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Bioengineering

एडेनोवायरस उत्पादन के लिए एक कुशल विधि

Published: June 10, 2021 doi: 10.3791/61691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Cellular Biology and Pathology "Nicolae Simionescu"

Summary

यहां, हम pAdEasy प्रणाली का उपयोग कर adenovirus उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस तकनीक में पेडट्रैक और पैडैसी-1 प्लाज्मिड्स का पुनर्संयोजन, एडेनोवायरस पैकेजिंग और प्रवर्धन, सेल लैसट और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों का शुद्धिकरण, वायरल टाइटेशन और एडेनोवायरस का कार्यात्मक परीक्षण शामिल है।

Abstract

एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन में ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति को कोशिका प्रकारों और अंगों की एक व्यापक विविधता में मजबूत और क्षणिक प्रेरण का लाभ होता है। हालांकि, पुनः संयोजन एडेनोवायरल तकनीक श्रमसाध्य, समय लेने वाली और महंगी है। यहां, हम शुद्ध एडेनोविराल कणों को प्राप्त करने के लिए pAdEasy प्रणाली का उपयोग करके एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो ट्रांसड्यूड कोशिकाओं में एक मजबूत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है। इस बेहतर विधि के फायदे तेजी से तैयारी कर रहे हैं और बर्ट वोगेलस्टीन द्वारा विकसित मूल विधि की तुलना में उत्पादन लागत में कमी आई है। एडेनोवायरल तकनीक के मुख्य कदम हैं: (1) बीजे5183 बैक्टीरिया में pAdEasy-1 प्लाज्मिड के साथ pAdTrack-GFP का पुनर्संयोजन; (2) एडेनोवायरल कणों की पैकेजिंग; (3) AD293 कोशिकाओं में एडेनोवायरस का प्रवर्धन; (4) कोशिका ओंटे और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की शुद्धि; और (5) एडेनोवायरस का वायरल टाइट्रेशन और कार्यात्मक परीक्षण। मूल विधि में सुधार बैक्टीरिया के रासायनिक परिवर्तन द्वारा BJ5183-युक्त pAdEasy-1 में पुनर्संयोजन (i) से मिलकर बनता है; (ii) "नकारात्मक" और "सकारात्मक" पीसीआर द्वारा पुनर्संयोजन क्लोन का चयन; (iii) एडेनोवायरल पैकेजिंग के लिए K2 ट्रांसफैक्शन सिस्टम का उपयोग करके AD293 कोशिकाओं का ट्रांसफैक्शन; (iv) कोशिका संस्कृति माध्यम में AD293 कोशिकाओं द्वारा जारी वायरल कणों के अमोनियम सल्फेट के साथ वर्षा; और (v) एक कदम सीजियम क्लोराइड असतत ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा वायरस का शुद्धिकरण । विभिन्न स्रोतों (मानव, गोजातीय, मुरीन) से विभिन्न प्रकार की ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं (जैसे हेपेटोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं) में ब्याज के जीन की एक मजबूत अभिव्यक्ति प्राप्त की गई थी। Adenoviral-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण आधुनिक जीन चिकित्सा के विकास के लिए मुख्य उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है ।

Introduction

एडेनोवायरस गैर - वेलोपिड वायरस हैं जिनमें न्यूक्लियोकैप्सिड और डबल-फंसे रैखिक डीएनए जीनोम1,2,3होते हैं । Adenoviruses सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित कर सकते हैं और संक्रमण सक्रिय मेजबान सेल डिवीजन पर निर्भर नहीं है। संक्रमण के बाद, एडेनोवायरस मेजबान कोशिका नाभिक में अपने जीनोमिक डीएनए का परिचय देता है, जहां यह एपीक्रोमोसोमल रहता है और मेजबान के जीन के साथ एक साथ लिखित है । इस प्रकार , सम्मिलित म्यूटेनेसिस या ओन्कोजीन विनियमन के लिए न्यूनतम संभावित जोखिम4, 5,6प्राप्तहोताहै । एडेनोवायरल जीनोम को मेजबान जीनोम के साथ दोहराया नहीं जाता है और इस प्रकार, एडेनोवायरल जीन को विभाजित कोशिका आबादी में पतला किया जाता है। एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन के फायदों में से, वहां हैं: (i) ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर; (ii) एपिसोमल अभिव्यक्ति के कारण, मेजबान जीनोम में वायरल डीएनए के एकीकरण से संबंधित जोखिमों को कम करना; (iii) विभिन्न प्रकार के विभाजन और गैर-विभाजन कोशिका प्रकारों का विभाजन। जैव चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश एडेनोवायरस गैर-प्रतिकृति हैं, जिसमें ई 1 क्षेत्र7,8,9की कमी है। उनके उत्पादन के लिए, E1 अनुक्रम (जैसे HEK293) की आपूर्ति करने वाली सेल लाइन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, वायरल जीवन चक्र (E3) के लिए एक गैर-आवश्यक क्षेत्र वायरल जीनोम में ट्रांसजीन के सम्मिलन की अनुमति देने के लिए हटा दिया गया था; अन्य क्षेत्रों (E2 और E4) को आगे कुछ adenoviruses में हटा दिया गया था, लेकिन इन मामलों में, एडेनोवायरल उत्पादन की कम उपज और ट्रांसजीन की कम अभिव्यक्ति7की सूचना दी गई ।

