Summary
In vitro kultur af kvæg ovarie cortex og effekten af ernæringsmæssige trappe-trin kost på æggestokkene mikromiljø præsenteres. Ovarie cortex stykker blev kultiveret i syv dage og steroider, cytokiner, og follikel faser blev evalueret. Den Stair-Step kost behandling havde øget steroidogenese resulterer i follikel progression i kultur.
Abstract
Follikel udvikling fra ur til antral fase er en dynamisk proces inden for æggestokkene cortex, som omfatter endokrine og parakrine faktorer fra somatiske celler og cumulus celle-oocyt kommunikation. Lidt er kendt om æggestokkene mikromiljø og hvordan kytokiner og steroider produceret i det omgivende miljø påvirke follikel progression eller anholdelse. In vitro kultur æggestokkene cortex gør det muligt follikler til at udvikle sig i et normaliseret miljø, der forbliver understøttet af tilstødende stroma. Vores mål var at bestemme effekten af ernæringsmæssige Stair-Step kost på æggestokkene mikromiljø (follikel udvikling, steroid, og cytokin produktion) gennem in vitro kultur af kvæg ovarie cortex. For at opnå dette blev æggestokkene kortikale stykker fjernet fra kvier, der gennemgår to forskellige ernæringsmæssigt udviklede ordninger før puberteten: Kontrol (traditionel ernæringsudvikling) og Stair-Step (fodring og begrænsning under udvikling), der blev skåret i ca. 0,5-1 mm3 stykker. Disse stykker blev efterfølgende passeret gennem en række vasker og placeret på en vævskulturindsats, der er sat i et godt indeholdende Waymouths kulturmedium. Ovarie cortex blev kultiveret i 7 dage med daglige kulturmedier ændringer. Histologisk sektion blev udført for at bestemme follikel fase ændringer før og efter kulturen til at bestemme virkningerne af ernæring og virkningen af kultur uden yderligere behandling. Cortex kultur medium blev samlet over dage til at måle steroider, steroid metabolitter, og cytokiner. Der var tendenser til øget steroid hormoner i æggestokkene mikromiljø, der tillod follikel progression i Stair-Step versus Control æggestokkene cortex kulturer. Den ovarie cortex kultur teknik giver mulighed for en bedre forståelse af æggestokkene mikromiljø, og hvordan ændringer i endokrine sekretion kan påvirke follikel progression og vækst fra både in vivo og in vitro behandlinger. Denne kultur metode kan også vise sig gavnligt for at teste potentielle terapeutiske, der kan forbedre follikel progression hos kvinder til at fremme fertiliteten.
Introduction
Æggestokken cortex repræsenterer det ydre lag af æggestokken, hvor follikel udvikling forekommer1. Ursække, der oprindeligt blev arresteret under udvikling, vil blive aktiveret til at blive primære, sekundære og derefter antrale eller tertiære follikler baseret på parakrine og gonadotropinin input1,2,3,4. For bedre at forstå fysiologiske processer i æggestokken kan vævskultur bruges som en in vitro-model, hvilket giver mulighed for et kontrolleret miljø til at udføre eksperimenter. Mange undersøgelser har udnyttet æggestokkene væv kultur for forskning i assisteret reproduktiv teknologi, fertilitet bevarelse, og kræft i æggestokkene5,6,7. Ovarievævskultur har også fungeret som model for undersøgelse af reproduktive toksiner, der skader æggestokkenes sundhed og ætiologien af reproduktive lidelser som polycystisk ovarie syndrom (PCOS)8,9,10,11. Således gælder dette kultursystem for en bred vifte af specialiteter.
Hos gnavere er hele foster- eller perinatale gonader blevet anvendt i reproduktive biologiforsøg12,13,14,15. Gonader fra større husdyr kan imidlertid ikke dyrkes som hele organer på grund af deres store størrelse og potentielle degeneration. Derfor skæres kvæg og ikke-human primat ovarie cortex i mindre stykker16,17,18. Mange undersøgelser har kultiveret små ovarie cortex stykker til at studere forskellige vækstfaktor (r) i ursækken indledning i husdyr og ikke-menneskelige primater1,17,18,19. Brugen af ovarie cortexkultur har også vist primordial follikelinitiering i mangel af serum til kvæg og primat kortikale stykker, der er kultiveret i 7 dage20. Yang og Fortune i 2006 behandlet føtal ovarie cortex kultur medium med en række testosteron doser over 10 dage og bemærkede, at 10-7 M koncentrationen af testosteron øget follikel rekruttering, overlevelse, og øget progression af tidlige fase follikler19. I 2007, ved hjælp af æggestokkene cortex kulturer fra kvæg fostre (5-8 måneders svangerskab), Yang og Fortune rapporterede en rolle for Vaskulære Endothelial Growth Factor A (VEGFA) i den primære til sekundære follikel overgang21. Desuden har vores laboratorium udnyttet æggestokkene cortex kulturer til at demonstrere, hvordan VEGFA isoforme (angiogen, antiangiogen, og en kombination) kan regulere forskellige signal transduktion veje gennem Kinase domæne receptor (KDR), som er den vigtigste signal transduktion receptor, VEGFA binder16. Disse oplysninger gav mulighed for en bedre forståelse af, hvordan forskellige VEGFA-isoformer påvirker signalvejene til at fremkalde follikel progression eller anholdelse. Samlet set, dyrkning af æggestokkene cortex stykker in vitro med forskellige steroider eller vækstfaktorer kan være en værdifuld analyse til at bestemme virkningerne på mekanismer, der regulerer folliculogenese. På samme måde kan dyr, der er udviklet på forskellige ernæringsmæssige regimer, have ændret ovariemikrvironments, som kan fremme eller hæmme folliculogenese, der påvirker kvinders reproduktive modenhed. Således er vores mål i det nuværende manuskript at rapportere kvæg cortex kultur teknik og afgøre, om der er forskelle i æggestokkene mikromiljø efter in vitro kultur af kvæg cortex fra kvier fodret enten Control eller Stair-Step kost indsamlet på 13 måneder som beskrevet tidligere16.
