Summary
In vitro cultuur van runder ovarium cortex en het effect van nutritionele trap-stap dieet op ovariële micro-omgeving wordt gepresenteerd. Ovariële cortexstukken werden gedurende zeven dagen gekweekt en steroïden, cytokines en follikelstadia werden geëvalueerd. De Stair-Step dieetbehandeling had een verhoogde steroidogenese, wat resulteerde in follikelprogressie in cultuur.
Abstract
Follikelontwikkeling van het primordiale tot antrale stadium is een dynamisch proces in de ovariële cortex, dat endocriene en paracriene factoren van somatische cellen en cumulus cel-oöcytcommunicatie omvat. Er is weinig bekend over de ovariële micro-omgeving en hoe de cytokines en steroïden die in het omringende milieu worden geproduceerd, de follikelprogressie of -arrestatie beïnvloeden. In vitro cultuur van de ovariële cortex maakt het mogelijk om follikels te ontwikkelen in een genormaliseerde omgeving die ondersteund blijft door aangrenzend stroma. Ons doel was om het effect van het nutritionele Stair-Step dieet op de ovariële micro-omgeving (follikelontwikkeling, steroïde en cytokineproductie) te bepalen door middel van in vitro cultuur van de boviene ovariumschors. Om dit te bereiken, werden ovariële corticale stukjes verwijderd van vaarzen die voorafgaand aan de puberteit twee verschillende nutritioneel ontwikkelde schema's ondergingen: Control (traditionele voedingsontwikkeling) en Stair-Step (voeding en beperking tijdens de ontwikkeling) die in ongeveer 0,5-1 mm3-stukken werden gesneden. Deze stukken werden vervolgens door een reeks wasbeurten geleid en op een weefselkweekinzet geplaatst die in een put met het kweekmedium van Waymouth wordt geplaatst. De ovariële cortex werd gedurende 7 dagen gekweekt met dagelijkse veranderingen in de cultuurmedia. Histologische sectie werd uitgevoerd om follikelstadiumveranderingen voor en na de kweek te bepalen om de effecten van voeding en de impact van cultuur te bepalen zonder aanvullende behandeling. Cortex cultuur medium werd gepoold over dagen om steroïden, steroïde metabolieten en cytokines te meten. Er waren tendensen voor verhoogde steroïde hormonen in de ovariële micro-omgeving die follikelprogressie mogelijk maakten in de Stair-Step versus Control ovariële cortexculturen. De ovariële cortexcultuurtechniek zorgt voor een beter begrip van de ovariële micro-omgeving en hoe veranderingen in endocriene secretie de follikelprogressie en -groei van zowel in vivo als in vitro behandelingen kunnen beïnvloeden. Deze kweekmethode kan ook gunstig zijn voor het testen van potentiële therapieën die de follikelprogressie bij vrouwen kunnen verbeteren om de vruchtbaarheid te bevorderen.
Introduction
De ovariële cortex vertegenwoordigt de buitenste laag van de eierstok waar follikelontwikkeling optreedt1. Primordiale follikels, aanvankelijk gestopt in ontwikkeling, zullen worden geactiveerd om primaire, secundaire en vervolgens antrale of tertiaire follikels te worden op basis van paracriene en gonadotrofine-ingangen1,2,3,4. Om fysiologische processen in de eierstok beter te begrijpen, kan weefselkweek worden gebruikt als een in vitro model, waardoor een gecontroleerde omgeving mogelijk is om experimenten uit te voeren. Veel studies hebben gebruik gemaakt van eierstokweefselkweek voor onderzoek naar geassisteerde voortplantingstechnologie, vruchtbaarheidsbehoud en eierstokkanker5,6,7. Ovariële weefselkweek heeft ook gediend als een model voor het onderzoeken van reproductieve toxines die de gezondheid van de eierstokken en de etiologie van reproductieve aandoeningen zoals polycysteus ovariumsyndroom (PCOS)8,9,10,11schaden. Dit cultuursysteem is dus toepasbaar op een breed scala aan specialiteiten.
Bij knaagdieren zijn hele foetale of perinatale geslachtsklieren gebruikt in experimenten met reproductieve biologie12,13,14,15. Gonaden van grotere huisdieren kunnen echter niet als hele organen worden gekweekt vanwege hun grote omvang en potentiële degeneratie. Daarom wordt de ovariële cortex van runderen en niet-menselijke primaten in kleinere stukken gesneden16,17,18. Veel studies hebben kleine ovariële cortexstukken gekweekt om verschillende groeifactor (en) te bestuderen in primordiale follikelinitiatie bij gedomesticeerd vee en niet-menselijke primaten1,17,18,19. Het gebruik van ovariële cortexcultuur heeft ook primordiale follikelinitiatie aangetoond in afwezigheid van serum voor corticale stukjes van runderen en primaten gekweekt gedurende 7 dagen20. Yang en Fortune behandelden in 2006 foetale ovariële cortexcultuurmedium met een reeks testosterondoses gedurende 10 dagen en merkten op dat de 10-7 M-concentratie van testosteron de follikelrekrutering, overleving en verhoogde progressie van follikels in een vroeg stadiumverhoogde 19. In 2007 rapporteerden Yang en Fortune met behulp van ovariële cortexculturen van runderfoetussen (5-8 maanden zwangerschap) een rol voor vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA) in de primaire naar secundaire follikelovergang21. Bovendien heeft ons laboratorium ovariële cortexculturen gebruikt om aan te tonen hoe VEGFA-isovormen (angiogene, antiangiogene en een combinatie) verschillende signaaltransductieroutes kunnen reguleren via de Kinase-domeinreceptor (KDR), de belangrijkste signaaltransductiereceptor die VEGFA bindt16. Deze informatie zorgde voor een beter begrip van hoe verschillende VEGFA-isovormen signaalroutes beïnvloeden om follikelprogressie of -arrestatie uit te lokken. Alles bij elkaar genomen kan het kweken van stukken van de ovariële cortex in vitro met verschillende steroïden of groeifactoren een waardevolle test zijn om effecten te bepalen op mechanismen die folliculogenese reguleren. Evenzo kunnen dieren die zijn ontwikkeld op verschillende voedingsregimes veranderde ovariële micro-omgevingen hebben, die folliculogenese kunnen bevorderen of remmen die de vrouwelijke reproductieve volwassenheid beïnvloedt. Ons doel in het huidige manuscript is dus om de boviene cortexcultuurtechniek te rapporteren en te bepalen of er verschillen zijn in ovariële micro-omgevingen na in vitro cultuur van runderschors van vaarzen die ofwel Control- of Stair-Step-diëten kregen verzameld op de leeftijd van 13 maanden zoals eerder beschreven16.
