Summary
Vi presenterer her en metode som kombinerer bruk av kjemisk epigenetisk sletting med mechanosensing-relaterte signaler for effektivt å generere pattedyr pluripotente celler, uten behov for gentransfeksjon eller retrovirale vektorer. Denne strategien er derfor lovende for translasjonsmedisin og representerer et bemerkelsesverdig fremskritt innen stamcelleorganoidteknologi.
Abstract
Cellefenotype kan reverseres eller modifiseres med forskjellige metoder, med fordeler og begrensninger som er spesifikke for hver teknikk. Her beskriver vi en ny strategi som kombinerer bruk av kjemisk epigenetisk sletting med mechanosensing-relaterte signaler, for å generere pattedyr pluripotente celler. To hovedtrinn kreves. I det første trinnet blir voksne modne (terminalt differensierte) celler utsatt for det epigenetiske viskelæret 5-aza-cytidin for å drive dem inn i en pluripotent tilstand. Denne delen av protokollen ble utviklet, basert på den økende forståelsen av de epigenetiske mekanismene som kontrollerer cellens skjebne og differensiering, og innebærer bruk av den epigenetiske modifikatoren for å slette celledifferensiert tilstand og deretter kjøre inn i et forbigående vindu med høy plastisitet.
I det andre trinnet er slettede celler innkapslet i polytetrafluoretylen (PTFE) mikrobioreaktorer, også kjent som Flytende klinkekuler, for å fremme 3D-cellerelegging for å utvide og stabilt opprettholde den oppkjøpte høye plastisiteten. PTFE er en ikke-reaktiv hydrofob syntetisk forbindelse, og bruken tillater opprettelse av et cellulært mikromiljø, som ikke kan oppnås i tradisjonelle 2D-kultursystemer. Dette systemet oppmuntrer og øker vedlikeholdet av pluripotens gjennom bio-mechanosensing-relaterte signaler.
De tekniske prosedyrene som er beskrevet her er enkle strategier for å muliggjøre induksjon og vedlikehold av en høy plastisitetstilstand i voksne somatiske celler. Protokollen tillot avledning av høye plastisitetsceller i alle pattedyrarter testet. Siden det ikke innebærer bruk av gentransfeksjon og er fri for virale vektorer, kan det representere et bemerkelsesverdig teknologisk fremskritt for translasjonelle medisinapplikasjoner. Videre gir mikrobioreaktorsystemet et bemerkelsesverdig fremskritt innen stamcelleorganoidteknologi ved in vitro som gjenskaper et spesifikt mikromiljø som muliggjør langsiktig kultur av celler med høy plastisitet, nemlig som ESC, iPSCer, epigenetisk slettede celler og MSCer.
Introduction
I løpet av de siste tiårene ble det allment aksepterte konseptet med enveis progresjon mot celleforpliktelse og differensiering fullstendig revidert. Det har blitt demonstrert at cellespesifikasjon kan reverseres, og en terminalt differensiert celle kan skyves mot en mindre engasjert og høyere tillatt tilstand, ved hjelp av forskjellige metoder.
Blant de foreslåtte metodene innebærer en av de mest lovende metodene bruk av kjemiske forbindelser for å indusere celler til en såkalt kjemisk indusert pluripotens. De små molekylene som brukes i denne tilnærmingen er i stand til å samhandle og modifisere den epigenetiske signaturen til en voksen moden celle, og unngår behovet for noen transgen og / eller viral vektor 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Tallrike studier har nylig vist at det er mulig å bytte celler fra en fenotype til en annen ved å gi spesifikke biokjemiske og biologiske stimuli som induserer reaktivering av hypermetylerte gener 11,12,13,14,15. Disse demetylerende hendelsene tillater konvertering av terminalt differensierte celler til en primitiv stamfar, en multipotent eller en høy plastisitet / pluripotent celle 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallelt har mange studier nylig fokusert på forståelsen av mechanosensing-relaterte signaler og, mer spesifikt, på muligheten til å bruke mekaniske krefter for å direkte påvirke celleplastisitet og / eller differensiering 16,17,18,19. Faktisk har det blitt tydelig demonstrert at den ekstracellulære matrisen (ECM) spiller en nøkkelrolle i kontrollen av celle skjebne. Spesielt regulerer de biomekaniske og biofysiske signalene produsert av ECM direkte molekylære mekanismer og signalveier, og påvirker celleadferd og funksjoner20,21. Disse nylige dataene har banet vei for utviklingen av nye 3D-kultursystemer som tettere etterligner in vivocellemikromiljøet, og replikerer mekanisk og fysisk stimuli drivende celleadferd.
