Summary
该协议提供胆瘤发芽测定，微血管增殖的外体模型。这种测定可用于评估增殖胆小血管所涉及的途径，并评估使用野生型和转基因小鼠组织的药物治疗。
Abstract
病理胆瘤血管生成，年龄相关的黄斑变性的显著特征，导致视力障碍和失明。使用人类视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）或分离原发性视网膜EC进行内皮细胞增殖检测，在体外模型中广泛使用，用于研究视网膜血管生成。然而，分离纯杂音视网膜内皮细胞在技术上具有挑战性，视网膜ECs可能有不同的增殖反应比胆状内皮细胞和不同的细胞/细胞相互作用。开发了一种高度可重复的外体胆瘤发芽测定，作为胆球微血管增殖的模型。该模型包括胆道血管（EC、巨噬细胞、心状物）和视网膜色素上皮（RPE）之间的相互作用。小鼠RPE/胆状/细胞外植在生长因子减少基膜提取物（BME）（第0天）中分离和孵育。中等每隔一天改变一次，胆瘤发芽在第6天被量化。使用倒置相显微镜拍摄单个胆瘤外植的图像，并使用本实验室开发的 ImageJ 软件半自动宏插件对发芽区域进行量化。这种可重复的外体胆瘤发芽测定可用于评估化合物的潜在治疗和微血管疾病研究，以评估使用野生型和转基因小鼠组织参与胆小血管增殖的途径。
Introduction
胆血管生成失调与新血管年龄相关的黄斑变性（AMD）1。胆小球是视网膜色素上皮（RPE）下的微血管床。研究表明，胆瘤中血流量的减少与AMD2的进展有关。血管内皮、RPE、巨噬细胞、心肺和其他细胞之间的复杂关系是组织3、4、5的平衡。因此，可重复的测定建模对新血管AMD的研究至关重要。
前活体血管生成测定和体外内皮细胞培养可以补充对体内微血管行为的研究，用于测试新药和机制学研究。内皮细胞，如人类视网膜微血管内皮细胞（HRMEC），人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC），分离的原兽脑或视网膜ECs，常用于体外研究，用于眼血管生成研究6，7，8。特别是HRMEC已被广泛用作体外胆状新血管化（CNV）9的模型，通过评估内皮增殖、迁移、管状形成和血管渗漏来评估干预6、10。然而，由于在胆道中与其他细胞类型缺乏相互作用，并且由于这些测定中使用的大多数EC并非源自胆瘤，培养中的EC作为CNV的模型受到限制。在培养中，小鼠巧克力球状电子能难以分离和维护。
大动脉环测定被广泛用作大血管增殖的模型。来自大动脉外植的血管芽包括 ES、周食和巨噬细胞11。大音环测定模型大血管发生井12，13，14。然而，它作为胆囊新血管化的模型有局限性，因为大动脉环是缺乏特征的胆囊微血管环境的大血管组织，而来自大型血管的芽可能与涉及微血管病理学的毛细管网络的芽不同。最近，一个小组发表了一个前维维视网膜测定15，16。虽然，它适用于视网膜新血管疾病，但它不像在AMD中所看到的那样适合胆状新血管化。
利用小鼠RPE、胆球和胆碱外植组织进行胆瘤发芽测定，以更好地模拟CNV。组织可以很容易地从小鼠（或其他物种）的眼睛17分离。这种测定允许重复评估药理化合物的亲血管原位和抗血管原位，并评估特定途径在胆道新血管化中的作用，利用转基因小鼠和对控组18。这种胆瘤发芽测定已在许多后续出版物9，10，18，19，20被引用。在这里，演示了使用这种测定的方法。
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Protocol
所述的所有动物实验都得到波士顿儿童医院机构动物护理和使用委员会的批准（ARCH协议号19-04-3913R）。
1. 准备
- 加入5 mL的青霉素/链霉素（10000 U/mL）和5 mL和10 mL的商用补充剂到500 mL的完整经典介质与血清。最初为 50 mL 的介质的 Aliquot。
注：请勿将任何介质退回库存，以免受到污染。 - 在冰上放一完全经典介质。
- 使用 70% 乙醇清洁解剖显微镜、钳子和剪刀。
- 准备两个细胞培养皿（10厘米），一个在解剖显微镜上，一个在冰上;在每道菜中放入 10 mL 的完整经典介质。
2. 实验步骤 （图1）
- 牺牲C57BL/6J小鼠周围的产后（P） 20使用75-100毫克/千克氯胺酮和7.5-10毫克/千克木氨酸注射在陷阱酮。解剖前，在冰上保持眼睛完全的经典介质。
- 去除结缔组织（肌肉和脂肪组织）和眼睛上的视神经。