यहां, हम एडीईसी सिस्टम का उपयोग करके एडेनोवायरस के निर्माण, पैकेजिंग और शुद्ध करने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन सुधारों ने निम्नलिखित फायदों के कारण बर्ट वोगेलस्टीन2,10द्वारा विकसित मूल विधि की तुलना में एडेनोवायरस की पैकिंग को तेज और अधिक किफायती तरीके से अनुमति दी: (i) बैक्टीरिया के रासायनिक परिवर्तन द्वारा बीजे 5183-युक्त pAdEasy-1 में पुनर्संयोजन; (ii) पीसीआर द्वारा पुनर्संयोजन क्लोन का चयन; (iii) एडेनोवायरल पैकेजिंग के लिए K2 ट्रांसफैक्शन सिस्टम का उपयोग करके AD293 कोशिकाओं का ट्रांसफैक्शन; (iv) वायरल पैकेजिंग और प्रवर्धन के बाद संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की वर्षा; (v) एक-चरण सीज़ियम क्लोराइड (सीएससीएल) रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का उपयोग करके एडेनोवायरल शुद्धिकरण।

एडीईसी सिस्टम(चित्रा 1)का उपयोग करके एडेनोवायरस उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल में निम्नलिखित कदम शामिल हैं:

(1) BJ5183 बैक्टीरिया में pAdEasy-1 के साथ pAdTrack-GFP का पुनर्संयोजन
(2) एडेनोवायरल कणों की पैकेजिंग
(3) एडेनोवायरस का प्रवर्धन
(4) कोशिका ओंटेत और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की शुद्धि
(5) एडेनोवायरस टाइट्रेशन।

Figure 1
चित्रा 1: एडेनोवायरस उत्पादन प्रौद्योगिकी। एडेनोवायरल तकनीक के मुख्य कदम हैं: (1) बीजे5183 बैक्टीरिया में pAdEasy-1 प्लाज्मिड के साथ PAdTrack-GFP का पुनर्संयोजन। चयनित पुनः संयोजन प्लाज्मिड DH5α बैक्टीरिया में परिलक्षित होते हैं और फिर शुद्ध होते हैं; (2) AD293 कोशिकाओं में एडेनोवायरल कणों की पैकेजिंग, जो एडेनो-E1 प्रोटीन का उत्पादन कर रहे हैं; (3) AD293 कोशिकाओं में एडेनोवायरस का प्रवर्धन; (4) सीएससीएल घनत्व ढाल पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन द्वारा कोशिका ओंटेत और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों की शुद्धि; (5) एडेनोवायरस का टाइटेशन और फंक्शनल टेस्टिंग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस प्रोटोकॉल में, हमने एडेनोवायरस के उत्पादन के लिए प्रौद्योगिकी का उदाहरण दिया, जो मेजबान कोशिकाओं में जीएफपी की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है। GFP पहले से ही एक दूसरे CMV प्रमोटर के तहत pAdTrack-CMV शटल वेक्टर (Addgene #16405) की रीढ़ में डाला जाता है और एक रिपोर्टर जीन(चित्रा 1)के रूप में प्रयोग किया जाता है । इस कारण से, यहां हमने पीएडट्रैक-सीएमवी वेक्टर को पीएडट्रैक-जीएफपी के रूप में नामित किया और हमने प्रदर्शनात्मक उद्देश्यों के लिए जीएफपी की अभिव्यक्ति का आकलन किया। जीएफपी अभिव्यक्ति के अलावा, सिस्टम का उपयोग ब्याज के जीन को अधिक प्रयोग करने के लिए किया जा सकता है, जिसे पीएडट्रैक-सीएमवी की कई क्लोनिंग साइटों में क्लोन किया जा सकता है। पीएडीट्रैक-सीएमवी में क्लोन किया गया जीन या मिनीजीन आमतौर पर सीडीएनए11की तुलना में अभिव्यक्ति प्रेरण के लिए अधिक कुशल होता है। आंकड़ों ने विभिन्न स्रोतों (मानव, गोजातीय, मुरीन) से ट्रांसड्यूडिक कोशिकाओं (जैसे हेपेटोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं) में एक मजबूत जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाई। Adenoviral-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण आधुनिक जीन चिकित्सा के विकास के लिए मुख्य उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है ।