Derfor var vores næste skridt at bestemme det æggestokkene mikromiljø i disse kvier, der blev udviklet med forskellige ernæringsmæssige kostvaner. Vi evaluerede æggestokkene cortex fra kvier fodret med enten en Stair-Step eller Control kost. Kontrol kvier blev tilbudt en vedligeholdelse kost på 97,9 g / kg0,75 i 84 dage. Stair-Step-diæten blev indledt efter 8 måneder, der indeholdt en begrænset fodret kost på 67,4 g / kg0,75 i 84 dage. Efter de første 84 dage, mens Control kvier fortsatte med at modtage 97,9 g / kg0,75, blev Stair-Step oksekød kvier tilbudt 118,9 g / kg0,75 i yderligere 68 dage, hvorefter de blev ovariektomi ved 13 måneder16 for at studere ændringer i follikulære stadier og morfologi før og efter kultur. Vi har også analyseret for forskelle i steroider, steroid metabolitter, chemokines, og cytokiner udskilles i cortex medier. Steroider og andre metabolitter blev målt for at afgøre, om der var nogen direkte virkninger fra behandlinger udført in vivo og/eller in vitro på væv levedygtighed og produktivitet. Ændringer i æggestokkene mikromiljø før og efter kultur gav et øjebliksbillede af det endokrine miljø og folliculogenese forud for kultur, og hvordan kultur eller behandling under kultur påvirker follikel progression eller anholdelse.
Æggestokke blev indsamlet efter ovariektomi blev udført på US Meat Animal Research Center (USMARC) i henhold til deres IACUC procedurer fra Control and Stair-Step kvier på 13 måneder afalder 16, rengøres med steril fosfat buffer saltvand (PBS) vasker med 0,1% antibiotika til at fjerne blod og andre forurenende stoffer, trimmet overskydende væv, og transporteres til University of Nebraska-Lincoln (UNL) Reproduktiv fysiologi laboratorium UNL på 37 ° C23 . Ved UNL blev ovarie cortexstykker skåret i små firkantede stykker (~ 0,5-1 mm3; Figur 1) og dyrkes i 7 dage (figur 2). Histologi blev udført på cortex kultur dias før og efter kultur til at bestemme follikler fase16,24 (Figur 3 og Figur 4), og ekstracellulære matrix proteiner, der kan indikere fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figur 5. Dette gjorde det muligt at fastslå virkningen af in vivo ernæringsmæssige regimer på follikel stadier og tilladt sammenligning af 7 dages ovarie cortex på follikel stadier og follikel progression. Gennem hele kulturen blev mediet indsamlet og ændret dagligt (ca. 70% af medierne blev indsamlet hver dag; 250 μL/brønd), således at enten daglige hormoner/cytokiner/chemokiner kan vurderes eller samles over dage for at opnå gennemsnitlige koncentrationer. Steroider såsom androstenedion (A4) og østrogen (E2) kan samles over 3 dage og vurderes gennem radioimmunoassay (RIA; Figur 6) og samlet over 4 dage pr. dyr og analyseret via højtydende flydende kromatografi-massespektrometri (HPLC-MS)24,25 ( tabel1). Cytokin arrays blev udnyttet til at vurdere cytokin og chemokin koncentrationer i æggestokkene cortex kultur medium26 (tabel 2). Realtid polymerase kædereaktion (RT-PCR) assay plader blev udført for at bestemme genekspression for specifikke signal transduktion veje som påvist tidligere16. Alle steroid, cytokin, follikel fase og histologiske markører giver et øjebliksbillede af æggestokkene mikromiljø og spor om evnen til at mikromiljøet til at fremme "normal" eller "unormal" folliculogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Æggestokkene blev fremstillet fra U. S. Meat Animal Research Center16. Som tidligere nævnt16, alle procedurer blev godkendt af U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af landbrugsdyr i landbrugsforskning og undervisning. Æggestokkene blev bragt til University of Nebraska-Lincoln Reproduktiv Laboratory, hvor de blev behandlet og kultiveret.
1. Forberedelse af påkrævede medier
-
Waymouth MB 752/1 medium
- Fyld en 1 L vævskulturflaske med 900 mL sterilt vand. Mens vandet forsigtigt omrører på en rørplade, tilsæt gradvist det pulveriserede medium. Når det pulveriserede medium er opløst, tilsættes 2,24 g natriumbicarbonat efterfulgt af 1,25 g kvægserumalbumin (BSA). Brug en pH-måler, og juster pH-skærmen til 7,25-7,35. Tilsæt yderligere sterilt vand for at bringe det endelige volumen til 1 L.
- Flyt til et biologisk sikkerhedsskab og tilsæt penicillin-streptomycin sulfat i en koncentration på 0,1% v/v af mediet. Mediet filtreres med et 0,22 μm pore 33,2 cm2 500 mL flaske topfilter.
- Hæld det filtrerede medium af i flere 50 mL koniske rør. Der tilsættes 0,5 mL insulinoverførsels selen-selen pr. 50 mL aliquoted medium.
