора и могут быть выбраны для отображения на экране графика размера во время размера пробега размера или анализа результатов. Поэтому довольно удобно и просто использовать мультипликативную спецификацию. Кроме того, было продемонстрировано,что и s, имеют различные физиологические последствия, связанные с аппаратом биосинтеза крахмала28. Распределение гранул размером крахмала от различных видов растений вполне может быть все lognormal так как образование крахмала гранулы в растительных крахмала накопления тканей попадает в неограниченно развивающейся сложнойсистемы 31 или внутриклеточной каталитическойреакции сети 32 характерны для логнормального распределения. Бимодальные гранулы размер распределения крахмала от некоторых видов растений, таких, какиз пшеницы 13,14, можно рассматривать как два lognormal распределения. Таким образом, мультипликативная спецификация логнормальных объемно-эквивалентных распределений размеров сферы может также позволить статистически обоснованное универсальное сравнение размеров гранул, определяемых из крахмалов различных источников растений и различных измерений, так как имеется в виде диаметра сферы объема эквивалентного объема и ss.
Соответствующий общий подсчет размеров гранул для анализа образца крахмала (в метаноле), который представляет размер выборки гранул, имеет наиболее важное значение для успешного определения распределения размера гранул статистической значимости для образца крахмала. В случае образцов крахмала sweetpotato, как только общее количество в одном запуске достигает более 65 000 и 125 000 фунтов стерлингов, графический геометрический S.D. (ы)и геометрическое среднее () отображаемой дифференциальной кривой распределения объема больше не меняется, соответственно, указывая минимальные подсчеты для s и статистической значимости. Избыточность выборки в размере 250 000 гранул для образца крахмала-метанола в процедуре предназначена для дисконтирования агрегированных и поврежденных гранул в бассейне гранул размера. Даже если предположить, что агрегированные и поврежденные или сломанные гранулы составили 50% от общего количества 250 000 гранул в завершенном запуске или двух объединенных повторных запусков, графические геометрические S.D. и среднее значение решительного распределения не были бы существенно повлияны, поскольку они были бы закреплены нетронутыми гранулами половины от общего числа. Кроме того, чем больше объемных размеров поврежденных или сломанных гранул, тем меньше они влияют на распределение. Это связано с тем, что меньшие гранулы принимают больший процент числа, но меньший процент объема от общего размера гранул. Как показало сравнение между числом и объемом кумулятивных распределений для одного и того же среднего распределения на рисунке 2,на крахмальные гранулы с диаметром эквивалентной сферы меньше или равен 9,967 мкм приходится около 48,53% от общего числа, но только 5,854% от общего объема. Таким образом, любые поврежденные или разбитые гранулы размером менее 10 мкм будут иметь очень небольшое влияние на распределение размеров дифференциального объема. Для образцов крахмала других растительных источников, соответствующий общий подсчет для их анализа размеров может быть один удвоение минимального количества, над которым графическое геометрическое среднее () от отображаемого распределения размера в пробном запуске больше не существенно изменить.
Технически, наиболее важным шагом для размера перспективе является падение надлежащего количества крахмала-метанола подвески к электролиту для оптимального диапазона от 5 до 8% номинальной концентрации для крахмала-электролитной подвески. Для достижения цели, размер падения и концентрация крахмала-метанола подвески, возможно, придется корректировать с помощью пробных запусков. Концентрации крахмал-электролитных суспензий выше оптимального диапазона повышают риск снижения точности размеров и частых закупорки диафрагмы, что может привести к абортам, что может очень трудно завершить пробежку. Но, слишком низкая концентрация (например, lt;2%) крахмал-электролитной подвески может продлить пробег слишком много, и исказить частоты гранул в различных бункерах размера из-за не случайной выборки гранул, что может привести к неприемлемой частоте ошибок (среднее резюме для анализа репликации. Общее количество размеров пробега также оказывает существенное влияние на оптимальную концентрацию крахмал-электролитной суспензии, следовательно, на количество и концентрацию добавленного крахмала-метанола. Чем больше общее количество пробега, тем дольше время для завершения пробега, и, следовательно, тем больше рисков для диафрагмы завалов, ведущих к запуску абортов. Проблема блокировки диафрагмы агрегатами усугубляется, когда для крахмальных гранул меньших размеров используются трубки диафрагмы меньшего диаметра, что очень затрудняет анализ мелких крахмальных гранул (Lt; 2 мкм). Это действительно является основным недостатком или ограничением процедуры. Проблема блокировки диафрагмы может быть в определенной степени решена с помощью некоторых технических средств. Можно использовать больше sonication для того чтобы сломать вверх агрегаты (неизбежно более поврежденные гранулы также) в подвеске крахмал-метанола, and/or разбавленной подвеске крахмал-электролита на 2-5% номинальных концентрациях. Кроме того, можно использовать технические повторные пробеги размеров минимального общего количества для стабильного sи распределения размера для типа крахмала (например, около 125 0000 кол-во для крахмала sweetpotato) из той же крахмал-электролитной подвески, и объединить результаты повторных запусков. Каждое из четырех дистрибутивов репликации (S1a, S1b, S2a и S2b), показанных на рисунке 1, было от двух объединенных технических повторных пробежек размером 125 000 гранул каждый из той же крахмало-электролитной подвески. Оба метода должны быть хорошо протестированы, так как они могут увеличить уровень ошибок репликации до неприемлемого уровня (т.е. среднее резюме
Технический и биологический анализ размеров репликации образцов крахмала из растительных источников в аналогичных физиологических условиях повышает воспроизводимость и точность установленного среднего распределения размера гранул. Практически три или четыре биологические репликации образцов крахмала могут быть независимо извлечены из одной и той же ткани при определенном состоянии. Но, мы ранее обнаружили, что не было существенной разницы в погрешности (CV и стандартные ошибки для среднего), и s - между средним распределением размера гранул, полученных от распределения четырех биологических репликаций (т.е. один размер х одна подвеска х 4 экстрактов) и один из двух технических выборки каждый из двух биологических репликаций (т.е., один размер х 2 крахмала-метанола подвески х2. Таким образом, биологические образцы репликации могут быть сокращены до двух, по крайней мере для крахмала sweetpotato. Другие шаги и технические параметры, которые могут быть изменены или скорректированы, были конкретно отмечены ниже каждого из этапов или конкретного параметра процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Эта работа частично поддерживается Кооперативным исследовательским центром сельского хозяйства и Комплексным научно-исследовательским центром продовольственной безопасности Колледжа сельского хозяйства и гуманитарных наук, Университетом Прейри-Вью. Мы благодарим Хуа Тянь за техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirrer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readability 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laboratory sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
References
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. BeMiller, J., Whistler, R. , Academic Press. Ch. 3 23-82 (2009).
- Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
- Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch - Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
- Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
- Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
- Matsushima, R. Starch: Metabolism and Structure. Nakamura, Y. , Ch. 13 425-441 (2015).
- Wang, S. -q, Wanf, L. -l, Fan, W. -h, Cao, H., Cao, B. -s Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
- Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
- Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
- Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
- Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
- Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
- Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
- Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
- Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
- Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
- Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
- Wriedt, T. The Mie Theory: Basics and Applications. Wolfram, H., Wriedt, T. , Springer. Berlin Heidelberg. 53-71 (2012).
- Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. ÅS., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
- Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
- Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
- Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
- Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
- Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch - Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
- Li, W. -Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
- Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
- Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
- Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
- Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
- Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
- Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , QLD. Australia. 309-320 (2004).
- Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).