Daarom was onze volgende stap om de ovariële micro-omgeving te bepalen in deze vaarzen die werden ontwikkeld met verschillende voedingsdiëten. We evalueerden de ovariële cortex van vaarzen die werden gevoed met een Stair-Step- of Control-dieet. Controle vaarzen kregen gedurende 84 dagen een onderhoudsdieet aangeboden van 97,9 g/kg0,75. Het Stair-Step dieet werd gestart na 8 maanden met een beperkt gevoed dieet van 67,4 g/kg0,75 gedurende 84 dagen. Na de eerste 84 dagen, terwijl controle vaarzen 97,9 g / kg0,75 blevenontvangen, kregen de Stair-Step runder vaarzen nog 68 dagen 118,9 g / kg0,75 aangeboden, waarna ze op de leeftijd van 13 maanden16 werden geïnvariectomie voor het bestuderen van veranderingen in folliculaire stadia en morfologie voor en na de kweek. We hebben ook getest op verschillen in steroïden, steroïde metabolieten, chemokines en cytokines die worden uitgescheiden in cortexmedia. Steroïden en andere metabolieten werden gemeten om te bepalen of er directe effecten waren van behandelingen die in vivo en/of in vitro werden uitgevoerd op de levensvatbaarheid en productiviteit van weefsel. Veranderingen in de ovariële micro-omgeving voorafgaand aan en na de kweek zorgden voor een momentopname van het endocriene milieu en folliculogenese voorafgaand aan de kweek en hoe cultuur of behandeling tijdens de kweek de follikelprogressie of -arrestatie beïnvloedt.
Eierstokken werden verzameld nadat ovariectomie werd uitgevoerd in het U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) volgens hun IACUC-procedures van Control en Stair-Step vaarzen op de leeftijd van 13 maanden op de leeftijd van16, gereinigd met steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) wasbeurten met 0,1% antibioticum om bloed en andere verontreinigingen te verwijderen, overtollig weefsel bijgesneden en vervoerd naar het reproductieve fysiologielaboratorium van de Universiteit van Nebraska-Lincoln (UNL) UNL bij 37 ° C23 . Bij UNL werden stukjes ovariële cortex in kleine vierkante stukjes gesneden (~ 0,5-1 mm3; Figuur 1) en gedurende 7 dagen gekweekt(figuur 2). Histologie werd uitgevoerd op de cortexkweekdia's voor en na de kweek om follikelsstadia16,24 (figuur 3 en figuur 4) en extracellulaire matrixeiwitten te bepalen die kunnen wijzen op fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figuur 5). Dit maakte het mogelijk om het effect van in vivo voedingsregimes op follikelstadia te bepalen en maakte vergelijking van 7 dagen ovariële cortex op follikelstadia en follikelprogressie mogelijk. Gedurende de kweek werd het medium dagelijks verzameld en verschoond (ongeveer 70% van de media werd elke dag verzameld; 250 μL / put) zodat dagelijkse hormonen / cytokines / chemokines kunnen worden beoordeeld of samengevoegd gedurende dagen om gemiddelde concentraties te verkrijgen. Steroïden zoals androstenedione (A4) en oestrogeen (E2) kunnen gedurende 3 dagen worden samengevoegd en beoordeeld via radioimmunoassay (RIA; Figuur 6) en gepoold over 4 dagen per dier en getest via High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (HPLC-MS)24,25 ( Tabel1). Cytokine-arrays werden gebruikt om cytokine- en chemokineconcentraties in ovariumschorscultuurmedium26 te beoordelen(tabel 2). Real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) testplaten werden uitgevoerd om genexpressie te bepalen voor specifieke signaaltransductieroutes zoals eerder aangetoond16. Alle steroïde, cytokine, follikelstadium en histologische markers bieden een momentopname van de ovariële micro-omgeving en aanwijzingen over het vermogen van die micro-omgeving om "normale" of "abnormale" folliculogenese te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eierstokken werden verkregen van U. S. Meat Animal Research Center16. Zoals eerder vermeld16, werden alle procedures goedgekeurd door het U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee in overeenstemming met de gids voor zorg en gebruik van landbouwdieren in landbouwkundig onderzoek en onderwijs. De eierstokken werden naar het Voortplantingslaboratorium van de Universiteit van Nebraska-Lincoln gebracht, waar ze werden verwerkt en gekweekt.
1. Voorbereiding van de benodigde media
-
Waymouth MB 752/1 medium
- Vul een 1 L weefselkweekfles met 900 ml steriel water. Terwijl het water zachtjes op een roerplaat roert, voegt u geleidelijk het medium in poedervorm toe. Zodra het medium in poedervorm is opgelost, voegt u 2,24 g natriumbicarbonaat toe, gevolgd door 1,25 g runderserumalbumine (BSA). Gebruik een pH-meter en stel de pH in op 7,25-7,35. Voeg extra steriel water toe om het uiteindelijke volume op 1 L te brengen.
- Ga naar een biologische veiligheidskast en voeg penicilline-streptomycinesulfaat toe in een concentratie van 0,1% v / v van het medium. Filtreer het medium met een 0,22 μm porie 33,2 cm2 500 ml fles top filter.
- Giet het gefilterde medium af in verschillende conische buizen van 50 ml. Voeg 0,5 ml insuline-transferrine-selenium toe per 50 ml gealiquoteerd medium.
