Summary
このプロトコルは、微小血管増殖の元生体モデルである脈絡芽発芽アッセイを提示する。このアッセイは、脈絡膜微小血管の増殖に関与する経路を評価し、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた薬物治療を評価するために使用することができる。
Abstract
加齢黄斑変性症の顕著な特徴である病的脈絡膜血管新生は、視力障害および失明を引き起こしうる。ヒトのレチナル微小血管内皮細胞(HRMEC)または単離された一次性の腎細胞を用いた内皮細胞(EC)増殖アッセイは、腎血管新生を研究するために、インビトロモデルで広く使用されている。しかし、純粋なマウスのレチナル内皮細胞を単離することは技術的に困難であり、RETINAL ECは脈絡膜内皮細胞および異なる細胞/細胞相互作用とは異なる増殖応答を有する可能性がある。脈絡膜微小血管増殖のモデルとして、再現性の高いex vivo脈絡膜発芽アッセイが開発された。このモデルには、脈絡膜血管系(EC、マクロファージ、ペリサイト)と網膜色素上皮(RPE)の相互作用が含まれます。マウス RPE/脈絡膜/鎖状外植体は、成長因子減少基底膜抽出物(BME)(0日目)で単離され、インキュベートされる。培地は1日おきに変化し、6日目に脈絡芽が定量される。個々のチョロイド外植の画像は反転した位相顕微鏡で撮影され、発芽領域は、本研究室で開発されたImageJソフトウェアへの半自動マクロプラグインを使用して定量化されます。この再現性ex vivo脈絡膜発芽アッセイは、潜在的な治療のための化合物を評価し、微小血管疾患研究のために、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた脈絡膜微小血管増殖に関与する経路を評価するために使用することができる。
Introduction
脈絡膜血管新生調節異常は、新血管加齢黄斑変性症(AMD)1と関連している。脈絡膜は、網膜色素上皮(RPE)の下に存在する微小血管床である。脈絡膜における血流の減少は、AMD2の進行と関連することが示されている。血管内皮、RPE、マクロファージ、包皮細胞および他の細胞との間の複雑な関係は、組織3、4、5の恒常性を担う。従って、再生可能なアッセイは、新血管AMDの研究に重要な脈絡膜微小環境をモデル化する。
Ex vivo血管新生アッセイおよびインビトロ内皮細胞培養は、生体内の微小血管挙動の研究、新薬の試験、および病原性の研究を補完することができる。ヒトの眼内小血管内皮細胞(HRMEC)、ヒトアンビリカル静脈内皮細胞(HUVEC)、単離された原発性動物の脳または眼内脳の脳などの内皮細胞は、眼血管新生研究6、7、8の体外研究でしばしば使用される。特にHRMECは、内皮増殖、移動、管形成、および血管漏れを評価することによってインビトロ脈絡膜新血管新生(CNV)9のモデルとして広く使用され、介入を評価する6,10。しかし、培養中のECは、脈絡膜に見られる他の細胞型との相互作用が欠如し、これらのアッセイで使用されるほとんどのECが脈絡膜に由来しないため、CNVのモデルとして制限されています。マウス脈絡膜電子株は培養中に分離し維持することが困難である。
大動脈環アッセイは、マクロ血管増殖のモデルとして広く用いられている。大動脈外植植物からの血管芽は、IC、ペリサイトおよびマクロファージ11を含む。大動脈環アッセイは、大血管血管新生ウェル12、13、14をモデル化する。しかし、大動脈環としての脈絡膜新血管化のモデルとしての限界があり、特徴的な脈絡膜微小血管環境を欠いた大血管組織であり、大血管からの芽は微小血管病理に関与する毛細血管ネットワークとは異なる可能性がある。最近、グループは、元生体のレティナルアッセイ15、16を発表しました。しかし、それは、疾患性新血管疾患に適しているが、それはAMDに見られるほど脈絡膜新血管化に適していない。
マウスRPE、脈絡膜、および硬化分離組織を用いた脈絡膜発芽アッセイは、より良いモデルCNVのために開発された。組織はマウス(または他の種)の目17から容易に単離することができる。このアッセイは、薬理学的化合物のプロおよび抗血管新生電位の再現性評価及び遺伝子組換えマウスおよび対照18からの組織を用いた脈絡膜新生血管形成における特定の経路の役割の評価を可能にする。この脈絡膜発芽アッセイは、その後の多くの出版物9、10、18、19、20で参照されています。ここでは、このアッセイの使用に関与する方法が示される。
