Summary
Se presenta el cultivo in vitro de la corteza ovárica bovina y el efecto de la dieta nutricional Stair-step sobre el microambiente ovárico. Las piezas de la corteza ovárica se cultivaron durante siete días y se evaluaron los esteroides, las citoquinas y las etapas del folículo. El tratamiento de la dieta Stair-Step había aumentado la esteroidogénesis, lo que resultó en la progresión del folículo en cultivo.
Abstract
El desarrollo del folículo desde la etapa primordial hasta la antral es un proceso dinámico dentro de la corteza ovárica, que incluye factores endocrinos y paracrinos de las células somáticas y la comunicación cúmulo célula-ovocito. Poco se sabe sobre el microambiente ovárico y cómo las citoquinas y esteroides producidos en el entorno circundante afectan la progresión o detención del folículo. El cultivo in vitro de la corteza ovárica permite que los folículos se desarrollen en un entorno normalizado que permanece soportado por el estroma adyacente. Nuestro objetivo fue determinar el efecto de la dieta nutricional Stair-Step sobre el microambiente ovárico (desarrollo del folículo, producción de esteroides y citoquinas) a través del cultivo in vitro de la corteza ovárica bovina. Para lograr esto, se retiraron piezas corticales ováricas de novillas sometidas a dos esquemas nutricionalmente desarrollados diferentes antes de la pubertad: Control (desarrollo de la nutrición tradicional) y Stair-Step (alimentación y restricción durante el desarrollo) que se cortaron en aproximadamente 0.5-1 mm3 pedazos. Estas piezas se pasaron posteriormente a través de una serie de lavados y se colocaron en un inserto de cultivo de tejidos que se coloca en un pozo que contiene el medio de cultivo de Waymouth. La corteza ovárica se cultivó durante 7 días con cambios diarios en los medios de cultivo. Se realizó un seccionamiento histológico para determinar los cambios en el estadio del folículo antes y después del cultivo para determinar los efectos de la nutrición y el impacto del cultivo sin tratamiento adicional. El medio de cultivo Cortex se agrupó durante días para medir esteroides, metabolitos esteroides y citoquinas. Hubo tendencias para el aumento de las hormonas esteroides en el microambiente ovárico que permitieron la progresión del folículo en los cultivos de corteza ovárica Stair-Step versus Control. La técnica de cultivo de la corteza ovárica permite una mejor comprensión del microambiente ovárico y cómo las alteraciones en la secreción endocrina pueden afectar la progresión y el crecimiento del folículo tanto a partir de tratamientos in vivo como in vitro. Este método de cultivo también puede resultar beneficioso para probar posibles terapias que pueden mejorar la progresión del folículo en las mujeres para promover la fertilidad.
Introduction
La corteza ovárica representa la capa externa del ovario donde se produce el desarrollo del folículo1. Los folículos primordiales, inicialmente detenidos en desarrollo, se activarán para convertirse en folículos primarios, secundarios y luego antrales o terciarios basados en entradas paracrinas y gonadotropinas1,2,3,4. Para comprender mejor los procesos fisiológicos dentro del ovario, el cultivo de tejidos se puede utilizar como un modelo in vitro, lo que permite un entorno controlado para realizar experimentos. Muchos estudios han utilizado el cultivo de tejido ovárico para la investigación en tecnología de reproducción asistida, preservación de la fertilidad y cáncer de ovario5,6,7. El cultivo de tejido ovárico también ha servido como modelo para investigar las toxinas reproductivas que dañan la salud ovárica y la etiología de trastornos reproductivos como el Síndrome de Ovario Poliquístico (SOP)8,9,10,11. Por lo tanto, este sistema de cultivo es aplicable a una amplia gama de especialidades.
En roedores, se han utilizado gónadas fetales o perinatales enteras en experimentos de biología reproductiva12,13,14,15. Sin embargo, las gónadas del ganado doméstico más grande no se pueden cultivar como órganos completos debido a su gran tamaño y posible degeneración. Por lo tanto, la corteza ovárica bovina y primate no humana se corta en trozos más pequeños16,17,18. Muchos estudios han cultivado pequeñas piezas de corteza ovárica para estudiar varios factores de crecimiento en la iniciación del folículo primordial en ganado doméstico y primates no humanos1,17,18,19. El uso del cultivo de corteza ovárica también ha demostrado la iniciación del folículo primordial en ausencia de suero para piezas corticales bovinas y primates cultivadas durante 7 días20. Yang y Fortune en 2006 trataron el medio de cultivo de corteza ovárica fetal con un rango de dosis de testosterona durante 10 días y observaron que la concentración de testosterona de 10-7 M aumentó el reclutamiento del folículo, la supervivencia y el aumento de la progresión de los folículos en etapa temprana19. En 2007, utilizando cultivos de corteza ovárica de fetos bovinos (5-8 meses de gestación), Yang y Fortune informaron un papel para el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular A (VEGFA) en la transición del folículo primario a secundario21. Además, nuestro laboratorio ha utilizado cultivos de corteza ovárica para demostrar cómo las isoformas VEGFA (angiogénicas, antiangiogénicas y una combinación) pueden regular diferentes vías de transducción de señales a través del receptor del dominio quinasa (KDR), que es el principal receptor de transducción de señales al que se une VEGFA16. Esta información permitió una mejor comprensión de cómo las diferentes isoformas de VEGFA afectan las vías de señalización para provocar la progresión o detención del folículo. En conjunto, el cultivo de piezas de corteza ovárica in vitro con diferentes esteroides o factores de crecimiento puede ser un ensayo valioso para determinar los efectos sobre los mecanismos que regulan la foliculogénesis. Del mismo modo, los animales que se desarrollan en diferentes regímenes nutricionales pueden tener microambientes ováricos alterados, lo que puede promover o inhibir la foliculogénesis que afecta la madurez reproductiva femenina. Por lo tanto, nuestro objetivo en el manuscrito actual es informar sobre la técnica de cultivo de corteza bovina y determinar si existen diferencias en los microambientes ováricos después del cultivo in vitro de la corteza bovina a partir de novillas alimentadas con dietas Control o Stair-Step recolectadas a los 13 meses de edad como se describió anteriormente16.