- Wikkel de conische buizen en voorraadfles van het medium in aluminiumfolie en bewaar bij 4 °C. Dit medium is lichtgevoelig.
OPMERKING: Waymouth medium kan tot 1 maand worden bewaard.
-
Leibovitz's L-15 (LB-15) medium
OPMERKING: LB-15 medium wordt gebruikt om weefsel te reinigen ter voorbereiding op kweek.- Vul een 1 L weefselkweekfles met 900 ml steriel water. Terwijl het steriele water zachtjes op een roerplaat roert, voegt u geleidelijk het bereide medium in poedervorm toe. Gebruik een pH-meter en stel de pH in op 7,25-7,35. Voeg extra steriel water toe om het uiteindelijke volume op 1 L te brengen.
- Ga naar biologische veiligheidskast. Maak 1 L LB-15 met 0,1% antibioticum (zie Tabel met materialen). Filtreer het medium in twee 500 ml weefselkweekflessen met behulp van een 0,22 μm porie 33,2 cm2 500 ml flesdekselfilter. Wikkel flessen in aluminiumfolie als LB-15 medium is lichtgevoelig en bewaar bij 4 °C.
OPMERKING: LB-15 medium kan maximaal 1 maand worden bewaard.
-
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
- Maak PBS in het laboratorium of koop steriele PBS zonder calcium of magnesium(Tabel met materialen). Om PBS in het laboratorium te maken, begint u met 800 ml gedestilleerd water en voegt u er 8 g natriumchloride (NaCl) aan toe. Voeg vervolgens 0,2 g kaliumchloride (KCl), 1,44 g natriumfosfaatdibasisch (Na2HPO4) en 0,24 g kaliumfosfaat dibasis (KH2PO4) toe. Stel de pH in op ~7,4 en stel het totale volume in op 1 L. Steriliseer de oplossing door autoclaveren.
- Maak 1 L PBS met 0,1% antibioticum (zie Tabel met materialen) in een biologische veiligheidskast.
2. Ovariële corticale cultuur protocol
OPMERKING: Eierstokken werden verkregen van in de lente geboren USMARC vaarzen op de leeftijd van 13 maanden. Eierstokken werden grondig gespoeld en al het bloed en andere vloeistof werden verwijderd met PBS met antibioticum (0,1%) en vervoerd bij 37 °C23 naar de University of Nebraska-Lincoln Reproduction Laboratory UNL (1,5 uur afstand). (Voor opmerkingen over de temperatuur van de eierstokken tijdens het transport, zie Discussie)
- Bereid het eierstokweefsel voor op een schone bank (figuur 1).
- Desinfecteer de schone bank met 70% ethanol. Plaats een fris absorberend kussen op het bankje. Zorg ervoor dat de schone bankblower een half uur voor de dissectie samen met UV-licht wordt ingeschakeld om alles in de schone bank te steriliseren, inclusief absorberend kussen en zorg ervoor dat de juiste PBM's worden gebruikt.
- Schik de petrischaaltjes (60 x 15 mm) voor weefselwassingen. Drie petrischalen zijn nodig voor PBS-was, drie voor PBS met antibioticum en drie voor LB-15-wasbeurten. Een extra LB-15-bevattende petrischaal met bijbehorend deksel zal worden gebruikt voor de definitieve plaatsing van stukken na het wassen.
- Vul elke petrischaal met ongeveer 10 ml geschikte vloeistoffen, PBS of LB-15.
Figuur 1: Lay-out van platen voor het wassen van de eierstok en cortexstukken in de schone bank. (A) PBS gebruikt voor het wassen van de eierstokken als delen van de cortex worden verwijderd. (B) PBS met antibiotica wassingen waar cortex stukjes doorheen worden bewogen. (C)Ovariële cortexstukken worden vier keer gewassen in LB-15 voordat ze naar de bioveiligheidskast gaan voor de laatste wasbeurt in LB-15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Haal de bereide Waymouth en LB-15 medium uit de koelkast en verwarm tot kamertemperatuur.
- Autoclaaf alle gereedschappen om sterilisatie te garanderen voorafgaand aan gebruik.
- Houd de eierstokken op 37 °C totdat de ovariële cortex klaar is om te worden verzameld.
- Gebruik een tang met gekartelde kaken, pak de eierstok op en was grondig in de eerste pbs-gevulde petrischaal. Breng de eierstok over naar de tweede PBS-was en reinig nogmaals grondig.
OPMERKING: De eierstok blijft in de tweede PBS-wassing terwijl de corticale strips van de eierstokken worden verwijderd. - Gebruik gekartelde kaaktang, zet de eierstok vast en snijd in tweeën. Op dit moment zal de ovariële cortex wegsnijden van de medulla. Zorg er met behulp van een liniaal voor dat niet meer dan 1-2 mm diepte van het oppervlak van de eierstok wordt verwijderd van de medulla16. Verwijder dwarsdoorsneden van de ovariële cortex uit medulla, snijd 3-4 dunne stroken ovariële cortex(figuur 2)met een scalpel (# 11 scalpelmes; # 3 handvat) en plaats de strips in de derde PBS-gevulde petrischaal.
OPMERKING: Op dit moment kan extra ovarium corticale weefsel worden verzameld voor RNA-extractie of worden gefixeerd en verzameld voor histologie van initiële niet-gekweekte cortexstukken. Vermijd bij het verwijderen van stroken van de ovariële cortex gebieden met zichtbare antrale follikels of corpora lutea. Vermijd bovendien het verzamelen van medullair weefsel. De histologie van de medulla is heel anders zoals eerder getoond16. Als de ovariële cortex niet tot meer dan een diepte van 1-2 mm wordt gesneden, mag de medulla niet worden verkregen. Verschillende histologie zorgt voor oriëntatiepunten tussen de cortex en het medulla. - Snijd de ovariële cortex strips in de derde PBS-was in kleine, vierkante stukjes (~ 0,5-1 mm3) met een # 21 scalpelmes. Gebruik een liniaal onder de petrischalen om ervoor te zorgen dat de stukken van vergelijkbare grootte en dikte zijn om consistente stukken van de ovariële cortex te maken. Gebruik een tang om de strips vast te zetten terwijl je de stukken snijdt met een scalpel.