- Pak de koniske rør og mediets lagerflaske ind i aluminiumsfolie og opbevares ved 4 °C. Dette medium er lysfølsomt.
BEMÆRK: Waymouth medium kan opbevares i op til 1 måned.
-
Leibovitz's L-15 (LB-15) medium
BEMÆRK: LB-15 medium bruges til at rense væv som forberedelse til kultur.- Fyld en 1 L vævskulturflaske med 900 mL sterilt vand. Mens det sterile vand forsigtigt omrører på en rørplade, tilsæt gradvist det forberedte pulveriserede medium. Brug en pH-måler, og juster pH-skærmen til 7,25-7,35. Tilsæt yderligere sterilt vand for at bringe det endelige volumen til 1 L.
- Flyt til biologisk sikkerhedsskab. Lav 1 L LB-15 med 0,1% antibiotikum (se Materialetabel). Filtrer mediet i to 500 mL vævskulturflasker ved hjælp af et 0,22 μm pore 33,2 cm2 500 mL flaske topfilter. Wrap flasker i aluminiumsfolie som LB-15 medium er lysfølsom og opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: LB-15 medium kan opbevares i op til 1 måned.
-
Fosfat buffered saltvand (PBS)
- Lav PBS i laboratoriet eller køb steril PBS uden calcium eller magnesium (Materialetabel). For at gøre PBS i laboratoriet, begynde med 800 mL destilleret vand og tilsæt 8 g natriumchlorid (NaCl) til det. Derefter tilsættes 0,2 g kaliumchlorid (KCl), 1,44 g natriumphosphat dibasic (Na2HPO4) og 0,24 g kaliumphosphat dibasic (KH2PO4). Juster pH til ~7,4, og juster det samlede volumen til 1 L. Steriliser opløsningen ved autoklavering.
- Lav 1 L PBS med 0,1% antibiotikum (se Materialetabel),mens du er i et biologisk sikkerhedsskab.
2. Ovarie kortikal kultur protokol
BEMÆRK: Æggestokkene blev fremstillet af forårsfødte USMARC kvier på 13 måneder. Æggestokkene blev skyllet grundigt, og alt blod og anden væske blev fjernet med PBS indeholdende antibiotikum (0,1%) og transporteret ved 37 °C23 til University of Nebraska-Lincoln Reproduction Laboratory UNL (1,5 timer væk). (For kommentarer om temperaturen af æggestokke under transport kan du se Diskussion)
- Forbered æggestokkene væv på en ren bænk (Figur 1).
- Desinficer den rene bænk med 70% ethanol. Placer en frisk absorberende pude på bordpladen. Sørg for, at den rene bænkblæser tændes en halv time før dissektion sammen med UV-lys for at sterilisere alt i den rene bænk, herunder absorberende pude og sørg for, at der anvendes passende PPE.
- Arranger petriskålene (60 x 15 mm) til vævsvask. Tre petriskåle er nødvendige for PBS vask, tre for PBS med antibiotika, og tre for LB-15 vasker. En ekstra LB-15-holdige Petri fad med tilhørende låg vil blive udnyttet til endelig placering af stykker efter vask.
- Fyld hver petriskål med ca. 10 mL passende væsker, enten PBS eller LB-15.
Figur 1:Layout af plader til vaskaf æggestokken og cortex stykker i den rene bænk. (A) PBS anvendes til vask af æggestokken som dele af cortex fjernes. (B) PBS med antibiotika vasker, at cortex stykker flyttes igennem. (C) Æggestokkene cortex stykker vaskes fire gange i LB-15 før du flytter til biosikkerhed kabinet til endelig vask i LB-15. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Fjern det forberedte Waymouth og LB-15 medium fra køleskabet og varm til stuetemperatur.
- Autoklave alle værktøjer for at sikre sterilisering før brug.
- Vedligehold æggestokke ved 37 °C, indtil æggestokkene cortex er klar til at blive indsamlet.
- Brug sammenkæber med savtakkede kæber, afhente æggestokken og grundigt vaske i den første PBS-fyldte Petri parabol. Overfør æggestokken til den anden PBS vask og rens grundigt igen.
BEMÆRK: Æggestokken vil forblive i den anden PBS vask, mens æggestokkene kortikale strimler fjernes. - Brug savtakkede kæbetrak, fastgør æggestokken og skær i halvdelen. På dette tidspunkt vil æggestokkene cortex skære væk fra medulla. Brug en lineal, sørg for, at ikke mere end 1-2 mm dybde af overfladen af æggestokken fjernes væk fra medulla16. Fjern tværgående dele af æggestokkene cortex fra medulla, skåret 3-4 tynde strimler af æggestokkene cortex (Figur 2) med en skalpel (# 11 skalpelblad; # 3 håndtag), og placere strimler i den tredje PBS-fyldte Petri parabol.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan yderligere ovarie kortikale væv indsamles til RNA-ekstraktion eller fast og opsamles til histologi af indledende ikke-dyrkede cortexstykker. Når du fjerner strimler af ovarie cortex, undgå områder med synlige antral follikler eller corpora lutea. Derudover undgå at indsamle medullært væv. Histologien af medulla er meget anderledes som vist tidligere16. Hvis æggestokkene cortex ikke skæres til mere end en 1-2 mm dybde, så medulla bør ikke opnås. Tydelig histologi giver mulighed for landemærker mellem cortex og medulla. - Skær æggestokkene cortex strimler i den tredje PBS vask i små, firkantede stykker (~ 0,5-1 mm3) med en # 21 skalpel klinge. Brug en lineal under Petri retter for at sikre, at stykkerne er af samme størrelse og tykkelse til at gøre konsekvent ovarie cortex stykker. Brug sammentrækninger til at fastgøre strimlerne, mens du skærer stykkerne med en skalpel.