Vi beskriver her en to-trinns protokoll som kombinerer bruk av kjemisk epigenetisk sletting med mekanosenserende relaterte signaler, for å generere pattedyr pluripotente celler. I det første trinnet inkuberes celler med det demetylerende molekylet 5-aza-cytidin (5-aza-CR). Denne agenten er i stand til å indusere en betydelig global DNA-demetylering gjennom en kombinert effekt av den direkte ti-elleve translokasjonen 2 (TET2)-mediert virkning 8,10 og indirekte hemming av DNA-metyltransferaser (DNMT)22,23. Dette trinnet induserer fjerning av de epigenetiske blokkene med en påfølgende reaktivering av pluripotensrelatert genuttrykk og derfor genereringen av celler med høy plastisitet 1,2,3,8,10, heretter referert til som "epigenetisk slettede celler". I det andre trinnet er celler innkapslet i et 3D-kultursystem. Til dette formål brukes den ikke-reaktive hydrofobe syntetiske forbindelsen polytetrafluoretylen (PTFE, med partikkelstørrelse på 1 μm) som mikrobioreaktor, som tillater opprettelse av et cellulært mikromiljø uoppnåelig ved bruk av tradisjonelle 2D-kultursystemer10. PTFE-pulverpartiklene fester seg til overflaten av væskedråpen der cellene suspenderes på nytt og isolerer væskekjernen fra støtteflaten, samtidig som gassutvekslingen mellom den indre væsken og omgivelsene24 tillates. "PTFE mikrobioreaktor" dermed oppnådd, også kjent som "Liquid Marble", oppfordrer celler til å fritt samhandle med hverandre, fremme 3D-celle omorganisering25,26,27, og utvider og stabilt opprettholder den oppkjøpte høye plastisitetstilstanden selv om bio-mechanosensing-relaterte signaler10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studiene ble gjennomgått og godkjent av Den etiske komité ved Universitetet i Milano. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publisert av US National Institutes of Health (NIH). Human celleisolasjon fra friske voksne individer ble godkjent av Den etiske komiteen i Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Alle metodene i studien vår ble utført i henhold til godkjente retningslinjer.
1. Hudfibroblastisolasjon
MERK: Alle prosedyrene beskrevet nedenfor kan brukes på fibroblaster isolert fra forskjellige pattedyrarter, inkludert mus, svin og menneske. Murine celler ble isolert fra 7 uker gamle hannmus og pinnsvin hudvev ble samlet på lokalt slakteri. Humane celler ble isolert fra voksne pasienter, etter skriftlig informert samtykke.
- Forbered 0,1% porcin gelatinoppløsning.
- Vei 0,1 g porcin gelatin og oppløs det i 100 ml vann. Steriliser gelatinoppløsningen ved autoklavering før bruk.
- Frakk 35 mm Petri-tallerken med 0,1% porcin gelatin ved å tilsette 1,5 ml av den tilberedte løsningen. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
- Klipp pattedyr (mus, porcin og menneskelig) hudbiopsier på ca. 2-5 cm i lengde og legg dem i Dulbeccos fosfat bufret saltvann (PBS) som inneholder 2% antibiotika antimykotisk løsning. Oppbevars ved + 4 °C til bruk.
MERK: Biopsisamlinger må gjennomføres etter avtale og etter etisk komités godkjennelse, i samsvar med de etablerte retningslinjene. - Vask de oppsamlede biopsiene grundig tre ganger i fersk steril PBS som inneholder 2% antibiotika antimykotisk løsning.
- Samle biopsier fra siste vask og legg dem i en steril 100 mm Petri-tallerken. Bruk en steril skalpell til å kutte dem i biter på ca. 2 mm3 størrelse.
- På slutten av 2 h inkubasjon, fjern overskuddet av gelatinoppløsning fra 35 mm Petri-parabolen (beskrevet i trinn 1.1.2) og legg umiddelbart 5-6 hudfragmenter i hver forhåndsbelagte kulturrett ved hjelp av en steril kirurgisk pinsett.
- Fukt fragmentene ved å tilsette 100 μL dråper fibroblastisolasjonsmedium (tabell 1) over hver av dem. Kultur ved 37 °C i 5 % CO 2-inkubator.
MERK: For å unngå at mediet fordampes, plasser 35 mm Petri-retten innenfor en 100 mm eller større Petri-tallerken som inneholder sterilt vann. Sørg for å hette begge Petri-rettene. - Etter 24 timers kultur, sjekk mengden av mediet i 35 mm kultur Petri-parabolen. Tilsett om nødvendig 500 μL fibroblastisolasjonsmedium for å holde fragmentene våte.
- Fjern forsiktig mediet og oppdater det minst annenhver dag med kultur ved hjelp av en pipette.
- Når fibroblaster begynner å vokse ut av hudfragmentene plassert i 35 mm Petri-parabolen (beskrevet i trinn 1.5.) og begynner å danne en cellemonolayer (vanligvis 6 dager). Fjern hudstykker ved hjelp av en steril kirurgisk pinsett og kultur i 2 ml fibroblastisolasjonsmedium.
- Fortsett å dyrke cellemonolayeren ved 37 °C i 5 % CO 2-inkubator til 80 % samløp og oppdateringsmedium annenhver dag.
2. Fibroblast primærcellelinjekultur
- Når fibroblaster når 80% samløp, fjern forsiktig fibroblastisolasjonsmedium og vask celler tre ganger med 3 ml PBS som inneholder 1% antibiotika antimykotisk løsning.
- For celleavløsning, tilsett 600 μL 0,25% trypsin-EDTA-løsning i kulturretten og inkuber ved 37 °C i 3-5 minutter.
- Tilsett 5,4 ml fibroblastkulturmedium for å nøytralisere trypsin når cellene begynner å løsne fra kulturretten (tabell 1).
- Løsne celler ved gjentatt og skånsom pipettering. Plateceller i nye kulturretter (uten gelatin), som holder passasjeforholdet mellom 1:2 og 1:4 (avhengig av vekstrate).