OPMERKING: Het aantal gesneden weefselstukken is afhankelijk van het experiment. Vier stukjes ovariële cortex is de minimale hoeveelheid weefsel die nodig is voor kweek. Andere methoden om de juiste lengte en diepte te garanderen, zijn onder meer het gebruik van speciale snijmachines26 of voorgesneden plastic stukken als sjablonen27. - Was ovariële corticale stukjes door alle drie PBS met met antibiotica gevulde petrischalen. Gebruik een gebogen tiptang om stukken tussen wasbeurten te verplaatsen.
- Beweeg cortexstukken door de reeks LB-15-wasbeurten en plaats ze in de laatste met LB-15 gevulde petrischaal. Label het deksel met dier-ID en eierstokzijde (links of rechts).
OPMERKING: Dompel de stukken van de ovariële cortex volledig onder in elke wasbeurt voor grondige reiniging. - Verzamel vier stukjes ovariële cortex per eierstok en fixeer voor dag nul histologie. Extra stukjes kunnen ook worden ingevroren voor RNA. De resterende weefselstukken zullen worden gebruikt voor kweek. Veeg ontleedgereedschappen af met 70% ethanol na elke weefselverzameling.
- Bereid een biologische veiligheidskast voor voor de laatste weefselwas en kweekvoorbereiding. Ontsmet benodigdheden met 70% ethanol voordat u ze in de biologische veiligheidskast plaatst. Gebruik de aseptische techniek bij het werken in de biologische veiligheidskast.
- Verplaats alle ovariële cortex bedoeld voor kweek naar de biologische veiligheidskast en was nogmaals in een met LB-15 gevulde petrischaal.
- Pipetteer in een 24-well tissuekweekplaat 350 μL Waymouth medium per put.
- Plaats ongecoate kweekputten in elke put met behulp van een tang. Zorg ervoor dat er geen bubbels worden gevormd onder de basis van de insert, omdat dit zou resulteren in het uitdrogen van het weefsel. Het medium moet de inserts aanraken om het medium te kunnen absorberen en de stukken van de eierstokschors te omringen.
- Plaats zorgvuldig vier stukken van de ovariële cortex op het gaas van elke insert(figuur 2). De tang kan het gaas doorboren als de weefselstukken niet subtiel worden geplaatst. De weefselstukken mogen elkaar of de zijkant van de insert niet raken.
- Incubeer het weefsel bij 37 °C met 5% CO216.
OPMERKING: Anderen hebben 38,8 °C28gebruikt. Er is echter geen verschil waargenomen in de integriteit van het weefsel noch in het vermogen van follikels om vooruitgang te boeken in 37 °C-weefsel, noch hebben anderen39,30. Op dit punt zou elk van deze temperaturen dus bevorderlijk moeten zijn voor het succes van het experiment. Anderen hebben 400 μL medium gebruikt. Beide hoeveelheden zijn prima zolang men consistent is en het weefsel gedeeltelijk ondergedompeld is, waardoor voldoende oppervlaktespanning mogelijk is om hydratatie van weefsel mogelijk te maken (media rond stukjes ovariumschors). Vul lege putten met 500 μL steriel water om verdamping uit andere putten te verminderen.
Figuur 2: Stukken ovariële cortex en kweekplaat. (A) Een ovariële strip die uit de cortex van de eierstok wordt gesneden. (B) Liniaal en cortex stuk naast elkaar weergegeven. (C) Vier cortexstukken (~ 0,5-1 mm3) rustend op de insert in het kweekmedium in de plaat. D)Het optillen van het inzetstuk om het kweekmedium uit de put te halen. Verzamel en vervang dagelijks alle kweekmedium (250 μL) om de juiste pH te behouden.Ongeveer 250 μL wordt elke dag uit elke put verkregen (ongeveer 70% van het initiële kweekmedium). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Media collectie
- Verander de ovariële cortex cultuur medium dagelijks gedurende 7 dagen. Medium veranderingen moeten zo dicht mogelijk bij 24 uur uit elkaar liggen om grote pH- en kleurveranderingen in medium te voorkomen. Warm Waymouth medium tot 37 °C voordat het medium wordt vervangen. Ongeveer 250 μL wordt elke dag uit elke put verkregen (ongeveer 70% van het initiële kweekmedium).
- Gebruik tijdens mediumwissels een tang om het inzetstuk voorzichtig uit de put te tillen. Verzamel het gekweekte Waymouth medium in buizen van 0,5 ml (ongeveer 250 μL /dag). Plaats de insert goed terug en voeg 350 μL vers kweekmedium toe door het medium tussen de zijkant van het inzetstuk en goed af te geven.
OPMERKING: Verander de meeste media dagelijks om voldoende media te verkrijgen om alle steroïden, cytokines en chemokines te meten die nodig zijn om de ovariële micro-omgeving te bepalen. Ook zijn dagelijkse mediumveranderingen belangrijk om grote pH-veranderingen (aangegeven door kleurverandering) in het medium te voorkomen. Druppels medium werden rond de stukken van de ovariële cortex bewaard om ervoor te zorgen dat de stukken nat bleven. Er werden geen problemen waargenomen met gekweekt weefsel als gevolg van het veranderen van 70% van de media. - Bewaar het verzamelde medium uit weefselkweek bij -20 °C.
4. Beeldvorming en downstream verwerking
- Na 7 dagen kweek bij 37 °C met 5% CO2, beeld de ovariële cortexstukken in met behulp van een dissectiemicroscoop met een aangesloten camera en een computerbeeldbewerkingssoftwareprogramma.