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Protocol
記載されているすべての動物実験は、ボストン小児病院の施設動物ケアおよび使用委員会(ARCHプロトコル番号19-04-3913R)によって承認されました。
1. 準備
- ペニシリン/ストレプトマイシン(10000 U/mL)5 mLと5mLと10mLの市販サプリメントを、完全な古典的な培地の500 mLに血清で加えます。初期の培地のアリコート50mL。
注:汚染を避けるために、在庫に媒体を戻さないようにしてください。 - 氷の上に完全な古典的な媒体のアリコートを置きます。
- 70%エタノールを使用して、解剖顕微鏡、鉗子、ハサミを洗浄してください。
- 解剖顕微鏡に1つ、氷の上に1つ、2つの細胞培養皿(10 cm)を準備します。各皿に完全な古典的な媒体の10 mLを入れてください。
2. 実験ステップ (図 1)
- 75-100 mg/kgケタミンを使用した出生後(P)20の周りのC57BL/6Jマウスを犠牲にし、7.5-10 mg/kgキシラジンを腹腔内注射する。解剖する前に氷の上に完全な古典的な媒体で目を保ちます。
- 結合組織(筋肉と脂肪組織)と眼の視神経を取り除きます。
- マイクロハサミを使用して角膜のリンブに0.5mm後部を円周的に切断します。角膜/虹彩複合体、ガラス状、レンズを取り除きます。
- 1mm切開を視神経に向かって切り取りエッジに垂直にし、幅1mmの円周バンドを切断します。複合体の中央領域と周辺領域を分離します。鉗子を使用して、RPE/脈絡/強膜複合体からレチナを剥がします。
- 氷の上に完全な古典的な媒体で末梢脈絡膜バンドを保ちます。もう一方の目を分離し、2番目のバンドを切断するプロセスを繰り返します。
- 円形のバンドを6~等しい正方形(〜1mm×1mm)に切ります。
注意:どのエッジにも触れないでください。 - 製造指図ごとに基底膜抽出物(BME)を解凍します。BMEの30 μL/wellを24ウェル組織培養プレートの各ウェルの中央に加えます。BMEの液滴が、エッジに触れることなくプレートの底部に凸型ドームを形成していることを確認してください。
注:冷蔵庫で一晩BMEを解凍してください。BMEは解凍後いつでも氷の上にあるべきです。 - BMEの真ん中に組織を置きます。
注意:脈絡膜の外植を平らにしないでください。一般に、組織をBME内で拡大させる。組織の向き(強膜側の上下)は、実験結果に影響を与えません。 - 37°Cでプレートを10分間インキュベートし、ゲルを固化させます。
- 完全な古典的な媒体/井戸の500 μLを加える。
- クラシックメディアを1日おきに変更します(500 μL)。脈絡芽は顕微鏡で3日後に観察することができる。
注:成長因子治療のために、4時間組織を飢えます。増殖因子還元培地で試験化合物を希釈する(1:50の代わりに1:200ブースト)。
3.SWIFT-コロイドコンピュータ化定量方法17 (図2)
注:成長する船舶がカバーする面積を測定するためのコンピュータ化された方法が使用されました。ImageJ ソフトウェアへのマクロプラグインは、定量化の前に必要です (詳細については 補足情報 を参照してください)。
- イメージJでチョロイドの発芽画像を開き、「画像|タイプ|グレースケールの 8 ビット "
- 「 イメージ |に移動する|を調整する明るさ/コントラスト(Ctrl/シフト/C)を使用し、コントラストを最適化します。
- 魔法の杖機能を使用して、新芽の中心に存在する脈絡膜組織を画像から外し、(ショートカットキーを使用してF1")(図2A,B)を使用します。
注:魔法の杖の許容率を20〜30%に設定します。 - 自由選択ツール (図 2C)で画像の背景を削除します。「 イメージ |に移動する|を調整するしきい値 (Ctrl/シフト/T)"。閾値関数を使用して、背景および周辺に対する微小血管芽を定義する(図2D)。
- [F2]をクリックすると、概要が表示されます。[保存] をクリックして、選択した領域の画像を保存します。今後の参照のために、元の画像と同じフォルダに保存します。
- サンプルのグループを測定した後、データ分析のために記録されたデータをコピーします。
注:また、「分析|で面積(μm²)を測定することも可能です。スケールバー付きのイメージを使用してスケール " を設定します。
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Representative Results