MERK: Sentrifugering er ikke nødvendig. - Opprettholde celler i kultur og endre medium hver annen dag, til de har nådd 80% samløp og passerer dem.
MERK: Forplant fibroblaster to ganger i uken for å opprettholde kraftig vekst.
3. Fibroblasteksponering for 5-aza-CR
- Forbered fersk 1 mM 5-aza-CR lagerløsning.
- Vei 2,44 mg 5-aza-CR og oppløs den i 10 ml DMEM høy glukose. Resuspend pulveret ved virvel. Steriliser oppløsningen med 0,22 μm filter.
MERK: 5-aza-CR lagerløsning må fremstilles umiddelbart før bruk. - Forbered 5-aza-CR arbeidsløsning ved å fortynne 1 μL 5-aza-CR lagerløsning (3.1.1.) i 1 ml fibroblastkulturmedium.
MERK: Konsentrasjonen av 5-aza-CR arbeidsløsning er 1 μM 1,2,3,8,9.
- Vei 2,44 mg 5-aza-CR og oppløs den i 10 ml DMEM høy glukose. Resuspend pulveret ved virvel. Steriliser oppløsningen med 0,22 μm filter.
- Prøv celler som tidligere beskrevet (2.1.-2.3.) og løsne celler ved gjentatte ganger og forsiktig pipettering.
- Samle cellefjæringen og overfør den til et konisk rør.
- Tell celler ved hjelp av et tellekammer under et optisk mikroskop ved romtemperatur. Beregn volumet av medium som trengs for å suspendere celler på nytt for å få 4 x 104 celler i 30 μL fibroblastkulturmedium supplert med 1 μM 5-aza-CR (se trinn 3.1.2.).
MERK: Formelen som skal brukes, avhenger av den spesifikke typen kammer.
- Sentrifuger cellefjæringen ved 150 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern den supernatante og resuspendpellets med fibroblastkulturmediet supplert med 1 μM 5-aza-CR (se trinn 3.1.2.). For volumet av fibroblastkulturmediet som skal brukes, se trinn 3.4.
MERK: Som en negativ kontroll, resuspend celler annonse samme konsentrasjon i fibroblast kultur medium uten 5-aza-CR og fortsette med celle innkapsling i PTFE pulver (trinn 4.1.-4.13.).
4. Fibroblast innkapsling i PTFE mikrobioreaktorer
- Fyll en 35 mm Petri-tallerken med polytetrafluoretylenpulver (PTFE) for å produsere en seng (figur 1A).
MERK: Bruk 35 mm bakteriologi Petri-retter for å unngå flytende marmoradhesjon. For å få et tynt hydrofobt og porøst skall, bruk et PTFE-pulver med en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på 1 μm og produsert med en maksimal grind på 2,0 NPIRI. Dette gjør det mulig å lage gassgjennomtrengelige flytende klinkekuler. Videre letter det gjennomsiktige belegget observasjonen av celleaggregeringsprosesser i sanntid Større partikkelstørrelse fører til høy polydispersitet som kan forårsake forhøyet fordampning, deformitet og tap av sfærisk form, og for tidlig oppløsning av mikrobioreaktorer. - Dispenser 30 μL enkeltdråpe som inneholder 4 x 104 celler (se trinn 3.4.- 3.5.) på pulversengen (figur 1B).
- Roter forsiktig 35 mm Petri-retten i en sirkulær bevegelse for å sikre at PFTE-pulveret helt dekker overflaten av væskedråpen for å danne en flytende marmormikrobioreaktor (figur 1C).
- Plukk opp den flytende marmormikrobioreaktoren ved hjelp av en 1000 μL pipettespiss, kuttet på kanten, for å imøtekomme marmorens diameter (figur 1D,E). Tallerken den flytende marmormikrobioreaktoren på en ren bakteriologi Petri-tallerken for å stabilisere den (figur 1F).
MERK: For å lage en friksjon for å gripe marmoren inne i spissen, kutt pipettespissene med en diameter omtrent litt mindre enn den flytende marmordiameteren. - Overfør den flytende mikrobioreaktoren i marmor fra Petri-retten til en 96 brønnplate (en marmor/brønn) (figur 1G).
- Tilsett sakte 100 μL medier fra brønnens margin. Mikrobioreaktoren begynner å flyte på toppen av mediet (figur 1H).
MERK: Mikrobioreaktoren bryter i direkte væskekontakt på grunn av forstyrrelse av PTFE hydrofobiskhet. Som en alternativ tilnærming kan mikrobioreaktorer av flytende marmor plasseres individuelt i en 35 mm bakteriologikulturrett. I dette tilfellet, for å forhindre flytende marmorfordampning, må 35 mm Petri-parabolen som inneholder mikrobioreaktoren settes inn i en 100 mm Petri-tallerken, tidligere aliquoted med sterilt vann. - Inkuber flytende marmormikrobioreaktor i 18 timer ved 37 °C i 5 % CO 2-inkubator 1,2,3,8,9.
MERK: PTFE-partikkelstørrelsen på 1 μm kan sikre en optimal gassutveksling mellom den indre væsken og omgivelsene. - Etter 5-aza-CR inkubasjon i 18 timer, samle flytende marmor mikrobioreaktor ved hjelp av en 1000 μL pipettespiss kuttet på kanten (se trinn 4.5).