Por lo tanto, nuestro siguiente paso fue determinar el microambiente ovárico en estas novillas que se desarrollaron con diferentes dietas nutricionales. Evaluamos la corteza ovárica de novillas alimentadas con una dieta Stair-Step o Control. A las novillas de control se les ofreció una dieta de mantenimiento de 97,9 g/kg0,75 durante 84 días. La dieta Stair-Step se inició a los 8 meses conteniendo una dieta restringida de 67,4 g/kg0,75 durante 84 días. Después de los primeros 84 días, mientras que las novillas control continuaron recibiendo 97,9 g/kg0,75,a las novillas de carne de res Stair-Step se les ofreció 118,9 g/kg0,75 durante otros 68 días, después de lo cual fueron ovariectomizadas a los 13 meses de edad de16 años para estudiar los cambios en las etapas foliculares y la morfología antes y después del cultivo. También se analizaron las diferencias en los esteroides, metabolitos esteroides, quimiocinas y citoquinas secretadas en los medios de la corteza. Se midieron los esteroides y otros metabolitos para determinar si hubo algún efecto directo de los tratamientos realizados in vivo y/o in vitro sobre la viabilidad y productividad de los tejidos. Los cambios en el microambiente ovárico antes y después del cultivo proporcionaron una instantánea del medio endocrino y la foliculogénesis antes del cultivo y cómo el cultivo o el tratamiento durante el cultivo afecta la progresión o detención del folículo.
Los ovarios se recolectaron después de que se realizaron ovariectomías en el Centro de Investigación de Animales de Carne de los Estados Unidos (USMARC) de acuerdo con sus procedimientos IACUC de novillas de control y escalonadas a los 13 meses de edad de16años, limpiadas con lavados estériles de solución salina tampón de fosfato (PBS) con 0.1% de antibiótico para eliminar sangre y otros contaminantes, recortaron el exceso de tejido y se transportaron al laboratorio de Fisiología Reproductiva de la Universidad de Nebraska-Lincoln (UNL) UNL a 37 ° C23 . En la UNL, las piezas de la corteza ovárica se cortaron en pequeños trozos cuadrados (~ 0.5-1 mm3; Figura 1) y cultivado durante 7 días (Figura 2). La histología se realizó en las diapositivas de cultivo de la corteza antes y después del cultivo para determinar los folículos en las etapas16,24 (Figura 3 y Figura 4),y las proteínas de la matriz extracelular que pueden indicar fibrosis (Picro-Sirus Red, PSR; Figura 5). Esto permitió la determinación del efecto de los regímenes nutricionales in vivo en las etapas del folículo y permitió la comparación de 7 días de corteza ovárica en las etapas del folículo y la progresión del folículo. A lo largo del cultivo, el medio se recolectó y cambió diariamente (aproximadamente el 70% de los medios se recolectaron cada día; 250 μL / pozo) para que las hormonas / citoquinas / quimiocinas diarias puedan evaluarse o agruparse durante días para obtener concentraciones promedio. Los esteroides como la androstenediona (A4) y el estrógeno (E2) se pueden agrupar durante 3 días y evaluarse a través de radioinmunoensayo (RIA; Figura 6) y agrupados durante 4 días por animal y ensayados mediante Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento-Espectrometría de Masas (HPLC-MS)24,25 ( Tabla1). Se utilizaron matrices de citoquinas para evaluar las concentraciones de citoquinas y quimiocinas en el medio de cultivo de la corteza ovárica26 (Tabla 2). Se realizaron placas de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real para determinar la expresión génica de vías de transducción de señales específicas, como se demostró anteriormente16. Todos los marcadores de esteroides, citoquinas, etapas foliculares e histológicos proporcionan una instantánea del microambiente ovárico y pistas sobre la capacidad de ese microambiente para promover la foliculogénesis "normal" o "anormal".
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Protocol
Los ovarios se obtuvieron del U. S. Meat Animal Research Center16. Como se indicó anteriormente16,todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación de Animales de Carne de los Estados Unidos (USMARC) de acuerdo con la guía para el Cuidado y Uso de Animales Agrícolas en la Investigación y Enseñanza Agrícola. Los ovarios fueron llevados al Laboratorio Reproductivo de la Universidad de Nebraska-Lincoln, donde fueron procesados y cultivados.
1. Preparación de los medios requeridos
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Waymouth MB 752/1 medio
- Llene una botella de cultivo de tejidos de 1 L con 900 ml de agua estéril. Mientras el agua se agita suavemente en una placa de agitación, agregue gradualmente el medio en polvo. Una vez disuelto el medio en polvo, añadir 2,24 g de bicarbonato de sodio seguido de 1,25 g de albúmina sérica bovina (BSA). Use un medidor de pH y ajuste el pH a 7.25-7.35. Agregue agua estéril adicional para llevar el volumen final a 1 L.
- Pase a un gabinete de seguridad biológica y agregue sulfato de penicilina-estreptomicina a una concentración de 0.1% v / v del medio. Filtre el medio con un filtro superior de botella de 0,22 μm de porode 33,2 cm 2 500 ml.