- 使用微剪刀圆圆切 0.5 mm 后角膜边缘。去除角膜/虹膜复合物、玻璃和透镜。
- 使切削边缘垂直于视神经的切口为 1 mm，并切割 1 mm 宽度的圆周带。将建筑群的中央和外围区域分开。使用钳子从RPE/胆状/四分层复合物中剥离视网膜。
- 保持外设胆小球带在冰上完全经典介质;隔离另一只眼睛，并重复这个过程，以削减第二个带。
- 将圆形带切成 6 = 相等的方形片（±1 mm x 1 mm）。
注：切勿接触任何边缘。 - 根据制造商的指示解冻基底膜提取物 （BME）。将 30 μL/μL/井的 BME 添加到 24 井组织培养板的每个井的中心。确保 BME 的液滴在板底部形成凸形圆顶，而不接触边缘。
注：在冰箱中通宵解冻 BME。解冻后，BME 应随时在冰上。 - 将组织放在 BME 的中间。
注：不要压平胆状外植;一般来说，让组织在BME内膨胀。组织的方向（侧向上或向下）不会影响实验结果。 - 在37°C下孵育板10分钟，让凝胶凝固。
- 加入 500 μL 的完整经典介质/井。
- 每隔一天更换一次经典介质（500 μL）。用显微镜观察3天后，可以观察到胆状芽。
注：对于生长因子治疗，使组织挨饿4小时。稀释生长因子降低介质中的试验化合物（1：200 提升而不是 1：50）。
3.SWIFT-Choroid计算机化定量方法17 （图2）
注：使用计算机化方法测量生长容器覆盖的区域。在量化之前，需要 ImageJ 软件的宏插件（有关更多详细信息 ，请参阅 补充信息）。
- 使用 ImageJ 打开 choroid 发芽图像并检查"图像|类型|8 位 "与灰度。
- 转到"图像|调整|亮度/对比度（Ctrl/shift/C）"并优化对比度。
- 使用魔杖功能从图像中轮廓和去除存在于芽的中心的胆状组织（使用快捷键"F1"）（图2A，B）。
注：将魔杖的容差率设置为 20-30%。 - 使用自由选择工具移除图像的背景（图 2C）。转到"图像|调整|阈值 （Ctrl/shift/T）"。使用阈值函数在背景和外围定义微血管芽（图 2D）。
- 单击"F2"，将显示摘要。单击"保存"来保存所选区域的图像。保存与原始图像相同的文件夹中，供将来参考。
- 测量一组样本后，复制记录以进行数据分析。
注：也可以通过"分析"测量面积（μm2）|使用带比例条的图像设置比例"。
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Representative Results
每天胆小球发芽生长的比较
我们解剖了带sclera的胆小球，嵌入到BME中，并培养了6天（图1）。第3天至第6天C57BL/6J小鼠的胆瘤发芽用显微镜检查，用SWIFT-Choroid对图像J中的半自动定量方法进行量化。在一个代表性的案例中，第3天（图3A）的胆状发芽区（从外植延伸的容器，不包括外植本身）为0.38毫米2（图3A），第4天为1.47毫米2（图3B），第5天为5.62毫米，第5天（图3C）为5.62毫米，第6天为10.09毫米2（图3D）。
自由脂肪酸受体（FFAR）4抑制加剧胆状神经血管化外体。
使用胆道发芽测定法18评估FFAR4（也称为G蛋白耦合受体120）对胆结血管发芽的影响。从 Ffar4敲出（-/-）和Ffar4+/+ 小鼠和培养的小鼠中解剖 了胆 小球、RPE和硬质肌结。 Ffar4-/- 与第 6 天的 Ffar4+/+ 相比，Ffar4-/- 增加的胆血管生长（p = 0.004）（图 4A，B）。与第6天未经治疗的小鼠相比，FFAR4激动剂（1 μM）的治疗减少了胆状发芽面积（p = 0.03）（图4C，D）。
图1：显示胆囊发芽测定的示意图图。
眼睛首先被诱化，并切圆周约0.5毫米后肢。角膜，虹膜，透镜和玻璃被移除。然后，从眼杯边缘向视神经切割了1毫米。然后，一个带被割以约1.0毫米后切边缘和带和周围区域的复合体分开。该带被切成约1毫米x1毫米件，并嵌入BME。然后使用显微镜，从胆小球的微血管芽被可视化。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：SWIFT-Choroid计算机化定量方法。
（A，B）魔杖功能用于勾勒出芽中心（白色箭头）的胆状组织（白箭），并以数字方式移除（快捷键"F1"）。 （C，D） 使用自由选择工具（黑色箭头）移除了图像的背景。然后，在背景和外围使用阈值函数定义微血管芽。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：鼠标外设胆瘤发芽。