BEMÆRK: Antallet af vævsstykker skåret er afhængig af eksperimentet. Fire stykker ovarie cortex er den mindste mængde væv, der er nødvendig for kulturen. Andre metoder til at sikre passende længde og dybde omfatter brug af specielle skiver26 eller forskårne plaststykker som skabeloner27. - Vask ovarie kortikale stykker gennem alle tre PBS med antibiotikafyldte petriskåle. Brug en buet spids sammentrak til at flytte stykker mellem vaske.
- Flyt cortex stykker gennem serien af LB-15 vasker og sted i den endelige LB-15-fyldt Petri parabol. Mærk låget med dyre-id og ovarieside (venstre eller højre).
BEMÆRK: Dyk de ovariebartexstykker helt ned i hver vask for grundig rengøring. - Saml fire æggestokkene cortex stykker pr æggestokken og fastsætte for dag nul histologi. Yderligere stykker kan også flash fryses til RNA. De resterende vævsstykker vil blive brugt til kultur. Tør dissekeringsværktøjer af med 70 % ethanol efter hver vævsindsamling.
- Forbered et biologisk sikkerhedsskab til endelig vævsvask og kulturforberedelse. Saner forsyninger med 70% ethanol, før du placerer i det biologiske sikkerhedsskab. Brug den aseptiske teknik, når du arbejder i det biologiske sikkerhedsskab.
- Flyt alle æggestokkene cortex beregnet til kultur til den biologiske sikkerhed kabinet og vaske igen i en LB-15-fyldt Petri parabol.
- I en 24-brønd væv kultur plade, pipette 350 μL af Waymouth medium per brønd.
- Placer ubestrøget kultur godt indsætter i hver brønd ved hjælp af sammenkrerne. Sørg for, at der ikke dannes bobler under bunden af indsatsen, da dette ville resultere i, at vævet tørrer ud. Mediet skal røre ved skær for at gøre det muligt for mediet at blive absorberet og omgiver æggestokkene cortex stykker.
- Anbring forsigtigt fire ovarie cortexstykker på masken på hver skær (Figur 2). De sammenkædninger kan punktere masken, hvis vævsstykkerne ikke er fint placeret. Vævsstykkerne må ikke røre ved hinanden eller på siden af indsatsen.
- Inkuberes vævet ved 37 °C med 5% CO216.
BEMÆRK: Andre har brugt 38,8 °C28. Der er dog ikke observeret nogen forskel i vævets integritet eller i folliklernes evne til at udvikle sig i 37 °C-væv eller andre39,30. Således bør på dette tidspunkt nogen af disse temperaturer være befordrende for eksperiment succes. Andre har brugt 400 μL medium. Begge beløb er fint, så længe man er konsekvent, og vævet er delvist nedsænket giver mulighed for tilstrækkelig overfladespænding for at give mulighed for hydrering af væv (medier omkring æggestokkene cortex stykker). Fyld tomme brønde med 500 μL sterilt vand for at hjælpe med at reducere fordampning fra andre brønde.
Figur 2: Æggestokkene cortex stykker og kultur plade. (A) En ovarie strimmel skæres fra æggestokkens cortex. (B) Lineal- og cortexstykket vist side om side. (C) Fire cortex stykker (~ 0,5-1 mm3) hviler på indsatsen i kulturmediet i pladen. (D) Løft indsatsen for at samle kulturmediet fra brønden. Opsamle og udskifte alle kulturmedium dagligt (250 μL) for at opretholde korrekt pH.Ca. 250 μL er fremstillet fra hver brønd hver dag (ca. 70% af det oprindelige kulturmedium). Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Mediesamling
- Skift ovarie cortex kultur medium dagligt i 7 dage. Medium ændringer bør være så tæt på 24 timers fra hinanden som muligt for at forhindre store pH og farveændringer i medium. Varm Waymouth medium til 37 °C før medium ændring. Ca. 250 μL opnås fra hver brønd hver dag (ca. 70% af det oprindelige kulturmedium).
- Under medium ændringer skal du bruge sammentak til forsigtigt at løfte indsatsen ud af brønden. Det kultiverede Waymouth-medium opsamles i 0,5 ML-rør (ca. 250 μL/dag). Sæt indsatsen godt tilbage, og tilsæt 350 μL frisk kulturmedium ved at dispensere mediet mellem siden af indsatsen og brønden.
BEMÆRK: Skift de fleste af medierne dagligt for at få nok medier til at måle alle de steroider, cytokiner, og chemokines er nødvendige for at bestemme æggestokkene mikromiljø. Daglige medium ændringer er også vigtige for at forhindre store pH-ændringer (angivet ved farveændring) i mediet. Dråber af medium blev bevaret omkring æggestokkene cortex stykker for at sikre stykker forblev våd. Ingen problemer blev observeret med kultiveret væv på grund af skiftende 70% af medierne. - Opbevar det indsamlede medium fra vævskultur ved -20 °C.
4. Billedbehandling og nedstrømsbehandling
- Efter 7 dages kultur ved 37 °C med 5% CO2, billede æggestokkene cortex stykker ved hjælp af en dissektion mikroskop med en vedhæftet kamera og en computer imaging software program.