Protocol

सुरक्षा नोट: सामान्य तौर पर, एडेनोवायरस को जैव सुरक्षा स्तर 2 जीवों के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और इस प्रकार, सभी जोड़तोड़ एक प्रशिक्षित व्यक्ति द्वारा कक्षा II जैव सुरक्षा कैबिनेट में किए जाने चाहिए, बायोहैजार्ड सुरक्षा उपकरण (दस्ताने सहित, जैविक एयरोसोल, प्रयोगशाला कोट, आदि के लिए चेहरा मुखौटा) पहने हुए। एडेनोवायरस से दूषित सभी ठोस सामग्रियों को 30 मिनट के लिए 10% ब्लीच समाधान से कीटाणुरहित किया जाना चाहिए और 121 डिग्री सेल्सियस और 1 बार में 30 मिनट के लिए ऑटोक्लेव किया जाना चाहिए। डाला जीन के आधार पर, बनाया एडेनोवायरस खतरनाक क्षमता हो सकती है और अन्य जैव शिक्षा के स्तर में वर्गीकृत किया जा सकता है।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. एडेनोवायरल जोड़तोड़ के लिए एक अलग सेल कल्चर हुड का उपयोग करें, और प्रत्येक एडेनोवायरस प्रकार के लिए एक अलग इनक्यूबेटर। वायरल पैकेजिंग और प्रवर्धन के लिए फिल्टर कैप के साथ टी फ्लास्क का उपयोग करें; वेंटेड पेट्री प्लेटों में जितना संभव हो उतना लेनदेन प्रयोगों से बचें।
  2. प्रत्येक उपयोग के बाद सेल संस्कृति हुड खाली करें और इसे 15 मिनट के लिए यूवी में बेनकाब करें।
  3. ऑटोक्लेव समय-समय पर पिपेट एड, पिपेट और अन्य बर्तन। यदि संभव हो तो, एक अलग सेल संस्कृति प्रयोगशाला में संस्कृति/एडेनोविराल पैकेजिंग (AD293 कोशिकाओं) के लिए कोशिकाओं और कोशिकाओं को पार प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा । एक ही अवधि में परिलक्षित विभिन्न एडेनोवायरस के बैचों को पीसीआर द्वारा क्रॉस-संदूषण के लिए जांचा जाना चाहिए।
  4. निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
    1. एसओबी (सुपर इष्टतम शोरबा) माध्यम तैयार करें: 20 ग्राम ट्राइप्टोन, 5 ग्राम खमीर निकालने, एनएसीएल के 0.5 ग्राम (10 एमएम अंतिम एकाग्रता), 1 एम केसीएल (2.5 एमएम अंतिम एकाग्रता) के 2.5 एमएल, एएमडी एच2ओ से 1 एल। 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग के बाद, निम्नलिखित बाँझ समाधान जोड़ें: 1 एम एमजीसीएल 2 के5 एमएल और 1 एम एमजीएसओ4के 5 एमएल।
    2. एसओसी (कैटाबोलाइट दमन के साथ सुपर इष्टतम शोरबा) माध्यम तैयार करें: 1 एल बाँझ सूबे में निम्नलिखित बाँझ समाधान जोड़ें: 1 एम ग्लूकोज के 20 एमएल, 1 एम एमजीसीएल 2 के5 एमएल, और 1 एम एमजीएसओ4के 5 एमएल।
    3. वर्षा समाधान तैयार करें: एच 2 ओ के 60 एमएल में29.5ग्राम पोटेशियम एसीटेट को भंग करें, एसिटिक एसिड के 11.5 एमएल जोड़ें, और एच2ओ से 100 एमएल करें।
    4. पुनः प्राप्ति बफर तैयार करें: 20% ग्लूकोज के 95 एमएल, 1 एम ट्राइस-सीएल पीएच 8 के 5 एमएल, 0.5 एम ईडीटीए पीएच 8 के 4 एमएल, और एच 2 ओ से200मिलियन एमएल जोड़ें।
    5. लाइसिस समाधान तैयार करें: 8.3 एम नाओएच का 4.8 एमएल, 20% एसडीएस का 10 एमएल और एच 2 ओ से200मिलीएल।