OPMERKING: Een donkere kamer is meestal het beste voor het bereiken van de beste beeldkwaliteit voor beeldvorming. - Na beeldvorming, fixeer twee ovariële cortex stukken per put in Bouins voor histologie en flash bevries twee ovariële cortex stukken in vloeibare stikstof om RNA voor cDNA te verkrijgen. Herhaal deze stap voor alle putjes met weefsel. Verzamel het medium vanaf dag 7 en bewaar bij -20 °C.
- Laat de stukjes ovariumschors gedurende ongeveer 1,5 uur ondergedompeld blijven in Bouins (picrinezuur 750 ml, ijsazijn 50 ml en 37% -40% formaline 250 ml) voordat ze drie keer worden gewassen met 70% ethanol. Het weefsel blijft in 70% ethanol en wordt dagelijks opgeruimd totdat de oplossing niet langer geel is.
OPMERKING: Andere fixatieven dan Bouins en paraformaldehyde kunnen worden gebruikt. In deze ervaring wordt Bouins gebruikt omdat het het fixatief is om optimale morfologie te bereiken. Als er meer weefsel nodig is voor andere analyse, kunnen extra bronnen van media en stukjes ovariële cortex van elk dier worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze boviene cortex kweekprocedure kan worden gebruikt om een breed scala aan hormoon-, cytokine- en histologische gegevens uit kleine stukjes van de eierstok te bepalen. Kleuring, zoals hematoxyline en eosine (H & E), kan worden gebruikt om de ovariële morfologie te bepalen door middel van follikelstadiëring16,23,31 (figuur 3). Kortom, follikels werden geclassificeerd als primordiaal, wat een eicel is omgeven door een enkele laag plaveiselcel pre-granulosacellen (0); overgangsfollikel of vroege primaire, wat een eicel is omgeven door meestal plaveiselcel pre-granulosacellen en sommige cuboïdale granulosacellen (1); primaire follikel, een eicel omgeven door 1-1,5 lagen kubusvormige granulosacellen (2); secundaire follikel, een eicel omgeven door twee of meer kuboïde granulosacellen (3); antrale follikel, die niet groter is dan 1 mm in diameter en omgeven door twee of meer lagen granulosacellen die een duidelijk antrum bevatten (4)16,23 ( figuur3). Follikelstadiëring kan worden uitgevoerd op de ovariumschors die vóór en na de kweek is gefixeerd om folliculogenese te beoordelen(figuur 4). We namen drie foto's per dia van drie verschillende dia's gekleurd met H & E. Vervolgens werden de follikels geënsceneerd en geteld door drie individuen en gemiddeld om het aantal follikels in elk stadium16,23te bepalen. Het gebied van het gezichtsveld voor een afbeelding (drie per dia) bij 400x vergroting is 0,4 mm2. Zo werd 30% van het gebied van de ovariële cortexstukken geteld om follikelstadia te bepalen. Het initiëlefollikelgetal (vóór kweek) (figuur 4A) wordt gebruikt om de follikels geteld na kweek te normaliseren (figuur 4B).
Bovendien kunnen verschillen in morfologie zoals bepaald door collageenafzetting (Picro Sirus Red-kleuring) wijzen op fibrose in de ovariële cortex van Stair Step of Control vaarzen(figuur 5). Dagelijkse verzameling van kweekmedium kan gedurende 3 dagen worden samengevoegd om de gevarieerde steroïde hormoonproductie door RIA te beoordelen (met behulp van 200 μL mediummonster per dier; Figuur 6) of steroïde metabolieten met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie massaspectrometrie (HPLC-MS; 220 μL mediummonster gepoold over 4 dagen per dier; Tabel 1) en cytokineproductie (tabel 2). Daarom kunnen meerdere replicaties van één dier nodig zijn om voldoende cortexmedium te garanderen om alle gewenste testen uit te voeren.
Omdat Stair-Step vaarzen aan het begin van de kweek verhoogde primordiale follikels hebben, verwachtten we dat deze in de cultuur zouden vorderen en een groter aantal secundaire follikels zouden verkrijgen, wat we in de resultaten hebben waargenomen. Ook, als gevolg van de toename van secundaire follikels, zouden we hogere concentraties van steroïden verwachten. We zagen wel de neiging tot toename van androgenen, glucocorticoïde metabolieten en progesteronmetabolieten, die dit in het huidige manuscript zouden ondersteunen. Ons laboratorium heeft ook de effecten van verschillende VEGFA-isovormen op follikelprogressie, steroidogenese en activering van verschillende signaaltransductiemoleculen in de KDR (ook bekend als Vasculaire Endothelial Growth Factor Receptor 2; VEGFR2) met behulp van signaaltransductie array platen16. Om de variatie in dieren te verminderen, gebruiken we 4-6 dieren per behandeling en voor andere experimenten, afhankelijk van krachtanalyse en variabiliteit, hebben we er maar liefst 11 gebruikt.
Herhaalbaarheid van resultaten van boviene ovarium cortex cultuur wordt het meest beïnvloed door besmetting van ovariële cortex stukken. Bovendien kunnen negatieve of ondermaatse resultaten optreden als het medium niet regelmatig binnen een periode van 24 uur wordt vervangen. Het medium wanneer het oorspronkelijk is toegevoegd, is roze van kleur, maar wanneer het medium wordt verzameld en de kleur oranje of felgeel lijkt te zijn, kan dit wijzen op een verandering in pH die schadelijk kan zijn voor het weefsel. Ook kunnen weefselstukken die te groot zijn gesneden, in het midden degeneratie ontwikkelen die niet zou worden waargenomen totdat weefselsectie voor histologie. Deze degeneratie zal het gebruik van het weefsel voor analyse beperken. De gegevens die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn geanalyseerd met behulp van niet-parametrische tests en een algemene lineaire modelanalyse in een statistisch softwareprogramma. Het aantal primordiale, primaire, secundaire en antrale follikels per sectie voor en na de kweek werd geanalyseerd met behulp van een gegeneraliseerd lineair gemengd model. Significantie werd bepaald bij P < 0,05 en een tendens werd gemeld bij 0,14 ≤ P ≥ 0,05.