- Vierta el medio filtrado en varios tubos cónicos de 50 ml. Añadir 0,5 ml de insulina-transferrina-selenio por cada 50 ml de medio alicitado.
- Envuelva los tubos cónicos y la botella de caldo del medio en papel de aluminio y guárdelo a 4 °C. Este medio es sensible a la luz.
NOTA: El medio Waymouth se puede almacenar hasta por 1 mes.
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Medio L-15 (LB-15) de Leibovitz
NOTA: El medio LB-15 se utiliza para limpiar el tejido en preparación para el cultivo.- Llene una botella de cultivo de tejidos de 1 L con 900 ml de agua estéril. Mientras el agua estéril se agita suavemente en una placa de agitación, agregue gradualmente el medio en polvo preparado. Use un medidor de pH y ajuste el pH a 7.25-7.35. Agregue agua estéril adicional para llevar el volumen final a 1 L.
- Pasar al gabinete de seguridad biológica. Hacer 1 L de LB-15 con 0.1% de antibiótico (ver Tabla de Materiales). Filtre el medio en dos botellas de cultivo de tejidos de 500 ml utilizando un filtro superior de botella de poro de 0,22 μm33,2 cm 2 500 ml. Envuelva las botellas en papel de aluminio ya que el medio LB-15 es sensible a la luz y guárdelo a 4 °C.
NOTA: El medio LB-15 se puede almacenar hasta por 1 mes.
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Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
- Haga PBS en el laboratorio o compre PBS estéril sin calcio ni magnesio(Tabla de materiales). Para hacer PBS en el laboratorio, comience con 800 ml de agua destilada y agréguele 8 g de cloruro de sodio (NaCl). Luego, agregue 0.2 g de cloruro de potasio (KCl), 1.44 g de fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)y 0.24 g de fosfato de potasio dibásico (KH2PO4). Ajuste el pH a ~ 7.4 y ajuste el volumen total a 1 L. Esterilice la solución en autoclave.
- Haga 1 L PBS con 0.1% de antibiótico (ver Tabla de Materiales)mientras está en un gabinete de seguridad biológica.
2. Protocolo de cultivo cortical ovárico
NOTA: Los ovarios se obtuvieron de novillas USMARC nacidas en primavera a los 13 meses de edad. Los ovarios se enjuagaron a fondo, y toda la sangre y otros líquidos se extrajeron con PBS que contenía antibiótico (0,1%) y se transportaron a 37 °C23 al Laboratorio de Reproducción UNL de la Universidad de Nebraska-Lincoln (a 1,5 h de distancia). (Para comentarios sobre la temperatura de los ovarios durante el transporte, consulte discusión)
- Preparar el tejido ovárico en un banco limpio (Figura 1).
- Desinfecte el banco limpio con etanol al 70%. Coloque una almohadilla absorbente fresca en la mesa de trabajo. Asegúrese de que el soplador de banco limpio se encienda media hora antes de la disección junto con la luz UV para esterilizar cualquier cosa en el banco limpio, incluida la almohadilla absorbente y asegúrese de que se use el EPP adecuado.
- Coloque las placas de Petri (60 x 15 mm) para lavados de pañuelos. Se requieren tres placas de Petri para el lavado de PBS, tres para PBS con antibióticos y tres para lavados de LB-15. Se utilizará una placa de Petri adicional que contiene LB-15 con tapa acompañante para la colocación final de las piezas después del lavado.
- Llene cada placa de Petri con aproximadamente 10 ml de fluidos apropiados, ya sea PBS o LB-15.
Figura 1: Disposición de las placas para lavar las piezas de ovario y corteza en el banco limpio. (A) PBS utilizado para lavar el ovario a medida que se eliminan las secciones de la corteza. (B) PBS con lavados antibióticos por los que se mueven las piezas de la corteza. (C) Las piezas de corteza ovárica se lavan cuatro veces en LB-15 antes de pasar al gabinete de bioseguridad para el lavado final en LB-15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Retire el medio Waymouth y LB-15 preparado del refrigerador y caliente a temperatura ambiente.
- Autoclave todas las herramientas para asegurar la esterilización antes de su uso.
- Mantenga los ovarios a 37 °C hasta que la corteza ovárica esté lista para ser recolectada.
- Usando fórceps con mandíbulas dentadas, recoja el ovario y lávese bien en la primera placa de Petri llena de PBS. Transfiera el ovario al segundo lavado de PBS y limpie a fondo una vez más.
NOTA: El ovario permanecerá en el segundo lavado de PBS mientras se retiran las tiras corticales ováricas. - Usando pinzas de mandíbula dentadas, asegure el ovario y corte por la mitad. En este momento, la corteza ovárica se separará de la médula. Usando una regla, asegúrese de que no se extraiga más de 1-2 mm de profundidad de la superficie del ovario lejos de la médula16. Retire las secciones transversales de la corteza ovárica de la médula, corte de 3 a 4 tiras delgadas de corteza ovárica(Figura 2)con un bisturí (hoja de bisturí # 11; mango # 3) y coloque las tiras en la tercera placa de Petri llena de PBS.
