Summary
Detta protokoll presenterar koridider groning assay, en ex vivo modell av microvascular spridning. Denna analys kan användas för att bedöma vägar som deltar i proliferering choroidal mikrokärl och bedöma läkemedelsbehandlingar med hjälp av vild typ och genetiskt modifierade musvävnad.
Abstract
Patologiska choroidal angiogenes, en framträdande egenskap hos åldersrelaterade makuladegeneration, leder till synnedsättning och blindhet. Endothelial cell (EG) spridningsanalyser med hjälp av humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) eller isolerade primära retinala ECS används i stor utsträckning in vitro-modeller för att studera retinal angiogenes. Isolera ren murin retinal endotel celler är emellertid tekniskt utmanande och retinal ECs kan ha olika spridning svar än choroidal endotel celler och olika cell/cell interaktioner. En mycket reproducerbara ex vivo choroidal sprouting assay som en modell av choroidal microvascular spridning utvecklades. Denna modell omfattar samspelet mellan choroid vasculature (EG, makrofager, pericyter) och retinal pigment epitel (RPE). Mus RPE/choroid/scleral explants isoleras och inkuberas i tillväxt-faktor-reducerade basalmembranextrakt (BME) (dag 0). Medium byts varannan dag och choroid groning kvantifieras vid dag 6. Bilderna av enskilda choroid explant tas med en inverterad fas mikroskop och groning området kvantifieras med hjälp av en halvautomatisk makro plug-in till ImageJ programvara som utvecklats i detta labb. Denna reproducerbara ex vivo choroidal sprouting assay kan användas för att bedöma föreningar för potentiell behandling och för mikrovaskulär sjukdom forskning för att bedöma vägar som deltar i koroidal mikrokärl spridning med hjälp av vild typ och genetiskt modifierade mus vävnad.
Introduction
Choroidal angiogenes dysregulation är associerad med neovaskulära åldersrelaterade makuladegeneration (AMD)1. Den choroid är en mikrovaskulär säng närvarande under den retinala pigment epitel (RPE). Det har visat sig att minskat blodflöde i choroid är associerad med progression av AMD2. Det invecklade förhållandet mellan vaskulär endotelet, RPE, makrofager, pericyter och andra celler är ansvarig för vävnadenshomeostas 3,4,5. Därför är en reproducerbar analys modellering choroidal mikromiljö kritisk för studiet av neovaskulär AMD.
Ex vivo angiogenes analyser och in vitro endothelial cell kulturer kan komplettera studier av mikrovaskulära beteende in vivo, för testning av nya läkemedel och för studier av patogenes. Endotelceller som humana näthinnemikrovaskulära endotelceller (HRMECs), Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), isolerade primära djurhjärna eller retinala ECs används ofta i in vitro-studier för okulär angiogenesforskning6,7,8. HRMECs i synnerhet har använts i stor utsträckning som en modell av in vitro choroidal neovascularization (CNV)9 genom att bedöma endotel spridning, migration, rörformig bildning, och vaskulär läckage för att utvärdera interventioner6,10. ECs i kultur är dock begränsade som en modell av CNV på grund av bristen på interaktioner med andra celltyper som finns i choroid och eftersom de flesta EG som används i dessa analyser inte härrör från choroid. Mouse choroidal ECs är svåra att isolera och underhålla i kultur.
Aortaringen assay används allmänt som en modell av makro vaskulär spridning. Vaskulära groddar från aortaexplantor inkluderar ECs, pericyter och makrofager11. Aortaringen assay modeller stora fartyg angiogenes väl12,13,14. Det har dock begränsningar som modell av koroidal kärlek som kolorektal ringar är en macrovascular vävnad saknar den karakteristiska choroidal mikrovaskulär miljö, och groddar från stora fartyg kan skilja sig från groddar från kapillär nätverk som deltar i mikrovaskulär patologi. Nyligen en grupp publicerade en ex-vivo retinal assay15,16. Även om, det är lämpligt för retinal neovaskulär sjukdom, är det inte lika lämpligt för koroidal kärlkärlens som ses i AMD.
