Summary
Este protocolo apresenta ensaio de brotos de choroide, um modelo ex vivo de proliferação microvascular. Este ensaio pode ser usado para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais e avaliar tratamentos medicamentosos usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.
Abstract
Angiogênese choroicular patológica, uma característica marcante da degeneração macular relacionada à idade, leva à deficiência visual e cegueira. Ensaios de proliferação de células endoteliais (CE) utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) ou CEs de retina primária isolada são amplamente utilizados em modelos in vitro para estudar angiogênese retinária. No entanto, isolar as células endoteliais da retina murina pura é tecnicamente desafiador e os CEs da retina podem ter respostas de proliferação diferentes das células endoteliais choroidais e diferentes interações celular/celular. Um ensaio altamente reprodutível ex vivo choroidal como modelo de proliferação microvascular choroidal foi desenvolvido. Este modelo inclui a interação entre vasculatura choroide (CE, macrófagos, pericílitos) e epitélio pigmento da retina (RPE). As explantas de RPE/coroid/scleral do mouse são isoladas e incubadas no extrato de membrana basal reduzida pelo fator de crescimento (BME) (dia 0). O meio é trocado a cada dois dias e o broto de coroide é quantificado no dia 6. As imagens da explanta choroide individual são tiradas com um microscópio de fase invertida e a área de broto é quantificada usando um plug-in macro semi-automatizado para o software ImageJ desenvolvido neste laboratório. Este ensaio reprodutível de broto ex vivo choroidal pode ser usado para avaliar compostos para tratamento potencial e para pesquisas de doenças microvasculares para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais usando tipo selvagem e tecido de camundongos geneticamente modificados.
Introduction
A desregulação da angiogênese choroidal está associada à degeneração macular relacionada à idade neovascular (DM)1. O coroide é um leito microvascular presente sob o epitélio pigmento da retina (RPE). Foi demonstrado que a redução do fluxo sanguíneo no coroide está associada à progressão da AMD2. A intrincada relação entre endotélio vascular, RPE, macrófagos, pericítos e outras células é responsável pela homeostase do tecido3,4,5. Portanto, um ensaio reprodutível modelando microambiente choroidal é fundamental para o estudo da AMD neovascular.
Ensaios ex vivo angiogênese e culturas celulares endoteliais in vitro podem complementar estudos de comportamento microvascular in vivo, para testes de novas drogas e para estudos de patogênese. Células endoteliais humanas como células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs), Células Endoteliais de Veia Umbilical Humana (HUVEC), cérebro animal primário isolado ou CEs da retina são frequentemente utilizadas em estudos in vitro para pesquisa de angiogênese ocular6,7,8. Os HRMECs, em particular, têm sido amplamente utilizados como modelo de neovascularização in vitro choroidal (CNV)9, avaliando a proliferação endotelial, migração, formação tubular e vazamento vascular para avaliar as intervenções6,10. No entanto, as CEs na cultura são limitadas como modelo de CNV devido à falta de interações com outros tipos de células encontradas no coroide e porque a maioria dos CE utilizados nesses ensaios não se originam do coroide. Os ECs de choroidal de rato são difíceis de isolar e manter na cultura.
O ensaio do anel aórtico é amplamente utilizado como modelo de proliferação macro vascular. Brotos vasculares de explantes aórticos incluem CES, pericítes e macrófagos11. O ensaio do anel aórtico modela angiogênese de vaso grande bem12,13,14. No entanto, tem limitações como modelo de neovascularização choroidal, pois os anéis aórticos são um tecido macrovascular que não tem o ambiente microvascular choroidal característico, e brotos de vasos grandes podem diferir de brotos de redes capilares envolvidas na patologia microvascular. Recentemente, um grupo publicou um ensaio ex-vivo retinal15,16. Embora seja adequado para doença neovascular da retina, não é tão apropriado para a neovascularização choroidal como visto na AMD.