- Plasser mikrobioreaktoren i en ny 35 mm bakteriologi Petri-tallerken (figur 1D-F).
- Bruk en nål til å punktere den flytende marmoren og bryte den.
- Gjenopprett dannede sfæroider med en 200 μL pipettespiss, kuttet på kanten, under et stereomikroskop (figur 1I, J).
MERK: Epigenetisk slettede celler innkapslet i PTFE danner en 3D sfærisk struktur (ett aggregat i hver flytende marmor). - For å vurdere oppkjøpet av pluripotent tilstand som svar på 5-aza-CR, sjekk utbruddet av pluripotensrelatert genuttrykk, OCT4, NANOG, REX1 og SOX2, ved kvalitativ PCR (tabell 2).
- Fortsett med det andre trinnet i protokollen som beskrevet nedenfor.
5. Kultur i PTFE mikrobioreaktorer av epigenetisk slettede celler
- Forbered ferskt ESC-kulturmedium (tabell 1).
- Overfør organoider i en Petri-tallerken som inneholder ESC-medium for vasking av rester av 5 aza-CR (se trinn 5.1.-5.2.).
- Forbered en ny 35 mm bakteriologi Petri-tallerken som inneholder PTFE pulverseng (se også trinn 4.1.).
- Dispenser en enkelt organoid i en dråpe på 30 μL ESC kulturmedium på pulversengen ved hjelp av en 200 μL pipettespiss, kutt på kanten (se trinn 4.9.; 5.3.).
- Roter forsiktig 35 mm Petri-parabolen i en sirkulær bevegelse for å danne en ny flytende marmormikrobioreaktor, plukk den opp med en 1000 μL pipettespiss, kutt på kanten, og plasser den nydannede mikrobioreaktoren i en brønn på 96-brønnsplate (en marmor / brønn) (se trinn 4.3.-4.6.).
- For å flyte mikrobioreaktorer, tilsett 100 μL medier fra brønnens margin for sakte å bade marmoren (se note 4.7.).
- Kultur flytende marmor mikrobioreaktorer ved 37 °C i 5 % CO 2-inkubator så lenge det er nødvendig. Bytt medium annenhver dag, etter prosedyren beskrevet i 5.3.-5.7.
MERK: I det nåværende manuskriptet gis resultater oppnådd med organoidkultur i 28 dager. Men om nødvendig kan lengre kulturperiode utføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den nåværende protokollen beskriver alle trinnene som skal utføres for å generere og stabilt opprettholde pattedyr pluripotente celler fra voksne somatiske celler. Denne metoden har vært vellykket med fibroblaster isolert fra forskjellige pattedyrarter, nemlig mus, porcin og menneske. De representative resultatene her som rapporteres er hentet fra alle cellelinjer, uavhengig av opprinnelsesarter.
Morfologiske analyser viser at etter 18 timers inkubasjon med demetylerende middel 5-aza-CR, fibroblaster innkapslet i PTFE mikrobioreaktorer (3D Post 5-aza-CR) aggregert og dannet 3D sfæriske strukturer som viser en jevn størrelse geometri, i alle de tre artene som vurderes. (Figur 2A-C, 3D Post 5-aza-CR). 86,31 ± 4,13% av innkapslede celler endret bemerkelsesverdig fenotypen sin, og viste funksjoner som vanligvis er relatert til en høy plastisitetsfenotype8. I motsetning til dette, etter 5-aza-CR celler dyrket inn i 2D standard forhold, selv om erstattet den typiske fibroblast langstrakte formen med en rund eller oval en, var betydelig mindre i størrelse med større og granulerte kjerner, beholde en monolayer distribusjon (Figur 2). De morfologiske endringene ble ledsaget av utbruddet av pluripotensrelatert genuttrykk både i 3D- og 2D Post 5-aza-CR-celler. Transkripsjon for POU klasse 5 homeobox 1 (OCT4), Nanog homeobox (NANOG), ZFP42 sinkfingerprotein (REX1) og kjønnsbestemmelse region Y-boks 2 (SOX2) ble også observert, som er fraværende i ubehandlede fibroblaster (T0), ble oppdaget (figur 3, figur 4, figur 5). Videre viste kvantitativ PCR-analyse en betydelig oppregulering av de ovennevnte genene, så vel som av ti-elleve translokasjon-2 (TET2), epitelcelleadhesjonsmolekyl (EPCAM) og kadherin 1 (CDH1) gener i 3D Post 5-aza-CR-celler (figur 3, figur 4, figur 5, blå barer) sammenlignet med celler dyrket i 2D-standard plastretter (2D Post 5-aza-CR) (figur 3, Figur 4, figur 5, oransje stolper). Parallelt var en signifikant nedregulering av fibroblastspesifikk markør Thy-1 celleoverflateantigen (THY1) tydelig påviselig i 3D- og 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 3, figur 4, figur 5).
Oppnåelsen av en høy plastisitetstilstand ble også bekreftet av ELISA-analyse av DNA global metylering, som viser en betydelig reduksjon av metyleringsnivåer i både 3D- og 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 6A-C). Videre, i samsvar med genuttrykksresultatene, var DNA-metyleringsnivåene betydelig lavere i 3D Post 5-aza-CR-celler (figur 6A-C, blå barer), sammenlignet med 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 6A-C, oransje barer).