Den choroidal spirande analysen med hjälp av mus RPE, choroid och scleral explanted vävnad utvecklades för att bättre modell CNV. Vävnaden kan lätt isoleras från mus (eller andra arter) ögon17. Denna analys gör reproducerbara utvärdering av pro- och anti-angiogenic potential av farmakologiska föreningar och utvärdering av rollen av specifika vägar i choroidal kärlbiologiska använda vävnad från genetiskt modifierade möss och kontroller18. Denna choroidal spirande analys har refererats i många efterföljande publikationer9,10,18,19,20. Här, den metod som deltar i användningen av denna analys påvisas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs godkändes av institutionskommittén för djurvård och användning vid Boston Children's Hospital (ARCH-protokollnummer 19-04-3913R).
1. Förberedelse
- Tillsätt 5 mL Penicillin/Streptomycin (10000 U/mL) och 5 mL och 10 mL av kommersiellt tillgängliga kosttillskott till 500 mL av komplett klassiskt medium med serum. Aliquot 50 mL av mediet initialt.
OBS: Returnera inte något medium tillbaka till beståndet för att undvika kontaminering. - Sätt en alikvot av komplett klassiskt medium på is.
- Använd 70% etanol för att rengöra dissekera mikroskop, tlyktor, och sax.
- Förbered två cellodlingsrätter (10 cm), en på dissekeringsmikroskopet, en på is; sätta 10 mL av komplett klassiskt medium i varje maträtt.
2. Experimentella steg (figur 1)
- Sacrifice C57BL/6J möss runt postnatal (P) 20 med 75-100 mg/kg ketamin och 7,5 -10 mg/kg xylazin injiceras intraperitoneally. Håll ögonen i komplett klassiskt medium på is innan dissektion.
- Ta bort bindväven (muskel- och fettvävnad) och synnerven på ögat.
- Använd en mikro-sax för att omskuren 0,5 mm posterior till hornhinnans limbus. Ta bort hornhinnan / iris komplex, glaskropp och linsen.
- Gör ett 1 mm snitt vinkelrätt mot den skurna kanten mot synnerven och skär ett omskärligt band på 1 mm bredd. Separera de centrala och perifera regionerna i komplexet. Använd tång för att skala av näthinnan från RPE/choroid/sclera-komplex.
- Håll perifera choroid bandet i komplett klassiskt medium på is; isolera det andra ögat och upprepa processen för att skära ett andra band.
- Skär det cirkulära bandet i 6 ~ lika fyrkantiga bitar (~ 1 mm x 1 mm).
OBS: Rör aldrig vid någon kant. - Tina basalmembranextraktet (BME) per tillverknings instruktion. Tillsätt 30 μL/brunn av BME i mitten av varje brunn av en 24 väl vävnadskulturplatta. Se till att droppen av BME bildar en konvex kupol längst ner på plattan utan att vidröra kanterna.
OBS: Tina BME:en över natten i kylskåp. BME ska vara på isen när som helst efter upptining. - Placera vävnaden mitt på BME.
OBS: Inte platta till choroid explant; allmänhet, låt vävnaden expandera inom BME. Vävnadens orientering (scleral sida uppåt eller nedåt) påverkar inte det experimentella utfallet. - Inkubera plattan vid 37 °C i 10 min för att låta gelen stelna.
- Tillsätt 500 μL av det kompletta klassiska mediet/brunnen.
- Byt det klassiska mediet varannan dag (500 μL). Choroid spirande kan observeras efter 3 dagar med mikroskop.
OBS: För behandling med tillväxtfaktor, svälta vävnaden i 4 h. Späd en försöksförening i tillväxtfaktorreducerade medium (1:200 boost istället för 1:50).
3.SWIFT-Choroid datoriserad kvantifieringsmetod17 (figur 2)
OBS: En datoriserad metod för att mäta det område som omfattas av växande fartyg användes. Ett makro plugin till ImageJ programvara behövs före kvantifiering (se Kompletterande Information för ytterligare detaljer).
- Öppna choroid spirande bilden med ImageJ och kontrollera "Bild | Typ| 8-bitars" med gråskala.