（A-D）使用 C57BL/6J 小鼠的胆芽具有代表性的图像，以及 SWIFT-Choroid 方法的演示，量化芽的面积。第3天（A）的胆状发芽区为0.38毫米2，第4天（B）为1.47毫米2，第5天（C）为5.62毫米，第6天（D）为10.09毫米。 比例杆;500 μm.请点击这里查看这个数字的较大版本。
图4：自由脂肪酸受体（FFAR）4抑制加剧胆状新血管化。
（A） 与Ffar4淘汰（-/-）小鼠相比，使用自由脂肪酸受体（Ffar）4+/=的发芽测定具有代表性的图像：上部图像显示Ffar4+/+，而下图显示Ffar4-/-choroid。（B）Ffar4-/-与Ffar4+/+ 小鼠（n = 6-8）相比，显示胆瘤发芽增加。（C）胆瘤发芽的代表性图像：上部图像演示车辆处理（控制）;下图演示 FFAR4 激动剂治疗。（D） FFAR4 激动剂抑制胆瘤发芽相比控制 （n = 10×12）。比例线 = 500 μm。数据通过学生的 t-test 进行分析，并表示为平均± SE.*p < 0.05;**p < 0.01.这个数字已经修改了从托米塔等人18。请单击此处查看此图的较大版本。
补充文件1：如何创建插件和快捷方式的胆芽检测程序。请点击这里下载此文件。
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Discussion
胆瘤发芽分析辅助研究的新血管AMD9，10，18，19，20。胆龙外植可以从老鼠以及大鼠和人类17，21分离。胆道外植包括ECs，巨噬细胞，和心状体17。在此测定胆道DC与相邻细胞（如RPE细胞）之间的相互作用，有助于阐明胆道血管生长中涉及的机制17。此外，这种可重复和半自动评估方法可减少观察器间变异性17。
首次发表的关于外活胆瘤组织的研究使用分离的胆球体来测试具有治疗D DR和AMD22、23、24、25潜力的药理干预。测定计算发芽血管的数量和长度，这些血管可受到观察器间变异性的影响。相比之下，此处描述的量化方法已标准化17。这种微血管胆结血管的测定包括互动伙伴细胞和细胞外基质。培养中的 2S 可能会失去许多生理特性，例如形成血管管26的能力，这可能是由于与其他细胞（如 RPE）失去相互作用。因此，EC体外培养物可能并不反映胆状新血管化的所有方面。大动脉环测定包括大血管内皮细胞和互动细胞，以评估从大血管发芽。但大血管芽可能无法准确反映胆状微血管疾病27。胆道发芽测定是胆瘤微血管反应的更紧密表现。
有重要的注意事项。首先，外周胆结复合的外植芽比中央区17段的外植更一致，生长速度也快得多。其次，从胆小球的RPE没有删除，因为带RPE的胆芽生长比没有RPE17快得多。为了了解药物对胆管的影响，可以使用没有RPE的测定。最后，在利用魔杖功能勾勒出胆状组织和发芽区的图像时，有时由于背景噪声高，很难追踪胆状芽区。图像之间可能变化。因此，为了保持一致性，在 choroid 和背景之间以数字方式创建足够的对比度非常重要，如图 2 所示。
总之，外体胆瘤发芽测定已被定性和半自动。该方法为AMD研究提供了实验工具。这种检测可用于筛选化合物作为潜在的治疗或评估使用野生类型和转基因小鼠组织增殖的胆小球微血管所涉及的途径。
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Disclosures
提交人没有财务披露。计算机化方法通过作者免费提供给学术机构。
Acknowledgments
这项工作得到了曼佩铃木糖尿病基金会（YT）、波士顿儿童医院 OFD/BTREC/CTREC 教师职业发展补助金、波士顿儿童医院眼科基金会、BCH 试点奖、BCH 曼顿中心奖学金和小长颈鹿基金会 （ZF）、德国研究基金会 （DFG; 到 BC [CA1940/1-1]）， NIH R24EY024868， EY017017， R01717-13S1， EY030904-01， BCH IDDRC （1U54HD090255）， 马萨诸塞州狮子眼基金会 （LEHS）.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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