NOTA: En este momento, se puede recolectar tejido cortical ovárico adicional para la extracción de ARN o fijarlo y recolectarlo para la histología de piezas iniciales de corteza no cultivadas. Al eliminar tiras de corteza ovárica, evite las áreas con folículos antrales visibles o cuerpos lúteos. Además, evite la recolección de tejido medular. La histología de la médula es muy diferente como se mostró anteriormente16. Si la corteza ovárica no se corta a más de 1-2 mm de profundidad, entonces no se debe obtener la médula. La histología distinta permite puntos de referencia entre la corteza y la médula. - Corte las tiras de la corteza ovárica en el tercer lavado de PBS en trozos pequeños y cuadrados (~ 0.5–1 mm3) con una cuchilla de bisturí # 21. Use una regla debajo de las placas de Petri para asegurarse de que las piezas sean de tamaño y grosor similares para hacer piezas consistentes de corteza ovárica. Use fórceps para asegurar las tiras mientras corta las piezas con un bisturí.
NOTA: El número de piezas de tejido cortadas depende del experimento. Cuatro piezas de corteza ovárica es la cantidad mínima de tejido necesaria para el cultivo. Otros métodos para garantizar una longitud y profundidad adecuadas incluyen el uso de cortadoras especiales26 o piezas de plástico precortadas como plantillas27. - Lave las piezas corticales ováricas a través de los tres PBS con placas de Petri llenas de antibióticos. Use pinzas de punta curva para mover piezas entre lavados.
- Mueva las piezas de la corteza a través de la serie de lavados LB-15 y colóquelas en la placa de Petri final llena de LB-15. Etiquete la tapa con identificación del animal y el lado del ovario (izquierda o derecha).
NOTA: Sumerja completamente las piezas de la corteza ovárica en cada lavado para una limpieza a fondo. - Recolecte cuatro piezas de corteza ovárica por ovario y arregle para la histología del día cero. Las piezas adicionales también se pueden congelar por flash para el ARN. Las piezas de tejido restantes se utilizarán para el cultivo. Limpie las herramientas de disección con etanol al 70% después de cada recolección de tejido.
- Prepare un gabinete de seguridad biológica para el lavado final de tejidos y la preparación de cultivos. Desinfecte los suministros con etanol al 70% antes de colocarlos en el gabinete de seguridad biológica. Utilice la técnica aséptica cuando trabaje en el gabinete de seguridad biológica.
- Mueva toda la corteza ovárica destinada al cultivo al gabinete de seguridad biológica y lávela una vez más en una placa de Petri llena de LB-15.
- En una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos, pipetee 350 μL de medio Waymouth por pozo.
- Coloque las inserciones de cultivo sin recubrimiento en cada pozo usando fórceps. Asegúrese de que no se formen burbujas debajo de la base del inserto, ya que esto provocaría que el tejido se seque. El medio debe tocar las inserciones para permitir que el medio sea absorbido y rodee las piezas de la corteza ovárica.
- Coloque cuidadosamente cuatro piezas de corteza ovárica en la malla de cada inserto (Figura 2). Los fórceps pueden perforar la malla si las piezas de tejido no están delicadamente colocadas. Las piezas de tejido no deben tocarse entre sí ni con el lado del inserto.
- Incubar el tejido a 37ºCcon un 5% de CO216.
NOTA: Otros han utilizado 38.8 °C28. Sin embargo, no se ha observado ninguna diferencia en la integridad del tejido ni en la capacidad de los folículos para progresar en el tejido a 37ºCni tampoco lo han hecho otros39,30. Por lo tanto, en este punto, cualquiera de estas temperaturas debería ser propicia para el éxito del experimento. Otros han utilizado 400 μL de medio. Cualquiera de las cantidades está bien siempre que una sea consistente, y el tejido está parcialmente sumergido, lo que permite una tensión superficial adecuada para permitir la hidratación del tejido (medios que rodean las piezas de la corteza ovárica). Llene los pozos vacíos con 500 μL de agua estéril para ayudar a reducir la evaporación de otros pozos.
Figura 2: Piezas de corteza ovárica y placa de cultivo. (A) Una tira ovárica que se corta de la corteza del ovario. (B) Regla y pieza de corteza que se muestran una al lado de la otra. (C) Cuatro piezas de corteza (~0.5-1 mm3) que descansan sobre el inserto en el medio de cultivo en la placa. (D) Levantar el inserto para recoger el medio de cultivo del pozo. Recolectar y reemplazar todo el medio de cultivo diariamente (250 μL) para mantener un pH adecuado.Aproximadamente 250 μL se obtienen de cada pozo cada día (aproximadamente el 70% del medio de cultivo inicial). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Colección de medios
- Cambie el medio de cultivo de la corteza ovárica diariamente durante 7 días. Los cambios de medio deben estar lo más cerca posible de 24 h de distancia para evitar grandes cambios de pH y color en el medio. Waymouth caliente medio a 37 °C antes del cambio medio. Se obtienen aproximadamente 250 μL de cada pozo cada día (aproximadamente el 70% del medio de cultivo inicial).
- Durante los cambios medios, use fórceps para levantar suavemente el inserto del pozo. Recoger el medio Waymouth cultivado en tubos de 0,5 ml (aproximadamente 250 μL/día). Vuelva a colocar el inserto en el pozo y agregue 350 μL de medio de cultivo fresco dispensando el medio entre el lado del inserto y el pozo.
NOTA: Cambie la mayoría de los medios diariamente para obtener suficientes medios para medir todos los esteroides, citoquinas y quimiocinas necesarias para determinar el microambiente ovárico. Además, los cambios diarios en el medio son importantes para prevenir grandes cambios de pH (indicados por el cambio de color) en el medio. Se retuvieron gotas de medio que rodeaban las piezas de la corteza ovárica para garantizar que las piezas permanecieran húmedas. No se observaron problemas con el tejido cultivado debido a la variación del 70% de los medios. - Almacene el medio recolectado del cultivo de tejidos a -20 °C.