O ensaio de broto de choroidal utilizando rpe rato, choroide e tecido escleral explantado foi desenvolvido para melhor modelar CNV. O tecido pode ser facilmente isolado dos olhos de camundongos (ou de outras espécies)17. Este ensaio permite a avaliação reprodutível do potencial pró e anti-angiogênico dos compostos farmacológicos e a avaliação do papel das vias específicas na neovascularização choroidal utilizando tecido de camundongos geneticamente modificados e controles18. Este ensaio de broto de choroidal foi referenciado em muitas publicações subsequentes9,10,18,19,20. Aqui, demonstram-se o método envolvido no uso deste ensaio.
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Protocol
Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil de Boston (protocolo ARCH número 19-04-3913R).
1. Preparação
- Adicione 5 mL de Penicillin/Streptomycin (10000 U/mL) e 5 mL e 10 mL de suplementos disponíveis comercialmente a 500 mL de meio clássico completo com soro. Alíquota de 50 mL do meio inicialmente.
NOTA: Não devolva nenhum meio de volta ao estoque para evitar contaminação. - Coloque uma alíquota de meio clássico completo no gelo.
- Use 70% de etanol para limpar o microscópio de dissecação, fórceps e tesouras.
- Preparar dois pratos de cultura celular (10 cm), um no microscópio de dissecção, outro no gelo; colocar 10 mL de meio clássico completo em cada prato.
2. Etapas experimentais(Figura 1)
- Sacrifício C57BL/6J camundongos em torno de posta natal (P) 20 usando 75-100 mg/kg de cetamina e 7,5 -10 mg/kg de xilazina injetada intraperitoneally. Mantenha os olhos em meio clássico completo no gelo antes da dissecação.
- Remova o tecido conjuntivo (músculo e tecido gorduroso) e o nervo óptico no olho.
- Use uma micro-tesoura para cortar circunferencialmente 0,5 mm posterior ao limbus da córnea. Remova o complexo de córnea/íris, vítreo e a lente.
- Faça uma incisão de 1 mm perpendicular à borda de corte em direção ao nervo óptico e corte uma faixa circunferencial de 1 mm de largura. Separe as regiões centrais e periféricas do complexo. Use fórceps para descascar a retina do complexo RPE/coroid/sclera.
- Manter a banda coroide periférica em meio clássico completo no gelo; isolar o outro olho e repetir o processo para cortar uma segunda faixa.
- Corte a faixa circular em 6 ~peças quadradas iguais (~1 mm x 1 mm).
NOTA: Nunca toque em nenhuma borda. - Descongele o extrato de membrana basal (BME) por instrução de fabricação. Adicione 30 μL/poço de BME no centro de cada poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Certifique-se de que a gota de BME forma uma cúpula convexa na parte inferior da placa sem tocar nas bordas.
NOTA: Descongele o BME durante a noite em uma geladeira. A BME deve estar no gelo a qualquer momento depois do descongelamento. - Coloque o tecido no meio da BME.
NOTA: Não achate a explanta choroide; geralmente, deixe o tecido se expandir dentro da BME. A orientação do tecido (lado escleral para cima ou para baixo) não afeta o desfecho experimental. - Incubar a placa a 37 °C por 10 minutos para deixar o gel solidificar.
- Adicione 500 μL do meio/bem clássico completo.
- Mude o meio clássico a cada dois dias (500 μL). O broto choroide pode ser observado após 3 dias com um microscópio.
NOTA: Para o tratamento do fator de crescimento, esfuira o tecido por 4h. Diluir um composto experimental em meio reduzido por fator de crescimento (aumento de 1:200 em vez de 1:50).
3.SWIFT-Choroid método de quantificação informatizada17 (Figura 2)
NOTA: Foi utilizado um método informatizado para medir a área coberta pelo cultivo de vasos. Um plugin macro para o software ImageJ é necessário antes da quantificação (consulte Informações Suplementares para obter mais detalhes).
- Abra a imagem choroide com ImageJ e verifique "Imagem | Digite| 8 bits" com escala cinza.