1日あたりの脈絡芽成長の比較
BMEに埋め込まれた鎖骨で脈絡膜を解剖し、6日間培養した(図1)。C57BL/6Jマウスで3日目から6日目までの脈絡芽を顕微鏡で調べ、ImageJでの半自動定量法をSWIFT-チョロイドで定量した。代表的な場合、発脈芽領域(外植から伸びる血管は、外植自体を除く)は、3日目(図3A)、4日目(図3B)で1.47mm2、5日目(図3C)で5.62mm2、6日目に10.09mm2(図3D)で0.38mm(外植自体を除く)であった。
遊離脂肪酸受容体(FFAR)4抑制は、脈絡膜新生血管化ex vivoを悪化させる。
脈絡膜血管芽発芽に対するFFAR4(G-タンパク質共役受容体120とも呼ばれる)の損失の影響を、脈絡芽経路診断18を用いて評価した。脈絡膜、RPE、およびスクレラ複合体をFfar4ノックアウト(-/-)およびFfar4+/+マウスから解剖し、上記のように培養した。Ffar4-/- 6日目のFfar4+/+と比較して発芽領域が増加した脈絡膜血管成長(p = 0.004)(図4A,B)。FFAR4アゴニスト(1μM)の治療は、6日目の未処理マウス(p=0.03)と比較して脈絡膜発芽領域を減少させた(図4C,D)。
図1:脈絡芽発芽アッセイを示す模式図。
目は最初に外核化され、約0.5mm後部を四肢に周回に切断した。角膜、虹彩、レンズおよびガラス膜を除去した。その後、眼球の端から視神経に向かって1mmカットした。バンドを次に、約1.0mm後部をカットエッジに周回切断し、バンドと複合体の周辺領域を分離した。バンドは約1mm x 1mmの部分に切断され、BMEに埋め込まれました。次に顕微鏡を用いて、脈絡膜からの微小血管芽を可視化した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SWIFT-チョロイドコンピュータ化定量法
(A,B)魔法の杖機能は、芽の中央に脈絡膜組織(白矢印)を概説するために使用され、デジタル的に除去された(ショートカットキー「F1」)。 (C、D) 画像の背景は、自由選択ツール(黒矢印)で削除されました。次いで、微小血管芽を、バックグラウンドおよび周辺に対する閾値関数を用いて定義した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウス周辺脈絡膜発芽。
(A-D)C57BL/6Jマウスを用いて発芽した脈絡膜の代表的な画像と、新芽の面積を定量化したSWIFT-チョロイド法のデモンストレーション。脈絡膜発芽領域は、3日目(A)、4日目(B)で1.47mm2、5日目(C)で5.62mm2、6日目(D)で10.09mm2であった。 スケールバー;500 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:遊離脂肪酸受容体(FFAR)4抑制は脈絡膜新生を悪化させる。
(A)遊離脂肪酸受容体(Ffar)4+/+からの発芽アッセイの代表的な画像は、Ffar4ノックアウト(--)マウスと比較して:上の画像はFfar4+/+の脈絡膜を示し、下の画像はFfar4-/-脈絡膜を示す。(B)Ffar4-/--Ffar4++マウスと比較して発芽した脈絡膜の増加を示した(n=6-8)。(C)脈絡芽の代表的な画像: 上の画像は、車両の処理(制御)を示しています。下の画像は、FFAR4アゴニスト治療を示す。(D) FFAR4アゴニストは、コントロールと比較して発芽を抑制した(n = 10-12)。スケールバー= 500 μm。データは学生のt検定によって分析され、SE±平均として表現されました。**p < 0.01.この図は、Tomitaら18から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:脈絡芽アッセイプログラムのプラグインとショートカットを作成する方法。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
脈絡膜発芽アッセイは、新血管AMD9、10、18、19、20の研究を助ける。脈絡膜外植は、マウスだけでなく、ラットおよびヒト17、21から単離することができる。脈絡膜外植は、IC、マクロファージ、およびペリサイト17を含む。このアッセイでは、脈絡膜ECとRPE細胞などの隣接細胞との相互作用により、脈絡膜血管成長17に関与するメカニズムの解明に役立つ。さらに、この再現性と半自動評価方法は、観察者間変動性を減少させる17.
