Summary
Qui è presentato un protocollo per l'isolamento e l'amplificazione di batteri commenali congiuntivali anaerobici aerobici e facultativi del topo utilizzando un tampone oculare unico e una fase di arricchimento basata sulla coltura con successiva identificazione con metodi microbiologici basati e spettrometria di massa MALDI-TOF.
Abstract
La superficie oculare era un tempo considerata immune privilegiata e abiotica, ma recentemente sembra che ci sia una piccola ma persistente presenza commerciale. L'identificazione e il monitoraggio delle specie batteriche nella mucosa oculare sono stati impegnativi a causa della loro bassa abbondanza e della limitata disponibilità di una metodologia appropriata per la crescita e l'identificazione commensal. Esistono due approcci standard: metodi basati sulla cultura o sequenziamento del DNA. Il primo metodo è problematico a causa dei batteri recuperabili limitati e il secondo approccio identifica sia i batteri vivi che morti che portano a una rappresentazione aberrante dello spazio oculare. Abbiamo sviluppato un metodo robusto e sensibile per l'isolamento batterico basandoci su tecniche di coltivazione microbiologiche standard. Questa è una tecnica a base di tampone, utilizzando un tampone sottile "in-lab" realizzato che si rivolge alla congiuntiva inferiore, seguita da una fase di amplificazione per i generi anaerobici aerobici e facultativi. Questo protocollo ci ha permesso di isolare e identificare specie congiuntivali come Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. L'approccio è adatto a definire la diversità commenale nei topi in diverse condizioni di malattia.
Introduction
Lo scopo di questo protocollo è quello di migliorare l'isolamento specifico di microbi anaerobici aerobici e facultativi vitali e rari dalla congiuntiva oculare per caratterizzare il microbioma oculare. Studi approfonditi hanno profilato le comunità mucose commenali sulla pelle, l'intestino, le vie respiratorie e genitali e mostrano che queste comunità influenzano lo sviluppo del sistema immunitarioe la risposta 1,2,3. Le comunità commenali oculari hanno dimostrato di cambiare durante alcune patologie della malattia, come la malattia dell'occhiosecco 4,la sindrome di Sjogren5 e il diabete6. Tuttavia, la capacità di definire una tipica comunità commensale di superficie oculare è ostacolata dalla loro abbondanza relativamente bassa rispetto agli altri siti dimucosa 6,7,8. Ciò suscita una controversia sul fatto che esista un microbioma oculare residente e se esiste, se differisce dal microbioma cutaneo e, di conseguenza, il suo effetto locale sullo sviluppo e la risposta del sistema immunitario innato. Questo protocollo può aiutare a risolvere questa domanda.
Generalmente, gli approcci per definire la nicchia commensal oculare si basano sul sequenziamento e sulle tecnichebasate sulla cultura 4,7,9. 16 Il sequenziamento s rDNA e l'analisi BRISK7 mostrano una diversità più ampia rispetto alle tecniche basate sulla cultura, ma non sono in grado di distinguere tra microbi vivi e morti. Poiché la superficie oculare è ostile a molti microbi a causa delle proprietà antimicrobiche4 del film lacrimale che generano una vasta gamma di frammenti di DNA, gli approcci basati sul DNA rileveranno questi artefatti che possono distorcere i dati verso l'identificazione di batteri morti come commensal residenti piuttosto che contaminanti. Ciò si traduce in un'identificazione commensale aberrante e nella caratterizzazione dello spazio oculare come più elevato nell'abbondanza e nella diversità dei microbi10. Ciò rende difficile definire il microbioma oculare residente tramite metodi basati sul DNA. Considerando che le tecniche standard basate sulle impostazioni cultura non sono in grado di rilevare commensals perché il carico ètroppo basso 11. Il nostro metodo migliora le pratiche standard utilizzando un tampone sottile in grado di colpire la congiuntiva, evitando così la contaminazione dalla pelle vicina, così come il concetto che gli organismi vitali possono essere arricchiti da una breve coltura in mezzi densi di nutrienti con l'obiettivo di rianimare vitale ma non culturabile, oltre che arricchente per rari microbi vitali.