2. BJ5183 बैक्टीरिया में pAdEasy-1 प्लाज्मिड के साथ pAdTrack-GFP वायरल वेक्टर का पुनर्संयोजन

  1. पीएडट्रैक-जीएफपी का रैखिकीकरण और रैखिक प्लास्मिड का शुद्धिकरण।
    1. बर्फ पर निम्नलिखित पाचन मिश्रण तैयार करें:
      10 pAdTrack-GFP के μg
      10x बेरंग बफर के 5 माइक्रोन
      पीएमई आई के 2 माइक्रोन
      एच2O के 50 μL की एक अंतिम मात्रा के लिए।
    2. पानी में नहाने में 3 घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय करें।
    4. पीएमई I के साथ पीएडट्रैक-जीएफपी के पाचन की दक्षता की जांच करें: 0.8% एगर उठे जेल पर 1 माइक्रोन अनचावनित प्लाज्मिड के साथ समानांतर में पचा हुआ प्लाज्मिड का 1 माइक्रोन चलाएं।
  2. डीएनए का अलगाव और शुद्धिकरण
    नोट: चरण 1-6 को धूम हुड में किए जाने की आवश्यकता है।
    1. पाचन मिश्रण पर फिनोल/क्लोरोफॉर्म/आइसोअमिल अल्कोहल (25:24:1) की बराबर मात्रा डालें और मिश्रण सजातीय होने तक ट्यूब को उलटा करें ।
    2. 16,200 x gपर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज, और फिर ऊपरी जलीय चरण को संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. कम कार्बनिक चरण और भंवर पर फिनोल/क्लोरोफॉर्म/आइसोअमिल अल्कोहल (25:24:1) की बराबर मात्रा जोड़ें ।
    4. 16,200 x gपर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज, और फिर ऊपरी चरण को उसी संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. संग्रह ट्यूब और भंवर में काटा जलीय चरण पर क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा जोड़ें।
    6. 16,200 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज, और फिर ऊपरी जलीय चरण को एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. 3 एम सोडियम एसीटेट की 1/10 मात्रा और ठंडे 100% इथेनॉल और भंवर की 2 मात्रा जोड़ें।
    8. -70 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे या रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. बर्फ पर नमूना गल और 16,200 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए यह अपकेंद्रित्र।
    10. सुपरनेट निकालें और 750 μL 75% इथेनॉल जोड़ें।
    11. 16,200 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
    12. संक्षेप में सभी सुपरनैंट को हटाने के लिए ट्यूब स्पिन करें और हुड में गोली को सुखा लें। डीएनए गोली को लंबे समय तक न सुखाएं क्योंकि इसे भंग करना मुश्किल है।
    13. गोली को एच2ओ के 15 माइक्रोन में घोलें।
    14. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (जैसे, नैनोड्रॉप) का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें।
  3. PAdTrack-GFP के साथ AdEasier-1 बैक्टीरिया का परिवर्तन
    नोट: इस चरण में, pAdEasy-1 प्लाज्मिड के साथ pAdTrack-GFP का पुनर्संयोजन होता है।
    1. निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए वाणिज्यिक परिवर्तन किट का उपयोग करके, AdEasier-1 (BJ5183-युक्त pAdEasy-1, Addgene #16399) रासायनिक सक्षम बैक्टीरिया तैयार करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोन सक्षम बैक्टीरिया के aliquots रखें।
    2. बर्फ पर सक्षम AdEasier-1 बैक्टीरिया का एक aliquot गल और शुद्ध Pme मैं-पचा pAdTrack-GFP के 1 μg जोड़ें । ट्यूब को फ्लिक करके धीरे-धीरे मिलाएं (मिश्रण को पिपेट न करें)। बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. एसओसी माध्यम के 900 माइक्रोन जोड़ें और मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 600 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए माइक्रोफ्यूज।
    5. सुपरनैंट के 900 माइक्रोन निकालें, गोली और सुपरनेट को मिलाएं और एलबी-एगर प्लेट्स पर ट्रांसफॉर्म किए गए बैक्टीरिया को कानामाइसिन के साथ सीड करें।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट (18 घंटे से अधिक नहीं है)।
  4. पीसीआर द्वारा संभावित सकारात्मक क्लोन का चयन
    1. टूथपिक्स को दो हिस्सों में बांट लें और आधे टूथपिक्स को ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज करें।
    2. बाँझ आधा टूथपिक्स का उपयोग करके छोटी और पारदर्शी कॉलोनियों को उठाएं।
    3. संक्षेप में, आधा टूथपिक को 10 माइक्रोल पानी (पीसीआर ट्यूब में) में बैक्टीरिया के साथ घुमाएं और फिर आधा टूथपिक को 1.5 एमएल एप्पेंडोर्फ ट्यूब में डाल दें जिसमें 100 माइक्रोन एसओसी माध्यम कानमाइसिन के साथ है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 घंटे के लिए इनक्यूबेट, जबकि आप "नकारात्मक" और "सकारात्मक" पीसीआर द्वारा क्लोन का परीक्षण करते हैं।
    4. बैक्टीरियल नमूना प्राप्त करने और "नकारात्मक" और "सकारात्मक" पीसीआर के समानांतर चलाने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए बैक्टीरिया के साथ 10 माइक्रोल पानी युक्त पीसीआर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    5. "नकारात्मक" पीसीआर - pAdTrack-GFP अखंडता का परीक्षण करने के लिए: बर्फ पर नकारात्मक पीसीआर के लिए निम्नलिखित पीसीआर मिश्रण तैयार करें।
      बैक्टीरियल नमूने का 5 माइक्रोन
      प्राइमर फॉरवर्ड के 0.1 माइक्रोन (4631 एफ: 5'-CAGTAGTCGGGGTCTTCCAG)
      प्राइमर रिवर्स के 0.1 माइक्रोन (5616 आर: 5'-TATGGGGGCTGTAATTTTCTC)
      0.1 डीएनटीपी 10 एमएमएम का माइक्रोन
      5x बफर के 3 माइक्रोन
      एमजीसीएल2 25mM के 1.5 माइक्रोन
      0.1 μL के GoTaq बहुलक
      एच2ओ 15 माइक्रोल की अंतिम मात्रा में
      नोट: सकारात्मक नियंत्रण जिसमें डीएनए टेम्पलेट pAdTrack-GFP वेक्टर है शामिल किया जाना चाहिए ।