Figuur 3: Hematoxyline- en eosinekleuring voor follikelstadiëring van de ovariële cortex. Verschillende stadia van follikels worden aangegeven door pijlen. (A) Primordiale follikels (stadium 0); (B) Vroege primaire follikels (stadium 1); (C) Primaire follikels (stadium 2); D)secundaire follikel (stadium 3); (E) Antrale follikel (stadium 4). Oppervlakte van het gezichtsveld voor een afbeelding bij 400x vergroting is 0,4 mm2. We tellen 30% van het gebied van de ovariële cortexstukken om de follikelstadia te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gemiddeld aantal follikels in verschillende folliculaire stadia in Control (n=6) en Stair-Step (n=6) vaarzen. (A) Vóór kweek Primordiaal P = 0,001, Vroeg Primair P = 0,12, Primair P = 0,31, Secundair P = 0,22. (B) Na 7 dagen kweek, Primordiaal P = 0,37, Vroeg Primair P = 0,84, Primair P = 0,69, Secundair P = 0,02. Foutbalken zijn representatief voor SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Collageen (Picro Sirius Red; PSR) kleuring in de ovariële cortex. PSR in (A) Control en Stair-Step vaarzen vanaf dag 0 en dag 7. (B) Grafiek waarin het gemiddelde gebied van PSR-positieve kleuring per ovariële cortex veld (pixels/μm2) tussen Control (n = 4) en Stair-Step (n = 4) vaarzen wordt vergeleken. Foutbalken zijn representatief voor SEM. Het gezichtsveld voor een afbeelding met een vergroting van 400x is 0,4 mm2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:Concentratiesvan A4 en E2. (A) Concentratie van A4 en (B) concentratie van E2 gepoold over 3 dagen cultuur in ovariële cortexmedia van Control en Stair-Step vaarzen zoals gemeten door RIA's. n = 4 voor elke groep. Foutbalken zijn representatief voor SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Hormonen | Beheersen | Traptrede | P-waarde | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| ng/ml | Bedoelen | SEM ± | Bedoelen | SEM ± | ||
| DOC | 0.33 | 0.28 | 0.72 | 0.48 | 0.15 | |
| HERBERG | 0.61 | 0.60 | 4.93 | 3.99 | 0.08 | |
| CORT | 0.003 | 0.003 | 0.01 | 0.01 | 0.85 | |
| 17PK | 0.59 | 0.53 | 1.88 | 0.99 | 0.08 | |
| A4- | 1.46 | 1.43 | 5.74 | 3.27 | 0.08 | |
| EEN | 0.15 | 0.09 | 0.54 | 0.32 | 0.08 | |
| DHEAS | 4.50 | 2.60 | 7.59 | 0.85 | 0.56 | |
| E2 | 0.05 | 0.05 | 0.13 | 0.08 | 0.32 | |
| P4 | 5.05 | 2.78 | 6.52 | 1.66 | 0.39 | |
| T | 0.33 | 0.33 | 1.33 | 0.96 | 0.14 | |
| Dht | 0.07 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.09 | |
| DOC - 11-Deoxycorticosteron, INN - 11-Deoxycortisol, CORT – Corticosteron, 17OHP – 17-Hydroxyprogesteron, A4- Androstenedione, AN – Androsteron, DHEAS – dehydroepiandrosteronsulfaat, E2 - Estradiol, P4 – Progesteron, T – Testosteron, DHT – Dihydrotestosteron | ||||||
Tabel 1: Steroïde en steroïde metabolieten gemeten in het kweekmedium van de ovariumschors uit één put voor elk dier gepoold gedurende 4 dagen cultuur. Gegevens gepresenteerd met gemiddelde ± SEM. Blauw geeft P aan < 0,1 en heeft de neiging om anders te zijn.
| Cytokines | Beheersen | Traptrede | P-waarde | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| pg/ml | Bedoelen | SEM ± | Bedoelen | SEM ± | ||
| Ang1 | 27.29 | 11.71 | 63.66 | 25.06 | 0.39 | |
| cd40l | 4527.01 | 2986.34 | 3537.59 | 3537.59 | 0.74 | |
| Dcn | 1307.68 | 320.87 | 996.54 | 282.96 | 0.77 | |
| Infβ | 0.36 | 0.36 | 0.002 | 0.002 | 0.85 | |
| Il18 | 0.00 | 0.00 | 1832.89 | 1265.33 | 0.13 | |
| LIF | 97.45 | 88.12 | 337.58 | 231.25 | 0.54 | |
| RANTES | 698.06 | 322.59 | 1254.13 | 811.19 | 0.56 | |
| INFγ | 4.49 | 1.37 | 3.68 | 0.65 | 0.77 | |
| Il13 | 501.21 | 285.07 | 810.81 | 159.67 | 0.25 | |
| Il21 | 24.38 | 9.51 | 18.52 | 6.17 | 0.56 | |
| Il1F5 | 5.07 | 3.85 | 5.40 | 1.70 | 0.56 | |
| TNFα | 61.45 | 35.00 | 44.91 | 13.41 | 0.77 | |
| ANG1 – Angiopoietine 1, CD40L – CD40 Ligand, DCN – Decorin, IFNβ – Interferon Beta 1, IL18 – Interleukine-18, LIF – Leukemie remmende fabriek, RANTES – Gereguleerd op Activering, Normale T-cel uitgedrukt en uitgescheiden, IFNγ – Interferon Gamma, IL13 – Interleukine 13, IL21 – Interleukine 21, IL1F5 – Interleukine 1 familielid 5, TNFα – Tumor Necrose Factor alfa | ||||||
Tabel 2: Cytokine en chemokines gemeten in het kweekmedium van de ovariumschors uit één put voor elk dier, gepoold over 4 dagen cultuur. Gegevens gepresenteerd met gemiddelde ± SEM. Blauw geeft P aan < 0,1-0,14 en heeft de neiging om anders te zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het voordeel van in vitro ovariële cortexcultuur, zoals beschreven in dit manuscript, is dat de follikels zich ontwikkelen in een genormaliseerde omgeving met aangrenzend stroma rond de follikels. De somatische cellen en eicellen blijven intact en er is geschikte cel-tot-cel communicatie als een in vivo model. Ons laboratorium heeft ontdekt dat een 7-daags kweeksysteem representatieve folliculogenese- en steroidogenesegegevens biedt voor de behandeling van de ovariële cortex. Andere ovariële weefselkweekprotocollen hebben ofwel relatief korte kweekperioden 1-6 dagen7,32 of lange kweekperioden van 10-15 dagen5,6,10. We hebben echter waargenomen dat kweken gedurende meer dan 7 dagen leidt tot weefselafbraak, verminderde steroidogenese en mogelijk een verhoogde kans op besmetting (gegevens niet getoond). Het kweken van de ovariële cortex na ovariëctomie geeft ook direct inzicht in de ovariële micro-omgeving binnen dat specifieke dier. Dit is van belang voor ons onderzoekslaboratorium omdat we veranderingen in de folliculaire ontwikkeling hebben geïdentificeerd nadat voedingsregimes werden opgelegd na het spenen en leiden tot puberteit bij vaarzen16.