I risultati, l'abbondanza relativa di commensali oculari per tampone oculare, caratterizzano il microbioma residente congiuntiva e sono importanti per scopi comparativi. I nostri dati mostrano che c'è una differenza tra pelle e microbiota congiuntivale, così come una maggiore diversità con l'aumento dell'età e una differenza di abbondanza specifica per sesso. Inoltre, questo approccio ha trovato riproducibilmente differenze commenali nei topi knock-out12. Questo protocollo può essere applicato per descrivere il microbioma oculare che può variare a causa di pratiche di permanenza in gabbia, geografia o stato di malattia, così come gli effetti locali dei metaboliti commensali e dei prodotti sullo sviluppo e la risposta del sistema immunitario.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono i topi seguono le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Segui le linee guida sulla sicurezza di laboratorio (come indicato dal tuo dipartimento istituzionale per la salute e la sicurezza ambientale) quando lavori con microrganismi e materiali potenzialmente contaminati. Utilizzare recipienti di rifiuti appropriati e procedure di decontaminazione prima dello smaltimento di materiali contaminati potenzialmente a rischio biologico.
1. Preparazione del tampone oculare, configurazione del campo di lavoro, tampone per gli occhi del topo e arricchimento del campione
- Preparare tamponi sterili per gli occhi
NOTA: I tamponi sterili per gli occhi sono stuzzicadenti in legno sottilmente rivestiti con uno strato sottile di fibra di cotone che batte e realizzato in casa.- Autoclave quantità appropriata di batting di cotone e stuzzicadenti per il numero di topi da tamponare.
- Pizzicare un pezzo di cotone lungo mezzo centimetro che batte con pollice e indice. Stuzzicare la battuta tirando i bordi con pollici e indice per formare un singolo strato poroso piatto, fermandosi poco prima che la battuta cada a pezzi (piccoli pezzi di cotone dispersi durante la battuta allungata sono accettabili).
- Ruotare la battuta attorno a una delle estremità affilate dello stuzzicadenti tenendo leggermente il pezzo allungato sulla punta dello stuzzicadenti mentre è attorcigliato, vedere Figura 1. Il tampone per gli occhi "completato" avrà uno strato molto sottile di cotone allungato sulla punta, che si estende a circa la metà-un centimetro di distanza dalla punta.
- Inserire tamponi "completati" in un piccolo becher, lato tampone verso il basso e coprire. autoclave.
- Configurare l'area di lavoro
- Preparare l'anestesia contenente 2 ml di ketamina (100 mg/mL), 400 μL di xiazina (100 mg/ml) e 27,6 ml di soluzione salina sterile (0,9% NaCl in dH2O) in un tubo sterile sterile di centrifuga da 50 ml sterile. Sterilizzare il filtro e l'anestesia aliquota per un uso immediato (può essere conservato a 4 °C per 1 mese; consentire sempre di equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso).
- Pulire e pulire l'area di lavoro con disinfettante per ridurre al minimo la contaminazione.
- Aliquota 0,5 ml di supporti sterili per infusione di cuore cerebrale (BHI) in tubi di microcentrifugo sterile da 1,5 ml etichettati (1 tubo per mouse e controllo); disporre in rack a microcentrifugo. Mettere il rack sul ghiaccio.
- Impostare il flusso di lavoro come segue (da sinistra a destra): stazione di anestetizzazione del topo (gabbia contenente topi sperimentali, gabbia sterile vuota, anestesia a temperatura ambiente, ago da 25 G e siringa da 1 ml), stazione di tamponamento degli occhi (BHI aliquota sul ghiaccio, tamponi sterilizzati per gli occhi, asciugamani di carta puliti, spray isopropanolo al 70%) e stazione di placcatura (piastre di agar del sangue a temperatura ambiente, pipette da 10 μL , 10 μL discariche sterili, contenitore di rifiuti a rischio biologico).