- Vá para "Image | Ajuste | Brilho/Contraste (Ctrl/shift/C)" e otimizar o contraste.
- Use a função varinha mágica para delinear e remover da imagem o tecido coroide que está presente no centro dos brotos (usando a tecla de atalho "F1")(Figura 2A,B).
NOTA: Defina a taxa de tolerância da varinha mágica para 20-30%. - Remova o fundo da imagem com as ferramentas de seleção gratuitas(Figura 2C). Vá para "Image | Ajuste | Limiar (Ctrl/shift/T)". Use a função limiar para definir os brotos microvasculares contra o fundo e a periferia(Figura 2D).
- Clique em "F2" e um resumo aparecerá. Salve uma imagem da área selecionada clicando em "Salvar". Salvo na mesma pasta da imagem original para referência futura.
- Após a medida de um grupo de amostras, copie o registrado para análise de dados.
NOTA: Também é possível medir a área (μm²) por "Analisar | Set Scale" usando imagens com barras de escala.
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Representative Results
Comparação do crescimento de brotos de coroides por dia
Dissecamos o coroide com esclera, embutido na BME e os cultuamos por 6 dias(Figura 1). Os brotos de coroide em camundongos C57BL/6J do dia 3 ao dia 6 foram examinados com um microscópio e quantificados com SWIFT-Choroid um método de quantificação semi-automatizado no ImageJ. Em um caso representativo, a área de broto choroidal (os vasos que se estendem da explanta, excluindo a própria explant) foi de 0,38 mm2 no dia 3 (Figura 3A), 1,47 mm2 no dia 4(Figura 3B),5,62 mm2 no Dia 5(Figura 3C), e 10,09 mm2 no Dia 6(Figura 3D).
A supressão do receptor de ácido graxo livre (FFAR)4 exacerba a neovascularização choroidal ex vivo.
Os efeitos da perda de FFAR4 (também conhecido como receptor acoplado à proteína G 120) no broto vascular coroidal foram avaliados utilizando o ensaio de broto de choroide18. O complexo de coroide, RPE e esclera foram dissecados a partir de ratos de nocaute ffar4 (-/-) e ffar4+/+ e cultivados como descrito acima. A área de broto em Ffar4-/- aumentou o crescimento vascular choroidal em comparação com o Ffar4+/+ no dia 6 (p = 0,004) (Figura 4A,B). O tratamento do agonista FFAR4 (1 μM) reduziu a área de brotos de choroidal em comparação com camundongos não tratados no dia 6 (p = 0,03) (Figura 4C,D).
Figura 1: Ilustração esquemática mostrando ensaio de broto de choroide.
Os olhos foram primeiro enucleados e cortados circunferencialmente cerca de 0,5 mm posterior ao limbus. A córnea, íris, lente e vítreos foram removidas. Em seguida, um corte de 1 mm foi feito da borda do copo do olho em direção ao nervo óptico. Uma banda foi então cortada circunferentemente cerca de 1,0 mm posterior à borda de corte e a banda e as regiões periféricas do complexo foram separadas. A banda foi cortada em aproximadamente 1 mm x 1 mm de peças e embutida na BME. Em seguida, usando um microscópio, os brotos microvasculares do coroide foram visualizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Método de quantificação computadorizada SWIFT-Choroid.
(A,B) A função varinha mágica foi usada para delinear o tecido coroide (seta branca) no centro dos brotos e foi removido digitalmente (chave de atalho "F1"). (C, D) O fundo da imagem foi removido com as ferramentas de seleção gratuitas (seta preta). Brotos microvasculares foram então definidos usando a função limiar contra o fundo e a periferia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Filhote de coroide periférico brotando.
(A-D) Imagens representativas de brotos coroides com um rato C57BL/6J e demonstrações do método SWIFT-Choroid quantificando a área dos brotos. A área de broto choroidal foi de 0,38 mm2 no dia 3 (A),1,47 mm2 no dia 4(B),5,62 mm2 no dia 5(C)e 10,09 mm2 no dia 6(D). Barra de escala; 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Receptor de ácido graxo livre (FFAR) 4 supressão exacerba neovascularização choroidal.