    6. "सकारात्मक" पीसीआर - ब्याज के जीन की उपस्थिति का परीक्षण करने के लिए। डाला जीन के लिए विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करें और पिछले चरण की तरह मिश्रण तैयार करते हैं। जीएफपी के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर निम्नलिखित थे:
      एफ: 5'-CAAGGACGACGGCAACTACA
      आर: 5'-ATGGGGGTTTTCTCTGGTAT
    7. समानांतर में "नकारात्मक" और "सकारात्मक" पीसीआर चलाएं। पीसीआर कार्यक्रम है: 5 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस; निम्नलिखित चरणों के 40 चक्र: 30 सेकंड, 95 डिग्री सेल्सियस; 30 सेकंड, 68 डिग्री सेल्सियस; 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस; अंतिम विस्तार: 10 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: ब्याज के जीन को प्रवर्धन के लिए एनीलिंग तापमान को अनुकूलित करें।
    8. 1% एगर उठे जेल पर पीसीआर उत्पादों का मूल्यांकन करें और क्लोन का चयन करें।
    9. "सकारात्मक पीसीआर" के बाद "नकारात्मक पीसीआर" और विशिष्ट पीसीआर उत्पाद के लिए कोई पीसीआर उत्पाद देने वाले क्लोन को आगे संसाधित करने के लिए विचार करें।
  5. चयनित पुनर्संयोजन क्लोन की बैक्टीरियल संस्कृतियों को बढ़ाएं
    1. माना सकारात्मक क्लोन की संस्कृतियों को पतला (कदम 2.4.3.) KANamycin के साथ एसओसी माध्यम के 4 डिग्री में, और मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रात भर इनक्यूबेट।
  6. AdEasier-1 बैक्टीरिया से प्लाज्मिड डीएनए का अलगाव (क्षारीय लाइसिस का उपयोग करके मिनीप्रेप)
    1. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में बैक्टीरियल कल्चर का 1.5 एमएल ट्रांसफर करें, 16,200 एक्स ग्रामपर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें, और सुपरनैंट को हटा दें।
    2. एक ही ट्यूब में एक और 1.5 एमएल बैक्टीरियल कल्चर स्थानांतरित करें, अपकेंद्री दोहराएं, और सुपरनेट को हटा दें।
    3. रिस्पन्सियन बफर (50 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम ईडीटीए, 25 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8) के 200 माइक्रोल जोड़ें।
    4. लाइसिस समाधान (0.2 एन नाओएच, 1% एसडीएस) के 200 माइक्रोन जोड़ें, ट्यूब को उलटा करके धीरे-धीरे मिलाएं।
    5. वर्षा समाधान के 200 μL जोड़ें (5 एम पोटेशियम एसीटेट के 60 एमएल, हिमनदों एसिटिक एसिड के 11.5 एमएल, 100 मिलीएल तक एच2ओ जोड़ें), और ट्यूब को उलटा करके धीरे-धीरे मिलाएं।
    6. 16,200 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    7. एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सुपरनेट को स्थानांतरित करें, बर्फ पर 20 मिनट के लिए 500 माइक्रोल आइसोप्रोपेनॉल, मिक्स और इनक्यूबेट जोड़ें।
    8. 16,200 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज और 75% इथेनॉल के 500 माइक्रोन जोड़ें।
    9. 16,200 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें।
    10. 16,200 x gपर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज, सुपरनैंट को हटा दें और एच2ओ के 15 माइक्रोल जोड़ें।
  7. पुनः मिलाए गए प्लाज्मिड्स का प्रवर्धन, अलगाव और पुनः परीक्षण
    1. AdEasier-1 कोशिकाओं से अलग डीएनए के साथ DH5α बैक्टीरिया का परिवर्तन।
      1. निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए वाणिज्यिक परिवर्तन किट का उपयोग करके DH5α सक्षम बैक्टीरिया तैयार करें।
      2. बर्फ पर DH5α सक्षम बैक्टीरिया के 100 μL गल, recombinant डीएनए जोड़ने के लिए, और बर्फ पर 10 मिनट इनक्यूबेट। फिर बैक्टीरिया को कनामासिन के साथ पौंड-एगर प्लेटों पर बीज दें।
      3. रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      4. कई उपनिवेशों को उठाएं और एलबी माध्यम के 2 एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस पर, रात भर, मिलाते हुए।
    2. डीएनए को अलग करें (क्षारीय लाइसिस का उपयोग करके मिनीप्रेप) और प्राप्त डीएनए को 25 माइक्रोन एच2ओ में फिर से खर्च करें।
    3. एंजाइमेटिक पाचन द्वारा सकारात्मक क्लोन की पुष्टि करें।
      1. बर्फ पर निम्नलिखित मिश्रण तैयार करें:
        5 μL recombinant डीएनए
        10x बेरंग बफर के 1.5 माइक्रोन
        0.5 μL के हिंद III या पीएसटी मैं
        एच2ओ 15 माइक्रोल की अंतिम मात्रा में
      2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
        नोट: एक नियंत्रण के रूप में, pAdTrack-GFP और pAdEasy-1 प्लाज्मिड्स को भी पचाएं।
      3. प्रत्येक नमूने में RNase A के साथ Sx6 लोडिंग बफर के 3 μL जोड़ें (यदि RNase A मिनीप्रेप बफर में मौजूद नहीं है)।
      4. 1% एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस पर पचा डीएनए के टुकड़ों को चलाएं।
        नोट: एक सकारात्मक क्लोन के पाचन पैटर्न में पचाने वाले pAdEasy प्लाज्मिड के अधिकांश टुकड़े शामिल हैं, जो pAdTrack वेक्टर के साथ pAdEasy पुनर्संयोजन का खुलासा करते हैं। ब्याज के जीन क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पाचन द्वारा सबूत होना चाहिए ।
    4. एडेनोवायरस पैकेजिंग के लिए प्लाज्मिड डीएनए (ट्रांसफैक्शन-ग्रेड) की तैयारी।
      1. प्लाज्मिड डीएनए को अलग करने के लिए एक सकारात्मक क्लोन से बैक्टीरिया की 200 मिलीएल संस्कृति बढ़ाएं।
      2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्लाज्मिड डीएनए मिडीप्रेप (जैसे, Qiagen प्लाज्मिड मिडी किट) के लिए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके प्लाज्मिड डीएनए को अलग करें।