- Tampone oculare
- Somministrare 10 μL di anestesia per 1 g di dosaggio del peso del topo di chetamina e xiazina rispettivamente per via intraperitoneale a ciascun topo adulto e posizionare in una gabbia autoclavata. Testare l'anestesia spremendo il cuscinetto del piede posteriore; nessun movimento indica un'anestesia appropriata.
- Assegnare una mano per gestire solo topi anestetizzati e l'altra mano per gestire solo il tampone oculare e la coltura. Per tamponare, rimuovere il topo completamente anestetizzato dalla gabbia; posto sopra la superficie di lavoro pulita posizionata sul lato con l'occhio sinistro esposto. Mani guantate spray con isopropanolo, asciutte con tovagliolo di carta pulito.
- Uncap ha etichettato specificamente il tubo di micro-centrifuga BHI con mano di movimentazione dei supporti dedicata. Riposizionare il tubo nel rack della micro-centrifuga sul ghiaccio. Immergere la punta rivestita di cotone del tampone per gli occhi in BHI, ritirare il tampone per gli occhi dal tubo ruotando la punta 2 volte contro la camera d'aria per rimuovere il liquido in eccesso.
- Con la mano di movimentazione del mouse, tenere delicatamente il mouse per la tracolla del collo. Con l'altra mano, posizionare la punta del tampone oculare contro la regione congiuntivale mediale dell'occhio sinistro, vedere figura 2A. Premere leggermente il bulbo oculare e spostare il tampone in un movimento di lavaggio della finestra (Figura 2B) avanti e indietro, tra la palpebra inferiore e l'occhio, 10 volte. Mantenere una pressione costante.
- Senza toccare la pelliccia, rimuovere delicatamente la punta del tampone, perpendicolare al punto in cui è stata inserita, e posizionare il lato di cotone tampone verso il basso direttamente in un tubo di micro-centrifuga etichettato contenente supporti BHI. Applicare un colliro lubrificante sull'occhio tamponato.
- Riportare il topo nella gabbia.
- Lasciare riposare il tampone per 10-15 minuti sul ghiaccio e rimuovere il tampone per gli occhi con la mano guantata sterilizzata mescolando la punta nel supporto per 10 rotazioni. Ritirare il tampone ruotando la punta contro la parete interna del tubo di micro-centrifuga per 5 rotazioni. Smaltire il tampone in un contenitore a rischio biologico.
- Ripetere i passaggi da 1.3.2 a 1.3.7 per ogni mouse e per i campioni di controllo (pelle o tampone di pelliccia). Sterilizzare i guanti in modo appropriato tra ogni tampone.
- arricchimento
- Arricchire il campione incubando il tubo in modo statico per 1 h a 37 °C
- Durante l'incubazione, etichettare una soia triptatasi a temperatura ambiente con una piastra di agar del sangue di pecora al 5% (piastra TSA) per topo e dividerla a metà.
- Dopo l'incubazione della coltura del tampone oculare, rimuovere i campioni arricchiti dall'incubatrice e posizionare sul ghiaccio.
- Campioni di vortice brevemente da mescolare e placcare secondo lo schema nella figura 3A. Aliquota 10 μL del campione sulla piastra TSA e inclinare la piastra per formare una striscia, ripetere 2 volte.
- Dall'altro lato della linea di demarcazione della piastra, punto 10 μL di campione sull'agar, ripetere 9 volte.
- Incubare le piastre a 37 °C per 18 ore, 2 giorni e 4 giorni (in una camera pulita che impedisce l'essiccazione delle piastre di agar). Contare le colonie in strisce, notare la morfologia e calcolare le unità di formazione delle colonie (CNO) per tampone per isolati morfologicamente simili. Guarda i punti per organismi unici non catturati a strisce.