BEMÆRK: Et mørkt rum er normalt bedst til at opnå den bedste billedkvalitet til billeddannelse. - Efter billeddannelse, fastsætte to æggestokkene cortex stykker pr brønd i Bouins for histologi og flash fryse to æggestokkene cortex stykker i flydende nitrogen for at opnå RNA for cDNA. Gentag dette trin for alle brønde med væv. Saml mediet fra dag 7 og opbevar ved -20 °C.
- Lad æggestokkene cortex stykker forblive nedsænket i Bouins (picric syre 750 ml, glacial eddikesyre 50 ml, og 37%-40% formalin 250 ml) for ca 1,5 h, før de vaskes med 70% ethanol tre gange. Vævet vil forblive i 70% ethanol og ryddes dagligt, indtil opløsningen ikke længere er gul.
BEMÆRK: Andre fiksativer end Bouins samt paraformaldehyd kan bruges. I denne erfaring bouins bruges som det er fiksativ til at opnå optimal morfologi. Hvis mere væv er påkrævet til anden analyse, yderligere brønde af medier og stykker af æggestokkene cortex kan fås fra hvert dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne kvæg cortex kultur procedure kan bruges til at bestemme en bred vifte af hormon, cytokin, og histologi data fra små stykker af æggestokken. Farvning, såsom hæmatoxylin og eosin (H&E), kan bruges til at bestemme ovariemorfologi gennem follikel iscenesættelse16,23,31 ( Figur3). Kort sagt blev follikler klassificeret som ur, som er en oocyt omgivet af et enkelt lag af pladeagtige præ-granulosa celler (0); overgangssækken eller den tidlige primær, som er en oocyt omgivet af for det meste pladeformede præ-granulosaceller og nogle kuboide granulosaceller (1); primær follikel, som er en oocyt omgivet af 1-1,5 lag af kuboide granulosaceller (2); sekundær follikel, som er en oocyt omgivet af to eller flere kuboide granulosaceller (3); antralsækken, som ikke er større end 1 mm i diameter og omgivet af to eller flere lag granulosaceller, der indeholder et tydeligt antrum (4)16,23 ( figur3). Follikel iscenesættelse kan udføres på æggestokkene cortex fast før og efter kultur til at vurdere folliculogenese (Figur 4). Vi tog tre billeder pr dias fra tre forskellige dias farves med H &E. Derefter blev folliklerne iscenesat og tælles af tre personer og i gennemsnit for at bestemme antallet af follikler på hvert trin16,23. Det område i synsfeltet for et billede (tre pr. dias) ved 400x forstørrelse er 0,4 mm2. Således blev 30% af arealet af æggestokkene cortex stykker talt for at bestemme follikel stadier. Det oprindelige follikelnummer(før kultur) (Figur 4A) bruges til at normalisere folliklerne, der tælles efter kultur (figur 4B).
Derudover kan forskelle i morfologi som bestemt af kollagen deposition (Picro Sirus Rød farvning) indikere fibrose i æggestokkene cortex fra trappetrin eller kontrol kvier (Figur 5). Daglig indsamling af kulturmedium kan samles over 3 dage for at vurdere varieret steroid hormonproduktion af RIA (ved hjælp af 200 μL medium prøve pr dyr; Figur 6) eller steroid metabolitter ved hjælp af højtydende flydende kromatografi massespektrometri (HPLC-MS; 220 μL medium prøve samlet over 4 dage pr. dyr; Tabel 1) og cytokinproduktion (tabel 2). Derfor kan flere kopier af et dyr være forpligtet til at sikre nok cortex medium til at udføre alle de ønskede assays.
Fordi Stair-Step kvier har øget ursækkene i begyndelsen af kulturen forventede vi, at disse fremskridt i kulturen og opnå et større antal sekundære follikler, som vi observerede i resultaterne. Også, på grund af stigning i sekundære follikler, Vi ville forvente større koncentrationer af steroider. Vi så tendens til stigninger i androgener, glucocorticoid metabolitter, og progesteron metabolitter, som ville støtte dette i det nuværende manuskript. Vores laboratorium har også evalueret virkningerne af forskellige VEGFA isoforme på follikel progression, steroidogenese, og aktivering af forskellige signal transduktion molekyler i KDR (også kendt som Vaskulær endothelial vækstfaktor receptor 2; VEGFR2) ved hjælp af signaltransduktion array plader16. For at reducere dyrevariation bruger vi 4-6 dyr pr. behandling, og til andre forsøg afhængigt af effektanalyse og variabilitet har vi brugt så mange som 11.
Repeterbarhed af resultater fra kvæg ovarie cortex kultur er mest påvirket af forurening af æggestokkene cortex stykker. Derudover kan der forekomme negative eller subpar-resultater, hvis mediet ikke ændres regelmæssigt inden for en periode på 24 timer. Mediet, når det oprindeligt blev tilføjet, er lyserødt i farve, men når mediet indsamles, og farven ser ud til at være orange eller lysegul, kan dette indikere en ændring i pH, der kan være skadelig for vævet. Også vævsstykker, der skæres for store, kan udvikle degeneration i midten, der ikke ville blive observeret, før vævssektion til histologi. Denne degeneration vil begrænse brugen af vævet til analyse. De data, der præsenteres i dette papir er blevet analyseret ved hjælp af nonparametriske tests og en generel lineær model analyse i et statistisk softwareprogram. Antallet af ur-, primær-, sekundær- og antralsække pr. sektion før og efter kultur blev analyseret ved hjælp af en generaliseret lineær blandet model. Betydningen blev bestemt ved P < 0,05 og en tendens blev rapporteret på 0,14 ≤ P ≥ 0,05.