Enda mer interessant er det at 3D Post 5-aza-CR-celler beholder den oppkjøpte 3D-sfæriske strukturen (figur 2A, 3D 28d) og opprettholder høye uttrykksnivåer av pluripotensrelaterte gener (figur 3, figur 4 og figur 5 blå barer) samt lave DNA-metyleringsnivåer (figur 6A-C, blå barer), i hele den påfølgende kulturperioden og spesielt til 28 dager, da kulturen ble arrestert. Til sammenligning, selv om 2D Post 5-aza-CR-celler transkriberer for de samme pluripotensgenene etter behandling med demetyleringsmiddelet, avslo de et slikt uttrykk etter dag 7 (figur 3, figur 4, figur 5, nd). Tilsvarende ble nedgangen i metyleringsnivåer opprettholdt i de første 72 timene; Metylering økte langsomt, og returnerte sammenlignbar med ubehandlede fibroblaster (figur 6A-C, T0, hvite stolper) etter dag 7 av kulturen (figur 6A-C, oransje barer).
Figur 1: Celleinnkapsling i PTFE mikrobioreaktor og organoid utvinning. (A) En bakteriologi Petri parabolen ble fylt med PTFE for å forberede en pulver seng. (B) En enkelt dråpe mediumholdige celler ble dispensert på toppen av PTFE-sengen. (C) Petri-retten ble forsiktig rotert med sirkulære bevegelser for å belegge dråpen og produsere mikrobioreaktoren. (D) En pipettespiss på 1000 μL ble kuttet på enden (rød pil) og (E) som brukes til å samle mikrobioreaktoren. (F) Den flytende marmoren ble overført til en ren Petri-tallerken for å stabilisere den, (G) plassert i en 96 brønnplate (en marmor / brønn) og (H) fløt på mediet. (I) For å samle nydannet organoid ble mikrobioreaktoren punktert med en nål og (J) de oppnådde celleaggregatene ble gjenvunnet under et stereomikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Pattedyr epigenetisk slettede celler innkapslet i PTFE mikrobioreaktorer danner 3D sfæriske strukturer. Murine (A), svin (B) og humane (C) celler innkapslet i PTFE og behandlet med 5-aza-CR form 3D sfæriske strukturer (3D Post 5-aza-CR), som ble stabilt opprettholdt i løpet av hele den påfølgende kulturperioden (3D 28d; Skalastang, 100 μm). I motsetning til dette erstattet murinceller (A), svin (B) og humane (C) celler belagt på plastretter og behandlet med 5-aza-CR den typiske fibroblasterte langstrakte formen (T0) i en rund epithelioid fenotype og beholdt en monolayerfordeling (2D Post 5-aza-CR). På dag 7 av kulturen gikk 2D-celler tilbake til sin opprinnelige langstrakte form som ble stabilt opprettholdt for den påfølgende kulturperioden (2D 28 d; Skalastang, 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Murine epigenetisk slettede celler innkapslet i PTFE mikrobioreaktorer viser høyt nivå og langsiktig vedlikehold av pluripotensrelatert genuttrykk. Transkripsjonsnivåer for Oct4, Nanog, Rex1, Sox2, Tet2, Epcam, Cdh1 og Thy1 gener i murine ubehandlede fibroblaster (T0, hvite barer), fibroblaster utsatt for 5-aza-CR (Post 5-aza-CR), og på forskjellige tidspunkter av kultur for PTFE innkapslet (blå barer) og standard plastfat (oransje barer) kultiverte celler. Genuttrykksverdier rapporteres med det høyeste uttrykket satt til 1 og alle andre i forhold til dette. Ulike vernepliktige angir signifikante forskjeller (P < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Svine epigene epigenetisk slettede celler innkapslet i PTFE mikrobioreaktorer viser høyt nivå og langsiktig vedlikehold av pluripotensrelatert genuttrykk. Transkripsjonsnivåer for OCT4-, NANOG-, REX1-, SOX2-, TET2-, EPCAM-, CDH1- og THY1-gener i porcin ubehandlede fibroblaster (T0, hvite barer), fibroblaster eksponert for 5-aza-CR (Post 5-aza-CR), og på forskjellige tidspunkter for kultur for PTFE innkapslede (blå barer) og standard plastfat (oransje barer) Genuttrykksverdier rapporteres med det høyeste uttrykket satt til 1 og alle andre i forhold til dette. Ulike vernepliktige angir signifikante forskjeller (P < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Humane epigenetisk slettede celler innkapslet i PTFE mikrobioreaktorer viser høyt nivå og langsiktig vedlikehold av pluripotensrelatert genuttrykk. Transkripsjonsnivåer for OCT4-, NANOG-, REX1-, SOX2-, TET2-, EPCAM-, CDH1- og THY1-gener i humane ubehandlede fibroblaster (T0, hvite barer), fibroblaster eksponert for 5-aza-CR (Post 5-aza-CR), og