- Gå till "| Justera | Ljusstyrka/Kontrast (Ctrl/skift/C)" och optimera kontrasten.
- Använd trollstavsfunktionen för att skissera och från bilden ta bort den choroidvävnad som finns i mitten av groddarna (med hjälp av genvägstangenten "F1") (Figur 2A,B).
OBS: Ställ in toleranshastigheten för trollstaven till 20-30%. - Ta bort bildens bakgrund med de fria markeringsverktygen (Bild 2C). Gå till "| Justera | Tröskel (Ctrl/skift/T)". Använd tröskelfunktionen för att definiera de mikrovaskulära groddar mot bakgrund och periferi (Figur 2D).
- Klicka på" F2" och en sammanfattning kommer att visas. Spara en bild av det markerade området genom att klicka på "Spara". Spara i samma mapp som originalbilden för framtida referens.
- Efter en grupp av prover har mätts, kopiera den registrerade för dataanalys.
OBS: Det är också möjligt att mäta området (μm²) genom "Analysera | Ställ Skala" med hjälp av bilder med skalstreck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jämförelse av choroid spirande tillväxt per dag
Vi dissekerade choroid med sclera, inbäddade i BME och odlade dem i 6 dagar (Figur 1). Den choroid groning i C57BL/6J möss från dag 3 till dag 6 undersöktes med mikroskop och kvantifieras med SWIFT-Choroid en semi-automatiserad kvantifiering metod i ImageJ. I ett representativt ärende den choroidal groning område (de fartyg som sträcker sig från explant, exklusive själva explant) var 0,38 mm2 på Dag 3 (Figur 3A), 1,47 mm2 på Dag 4 (Figur 3B), 5,62 mm2 på dag 5 (Figur 3C), och 10,09 mm2 på Dag 6 (Figur 3D).
Gratis fettsyra receptor (FFAR)4 undertryckande förvärrar choroidal kärlverkan ex vivo.
Effekterna av förlust av FFAR4 (även känd som G -protein kopplade receptorn 120) på choroidal vaskulär groning utvärderades med hjälp av den choroid spirande assay18. Den choroid, RPE och sclera komplexa dissekerades från Ffar4 knock out (-/-) och Ffar4 + / + möss och odlade enligt beskrivningen ovan. Den groning område i Ffar4-/- ökad choroidal vaskulär tillväxt jämfört med Ffar4 +/+ vid dag 6 (p = 0,004) (Figur 4A,B). Behandlingen av FFAR4-agonist (1 μM) minskade det koroidala groningsområdet jämfört med obehandlade möss vid dag 6 (p = 0,03) (Figur 4C,D).
Bild 1: Schematisk illustration som visar koroidrodyranalys.
Ögon var först enucleated och skär circumferentially ca 0,5 mm posteriort till limbus. Hornhinnan, iris, lins och glaskropp togs bort. Sedan gjordes en 1 mm snitt från kanten av ögat kopp mot synnerven. Ett band skars sedan circumferentially ca 1,0 mm posteriort till den skära kanten och bandet och de perifera regionerna i komplexet separerades. Bandet skars i cirka 1 mm x 1 mm bitar och inbäddade i BME. Sedan med hjälp av ett mikroskop, de microvascular groddar från choroid visualiserades. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: SWIFT-Choroid datoriserad kvantifieringsmetod.
(A,B) Trollstavens funktion användes för att skissera choroid vävnaden (vit pil) i mitten av groddar och det togs bort digitalt (Genväg nyckel "F1"). (C, D) Bakgrunden på bilden togs bort med verktygen för frival (svart pil). Mikrovaskulära groddar definierades sedan genom att använda tröskelfunktionen mot bakgrund och periferi. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Mus perifer choroid groning.
(A-D) Representativa bilder av choroid groddar med en C57BL/6J mus och demonstrationer av SWIFT-Choroid metod kvantifiera området av groddar. Den choroidal groning område var 0,38 mm2 på dag 3 (A), 1,47 mm2 på dag 4 (B), 5,62 mm2 på dag 5 (C), och 10,09 mm2 på dag 6 (D). Skala bar; 500 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Fri fettsyra receptor (FFAR) 4 undertryckande förvärrar choroidal kärlverkan.