Figur 3: Hæmatoxylin og Eosin farvning til follikel iscenesættelse af æggestokkene cortex. Forskellige stadier af follikler er angivet med pile. (A) Ursække (fase 0); (B) Tidlige primære follikler (fase 1); c) Primære follikler (fase 2) d) Sekundær follikel (fase 3) (E) Antral follikel (fase 4). Det område af synsfeltet for et billede ved 400x forstørrelse er 0,4 mm2. Vi tæller 30% af arealet af æggestokkene cortex stykker til at bestemme follikel faser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Gennemsnitligt antal follikler på forskellige follikicular stadier i Control (n=6) og Stair-Step (n=6) kvier. (A) Før kultur Primordial P = 0,001, Early Primary P = 0,12, Primær P = 0,31, Sekundær P = 0,22. (B) Efter 7 dages kultur, Primordial P = 0,37, Tidlig Primær P = 0,84, Primær P = 0,69, Sekundær P = 0,02. Fejllinjer er repræsentative for SEM. Klik her for at få vist en større version af dette tal.
Figur 5: Kollagen (Picro Sirius Red; PSR) farvning i æggestokkene cortex. PSR i (A) Kontrol og Trappe-Step kvier fra dag 0 og dag 7. (B) Graf, der sammenligner det gennemsnitlige område af PSR-positiv farvning pr. ovarie cortexfelt (pixel/μm2) mellem Control (n = 4) og Stair-Step (n = 4) kvier. Fejllinjer er repræsentative for SEM. Området i synsfeltet for et billede ved 400x forstørrelse er 0,4 mm2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Koncentrationerne af A4 og E2. (A) Koncentration af A4 og(B)koncentration af E2 samlet over 3 dages kultur i æggestokkene cortex medier control og trappe-trin kvier målt ved RIA's. n = 4 for hver gruppe. Fejllinjer er repræsentative for SEM. Klik her for at få vist en større version af dette tal.
| Hormoner | Kontrol | Trappetrin | P-værdi | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| ng/mL | Betyde | SEM ± | Betyde | SEM ± | ||
| DOC | 0.33 | 0.28 | 0.72 | 0.48 | 0.15 | |
| KRO | 0.61 | 0.60 | 4.93 | 3.99 | 0.08 | |
| CORT | 0.003 | 0.003 | 0.01 | 0.01 | 0.85 | |
| 17OHP | 0.59 | 0.53 | 1.88 | 0.99 | 0.08 | |
| A4 | 1.46 | 1.43 | 5.74 | 3.27 | 0.08 | |
| EN | 0.15 | 0.09 | 0.54 | 0.32 | 0.08 | |
| DHEAS | 4.50 | 2.60 | 7.59 | 0.85 | 0.56 | |
| E2 | 0.05 | 0.05 | 0.13 | 0.08 | 0.32 | |
| P4 | 5.05 | 2.78 | 6.52 | 1.66 | 0.39 | |
| T | 0.33 | 0.33 | 1.33 | 0.96 | 0.14 | |
| DHT | 0.07 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.09 | |
| DOC - 11-Deoxycorticosterone, INN - 11-Deoxycortisol, CORT – Corticosterone, 17OHP – 17-Hydroxyprogesterone, A4- Androstenedione, AN – Androsterone, DHEAS – dehydroepiandrosterone sulfat, E2 - Estradiol, P4 – Progesteron, T – Testosteron, DHT – Dihydrotestosterone | ||||||
Tabel 1: Steroid og steroid metabolitter målt i æggestokkene cortex kultur medium fra en brønd for hvert dyr samlet over 4 dages kultur. Data præsenteret med gennemsnitlige ± SEM. Blå indikerer P < 0,1 og har en tendens til at være anderledes.
| Cytokiner | Kontrol | Trappetrin | P-værdi | |||
| n | 4 | 4 | ||||
| pg/mL | Betyde | SEM ± | Betyde | SEM ± | ||
| ANG1 | 27.29 | 11.71 | 63.66 | 25.06 | 0.39 | |
| CD40L | 4527.01 | 2986.34 | 3537.59 | 3537.59 | 0.74 | |
| DCN | 1307.68 | 320.87 | 996.54 | 282.96 | 0.77 | |
| INFβ | 0.36 | 0.36 | 0.002 | 0.002 | 0.85 | |
| IL18 | 0.00 | 0.00 | 1832.89 | 1265.33 | 0.13 | |
| LIF | 97.45 | 88.12 | 337.58 | 231.25 | 0.54 | |
| RANTES | 698.06 | 322.59 | 1254.13 | 811.19 | 0.56 | |
| INFγ | 4.49 | 1.37 | 3.68 | 0.65 | 0.77 | |
| IL13 | 501.21 | 285.07 | 810.81 | 159.67 | 0.25 | |
| IL21 | 24.38 | 9.51 | 18.52 | 6.17 | 0.56 | |
| IL1F5 | 5.07 | 3.85 | 5.40 | 1.70 | 0.56 | |
| TNFα | 61.45 | 35.00 | 44.91 | 13.41 | 0.77 | |
| ANG1 – Angiopoietin 1, CD40L – CD40 Ligand, DCN – Decorin, IFNβ – Interferon Beta 1, IL18 – Interleukin-18, LIF – Leukæmi hæmmende fabrik, RANTES – Reguleret på aktivering, Normal T Cell Udtrykt og udskilles, IFNγ – Interferon Gamma, IL13 – Interleukin 13, IL21 – Interleukin 21, IL1F5 – Interleukin 1 familiemedlem 5, TNFα – Tumor Nekrose Faktor alpha | ||||||
Tabel 2: Cytokin og chemokiner målt i æggestokkene cortex kultur medium fra en brønd for hvert dyr samlet over 4 dages kultur. Data præsenteret med gennemsnitlige ± SEM. Blå indikerer P < 0,1-0,14 og har en tendens til at være anderledes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelen ved in vitro ovarie cortex kultur, som beskrevet i dette manuskript, er, at folliklerne udvikler sig i et normaliseret miljø med tilstødende stroma omkring folliklerne. De somatiske celler og oocyt forbliver intakte, og der er passende celle-til-celle kommunikation som en in vivo-model. Vores laboratorium har konstateret, at en 7-dages kultur system giver repræsentative folliculogenese og steroidogenese data til behandling af æggestokkene cortex. Andre protokoller for ovarievævskultur har enten relativt korte kulturperioder 1-6 dage7,32 eller lange kulturperioder på 10-15 dage5,6,10. Men, Vi har observeret, at dyrkning i mere end 7 dage fører til vævsforringelse, reduceret steroidogenese, og potentielt en øget sandsynlighed for forurening (data ikke vist). Dyrkende ovariebark efter ovariektomi giver også direkte indsigt i det ovarie mikromiljø i det pågældende dyr. Dette er af interesse for vores forskningslaboratorium, da vi har identificeret ændringer i follikulær udvikling efter ernæringsmæssige regimer blev pålagt efter fravænning og fører til puberteten i kvier16.