EX生体脈絡膜組織の最初の公表された研究は、DRおよびAMD22、23、24、25を治療する可能性を有する薬理学的介入をテストするために単離された脈絡膜を使用した。アッセイは発芽容器の数と長さを数え、観察者間変動の影響を受けうる。これに対し、ここで説明する定量方法は17に標準化されている。この微小血管脈絡膜血管新生のアッセイには、インタラクティブなパートナー細胞および細胞外マトリックスが含まれる。培養中のICは、RPEなどの他の細胞との相互作用の喪失に起因する血管管26を形成する能力など、それらの生理学的特性の多くを失う可能性がある。したがって、ECインビトロ培養は、脈絡膜新血管化のすべての側面を反映していない可能性がある。大動脈環アッセイには、大血管内皮細胞およびインタラクティブ細胞を含み、大血管からの発芽を評価する。しかし、大きな血管芽は脈絡膜微小血管疾患27を正確に反映していない可能性がある。脈絡膜発芽アッセイは、脈絡膜微小血管応答の詳細な表現である。
重要な注意点があります。まず、末梢脈絡膜複合外植芽はより一貫しており、中央部17からの外植物よりもはるかに速く成長する。第二に、RPEを伴う脈絡芽はRPE17を使用しないよりもはるかに速く成長するため、脈絡膜からのRPEは除去されなかった。薬物が脈絡膜だけに及ぼす影響を理解するために、RPEを含まないアッセイを用いてもよい。最後に、魔法の杖機能を用いて脈絡組織や発芽領域の画像を概説する際、バックグラウンドノイズが高いために発芽する脈絡膜の領域をトレースすることが困難な場合がある。画像間でバリエーションが存在する可能性があります。したがって、一貫性を保つためには、 図2に示すように、脈絡膜と背景の間に十分なコントラストをデジタル的に作成することが重要である。
要約すると、ex vivo脈絡芽芽のアッセイは、特徴付けられており、半自動化されている。この方法は、AMD研究のための実験的なツールを提供します。このアッセイは、化合物を潜在的な治療法としてスクリーニングしたり、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を使用して増殖性脈絡膜微小血管に関与する経路を評価するために使用することができる。
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Disclosures
著者らは財務上の開示を行っていない。コンピュータ化された方法は、著者を通じて学術機関に無料で利用可能です。
Acknowledgments
この研究は、鈴木マンペイ糖尿病財団(YT)、ボストン小児病院OFD/BTREC/CTREC教員キャリア開発助成金、ボストン小児病院眼科学財団、BCHパイロット賞、BCHマントンセンターフェローシップ、マントンセンターフェローシップの助成金によって支援されました。 そしてリトルキリン財団(ZF)、ドイツ研究財団(DFG;紀元前[CA1940/1-1])、NIH R24EY024868、EY017017、R01EY01717-13S1、EY030904-01、BCH IDDRC(1U54HD09025)、マサチューセッツ州ライオンズ財団(1U54HD09025)、マサチューセッツ州ライオンズ財団(1U54HD09025)、LEHS財団(
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
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