(A) Representativa bilder av den gronde analysen med koroid från Free fettsyra receptor (Ffar)4 +/+ jämfört med Ffar4 knock out (-/-) möss: övre bilden visar koroid av Ffar4 +/+ medan lägre bild visar Ffar4-/- choroid. (B)Ffar4-/- visade ökad choroid groning jämfört med Ffar4 +/+ möss (n = 6-8). (C) Representativa bilder av koroidrodring: övre bilden demonstrerar fordonsbehandling (kontroll); lägre bild visar FFAR4 agonist behandling. (D) FFAR4-agonist undertryckt koroidal groning jämfört med kontroll (n = 10–12). Skalstång = 500 μm. Data analyserades av Students t-test och uttrycktes som medelst ± SE. *p < 0.05; **p < 0,01. Denna siffra har ändrats från Tomita et al.18. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Supplemental File 1: Hur man skapar plugins och genvägar för choroid spirande assay programmet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den choroidal spirande analysen stöd forskning i neovaskulär AMD9,10,18,19,20. Choroid explants kan isoleras från möss samt råttor och människor17,21. Den choroid explant omfattar ECs, makrofager, och pericyter17. I denna analys samspelet mellan choroidal ECs och angränsande celler såsom RPE celler, hjälpa belysa de mekanismer som är involverade i choroidal vaskulär tillväxt17. Vidare minskar denna reproducerbara och halvautomatiska bedömningsmetod interobservervariabilitet17.
Den första publicerade studien av ex vivo choroidal vävnad används isolerade choroid att testa farmakologiska interventioner med potential att behandla DR och AMD22,23,24,25. Analysen räknade antalet och längden på groningskärl, som kan vara föremål för interobservervariabilitet. Däremot har den kvantifieringsmetod som beskrivs här standardiserats17. Denna analys av mikrovaskulär choroid angiogenes innehåller interaktiva partnerceller och extracellulär matris. ECs i kultur kan förlora många av sina fysiologiska egenskaper, såsom förmågan att bilda vaskulära rör26 som kan bero på förlust av interaktion med andra celler såsom RPE. Därför kan EG in vitro kulturer inte återspeglar alla aspekter av koroidal neovascularization. Aortaringen assay omfattar stora fartyg endotelceller och interaktiva celler för att utvärdera groning från stora fartyg. Men stora fartyg groddar kanske inte korrekt återspeglar koroidal mikrovaskulär sjukdom27. Den choroidal spirande analysen är en närmare representation av koroidal microvascular svar.
Det finns viktiga förbehåll. Först, den perifera choroid komplexa explant groddar är mer konsekvent och växa mycket snabbare än explants från de centralaavsnitten 17. Andra, den RPE från choroid togs inte bort eftersom choroid groddar med RPE växa mycket snabbare än utan RPE17. För att förstå effekten av ett läkemedel på choroid ensam, analysen utan RPE kan användas. Slutligen, när skissera bilden av koroidvävnad och groning område genom att använda den magiska trollstaven funktion, är det ibland svårt att spåra området för koroida groning på grund av höga bakgrundsljud. Det kan finnas variation bland bilder. Därför är det för konsekvens viktigt att digitalt skapa tillräcklig kontrast mellan choroid och bakgrund som ses i figur 2.
Sammanfattningsvis har ex vivo choroid sprouting assay karakteriserats och semi-automatiserade. Denna metod ger ett experimentellt verktyg för AMD forskning. Denna analys kan användas för att skärmen föreningar som potentiella behandlingar eller för att bedöma vägar som deltar i prolifering choroidal mikrokärl med hjälp av vild typ och genetiskt modifierade musvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga finansiella upplysningar. Den datoriserade metoden är tillgänglig gratis för akademiska institutioner genom författarna.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av Grants från Manpei Suzuki Diabettic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD / BTREC / CTREC Fakulteten Karriärutveckling Grant, Boston Children's Hospital Ofthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship, och Little Giraffe Foundation (ZF), Den tyska Forskningsstiftelsen (DFG; till BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY017-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
- Fu, Z., et al.
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C.
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