4. Procesamiento de imágenes y posterior
- Después de 7 días de cultivo a 37 °C con 5% de CO2,obtenga imágenes de las piezas de la corteza ovárica utilizando un microscopio de disección con una cámara adjunta y un programa de software de imágenes por computadora.
NOTA: Una habitación oscura suele ser la mejor para lograr la mejor calidad de imagen para la obtención de imágenes. - Después de la obtención de imágenes, fije dos piezas de corteza ovárica por pozo en Bouins para histología y congele dos piezas de corteza ovárica en nitrógeno líquido para obtener ARN para el ADNc. Repita este paso para todos los pozos con tejido. Recoger el medio a partir del día 7 y almacenar a -20ºC.
- Deje que las piezas de la corteza ovárica permanezcan sumergidas en Bouins (ácido picrico 750 ml, ácido acético glacial 50 ml y 37%-40% formalina 250 ml) durante aproximadamente 1,5 h antes de lavarse con etanol al 70% tres veces. El tejido permanecerá en etanol al 70% y se eliminará diariamente hasta que la solución ya no sea amarilla.
NOTA: Se pueden usar fijadores que no sean Bouins, así como paraformaldehído. En esta experiencia se utiliza Bouins ya que es el fijador para lograr una morfología óptima. Si se requiere más tejido para otros análisis, se pueden obtener pocillos adicionales de medios y piezas de corteza ovárica de cada animal.
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Representative Results
Este procedimiento de cultivo de corteza bovina se puede utilizar para determinar una amplia variedad de datos hormonales, citoquinas e histológicos de pequeñas piezas del ovario. La tinción, como la hematoxilina y la eosina (H&E), se puede utilizar para determinar la morfología ovárica a través de la estadificación del folículo16,23,31 ( Figura3). Brevemente, los folículos se clasificaron como primordiales, que es un ovocito rodeado por una sola capa de células escamosas de la pregranulosa (0); folículo de transición o primario temprano, que es un ovocito rodeado de células pregranulosas en su mayoría escamosas y algunas células de la granulosa cuboidal (1); folículo primario, que es un ovocito rodeado por 1-1.5 capas de células de la granulosa cuboidal (2); folículo secundario, que es un ovocito rodeado por dos o más células de la granulosa cuboidal (3); folículo antral, que no mide más de 1 mm de diámetro y está rodeado por dos o más capas de células de la granulosa que contienen un antro distinto (4)16,23 ( Figura3). La estadificación del folículo se puede realizar en la corteza ovárica fijada antes y después del cultivo para evaluar la foliculogénesis(Figura 4). Tomamos tres imágenes por diapositiva de tres diapositivas diferentes teñidas con H&E. Luego, los folículos fueron estadificados y contados por tres individuos y promediados para determinar el número de folículos en cada etapa16,23. El área del campo de visión para una imagen (tres por diapositiva) con un aumento de 400x es de 0.4mm2. Por lo tanto, el 30% del área de las piezas de la corteza ovárica se contaron para determinar las etapas del folículo. El número inicial defolículos (antes del cultivo) (Figura 4A) se utiliza para normalizar los folículos contados después del cultivo (Figura 4B).
Además, las diferencias en la morfología determinadas por la deposición de colágeno (tinción de Picro Sirus Red) pueden indicar fibrosis en la corteza ovárica de las novillas Stair Step o Control(Figura 5). La recolección diaria de medio de cultivo se puede agrupar durante 3 días para evaluar la producción variada de hormonas esteroides por RIA (utilizando una muestra de medio de 200 μL por animal; Figura 6) o metabolitos esteroides utilizando espectrometría de masas por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC-MS; muestra mediana de 220 μL agrupada durante 4 días por animal; Tabla 1) y producción de citoquinas (Tabla 2). Por lo tanto, se pueden requerir varias réplicas de un animal para garantizar suficiente medio de corteza para realizar todos los ensayos deseados.
Debido a que las novillas Escalonadas han aumentado los folículos primordiales al inicio del cultivo esperamos que estos progresen en cultivo y obtengan un mayor número de folículos secundarios, lo que observamos en los resultados. Además, debido al aumento de los folículos secundarios, esperaríamos mayores concentraciones de esteroides. Vimos tendencia a aumentos en andrógenos, metabolitos glucocorticoides y metabolitos de progesterona, lo que apoyaría esto en el manuscrito actual. Nuestro laboratorio también ha evaluado los efectos de diferentes isoformas de VEGFA sobre la progresión del folículo, la esteroidogénesis y la activación de diferentes moléculas de transducción de señales en el KDR (también conocido como Receptor 2 del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular; VEGFR2) utilizando placas de matriz de transducción deseñales 16. Para reducir la variación animal, utilizamos 4-6 animales por tratamiento y para otros experimentos dependiendo del análisis de potencia y la variabilidad hemos utilizado hasta 11.
La repetibilidad de los resultados del cultivo de corteza ovárica bovina es la más afectada por la contaminación de las piezas de la corteza ovárica. Además, pueden ocurrir resultados negativos o inferiores si el medio no se cambia regularmente dentro de un período de 24 horas. El medio cuando se agrega originalmente es de color rosa, pero cuando se recolecta el medio y el color parece ser naranja o amarillo brillante, esto podría indicar un cambio en el pH que podría ser perjudicial para el tejido. Además, las piezas de tejido que se cortan demasiado grandes pueden desarrollar degeneración en el medio que no se observaría hasta la seccionamiento de tejido para histología. Esta degeneración limitará el uso del tejido para el análisis. Los datos presentados en este trabajo han sido analizados mediante pruebas no paramétricas y un análisis de modelo lineal general en un programa de software estadístico. El número de folículos primordiales, primarios, secundarios y antrales por sección antes y después del cultivo se analizó utilizando un modelo mixto lineal generalizado. La significación se determinó a P < 0,05 y se informó una tendencia a 0,14 ≤ P ≥ 0,05.