2. Piastra principale, caratterizzazione e identificazione dei microbi oculari
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Piastra principale
- Disegnare griglie sul retro di una piastra TSA (Figura 3B). Scegli una colonia con uno stuzzicadenti sterile da ogni piastra del tampone per gli occhi del mouse e strisci il quadrato della piastra principale (griglie), la griglia delle etichette con il numero di colonia e le informazioni sul mouse. Scegli e placca tre diverse colonie per ogni colonia morfologicamente distinta.
- Incubare la piastra durante la notte a 37 °C. Continuare l'incubazione per 96 ore, controllando quotidianamente la comparsa di nuovi isolati.
NOTA: La popolazione di Commensal varierà in base all'età del topo, all'alimentazione, allo stato della malattia e alle pratiche di permanenza in gabbia. La caratterizzazione isolata si basa sui batteri anaerobici aerobici e facultativi predominanti presenti nel nostro laboratorio.
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caratterizzazione
- Duplicarei microbi a 13 piastre sulle piastre Mannitol Salt Agar (MSA) e MacConkey (MAC), incubare durante la notte a 37 °C. Si noti la crescita per ogni isolato e la presenza di colonie cere o colonie gialle con alone su MSA.
- Per i cocci gram positivi, prova con il test dellacatalasi 13,14. Posizionare una goccia di perossido di idrogeno al 3% su uno scivolo di vetro pulito. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, scegliere il microbo corrispondente dalla piastra del tampone per gli occhi. Nessuna formazione di bolle indica Streptococcus spp., leggera formazione di bolle indica Corynebacterium spp. e forse Aerococcus spp.
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Identificazione: analisi MALDI-TOF MS
NOTA: Le identificazioni batteriche vengono effettuate utilizzando il MALDI-TOF e il Database software. Questo sistema utilizza la ionizzazione del desorbimento laser assistito da matrice-tempo di spettrometria di massa di volo (MALDI-TOF MS) per lo sviluppo di profili di spettri che vengono confrontati con spettri batterici noti per l'identificazione. E.coli, ATCC 8739, viene utilizzato per la calibrazione del sistema.- La piastra batterica si isola su piastre TSA contenenti il 5% di sangue di pecora e incuba durante la notte con il 5% di anidride carbonica a 37 °C.
- Utilizzando un loop da 1 μL, applicare uno strato sottile dei batteri puri allo scivolo bersaglio MALDI-TOF; 1 μL di soluzione a matrice CHCA MALDI-TOF MS (acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico) è sovrapposto e lasciato asciugare completamente all'aria prima di caricare lo scivolo nello strumento MALDI-TOF.
- Ogni isolato viene individuato in duplicato.
- I rapporti contenenti punteggi di probabilità superiori all'80%, che indicano un elevato valore di discriminazione, sono accettati come risultati affidabili e l'identificazione batterica accettata.
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Representative Results
I risultati rappresentativi di una piastra per tamponi per gli occhi che dimostra diversi metodi di placcatura sono raffigurati nella figura 3A che mostra isolati morfologicamente diversi dal mouse C57BL/6. Per ogni isolato distinto, le colonie sono state contate nella striscia e l'abbondanza relativa, unità di formazione delle colonie uniche (CTU) per tampone oculare, calcolate e tracciate a scopo di confronto. Per la caratterizzazione microbiologica, i batteri sono stati prelevati da singole piastre per tamponi per topi per produrre una piastra TSA master (creata raccogliendo isolati morfologicamente distinti in triplice copia da ogni piastra del tampone per gli occhi del topo). Dalla piastra principale, il giorno successivo o quando appare la crescita, sono stati eseguiti ulteriori test per caratterizzare o identificare i microbi. La piastra principale è stata utilizzata per fornire abbastanza inoculo per espandere i rispettivi isolati.