3. एडेनोविराल कणों की पैकेजिंग

  1. दिन 1. AD293 कोशिकाओं बीज
    1. AD293 कोशिकाओं को पीबीएस के साथ धोएं और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए 0.125% ट्राइप्सिन के साथ इनक्यूबेट करें।
    2. सीरम के साथ ठंडे माध्यम में कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    4. सीरम के साथ मध्यम में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और कोशिकाओंको ~2 x 10 6/T25 फ्लास्क के घनत्व पर बीज करें । अधिमानतः, एक फिल्टर के साथ एक फ्लास्क का उपयोग करें।
  2. दिन 1. पीएसी मैं के साथ recombinant डीएनए पचा
    1. निम्नलिखित मिश्रण तैयार करें:
      6 μL के recombinant डीएनए (1 μg/μL)
      पीएसी I के 2 माइक्रोन
      10x बेरंग बफर के 2.5 माइक्रोन
      एच2O 25 माइक्रोल की अंतिम मात्रा में
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे (या रात भर) के लिए इनक्यूबेट, और फिर 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम निष्क्रिय।
    3. इथेनॉल के साथ डीएनए वर्षा: 2.5 माइक्रोन (1/10 v/v) 3 एम सोडियम एसीटेट और 100% इथेनॉल के 2-3 वॉल्यूम जोड़ें। इनक्यूबेशन -70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट या रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और बाँझ पानी में गोली को फिर से खर्च करें।
  3. दूसरा दिन: K2 अभिकर् ता का उपयोग करके AD293 कोशिकाओं का ट्रांसफ़ेक्शन
    1. ट्रांसफैक्शन से दो घंटे पहले कोशिकाओं पर K2 गुणक के 40 μL जोड़ें।
    2. ए और बी समाधान तैयार करें:
      समाधान ए: ऑप्टी-एमईएम के 260 माइक्रोन में पीएसी एल-रैखिक डीएनए के 6 माइक्रोन जोड़ें।
      समाधान बी: ऑप्टी-एमईएम के 248.4 माइक्रोन में K2 रीएजेंट के 21.6 माइक्रोन जोड़ें।
    3. समाधान ए ओवर सॉल्यूशन बी जोड़ें और पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं।
    4. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं में ड्रॉपवाइज ए और बी मिक्स जोड़ें।
  4. दिन 3-11: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा जीएफपी अभिव्यक्ति की निगरानी करें
    नोट: कोशिकाओं फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में हरे रंग की दिखाई देना चाहिए और धीरे से अलग होना चाहिए ।
  5. दिन 11: फसल F1 adenoviral कणों
    1. अलग कोशिकाओं और माध्यम को 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें, अनुयायी कोशिकाओं को कुरेदें, और उन्हें एक ही ट्यूब में जोड़ें।
    2. 400 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज, एक नई ट्यूब में सुपरनैंट इकट्ठा करें और पीबीएस के 0.5 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
    3. सेल व्यवधान
      1. कोशिका निलंबन को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      2. अधिकतम 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर तीन फ्रीज/गल चक्र (तरल नाइट्रोजन में फ्रीज या -80 डिग्री सेल्सियस /गल पर) करें।
      3. टूटी हुई कोशिकाओं को 23 जी सिरिंज सुई के माध्यम से तीन बार पास करें।
    4. 12 मिनट के लिए 9,600 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे को हटा दें।
    5. सुपरनिटेंट को एकत्रित माध्यम के साथ 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।

4. एडेनोवायरस का प्रवर्धन

नोट: यदि AD293 कोशिकाएं आवश्यक संगम तक नहीं पहुंचती हैं, तो संक्रमण के लिए उपयोग किए जाने वाले एडेनोवायरल स्टॉक (वायरस उत्पादक कोशिकाओं से प्राप्त lysate) के aliquots -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

  1. F2 adenoviral कणों को तैयार करें।
    1. एक T75 फ्लास्क (5 x 106 कोशिकाओं/फ्लास्क) में AD293 कोशिकाओं बीज ।
    2. F1 adenoviral कणों का उपयोग कर ~ 90% शांत AD293 कोशिकाओं को संक्रमित करें: T75 फ्लास्क में उगाई जाने वाली कोशिकाओं पर टी-25 फ्लास्क से सेल समरूप और माध्यम जोड़ें।
    3. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा जीएफपी अभिव्यक्ति की निगरानी करें।
    4. वायरस पैदा करने वाली कोशिकाओं को तब काटा जाए जब ~ 90% ट्रांसड्यूडेड एडी 293 अलग हो जाते हैं (~ ट्रांसडक्शन के बाद5 वें दिन)। सेल कल्चर मीडियम को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    5. 1 एमएल पीबीएस में कोशिकाओं (इसी तरह F1 के लिए उन लोगों के साथ) को बाधित करें।
  2. F3 adenoviral कणों को तैयार करें।
    1. F2 adenoviral कणों और F2 adenoviral कणों से सेल संस्कृति माध्यम के साथ T175 फ्लास्क में वरीयता प्राप्त ~ 90% ढुलमुल AD293 कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    2. कोशिकाओं की कटाई (~ 5 दिन के बाद) ।
    3. पीबीएस के 2 एमएल में कोशिकाओं (इसी तरह F1 के लिए उन लोगों के साथ) को बाधित करें।
  3. F4 adenoviral कणों को तैयार करें।
    1. F3 adenoviral कणों और सेल संस्कृति माध्यम के साथ ~ 90% ढुलमुल AD293 कोशिकाओं वाले 5 T175 फ्लास्क को संक्रमित करें।
    2. कोशिकाओं की कटाई (~ 5 दिन के बाद) ।
    3. पीबीएस के 3 एमएल में कोशिकाओं (इसी तरह F1 के लिए उन लोगों के साथ) को बाधित करें।
  4. F5 adenoviral कणों को तैयार करें।
    1. F4 adenoviral स्टॉक और सेल संस्कृति माध्यम के साथ ~ 90% कन्फ्लूंट AD293 कोशिकाओं वाले 25 T175 फ्लास्क को संक्रमित करें।