Figura 3: Tinción de hematoxilina y eosina para la estadificación del folículo de la corteza ovárica. Las diferentes etapas de los folículos se indican mediante flechas. (A) Folículos primordiales (etapa 0); (B) Folículos primarios tempranos (etapa 1); (C) Folículos primarios (etapa 2); (D) Folículo secundario (estadio 3); (E) Folículo antral (estadio 4). El área del campo de visión para una imagen con un aumento de 400x es de 0.4 mm2. Contamos el 30% del área de las piezas de la corteza ovárica para determinar las etapas del folículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Número medio de folículos en diferentes estadios foliculares en novillas control (n=6) y escalonada (n=6). (A) Antes del cultivo P primordial = 0,001, P primaria temprana = 0,12, p primaria = 0,31, p secundaria = 0,22. (B) Después de 7 días de cultivo, P Primordial = 0.37, P Primario Temprano = 0.84, P Primario = 0.69, P Secundario = 0.02. Las barras de error son representativas de SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Colágeno (Picro Sirius Red; PSR) tinción en la corteza ovárica. PSR en (A) Novillas de control y escalones a partir del día 0 y el día 7. (B) Gráfico que compara el área promedio de tinción PSR positiva por campo de corteza ovárica (píxeles/μm2) entre las novillas Control (n = 4) y Stair-Step (n = 4). Las barras de error son representativas de SEM. El área del campo de visión para una imagen con un aumento de 400x es de 0.4mm2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:Concentraciones de A4 y E2. (A) Concentración de A4 y (B) concentración de E2 agrupada durante 3 días de cultivo en medios de corteza ovárica de novillas de Control y Escalonado medido por RIA. n = 4 para cada grupo. Las barras de error son representativas de SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Hormonas | Control | Escalera-Paso | Valor P | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| ng/mL | Significar | ± SEM | Significar | ± SEM | ||
| DOC | 0.33 | 0.28 | 0.72 | 0.48 | 0.15 | |
| POSADA | 0.61 | 0.60 | 4.93 | 3.99 | 0.08 | |
| CORT | 0.003 | 0.003 | 0.01 | 0.01 | 0.85 | |
| 17OHP | 0.59 | 0.53 | 1.88 | 0.99 | 0.08 | |
| A4 | 1.46 | 1.43 | 5.74 | 3.27 | 0.08 | |
| UN | 0.15 | 0.09 | 0.54 | 0.32 | 0.08 | |
| DHEAS | 4.50 | 2.60 | 7.59 | 0.85 | 0.56 | |
| E2 | 0.05 | 0.05 | 0.13 | 0.08 | 0.32 | |
| P4 | 5.05 | 2.78 | 6.52 | 1.66 | 0.39 | |
| T | 0.33 | 0.33 | 1.33 | 0.96 | 0.14 | |
| DHT | 0.07 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.09 | |
| DOC - 11-Desoxicorticosterona, DCI - 11-Desoxicortisol, CORT - Corticosterona, 17OHP - 17-Hidroxiprogesterona, A4- Androstenediona, AN - Androsterona, DHEAS - sulfato de dehidroepiandrosterona, E2 - Estradiol, P4 - Progesterona, T - Testosterona, DHT - Dihidrotestosterona | ||||||
Tabla 1: Metabolitos esteroides y esteroides medidos en medio de cultivo de corteza ovárica a partir de un pozo para cada animal agrupado durante 4 días de cultivo. Los datos presentados con media ± SEM. El azul indica P < 0,1 y tiene una tendencia a ser diferente.
| Citoquinas | Control | Escalera-Paso | Valor P | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| pg/ml | Significar | ± SEM | Significar | ± SEM | ||
| ANG1 | 27.29 | 11.71 | 63.66 | 25.06 | 0.39 | |
| CD40L | 4527.01 | 2986.34 | 3537.59 | 3537.59 | 0.74 | |
| DCN (en inglés) | 1307.68 | 320.87 | 996.54 | 282.96 | 0.77 | |
| INFβ | 0.36 | 0.36 | 0.002 | 0.002 | 0.85 | |
| IL18 | 0.00 | 0.00 | 1832.89 | 1265.33 | 0.13 | |
| LIF | 97.45 | 88.12 | 337.58 | 231.25 | 0.54 | |
| RANTES | 698.06 | 322.59 | 1254.13 | 811.19 | 0.56 | |
| INFγ | 4.49 | 1.37 | 3.68 | 0.65 | 0.77 | |
| IL13 | 501.21 | 285.07 | 810.81 | 159.67 | 0.25 | |
| IL21 | 24.38 | 9.51 | 18.52 | 6.17 | 0.56 | |
| IL1F5 | 5.07 | 3.85 | 5.40 | 1.70 | 0.56 | |
| TNFα | 61.45 | 35.00 | 44.91 | 13.41 | 0.77 | |
| ANG1 – Angiopoyetina 1, CD40L – Ligando CD40, DCN – Decorina, IFNβ – Interferón Beta 1, IL18 – Interleucina-18, LIF – Fábrica inhibidora de la leucemia, RANTES – Regulado en la activación, Célula T normal expresada y secretada, IFNγ – Interferón Gamma, IL13 – Interleucina 13, IL21 – Interleucina 21, IL1F5 – Interleucina 1 miembro de la familia 5, TNFα – Factor de necrosis tumoral alfa | ||||||
Tabla 2: Citoquinas y quimiocinas medidas en medio de cultivo de corteza ovárica a partir de un pozo para cada animal agrupado durante 4 días de cultivo. Los datos presentados con media ± SEM. El azul indica P < 0.1-0.14 y tiene una tendencia a ser diferente.