Le specie sono state caratterizzate con tecniche microbiologiche e poi identificate dall'analisi MALDI-TOF MS. Ogni isolato dalla piastra principale, è stato testato mediante test catalasi13,14 e coltivato su supporti selettivi. Poiché i microbi predominanti nei nostri studi sono Streptococcus spp., Staphylococcus spp. La crescita sul sale di mannitol Agar indica Staphylococcus spp13,16. Poiché l'MSA contiene rosso fenolo, un alone giallo intorno alla colonia indica la fermentazione del mannito e la classificazione come Staphylococcus aureus (confermare con test alternativi come il test della coagulasi)13. La crescita sull'agar MacConkey indica batteri Gram negativi, poiché i sali biliari e il viola cristallino sono in grado di trasgredire la membrana batterica e inibire la crescita batterica gram positiva13. La crescita cerosa su MSA indica la produzione di acido micolico e può essere dovuta ad organismi come Corneybacterium spp13. Infine, il test della catalasi differenzia lo Streptococcus spp.
Per identificare gli isolati, una piastra TSA è stata striata e incubata durante la notte in un ambiente di anidride carbonica del 5% e 37 °C e MALDI-TOF MS eseguita. La figura 4 mostra i risultati S. acidominimus (un membro di viridans Streptococcus spp. 17) e A. viridans. Spesso Aerococcus spp. sono erroneamente identificati come il gruppo viridans di streptococchi18,19, basato su test biochimici e fenotipici. MALDI-TOF MS è stata in grado di identificare gli isolati con un livello di confidenza di 99,9 senza specie non identificabili.
Differenze di pregiudizio sessuale possono essere osservate nella figura 5, dove livelli significativamente diversi di organismi commenali sono stati recuperati da topi C57BL/6 maschi e femmine. È stata determinata l'abbondanza relativa per ogni isolato. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans e coagulasi stafilococco negativo(SNC)isolano #1 ed E. coli spp. sono stati trovati in tutti i topi, con i maschi che mostrano una maggiore abbondanza relativa e una maggiore diversità.
Figura 1: Tampone per gli occhi interno.
( A ) Trailpunto dello stuzzicadenti sterile e l'indice è stato tenuto un sottile pezzo di cotone tirato di circa 1 cm e lo stuzzicadenti è stato arrotolato mantenendo una leggera pressione contro l'indice fino a quando il cotone non è stato completamente arrotolato sulla punta dello stuzzicadenti. (B) Esempio di tampone oculare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Posizionamento congiuntivale del topo del tampone oculare.
(A) La punta del tampone per gli occhi bagnati BHI è stata inserita, con un angolo di 90°, nell'angolo mediale dell'occhio sinistro di un topo anestetizzato, deprimendo il bulbo oculare. (B) Il tampone è stato spostato lungo la congiuntiva mantenendo una leggera pressione sull'occhio con un movimento avanti e indietro, 10 volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi per il tampone oculare e le piastre master.
(A) 10 μL di supporti arricchiti inoculati per tamponi oculari sono stati aliquoti sul lato destro della piastra di agar del sangue e inclinati da 30 a 60 gradi per consentire al supporto di formare strisce e sul lato sinistro della piastra sono stati dispensati dieci punti da 10 μL del campione. La fotografia della piastra incubata mostra le singole colonie e la diversità morfologica. (B) Una piastra principale di isolati è stata creata raccogliendo una colonia dalla piastra del tampone oculare e striature all'interno di uno dei quadrati (griglie). Tre colonie morfologicamente simili sono striate in griglie separate. Ogni griglia ha tre strisce della stessa colonia che è stata raccolta dalla piastra del tampone per gli occhi del topo. Dopo che la crescita è apparsa sulle piastre, l'isolato è stato caratterizzato da placcatura selettiva e test catalasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempio di risultati MALDI-TOF MS.