5. कोशिका और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरस की शुद्धि

  1. वायरस पैदा करने वाली कोशिकाओं और संस्कृति माध्यम की कटाई।
    1. ट्रांसडक्शन से 5 दिनों के बाद F5 की AD293 कोशिकाओं को फसल।
    2. एडिनोवायरल कणों की वर्षा के लिए एक बाँझ बोतल में माध्यम को बचाएं।
      नोट: एडेनोवायरस की शुद्धि होने तक माध्यम को फ्रिज में रखें।
    3. 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें, 5 मिनट के लिए, 4 ओसी पर।
    4. 10 एमएमएम ट्रिस एचसीएल के 5 एमएल में अंतिम गोली को फिर से रीसुड करें, पीएच 8 के साथ 2 एमएमएम एमजीसीएल2।
    5. 1.5 एमएल ट्यूब में निलंबन को अलीकोट करें।
    6. कोशिकाओं को बाधित (इसी तरह F1 के लिए उन लोगों के साथ): ठंड के तीन चक्र/
      नोट: यदि अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन तुरंत नहीं किया जा सकता है, तो नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    7. तीन बार के लिए एक 23G सिरिंज सुई के माध्यम से सेल निलंबन पास।
    8. 12 मिनट के लिए, 9 600 x ग्राम पर समरूप अपकेंद्रित्र करें।
    9. सीएससीएल रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन द्वारा एडेनोवायरस शुद्धिकरण के लिए सुपरनेट को बचाएं।
  2. संस्कृति माध्यम में जारी एडेनोवायरस की वर्षा।
    1. कमरे के तापमान पर बचाया सेल संस्कृति माध्यम के साथ बोतल लाओ।
    2. सेल कल्चर मीडियम के हर 500 एमएल में 121 ग्राम अमोनियम सल्फेट जोड़ें (समाधान का संतृप्ति 40 - 42%) के बीच होना चाहिए।
    3. अमोनियम सल्फेट पूरी तरह से घुल जाने तक ध्यान से मिलाएं।
    4. कमरे के तापमान पर न्यूनतम 2.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    5. 1600 x g पर सेंट्रलाइज, 15 मिनट के लिए, 22 ओसी पर और गोली को बचाएं।
    6. 10एमएम ट्रिस एचसीएल पीएच 8 के 4 एमसीएल में 2एमएम एमजीसीएल2के साथ गोली को फिर से र्इंसल करें; इस निलंबन को सीएससीएल ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा तुरंत शुद्ध किया जाना चाहिए।
      नोट: यदि शुद्धिकरण कदम बाद में नहीं किया जा सकता है, तो रातोंरात 10mM Tris HCl, पीएच 8 के खिलाफ 2mM MgCl2के साथ फिर से निलंबित गोली ।
  3. अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन द्वारा एडेनोवायरस शुद्धिकरण।
    1. SW41Ti रोटर के लिए पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में एक असतत सीसीएल ढाल तैयार करें। ट्यूब के नीचे 765 मिलीग्राम/एमएल सीएससीएल (उच्च घनत्व: 1.4 ग्राम/एल) का 3 एमएल जोड़ें। पहले सीएससीएल लेयर के शीर्ष पर धीरे-धीरे 288.5 मिलीग्राम/एमएल सीएससीएल (कम घनत्व: 1.2 ग्राम/एल) का 3 एमएल जोड़ें।
    2. धीरे-धीरे कोशिकाओं से जारी एडेनोवायरल कण निलंबन के 3 - 4 एमएल को ओवरले करें या ढाल के शीर्ष पर कोशिका संस्कृति माध्यम (जैसा कि पहले वर्णित है) से उपजी हो।
    3. ट्यूबों को खनिज तेल से भरें, और ट्यूबों को ठंड SW41Ti बाल्टी में डाल दें।
    4. ट्यूबों को बराबर करना। सुनिश्चित करें कि भरे हुए पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब को रोटर में सममित रूप से लोड किया जाता है। अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में रोटर लगा दें।
    5. 210,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज, 18 घंटे के लिए, कोई ब्रेक नहीं।
    6. बैंड पाने के लिए पीछे एक काले कागज के साथ एक स्टैंड पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें।
    7. ब्लीचिंग समाधान के साथ एक अपशिष्ट कंटेनर में स्पष्ट ऊपरी चरण, सेल मलबे, और ऊपरी बैंड को त्यागें।
    8. सबसे कम बैंड को फसल करें जिसमें एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में पूर्ण एडेनोवायरस (~ 700 माइक्रोन - 1 एमएल) शामिल है और इसे बर्फ पर रखें।
    9. डायलिसिस बफर में एक डायलिसिस कैसेट को प्री-वेट करें (10 एमएम ट्रिस-सीएल बफर पीएच 8, 2 एमएमएम एमजीसीएल2)।
    10. 2 मिलील सिरिंज का उपयोग करके शुद्ध एडेनोवायरस को डायलिसिस कैसेट में इंजेक्ट करें।
    11. 10 mM Tris-सीएल बफर पीएच 8, 2 mM MgCl 2 (डायलिसिस बफर 3-4 बार बदलें) के खिलाफ रातोंरात डायलाइज ।
    12. 10 - 100 माइक्रोल के aliquots में डायलिसिस कैसेट से एडेनोवायरल स्टॉक फसल।
    13. वायरल एलिकोट्स (क्रायोप्रोटेक्शन के लिए) में 4% अंतिम एकाग्रता में सुक्रोज जोड़ें।
    14. -80 डिग्री सेल्सियस पर अलीकोट स्टोर करें।