på forskjellige tidspunkter for kultur for PTFE innkapslede (blå barer) og standard plastfat (oransje barer) Genuttrykksverdier rapporteres med det høyeste uttrykket satt til 1 og alle andre i forhold til dette. Ulike vernepliktige angir signifikante forskjeller (P < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: PTFE mikrobioreaktor forbedrer 5-aza-CR demetylerende effekt og opprettholder langsiktig DNA-hypometylering hos pattedyr epigenetisk slettede fibroblaster. Globale DNA-metyleringsnivåer av murin (A), svin (B) og humane (C) celler innkapslet i PTFE mikrobioreaktorer (blå barer) eller belagt på standard plast (oransje barer) utsatt for 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) og dyrket i ESC medium i 28 dager. Ubehandlede fibroblaster (T0; hvite stenger). Resultatene representerer gjennomsnittlig ± SD av tre uavhengige eksperimenter med fem uavhengige biologiske repliker. Ulike vernepliktige angir signifikante forskjeller (P < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Fibroblast isolasjonsmedium (100 ml) | |
| DMEM, høy glukose, pyruvat | 77 ml |
| Fetal Bovine Serum, kvalifisert, varmeinaktivert | 20 ml |
| L-Glutamin-løsning | 1 ml |
| Antimykotisk antibiotikaoppløsning (100×) | 2 ml |
| Fibroblast kulturmedium (100 ml) | |
| DMEM, høy glukose, pyruvat | 88 ml |
| Fetal Bovine Serum, kvalifisert, varmeinaktivert | 10 ml |
| L-Glutamin-løsning | 1 ml |
| Antimykotisk antibiotikaoppløsning (100×) | 1 ml |
| ESC kulturmedium (10 ml) | |
| Skinkes F-10 næringsblanding | 3,99 ml |
| DMEM, lav glukose, pyruvat | 3,99 ml |
| Utstansing av serumerstatning | 1 ml |
| Fetal Bovine Serum, kvalifisert, varmeinaktivert | 500 μL |
| Antimykotisk antibiotikaoppløsning (100×) | 100 μL |
| L-Glutamin-løsning | 100 μL |
| MEM ikke-essensielle aminosyrer oppløsning (100X) | 100 μL |
| 2-Mercaptoetanol (10 mM) | 100 μL (0,1 mM) |
| Nukleosidblanding (0,3 M Guanosin, 0,3 M Adenosin, 0,3 M Cytidin, 0,3 M Uridine og 0,1 M Timidin) | 100 μL (3 mM guanosin, 3 mM adenosin, 3 mM cytidin, 3 mM uridin og 1 mM timidin) |
| ESGRO Rekombinant Mus LIF Protein (1000 enheter/ml) | 10 μL (1 enhet/ml) |
| Rekombinant Human FGF grunnleggende (bFGF) (5 μg/ml) | 10 μL (5 ng/ml) |
Tabell 1: Sammensetning av fibroblastisolasjonsmedium, fibroblastkulturmedium og ESC kulturmedium.
| Mål | PCR Primer-sett | Art | |
| Cdh1 | Fremover: GAGGAACCCACAGCCTCATA | Mus | |
| Omvendt: GTTGACCGTCCCTTCACAGT | Mus | ||
| Epcam | Fremover: TGGCAACAAGTTGCTCTCTG | Mus | |
| Omvendt: CTTGTCGGTTCTTCGGACTC | Mus | ||
| Nanog | Fremover: AGGCTGATTTGGTTGGTGTC | Mus | |
| Omvendt: CCAGGAAGACCCACACTCAT | Mus | ||
| 4. okt. | Fremover: ACACCTGGCTTCAGACTTCG | Mus | |
| Omvendt: AGTTGCTTTCCACTCGTGCT | Mus | ||
| Rex1 | Fremover: CAGGTTCTGGAAGCGAGTTC | Mus | |
| Omvendt: GACAAGCATGTGCTTCCTCA | Mus | ||
| Sox2 | Fremover: AGAACCCCAAGATGCACAAC | Mus | |
| Omvendt: CTCCGGGAAGCGTGTACTTA | Mus | ||
| Tet2 | Fremover: GCACAGGGAGCAAGAGATTC | Mus | |
| Bakside: ATGTTGACATTGCCAGTGGA | Mus | ||
| Din1 | Fremover: AACTCTTGGCACCATGAACC | Mus | |
| Omvendt: GCACGTGCTTCCTCTTCTCT | Mus | ||
| CDH1 | Fremover: GAATGACAATGGCCCCATAC | Porcine | |
| Bakside: AGGTGGTCACCTGGTCTTTG | Porcine | ||
| EPCAM | Fremover: GCTTGGTCAGTGCCAGTGTA | Porcine | |
| Omvendt: CTTCTGACCCCAGCAGTGTT | Porcine | ||
| NANOG | Fremover: ATCCAGCTTGTCCCCAAAG | Porcine | |
| Omvendt: ATTTCATTCGCTGGTTCTGG | Porcine | ||
| OKT. | Fremover: GTTCAGCCAAACGACCATCT | Porcine | |
| Omvendt: CTCCAGGTTGCCTCTCACTC | Porcine | ||
| REX1 | Fremover: CTTCAAGGAGAGCGCAAAAC | Porcine | |
| Omvendt: TGTCCCCAATCAAAAATGCT | Porcine | ||
| SOX2 | Fremover: GCCCTGCAGTACAACTCCAT | Porcine | |
| Omvendt: GCTGATCATGTCCCGTAGGT | Porcine | ||
| TET2 | Fremover: CAGAAAACAATGCAGCCAGA | Porcine | |
| Omvendt: GAATGGCTCGGTCTCTGAAG | Porcine | ||
| THY1 | Fremover: GGCATCGCTCTTGCTAAC | Porcine | |
| Omvendt: GCTGGAGAAGTTGGTTCGAG | Porcine | ||
| CDH1 | Fremover: TGCCCAGAAAATGAAAAAGG | Menneske | |
| Omvendt: GTGTATGTGGCAATGCGTTC | Menneske | ||
| EPCAM | Fremover: GCTGGTGTGTGAACACTGCT | Menneske | |
| Omvendt: ACGCGTTGTGATCTCCTTCT | Menneske | ||
| NANOG | Fremover: AGAAAAACAACTGGCCGAAG | Menneske | |