Follikelontwikkeling van het primordiale tot antrale stadium is een dynamisch proces in de ovariële cortex, dat endocriene en paracriene factoren van somatische cellen en cumulus cel-oöcytcommunicatie omvat33. Weefselkweek, zoals ovariële cortexcultuur, biedt een gecontroleerde omgeving om de mechanistische rol van deze factoren en het endocriene milieu in de ovariële micro-omgeving te onderzoeken. Eierstokken kunnen worden verzameld van dieren die een in vivo behandeling hebben ondergaan of genetisch zijn veranderd om effecten op follikelprogressie te bepalen.
Eierstokken kunnen ook worden verzameld bij een lokaal slachthuis (op 1 uur afstand) en bij 37 °C worden vervoerd in een thermoskan met PBS met antibioticum. Als het transport langer is (bijvoorbeeld 's nachts), worden de eierstokken verscheept of vervoerd op ijs22. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen, ongeacht of het transport van eierstokken 's nachts op ijs gebeurt of bij 37 °C met kortdurend transport in een thermoskan. De 37 °C met een thermostransport maakt het mogelijk om eicellen uit dit weefsel te oogsten voor in vitro rijping (IVM) of in vitro fertilisatie (IVF)34. Andere studies hebben aangetoond dat het transporteren van weefsel bij temperaturen tussen 2-8 ° C ook is gebruikt voor vruchtbaarheidsbehoud in voortplantingsweefsels35,36,37. Weer andere studies hebben eierstokken gebruikt die bij 34-37 °C en op ijs worden vervoerd en hebben geen verschillen waargenomen in runderweefselkweek38.
Als het kweekweefsel van de ovariumschors er na de kweek niet gezond uitziet, kan dit te wijten zijn aan het feit dat de stukken ovariële cortex te groot zijn. Een cruciale stap in het protocol is om ervoor te zorgen dat de stukken van de ovariële cortex niet groter zijn dan 0,5-1 mm3. We gebruiken een liniaal om de stukken te meten en gebruiken een schaal in de ontleedmicroscoop om de grootte van de stukken van de ovariële cortex te bepalen(figuur 2C). Anderen gebruiken specifieke apparatuur (zie Tabel met materialen)voor uniforme dikte en lengte / breedte, respectievelijk26. Als deze apparaten niet beschikbaar zijn, kunnen plastic vierkanten worden gebruikt als sjabloon om een uniforme dikte te verkrijgen en te zorgen voor stukken van vergelijkbare grootte27.
Om ervoor te zorgen dat stukjes die alleen uit de cortex komen en geen medulla hebben na het wassen van de eierstok, plaatsen we deze in de schaal van 60 mm en snijden we deze doormidden. De cortex en medulla zijn histologisch heel verschillend zoals eerder gezien in Abedal-Majed, 202016. Elke helft van de eierstok wordt gefileerd met het mes om ervoor te zorgen dat alleen de cortex uit de eierstok wordt verwijderd en het medulla overblijft. Als individuen net beginnen met het perfectioneren van deze snijtechniek, kunnen ze ook neutraal rood gebruiken om de histologie van elke helft van de eierstok van dichtbij te bekijken39. Dit zal de ontwikkeling van oriëntatiepunten mogelijk maken naarmate hun snijtechniek verbetert. Verder kunnen ze instrumenten gebruiken die een uniforme dikte kunnen snijden (zie Tabel met materialen)zoals hierboven vermeld26,27.
Ovariële cortex medium moet lichtroze zijn. We hebben waargenomen dat de pH van het ovariële cortexcultuurmedium bij sommige dieren snel verandert, dus de meerderheid (70%) van het medium van de eierstokschors moet elke 24 uur worden gewijzigd om de gezondheid van de cultuur te bevorderen. Eerdere artikelen hebben gesproken over het veranderen van de helft van het medium dagelijks40. Onze reden om een meerderheid van de media in het huidige manuscript te veranderen, was om de gezondheid van de ovariële cortexculturen te bevorderen. Druppels rond de stukken van de ovariële cortex blijven en er waren geen negatieve effecten van mediumverandering op de cultuur. Bovendien stelde dit ons in staat om meer hormonen, cytokines en chemokines voor elk dier te analyseren om inzicht te krijgen in de ovariële micro-omgeving.