Ogni isolato è stato coltivato su TSA durante la notte, applicato allo scivolo MALDI-TOF MS e sovrapposto con soluzione MALDI-TOF MS, essiccato all'aria e individuato in duplicato. I risultati di Streptococcus acidominimus (A) e Aerococcus viridans (B) sono stati identificati positivamente con un valore di confidenza di 99,9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Crescita congiuntiva commenale a pregiudizio sessuale.
I topi C57BL6/N abbinati all'età sono stati confrontati per la relativa diversità commensale. Gli occhi erano tamponati e gli organismi commensali identificati. La specie più predominante era lo Streptococcus acidominimus, che era significativamente più abbondante nei topi maschi che femmine (ANOVA a 2 modi, p<0.0001). Sono stati identificati 5 diversi isolati del SNC, Aerococcus viridans ed E.coli. Mentre alcuni degli isolati del SNC non erano presenti in tutti i topi, lo Streptococcus acidominimus, l'Aerococcus viridans, l'isolato 1 del SNC e L'E. coli sono stati trovati in tutti i topi con abbondanzadistinta . Si prega di fare clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
A causa dello stato paucibacterial della superficie oculare, molti laboratori hanno avuto difficoltà a isolare i commensaloculari 7,20, con conseguente basso numero di campioni con crescita, bassa abbondanza e bassa diversità8. Questo metodo migliora significativamente le pratiche di coltura standard4,21 con l'aggiunta di una fase di arricchimento, nonché un tampone per gli occhi ridisegnato e l'identificazione da parte di MALDI-TOF MS. La fase di arricchimento affronta la bassa recuperabilità amplificando la carica batterica. Il significativo aumento dei batteri recuperabili da meno di 100 CFU all'abbondanza relativa di 2.500 CFU per tampone oculare per topi maschi di tipo selvatico suggerisce che l'incubazione in mezzi ricchi di nutrienti rinvigorisce batteri vitali ma non coltivabili22,23, consentendo così il recupero di microbi dormienti. Recenti fasi di arricchimento basate sulla coltura sono state incorporate negli studi di sequenziamento molecolare del microbiota per consentire la discriminazione tra le firme di espressione ospite e microbica24,25,26e per amplificare i generi rari. Il nostro passo di arricchimento del protocollo è il primo ad essere applicato agli studi sul microbioma oculare e utilizza l'arricchimento per selezionare microbi vivi, espandere il numero di isolati scarsi recuperabili e forse rianimare commensal vitali ma non coltivabili. Inoltre, il nostro tampone per gli occhi realizzato internamente consente lo spavaldamento mirato della congiuntiva, riducendo la contaminazione dalla pelle / pelliccia circostante a causa delle sue piccole dimensioni e della sottile forma affusolata appuntita. La scelta dello spessore e del materiale del rivestimento del tampone èimportante 21. Questo tampone per gli occhi fatto in laboratorio è rivestito con un sottile strato di batting di cotone non tossico, che impedisce l'intrappolamento commensale tamponato all'interno del materiale tampone, oltre ad essere preferibile ai tamponi per gli occhi alginati di calcio che possono esserecitossici 27. I test longitudinali dimostrano che il nostro metodo è riproducibile; con i batteri dominanti recuperati dai tamponi oculari tra cui Streptococcus spp. Questi risultati concordano con i risultati pubblicati per i generi oculari anaerobici dominanti7,9,20 rilevati tramite metodi basati sulla coltura o sull'imaging. Questo metodo ha trovato uno spettro più ampio di isolati nella congiuntiva, tra cui Escherichia coli e Pseudomonas spp. Inoltre, l'identificazione da parte di MALDI-TOF MS consente una migliore discriminazione tra generi e specie, come il gruppo viridans di streptococchi e Aerococci spp. 19di28.