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Discussion
El beneficio del cultivo in vitro de corteza ovárica, como se describe en este manuscrito, es que los folículos se desarrollan en un ambiente normalizado con estroma adyacente que rodea los folículos. Las células somáticas y los ovocitos permanecen intactos, y existe una comunicación apropiada de célula a célula como modelo in vivo. Nuestro laboratorio ha encontrado que un sistema de cultivo de 7 días proporciona datos representativos de foliculogénesis y esteroidogénesis para el tratamiento de la corteza ovárica. Otros protocolos de cultivo de tejido ovárico tienen períodos de cultivo relativamente cortos de 1-6 días7,32 o períodos de cultivo largos de 10-15 días5,6,10. Sin embargo, hemos observado que el cultivo durante más de 7 días conduce a la degradación de los tejidos, la reducción de la esteroidogénesis y, potencialmente, una mayor probabilidad de contaminación (datos no mostrados). El cultivo de la corteza ovárica después de la ovariectomía también proporciona una visión directa del microambiente ovárico dentro de ese animal en particular. Esto es de interés para nuestro laboratorio de investigación, ya que hemos identificado cambios en el desarrollo folicular después de que se impusieran regímenes nutricionales después del destete y condujeran a la pubertad en las novillas16.
El desarrollo del folículo desde la etapa primordial hasta la antral es un proceso dinámico dentro de la corteza ovárica, que incluye factores endocrinos y paracrinos de las células somáticas y la comunicación cúmulo célula-ovocito33. El cultivo de tejidos, como el cultivo de corteza ovárica, ofrece un entorno controlado para investigar el papel mecanicista de estos factores y el entorno endocrino en el microambiente ovárico. Los ovarios se pueden recolectar de animales que han pasado por un tratamiento in vivo o están genéticamente alterados para determinar los efectos sobre la progresión del folículo.
Los ovarios también se pueden recolectar de un matadero local (a 1 h de distancia) y transportarse a 37 ° C en un termo que contenga PBS con antibiótico. Si el transporte es más largo (por ejemplo, durante la noche), los ovarios se envían o transportan en hielo22. Se han observado resultados similares si el transporte de ovarios ocurre en hielo durante la noche o a 37 ° C con transporte a corto plazo en un termo. El transporte de 37 °C con termo permite la recolección de ovocitos de este tejido para la maduración in vitro (IVM) o la fertilización in vitro (FIV)34. Otros estudios han encontrado que el transporte de tejido a temperaturas entre 2-8 ° C también se ha utilizado para la preservación de la fertilidad en tejidos reproductivos35,36,37. Sin embargo, otros estudios han utilizado ovarios transportados a 34-37 °C y en hielo y no han observado diferencias en el cultivo de tejidos bovinos38.
Si el tejido de cultivo de la corteza ovárica no se ve saludable después del cultivo, esto podría deberse a que las piezas de la corteza ovárica son demasiado grandes. Un paso crítico en el protocolo es asegurarse de que las piezas de la corteza ovárica no sean más grandes que 0.5-1 mm3. Utilizamos una regla para medir las piezas y usamos una escala dentro del microscopio de disección para determinar el tamaño de las piezas de la corteza ovárica(Figura 2C). Otros utilizan equipos específicos (ver Tabla de Materiales)para espesores y longitud/anchura uniformes, respectivamente26. Si estas piezas de equipo no están disponibles, entonces los cuadrados de plástico se pueden usar como plantilla para obtener un grosor uniforme y garantizar piezas de tamaño similar27.
Para asegurarnos de cortar trozos que son solo de la corteza y no tienen médula después de lavar el ovario lo colocamos en el plato de 60 mm y lo cortamos por la mitad. La corteza y la médula son muy diferentes histológicamente como se vio anteriormente en Abedal-Majed, 202016. Cada mitad del ovario se filetea con la cuchilla para garantizar que solo se elimine la corteza del ovario y que quede la médula. Si los individuos están empezando a perfeccionar esta técnica de corte, también pueden usar rojo neutro para ver de cerca la histología de cada mitad del ovario39. Esto permitirá el desarrollo de puntos de referencia a medida que su técnica de corte, mejore. Además, pueden utilizar instrumentos que pueden cortar espesores uniformes (ver Tabla de Materiales)como se indicó anteriormente26,27.
El medio de la corteza ovárica debe ser de color rosa claro. Hemos observado que el pH del medio de cultivo de la corteza ovárica cambia rápidamente en algunos animales, por lo tanto, la mayoría (70%) del medio de la corteza ovárica debe cambiarse cada 24 h para promover la salud del cultivo. En trabajos anteriores se ha hablado de cambiar la mitad del medio diario40. Nuestra razón para cambiar la mayoría de los medios en el manuscrito actual fue promover la salud de las culturas de la corteza ovárica. Quedan gotas que rodean las piezas de la corteza ovárica y no hubo efectos negativos del cambio de medio en el cultivo. Además, esto nos permitió analizar más hormonas, citoquinas y quimiocinas para cada animal para generar información sobre el microambiente ovárico.