Follikel udvikling fra ur til antral fase er en dynamisk proces inden for æggestokkene cortex, som omfatter endokrine og parakrine faktorer fra somatiske celler og cumulus celle-oocyt kommunikation33. Vævskultur, såsom ovarie cortex kultur, tilbyder et kontrolleret miljø til at undersøge den mekanistiske rolle af disse faktorer og det endokrine miljø i æggestokkene mikromiljø. Æggestokke kan indsamles fra dyr, der har gennemgået en in vivo behandling eller er genetisk ændret for at bestemme virkningerne på follikel progression.
Æggestokke kan også indsamles fra et lokalt slagteri (1 time væk) og transporteres ved 37 °C i en termokande indeholdende PBS med antibiotika. Hvis transporten er længere (f.eks. natten over), sendes eller transporteres æggestokkene på is22. Lignende resultater er blevet observeret, om transport af æggestokke sker på is natten over eller ved 37 °C med kortvarig transport i en termokande. De 37 °C med termokandetransport giver mulighed for høst af oocytter fra dette væv til in vitromodning (IVM) eller in vitro-befrugtning (IVF)34. Andre undersøgelser har vist , at transport af væv ved temperaturer mellem 2-8 °C også er blevet anvendt til fertilitetsbevarelse i reproduktive væv35,36,37. Andre undersøgelser har dog anvendt æggestokke, der transporteres ved 34-37 °C og på is, og har ikke observeret forskelle i kvægvævskultur38.
Hvis ovarie cortex kultur væv ikke ser sundt efter kultur, kan dette skyldes, at stykker af æggestokkene cortex er for store. Et kritisk skridt i protokollen er at sikre, at æggestokkene cortex stykker ikke er større end 0,5-1 mm3. Vi bruger en lineal til at måle stykkerne og bruge en skala i dissekering mikroskop til at bestemme størrelsen af æggestokkene cortex stykker (Figur 2C). Andre anvender specifikt udstyr (se Materialetabel)for ensartet tykkelse og længde/bredde, henholdsvis26. Hvis disse stykker udstyr ikke er tilgængelige, kan plast firkanter bruges til som en skabelon for at opnå ensartet tykkelse og sikre lignende størrelse stykker27.
For at sikre afskårne stykker, der kun er fra cortex og ikke har medulla efter vask æggestokken placerer vi den i 60 mm skålen og skæres i halvdelen. Cortex og medulla er meget forskellige histologisk set som tidligere set i Abedal-Majed, 202016. Hver halvdel af æggestokken er fileteret med bladet for at sikre, at kun cortex fjernes fra æggestokken, og medulla forbliver. Hvis enkeltpersoner lige er begyndt at perfektionere denne skæreteknik, kan de også bruge neutral rød til nøje at se histologien i hver halvdel af æggestokken39. Dette vil give mulighed for udvikling af landemærker som deres skæring teknik, forbedres. Desuden kan de anvende instrumenter , der kan skære ensartet tykkelse (se Materialetabel) som anført ovenfor26,27.
Ovarie cortex medium skal være lyserød. Vi har observeret, at pH af æggestokkene cortex kultur medium ændringer hurtigt i nogle dyr, således at flertallet (70%) af æggestokkene cortex medium bør ændres hver 24 timer for at fremme kultur sundhed. Tidligere papirer har drøftet at ændre halvdelen af mediet dagligt40. Vores grund til at ændre et flertal af medierne i det nuværende manuskript var at fremme sundheden for æggestokkene cortex kulturer. Dråber omkring æggestokkene cortex stykker tilbage, og der var ingen negative virkninger af medium forandring på kulturen. Desuden gav dette os mulighed for at analysere flere hormoner, cytokiner og chemokiner for hvert dyr for at generere indsigt i det æggestokkene mikromiljø.