Tre passaggi sono fondamentali per massimizzare il risultato: produzione di tamponi per occhi, tecnica del tampone per gli occhi e selezione unica dell'isolato dalla piastra del tampone per gli occhi. Come discusso in precedenza, uno strato piatto di cotone molto sottile è importante per la cattura iniziale dei commensal dalla superficie oculare e per il loro successivo rilascio nel supporto di arricchimento. Tamponi spessi o grumosi possono portare alla selezione di contaminanti, oltre a trattenere gli isolati all'interno della punta del tampone. In secondo luogo, la depressione continua del bulbo oculare durante lo svezzamento è necessaria per ridurre al minimo la contaminazione dalle superfici circostanti. La tecnica ideale di tampone prevede l'inserimento normale (90 gradi) del tampone nel fornix congiuntivale inferiore mediale e una pressione di tampone costante accoppiata a un lento movimento continuo. Infine, la piastra del tampone per gli occhi deve essere monitorata giornalmente per selezionare gli isolati appena apparsi o quelli che crescono a un ritmo diverso al fine di catturare completamente il microbioma rappresentativo.
Esistono alcune limitazioni del protocollo che possono essere affrontate con una chiara comprensione dei risultati o della modifica del protocollo. I risultati sono una misura dell'abbondanza commensale relativamente vitale, e non dell'effettivo carico batterico congiuntivale, con l'obiettivo di definire la comunità commensalo oculare. L'abbondanza relativa e la diversità sono state utilizzate nei nostri studi per scopi comparativi nella cheratite batterica, così come, per indagare la risposta immunitaria innata nei topi knock-out e di tiposelvatico 12. Inoltre, l'identificazione da parte di MALDI-TOF MS dipende da un databasesostanziale 28,che fornisce un risultato di "nessun ID" per profili di spettri isolati sconosciuti, evidenziando l'importanza di utilizzare un database corrente. Infine, questo protocollo rileva solo i batteri anaerobici aerobici e facultativi, ma la sua struttura è adattabile e può essere costruita per aiutare a definire lo spazio microbico oculare modificando i mezzi di arricchimento, le condizioni di crescita delle piastre e il mezzo di selezione. Cambiando la piastra principale e le condizioni di crescita dell'arricchimento in anaerobico, può essere rilevato un altro commensal oculare comunemente isolato, Propionibacterium spp. o altri anaerobi; anche se, nelle nostre mani non abbiamo visto quasi nessuna crescita anaerobica.
Forse, questa struttura può essere utilizzata in combinazione con tecniche di sequenziamento del DNA profondo. Un grosso ostacolo nell'identificazione dei microbi tramite il sequenziamento del DNA è l'incapacità di valutare lafattibilità 10. Questo protocollo può fornire un metodo ortogonale modificando i mezzi di arricchimento e le condizioni di placcatura in modo che corrispondano ai criteri di crescita preferiti di un isolato candidato (identificato dal sequenziamento del DNA). Ciò può portare a un prezioso approccio basato sulla cultura per catturare commensals da batteri vitali ma incolti o specie presenti ma a bassa abbondanza.
La definizione della comunità commerciale oculare vitale è essenziale per esaminare il profilo di espressione commenale oculare. Un'ampia ricerca suggerisce che gli acidi grassi a catena corta e i prodotti microbici modulano la risposta immunitaria oculare3,29,30,31,32,33e che la loro azione si verifica localmente. Ciò suggerisce che non solo la produzione distale, ma anche la produzione locale di questi fattori è importante. Inoltre, stati di malattia come malattie dell'occhio secco e diabete cambiano il microbioma della superficie oculare4,6,33,34. Ciò evidenzia la necessità di un metodo che colmi il sequenziamento basato sul DNA e approcci basati sulla cultura in modo da poter meglio definire il microbioma oculare praticabile in salute e malattia.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi da rivelare.
Acknowledgments
I finanziamenti del P30 DK034854 hanno supportato VY, LB e studi nel Massachusetts Host-Microbiome Center e finanziamenti da NIH/NEI R01 EY022054 supportato MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
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