| Bakside: TGCTCCAGGACTGGATGTTC | Menneske | ||
| OKT. | Fremover: AATTTGCCAAGCTCCTGAAG | Menneske | |
| Omvendt: GTTGCCTCTCACTCGGTTCT | Menneske | ||
| REX1 | Fremover: ACGTTTCGTGTGTCCCTTTC | Menneske | |
| Omvendt: TATAACCGCTTTTGGGGTTG | Menneske | ||
| SOX2 | Fremover: ACACCAATCCCATCCACACT | Menneske | |
| Omvendt: GCAAACTTCCTGCAAAGCTC | Menneske | ||
| TET2 | Fremover: CCCACTTACCTGCGTTTCAT | Menneske | |
| Omvendt: ACTGTGACCTTTCCCCACTG | Menneske | ||
| THY1 | Fremover: AGATCCCAGAACCATGAACC | Menneske | |
| Omvendt: GCACGTGCTTCTTTGTCTCA | Menneske | ||
| Mål | Katalognummer for TaqMan-analyser | Art | |
| Actb | Mm02619580_g1 | Mus | |
| Cdh1 | Mm01247357_m1 | Mus | |
| Epcam | Mm00493214_m1 | Mus | |
| Gapdh | Mm99999915_g1 | Mus | |
| Nanog | Mm02019550_s1 | Mus | |
| 4. okt. | Mm03053917_g1 | Mus | |
| Rex1 | Mm03053975_g1 | Mus | |
| Sox2 | Mm03053810_s1 | Mus | |
| Tet2 | Mm00524395_m1 | Mus | |
| Din1 | Mm00493681_m1 | Mus | |
| ACTB | Ss03376563_uH | Porcine | |
| CDH1 | Ss06942341_m1 | Porcine | |
| EPCAM | Ss03384752_u1 | Porcine | |
| GAPDH | Ss03375629_u1 | Porcine | |
| NANOG | Ss04245375_s1 | Porcine | |
| OKT. | Ss03389800_m1 | Porcine | |
| REX1 | Ss03373622_g1 | Porcine | |
| SOX2 | Ss03388002_u1 | Porcine | |
| TET2 | Ss06880359_m1 | Porcine | |
| THY1 | Ss03376963_u1 | Porcine | |
| ACTB | Hs01060665_g1 | Menneske | |
| CDH1 | Hs01023895_m1 | Menneske | |
| EPCAM | Hs00901885_m1 | Menneske | |
| GAPDH | Hs02786624_g1 | Menneske | |
| NANOG | Hs02387400_g1 | Menneske | |
| OKT. | Hs00999632_g1 | Menneske | |
| REX1 | Hs00399279_m1 | Menneske | |
| SOX2 | Hs01053049_s1 | Menneske | |
| TET2 | Hs00325999_m1 | Menneske | |
| THY1 | Hs00174816_m1 | Menneske | |
Tabell 2: Primer-informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av de siste tiårene fokuserte flere studier på utvikling av strategier for å tilbakestille en terminalt differensiert celle mot en mindre engasjert og høyere tillatt tilstand. Protokollen her beskrevet tillater generering og langsiktig vedlikehold av pluripotente celler som starter fra voksne modne terminalt differensierte celler. Metoden kombinerer to uavhengige trinn som involverer induksjon av en høy tillatt tilstand som oppnås gjennom kjemisk epigenetisk sletting og dets påfølgende vedlikehold sikret ved hjelp av et 3D-kultursystem.
Dannelsen av 3D sfæroidstrukturer observert i PTFE innkapslede celler (figur 2) er i samsvar med andre studier som viser PTFE evne til effektivt å oppmuntre til celleaggregering, noe som letter etableringen av olfaktoriske ensheathing celle (OEC) sfæroid strukturer25 eller dannelsen av 3D toroidale aggregater26. Disse morfologiske endringene er parallelt med utbruddet av pluripotensrelatert genuttrykk (figur 3, figur 4, figur 5) som viser signifikant høyere nivåer i 3D Post 5-aza-CR-celler, sammenlignet med 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 3, figur 4, figur 5). Konsekvent viser 3D Post 5-aza-CR-celler en høyere DNA-hypometylering enn 2D Post 5-aza-CR-celler (figur 6). Samlet sett indikerer disse resultatene 5-aza-CR evne til å indusere en høy plastisitetstilstand, uavhengig av cellekultursystemet som brukes. Imidlertid fremmes den kjemisk induserte pluripotenstilstanden som oppnås av cellene, betydelig ved hjelp av en PTFE mikrobioreaktor som øker pluripotensgentranskripsjon og øker 5-aza-CR demetylerende effekter. Enda mer interessant er det at bare 3D Post 5-aza-CR-celler stabilt beholder den oppkjøpte 3D-sfæriske strukturen (figur 2) og opprettholder høye uttrykksnivåer av pluripotensrelaterte gener (figur 3, figur 4, figur 5) samt lave DNA-metyleringsnivåer (figur 6), i løpet av hele den påfølgende kulturperioden. Til sammen viser de representative resultatene her at denne to-trinns strategien er svært effektiv og robust, og bruken av en PTFE mikrobioreaktor øker ikke bare høy plastisitet, men tillater også sitt stabile, langsiktige vedlikehold i pattedyrartene som vurderes. Vi har nylig demonstrert at disse gunstige effektene er relatert til aktiveringen av Hippo-signalveien og dens mekanal-relaterte signaler10, som tidligere har vist seg å ha en nøkkelrolle i aktiv regulering av celle pluripotens 28,29,30.