(A) Imagens representativas do ensaio de broto com coroide do receptor de ácido graxo Livre (Ffar)4+/+ em comparação com os ratos de nocaute de Ffar4 (-/-) : a imagem superior mostra o coroide de Ffar4+/+ enquanto a imagem inferior mostra Ffar4-/- choroid. (B)Ffar4-/- apresentou aumento do broto de coroide em comparação com os camundongos Ffar4 +/+ (n = 6-8). (C) Imagens representativas do broto de coroide: a imagem superior demonstra o tratamento do veículo (controle); imagem inferior demonstra tratamento agonista FFAR4. (D) Agonista FFAR4 suprimiu o choroidal em comparação com o controle (n = 10-12). Barras de escala = 500 μm. Os dados foram analisados pelo t-teste do Aluno e foram expressos como média ± SE. *p < 0,05; **p < 0,01. Este valor foi modificado a partir de Tomita et al.18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Como criar plugins e atalhos para o programa de ensaio de brotos de choroide. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O ensaio de brotação de choroida ajuda a pesquisa em AMD neovascular9,10,18,19,20. Explantas choroides podem ser isoladas de camundongos, bem como ratos e humanos17,21. A explantação coroide inclui CES, macrófagos e pericítes17. Neste ensaio, a interação entre os CEs choroidal e as células adjacentes, como as células RPE, ajuda a elucidar os mecanismos envolvidos no crescimento vascular coroidal17. Além disso, este método de avaliação reprodutível e semi-automatizado diminui a variabilidade do interobservador17.
O primeiro estudo publicado do tecido ex vivo choroidal utilizou coroide isolado para testar intervenções farmacológicas com potencial para tratar DR e AMD22,23,24,25. O ensaio contou o número e o comprimento dos vasos brotantes, que podem estar sujeitos à variabilidade do interobservador. Em contrapartida, o método de quantificação descrito aqui foi padronizado17. Este ensaio de angiogênese choroide microvascular inclui células parceiras interativas e matriz extracelular. As CES na cultura podem perder muitas de suas propriedades fisiológicas, como a capacidade de formar tubos vasculares26, que podem ser devido à perda de interação com outras células, como a RPE. Portanto, as culturas in vitro da CE podem não refletir todos os aspectos da neovascularização choroidal. O ensaio do anel aórtico inclui grandes células endoteliais de vasos e células interativas para avaliar o broto de grandes vasos. Mas grandes brotos de vasos podem não refletir com precisão a doença microvascular choroidal27. O ensaio de broto de choroidal é uma representação mais próxima das respostas microvasculares choroidais.
Há ressalvas importantes. Primeiro, os brotos de explant complexo coroóide periférico são mais consistentes e crescem muito mais rápido do que as explantas das seções centrais17. Em segundo lugar, o RPE do choroide não foi removido porque os brotos de coroide com RPE crescem muito mais rápido do que sem RPE17. Para entender o impacto de uma droga apenas em coroide, o ensaio sem RPE pode ser usado. Finalmente, ao delinear a imagem do tecido coroide e da área de broto usando a função varinha mágica, às vezes é difícil rastrear a área de brotos de coroide por causa do alto ruído de fundo. Pode haver variação entre as imagens. Portanto, para consistência, é importante criar digitalmente contraste suficiente entre coroide e fundo, como visto na Figura 2.
Em resumo, o ensaio ex vivo choroid sprouting tem sido caracterizado e semi-automatizado. Este método fornece uma ferramenta experimental para a pesquisa da AMD. Este ensaio pode ser usado para rastrear compostos como tratamentos potenciais ou para avaliar caminhos envolvidos na proliferação de micro vasos choroidais usando tipo selvagem e tecido de rato geneticamente modificado.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações financeiras. O método informatizado está disponível gratuitamente para instituições acadêmicas através dos autores.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado por subsídios da Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ofthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship e Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; ao BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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