Dit weefselkweekprotocol biedt verschillende voordelen. Het kweken van de ovariële cortex zorgt ervoor dat follikels zich kunnen ontwikkelen in een omgeving die vergelijkbaar is met in vivo. Follikels blijven ondersteund door het omringende stroma en de communicatie tussen somatische cellen en cumulus cel-eicel gaat door. Het gebruik van kweekputinzetstukken stelt de ovariële cortex in staat om op het kweekmedium te rusten zonder ondergedompeld te worden, waardoor wordt voorkomen dat het weefsel zich bindt aan de plastic basis van de putplaat. Een ander voordeel is het cultuurvenster. Het 7-daagse kweekvenster dat in het protocol wordt beschreven, biedt representatieve hormoon- en groeifactorgegevens. Bovendien blijft folliculogenese zich ontwikkelen in deze in vitro omgeving, omdat we minder vroeg-stadium follikels (primordiaal) en meer laat-stadium follikels (secundair, antrale) hebben geteld na 7 dagen cultuur16. Eerdere ovariële weefselkweekprotocollen hebben relatief korte (1-6 dagen7,32)of lange (10-15 dagen5,6,10)kweekperioden gebruikt. Kortere kweekvensters zijn gebruikt om primordiale follikelactivering in foetale boviene ovariumschors te onderzoeken41. Bij niet-menselijke primaten werd een kweekperiode van 20 dagen gebruikt om het vermogen van de primordiale follikels van de primaat om te overleven en groei in vitro te initiëren in serumvrij medium te evalueren18. We hebben echter een verhoogde weefselafbraak waargenomen bij het kweken van de ovariële runderschors langer dan 7 dagen in serumvrij medium. We hebben ook vastgesteld in de analyse van dagelijkse monsters dat steroïde concentraties zijn verlaagd na 4 dagen cultuur (gegevens niet getoond). Een langer kweekvenster kan ook de kans op besmetting in ovariële cortexculturen vergroten. Daarom kunnen grote effecten worden gemeten door 7 dagen cultuur15 en kan de tijd van cultuur afhankelijk zijn van het diermodel en de wetenschappelijke vraag die wordt behandeld.
Hoewel er verschillende voordelen van dit protocol voor de boviene ovariumschors bestaan, zijn er een paar beperkingen. Een beperking is de hoeveelheid ovarium corticale weefsel en kweekmedium volume verzameld tijdens ovariële corticale cultuur. De kleine omvang van de stukjes ovariumschors maakt het mogelijk om een beperkt aantal weefselsecties te gebruiken voor kleuringsdoeleinden (H & E, immunofluorescentie, enz.). Om RT-PCR uit te voeren, zijn minimaal vier cortexstukken nodig16. Bovendien kan het lage volume van het verzamelde kweekmedium de hoeveelheid uitgevoerde analyses beperken. Om deze beperkingen te bestrijden, raden we aan om verschillende replicaties per eierstok te kweken om een voldoende voorraad kweekmedium en weefsel te bieden voor histologie, assays en PCR. Heel vaak kweken we verschillende stukken van elke eierstok van één koe / vaars om meer weefsel te verkrijgen voor verdere analyse en om een verhoogd kweekmedium te verkrijgen om de cortexsecretie van hormonen / cytokines / chemokines te meten. Preantrale follikels zijn diffuser in oudere koeien eierstokken dan jongere vrouwtjes (vaarzen). Een mogelijke beperking is dus het verkrijgen van preantrale follikels op alle stukken van de ovariële cortex die zijn gekweekt. Verschillende manieren om deze beperking te verminderen, zijn om meer stukken van de ovariële cortex te verkrijgen en extra putten voor elk dier te kweken of om neutraal rood te gebruiken om follikels te visualiseren en ervoor te zorgen dat alle cortexstukken vroege preantrale follikels bevatten. Een derde beperking van de ovariële cortexcultuur is dat elke besmetting van het kweeksysteem de media en cortexstukken onbruikbaar maakt voor analyse. Verschillende manieren om een steriele omgeving te behouden, is dus het filteren van het medium dat in de cultuur wordt gebruikt. Zorg er voorafgaand aan het verwerken en snijden van stukken van de ovariële cortex voor dat de schone bank is gesteriliseerd met 70% ethanol en dat de luchtstroom minstens 30 minuten heeft gedraaid voorafgaand aan dissecties. Als u een absorberend kussen gebruikt om gemakkelijker op te ruimen(figuur 1),moet u er ook voor zorgen dat het UV-licht gedurende 30 minuten is ingeschakeld voordat u weefsel in de schone bank plaatst om de pad en de bank schoon te maken. Ten slotte moeten alle mediaveranderingen worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met voldoende luchtstroom, steriele instrumenten en veranderende pipetpunten om ervoor te zorgen dat alleen steriele tips in het medium worden ingebracht om in putten te worden geplaatst voor ovariële cortexcultuur.
Toepassing van deze techniek zal helpen bij het begrijpen van de ovariële micro-omgeving en kan beginnen met het ontrafelen van mechanismen die betrokken zijn bij vrouwelijke reproductieve aandoeningen die een veranderde folliculaire ontwikkeling met zich meebrengen. Zo blijven de etiologie van polycysteus ovariumsyndroom (PCOS) en aspecten van prematuur ovarieel falen (POF) onduidelijk. Omdat koeien mono-ovulatoir zijn, vormen ze een uitstekend model om factoren te begrijpen die de follikelprogressie en -arrestatie beïnvloeden bij andere mono-ovulatoire soorten (bijv. Mensen en niet-menselijke primaten). Bovendien kan deze ovariële cortexcultuurmethode ook gunstig zijn voor het testen van potentiële therapieën die follikel-gemedieerde aandoeningen kunnen verbeteren die resulteren in onvruchtbaarheid bij vrouwen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 aan ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants aan ASC. United States Department of Agriculture Hatch grant NEB26-202/W3112 Accession #1011127 to ASC, Hatch–NEB ANHL Accession #1002234 to ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support - COVID-19 Award voor zomerfinanciering voor CMS.
De auteurs willen graag hun waardering uitspreken voor Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE om hem te bedanken voor het verstrekken van de eierstokken in een eerdere publicatie, die vervolgens in het huidige artikel werden gebruikt als een proof of concept bij het valideren van deze techniek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
References
- Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
- Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
- Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
- McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
- Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
- Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
- Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
- Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
- Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
- Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
- Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
- Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
- Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
- Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
- Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
- Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
- Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
- Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
- Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
- Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
- Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
- Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
- Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
- Mohammed, B. T., Donadeu, F. X.
- Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).