De to mest kritiske trinnene for en vellykket prosedyre er strengt vedlikehold av celler ved 37 °C, til enhver tid, inkludert håndtering under den sterile laminære strømmen og mikroskopet og bruk av riktig cellenummer / væskevolumhastighet under mikrobioreaktorproduksjon, som kan variere i henhold til den spesifikke celletypen som brukes. Etter vår erfaring anbefales det også sterkt å forberede reagenser ferskt, før de brukes i kultur (dette er helt avgjørende for 5-aza-CR lagerløsning). Videre må middels forfriskende utføres under et stereomikroskop siden 3D sfæriske organoider kan gå tapt under middels endringer.
Hovedstyrken til denne metoden er ingen transgene og / eller virale vektorkrav; robustheten og reproduserbarheten i forskjellige pattedyrarter; lave kostnader; og høy fleksibilitet til ulike celletyper. På den annen side kan en mulig begrensning representeres av det begrensede antallet data som er innhentet, på grunn av de små volumene av mikrobioreaktorer. I tillegg kan bruk av høy celletetthet føre til lave oksygenoverføringshastigheter og begrenset vekst i suspensjon. For å løse disse problemene er det fortsatt nødvendig med ytterligere arbeid med oppskalerings- og/eller nedskaleringsstrategier.
Det er viktig å markere at de viktigste aspektene som er felles for alle 3D sfæroidbaserte applikasjoner er reproduserbarheten, produksjonseffektiviteten, den organoide størrelsesuniformiteten og påvirkningen på cellulær fysiologi. Disse funksjonene er strengt korrelert med de mekaniske kreftene som genereres i kultursystemet og varierer i henhold til de forskjellige metodene som brukes. For eksempel kan multicellulære organoider dyrkes ved hjelp av ikke-tilhengerretter i stasjonære systemer. Denne tilnærmingen er hovedsakelig basert på diffusjonsbegrensede forhold og resulterer vanligvis i dannelsen av løs-aggregerte klynger. Hanging-drop-teknikken viser samme begrensning. Faktisk faller avsetningen av cellefjæring på undersiden av lokket på en vevskulturrett fører til opprettelsen av mikrogravitetsmiljø som konsentrerer celler ved det frie væskeluftgrensesnittet, og induserer genereringen av lavaggregaterte multicellulære sfærer. Et mulig alternativ er representert av spinnerflasketeknikken. Denne metoden er imidlertid svært dyr siden den krever forhøyede mengder kulturmedium. Videre må de dannede organoidene overføres til stasjonært kultursystem når de brukes til karakterisering eller ytterligere in vitro-tester. Alle disse problemene kan løses ved å bruke flytende marmor mikrobioreaktorer. Faktisk gir de en ikke-tilhenger flytende overflate som kombinerer fordelene med både stasjonære og spinnende metoder, og induserer en rask celleaggregering og generering av kompakte sfæroider. Parallelt tillater den konkave bunnen, den sfæriske formen og den indre væskestrømmen av hver marmor celler å bosette seg på bunnen av mikrobioreaktoren, noe som resulterer i dannelse av organoider ensartet i størrelse og form. En annen betydelig fordel ved bruk av flytende klinkekuler er representert av de optimale gassutvekslingene som, takket være deres sfæriske form, kan oppstå gjennom hele overflaten.
Til slutt tillater protokollen her som er beskrevet en effektiv og enkel generasjon av pattedyr pluripotente celler. Siden denne strategien er viral vektorfri og ikke innebærer bruk av gentransfeksjon, er den svært lovende for translasjonelle medisinapplikasjoner og kan betraktes som et skritt fremover i pasientspesifikk celleterapi. Videre kan bruk av 3D-mikrobioreaktorkultursystemer representere et bemerkelsesverdig gjennombrudd i stamcelleorganoidteknologi og kan utgjøre et fordelaktig mikromiljø for langsiktig kultur av forskjellige celletyper, for eksempel ESC, iPSCer og MSCer. En ekstra fordel er representert av det lille volumet som gjør det mulig å studere effekten av parakrine / autocrine signalering av det rike miljøet etablert i mikrobioreaktoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Carraresi Foundation og MiND FoodS Hub ID: 1176436. Alle forfatterne er medlemmer av COST Action CA16119 In vitro 3D total celleveiledning og kondisjon (CellFit).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
- Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333 (2015).
- Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
- Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
- Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017 (2016).
- Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
- Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
- Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
- Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
- Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).
- Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41 (2012).
- Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
- Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
- Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083 (2015).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).
- Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).
- Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
- Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).