Este protocolo de cultivo de tejidos ofrece varias ventajas. El cultivo de la corteza ovárica permite que los folículos se desarrollen en un entorno similar al in vivo. Los folículos permanecen apoyados por el estroma circundante y la comunicación entre las células somáticas y el cúmulo célula-ovocito continúa. El uso de insertos de pozos de cultivo permite que la corteza ovárica descanse sobre el medio de cultivo sin sumergirse, evitando así que el tejido se una a la base plástica de la placa del pozo. Otra ventaja es la ventana de cultura. La ventana de cultivo de 7 días descrita en el protocolo proporciona datos representativos de hormonas y factores de crecimiento. Además, la foliculogénesis continúa progresando en este entorno in vitro ya que hemos contabilizado menos folículos en etapa temprana (primordial) y más folículos en etapa tardía (secundario, antral) después de 7 días de cultivo16. Los protocolos previos de cultivo de tejido ovárico han utilizado períodos de cultivo relativamente cortos (1-6 días7,32)o largos (10-15 días5,6,10). Se han utilizado ventanas de cultivo más cortas para investigar la activación del folículo primordial en la corteza ovárica bovina fetal41. En primates no humanos, se utilizó un período de cultivo de 20 días para evaluar la capacidad de los folículos primordiales de los primates para sobrevivir e iniciar el crecimiento in vitro en medio libre de suero18. Sin embargo, hemos observado un aumento de la degradación tisular al cultivar la corteza ovárica bovina durante más de 7 días en medio libre de suero. También hemos determinado en el análisis de muestras diarias que las concentraciones de esteroides disminuyen después de 4 días de cultivo (datos no mostrados). Una ventana de cultivo más larga también puede aumentar la posibilidad de contaminación en cultivos de corteza ovárica. Por lo tanto, los efectos principales se pueden medir por 7 días de cultivo15 y el tiempo de cultivo puede depender del modelo animal y la cuestión científica abordada.
Si bien existen varias ventajas de este protocolo de corteza ovárica bovina, existen algunas limitaciones. Una limitación es la cantidad de tejido cortical ovárico y el volumen del medio de cultivo recogido durante el cultivo cortical ovárico. El pequeño tamaño de las piezas de la corteza ovárica permite que un número limitado de secciones de tejido se utilicen para fines de tinción (H & E, inmunofluorescencia, etc.). Para realizar RT-PCR se necesitan un mínimo de cuatro piezas de corteza16. Además, el bajo volumen de medio de cultivo recogido puede limitar la cantidad de análisis realizados. Para combatir estas limitaciones, sugerimos cultivar varias réplicas por ovario para proporcionar un suministro adecuado de medio de cultivo y tejido para histología, ensayos y PCR. Muy a menudo cultivamos varias piezas de cada ovario de una vaca / novilla para obtener más tejido para un análisis adicional y para obtener un mayor medio de cultivo para medir la secreción de la corteza de hormonas / citoquinas / quimiocinas. Los folículos preantrales son más difusos en los ovarios de vaca más viejos que en las hembras más jóvenes (novillas). Por lo tanto, una limitación potencial es la obtención de folículos preantrales en todas las piezas de la corteza ovárica que se cultivan. Varias formas de mitigar esta limitación es obtener más piezas de corteza ovárica y cultivar pocillos adicionales para cada animal o usar rojo neutro para visualizar los folículos y garantizar que todas las piezas de corteza contengan folículos preantrales tempranos. Una tercera limitación del cultivo de la corteza ovárica es que cualquier contaminación del sistema de cultivo hace que los medios y las piezas de la corteza sean inutilizables para el análisis. Por lo tanto, varias formas de mantener un ambiente estéril es filtrar el medio utilizado en el cultivo. Antes de procesar y cortar las piezas de la corteza ovárica, asegúrese de que el banco limpio haya sido esterilizado con etanol al 70% y que el flujo de aire haya estado funcionando durante al menos 30 minutos antes de las disecciones. Además, si usa una almohadilla absorbente para facilitar la limpieza(Figura 1),asegúrese de que la luz UV se haya encendido durante 30 minutos antes de colocar cualquier pañuelo en el banco limpio para esterilizar la almohadilla y el banco limpio. Finalmente, todos los cambios de medios deben realizarse en un gabinete de bioseguridad con flujo de aire adecuado, instrumentos estériles y puntas de pipeta cambiantes para garantizar que solo se introduzcan puntas estériles en el medio para colocarlas en pozos para el cultivo de corteza ovárica.
La aplicación de esta técnica ayudará a comprender el microambiente ovárico y puede comenzar a desentrañar los mecanismos involucrados en los trastornos reproductivos femeninos que implican un desarrollo folicular alterado. Por ejemplo, la etiología del síndrome de ovario poliquístico (SOP) y los aspectos de la insuficiencia ovárica prematura (FOP) siguen sin estar claros. Dado que las vacas son monoovulatorias, son un excelente modelo para comprender los factores que afectan la progresión y detención del folículo en otras especies monoovulatorias (por ejemplo, humanos y primates no humanos). Además, este método de cultivo de corteza ovárica también puede resultar beneficioso para probar posibles terapias que pueden mejorar los trastornos mediados por el folículo que resultan en infertilidad en las mujeres.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura 2013-67015-20965 a ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants to ASC. Subvención neb26-202/W3112 adhesión del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos #1011127 a ASC, Hatch–NEB ANHL Adhesión #1002234 a ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – Premio COVID-19 para la financiación de verano para CMS.
Los autores desean extender su agradecimiento al Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE para agradecerle por proporcionar los ovarios en una publicación anterior, que luego se utilizaron en el artículo actual como prueba de concepto para validar esta técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
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