Denne vævskultur protokol tilbyder flere fordele. Dyrkning æggestokkene cortex tillader follikler at udvikle sig i et miljø, der ligner in vivo. Follikler forbliver understøttet af den omgivende stroma og kommunikation mellem somatiske celler og cumulus celle-oocyt fortsætter. Brugen af kultur godt skær gør det muligt for æggestokkene cortex at hvile på kulturmediet uden at blive nedsænket, hvilket forhindrer vævet i at binde sig til plastbunden af brøndpladen. En anden fordel er kulturvinduet. Den 7-dages kultur vindue beskrevet i protokollen giver repræsentative hormon og vækstfaktor data. Derudover fortsætter folliculogenese med at udvikle sig i dette in vitro-miljø, da vi har talt færre tidlige stadierede follikler (ur) og flere sene hårsække (sekundær, antral) efter 7 dage med kultur16. Tidligere protokoller for ovarievævskultur har udnyttet relativt korte (1-6 dage7,32) eller lange (10-15 dage5,6,10) kulturperioder. Kortere kultur vinduer er blevet brugt til at undersøge primordial follikel aktivering i føtal kvæg æggestokkene cortex41. I ikke-menneskelige primater blev en 20-dages kulturperiode brugt til at evaluere primat primordials folliklers evne til at overleve og indlede vækst in vitro i serumfri medium18. Vi har dog observeret øget vævsforringelse, når vi dyrkede ovariekvægbarken i længere end 7 dage i serumfrit medium. Vi har også fastslået i analyse af daglige prøver, at steroid koncentrationer er faldet efter 4 dages kultur (data ikke vist). Et længere kulturvindue kan også øge muligheden for forurening i æggestokkene cortex kulturer. Derfor kan større virkninger måles ved 7 dages kultur15, og kulturtidspunktet kan være afhængigt af dyremodellen og det videnskabelige spørgsmål, der behandles.
Mens flere fordele ved denne kvæg ovarie cortex protokol findes, der er et par begrænsninger. En begrænsning er mængden af ovarie kortikale væv og kultur medium volumen indsamlet under æggestokkene kortikale kultur. Den lille størrelse af æggestokkene cortex stykker giver mulighed for et begrænset antal væv sektioner, der skal anvendes til farvning formål (H &E, immunofluorescence, osv.). For at udføre RT-PCR er der brug for mindst fire cortexstykker16. Desuden kan den lave mængde af indsamlede kulturmedier begrænse mængden af gennemførte analyser. For at bekæmpe disse begrænsninger foreslår vi dyrkning af flere replikaer pr. æggestok for at give en tilstrækkelig forsyning af kulturmedium og væv til histologi, analyser og PCR. Ofte vi kultur flere stykker af hver æggestok fra en ko / kvie at få mere væv til yderligere analyse og for at opnå øget kultur medium til at måle cortex sekretion af hormoner / cytokiner / chemokines. Præantrale follikler er mere diffuse hos ældre ko æggestokke end yngre kvinder (kvier). Således er en potentiel begrænsning at opnå præantrale follikler på alle æggestokkene cortex stykker, der er kultiveret. Flere måder at afbøde denne begrænsning er at opnå mere æggestokkene cortex stykker og til kultur yderligere brønde for hvert dyr eller til at bruge neutral rød til at visualisere follikler og sikre, at alle cortex stykker indeholder tidlige præantrale follikler. En tredje begrænsning af æggestokkene cortex kultur er, at enhver forurening af kultursystemet gør medierne og cortex stykker ubrugelig til analyse. Således er flere måder at opretholde et sterilt miljø at filtrere det medium, der anvendes i kulturen. Før forarbejdning og skæring æggestokkene cortex stykker sørg for, at den rene bænk er blevet steriliseret med 70% ethanol, og luftstrømmen har kørt i mindst 30 minutter før dissektioner. Hvis du bruger en absorberende pude til at muliggøre lettere oprydning (Figur 1), skal du også sikre dig, at UV-lyset er tændt i 30 minutter, før du placerer væv i den rene bænk for at sterilisere puden og rengøre bænken. Endelig bør alle medieændringer udføres i et biosikkerhedsskab med tilstrækkelig luftstrøm, sterile instrumenter og skiftende pipetspidser for at sikre, at der kun indføres sterile spidser i mediet, der skal placeres i brønde til ovarie cortexkultur.
Anvendelse af denne teknik vil støtte til at forstå æggestokkene mikromiljø og kan begynde at optrævle mekanismer, der er involveret i kvindelige reproduktive lidelser, der involverer ændret follikulær udvikling. For eksempel er ætiologien af polycystisk ovariesyndrom (PCOS) og aspekter af for tidlig ovariesvigt (POF) fortsat uklare. Da køer er monoovulatoriske, laver de en fremragende model til at forstå faktorer, der påvirker follikel progression og anholdelse i andre monoovulatoriske arter (f.eks. mennesker og ikke-menneskelige primater). Desuden, denne æggestokkene cortex kultur metode kan også vise sig gavnligt for at teste potentielle terapeutiske, der kan forbedre follikel-medierede lidelser resulterer i infertilitet hos kvinder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 til ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants til ASC. Usa's landbrugsministerium Hatch tilskud NEB26-202/W3112 Tiltrædelse # 1011127 til ASC, Hatch-NEB ANHL Tiltrædelse # 1002234 til ASC. Kvantitativ Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – COVID-19 Award for sommerstøtte til CMS.
Forfatterne vil gerne udvide deres påskønnelse til Dr. Robert Cushman, US Meat Animal Research Center, Clay Center, NE at takke ham for at give æggestokkene i en tidligere publikation, som derefter blev brugt i det nuværende papir som et proof of concept i validering af denne teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
References
- Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
- Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
- Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
- McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
- Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
- Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
- Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
- Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
- Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
- Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
- Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
- Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
- Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
- Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
- Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
- Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
- Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
- Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
- Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
- Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
- Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
- Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
- Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
- Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
- Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
- Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
- Mohammed, B. T., Donadeu, F. X.
- Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
- Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
- Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).