6. एडेनोवायरस टाइट्रेशन

  1. 1 दिन: कोशिकाओं चढ़ाना
    1. 1 मिलीएल पूर्ण विकास माध्यम में 2.5 × 105 कोशिकाओं (12-अच्छी संस्कृति प्लेट में) के घनत्व पर एडी 293 कोशिकाओं को बीज दें, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को सटीक टाइटर दृढ़ संकल्प के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से समान रूप से फैल रहे हैं ।

Figure 2
चित्रा 2: टिटरेशन प्लेट डिजाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. दूसरा दिन: कोशिकाओं का लेनदेन
    1. ट्रिप्पसिन के साथ एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को अलग करें और उन्हें गिनें। इस नंबर पर ध्यान दें क्योंकि इसका इस्तेमाल वायरल टाइटर की गणना के लिए किया जाएगा।
    2. पूर्ण विकास माध्यम के 1 मिलीलन में वायरल स्टॉक के धारावाहिक कमजोर पड़ने(1/104;1/105;1/107)इस प्रकार है:
    3. 1/103:वायरस स्टॉक को कमजोर करना - पूर्ण माध्यम के 1998 माइक्रोन में वायरल स्टॉक के 2 माइक्रोन जोड़ें।
    4. 1/104:1:103 के 1:10 कमजोर करने के लिए 120 माइक्रोन को कमजोर करके 1080 पूर्ण माध्यम (ए) के μL ।
    5. 1/105:पूर्ण माध्यम (बी) के एक से १०८० माइक्रोन के १२० माइक्रोन को कमजोर करके बी का 1:10 कमजोर करें ।
    6. 1/106:बी के 120 माइक्रोन को कमजोर करके सी को 1080 माइक्रोन पूर्ण माध्यम (सी) के रूप में कमजोर करें।
    7. 1/107:1:10 सी के 120 माइक्रोन को पतला करके पूर्ण माध्यम (डी) का 1080 माइक्रोन करके डी का पतला करें।
      नोट: ट्रिपलआईटी में प्रयोग करने के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने (ए, बी, सी, डी) की 3 ट्यूब तैयार करें।
    8. कुओं से सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें और वायरस के तैयार कमजोर पड़ने को जोड़ें, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है।
  2. 3 दिन: जीएफपी अभिव्यक्ति की निगरानी
    1. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके हरी कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए कुओं की जांच करें।
  3. 4 दिन: जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
    1. बारह 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें और लेबल करें।
    2. 1.5 एमएल ट्यूबों में सेल कल्चर मीडियम (अलग कोशिकाओं के साथ) को इकट्ठा करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    3. प्रत्येक कुएं में ट्राइपसिन के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    4. सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर2 - 3 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    5. कोशिका संस्कृति माध्यम के साथ एक ही Eppendorf ट्यूबों में कोशिकाओं फसल। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    6. 400 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली, 5 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    7. सुपरनैंट निकालें; ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    8. पीबीएस + 2% एफबीएस के 250 माइक्रोल में गोली को फिर से खर्च करें; ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    9. प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब या प्लेट में सेल निलंबन स्थानांतरित करें।
    10. कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले जीएफपी के फ्लोरेसेंस को रिकॉर्ड करने वाले प्रवाह साइटोमीटर पर नमूनों को चलाएं।
      टाइटर गणना: माता-पिता की आबादी से 5 - 20% जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं वाले नमूनों को निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके वायरल टाइटर की गणना के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए:
      टाइटर (TU/mL) = D x F/100 x C/V
      D = कमजोर पड़ने का कारक
      एफ = सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत/
      C = कोशिकाओं की संख्या/
      V = वायरल इनोकुलम की मात्रा

7. लक्ष्य कोशिकाओं का एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन और प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति का परीक्षण

  1. पहला दिन: कोशिकाओं को सीडिंग
    1. लक्ष्य कोशिकाओं को यह सुनिश्चित करने के लिए बीज दें कि वे कुओं में समान रूप से फैले हुए हैं।
  2. दूसरा दिन: कोशिकाओं का लेनदेन
    1. लक्ष्य कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से अलग करें और उन्हें गिनें।
    2. प्रति कोशिका संक्रामक कणों की वांछित संख्या के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक एडेनोवायरल निलंबन की उचित मात्रा की गणना करें।
    3. लक्ष्य कोशिकाओं में वायरल निलंबन की संबंधित राशि जोड़ें।
  3. 3 दिन: वायरल निलंबन को हटाने और GFP अभिव्यक्ति के लिए जांच
    1. एडेनोवायरल कणों वाले सेल कल्चर मीडियम को ताजा माध्यम से बदलें।
    2. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर जीएफपी अभिव्यक्ति की जांच करें।

Representative Results

हमने तेजी से और अधिक कुशल एडेनोवायरस उत्पादन प्राप्त करने के लिए मूल वोगेलस्टीन के प्रोटोकॉल को संशोधित और बेहतर बनाया। सबसे पहले, हमने पुनर्संयोजनों का आसान चयन प्राप्त करने के लिए कार्यप्रणाली को संशोधित किया। पुनर्संयोजन के बाद, BJ5183 बैक्टीरियल क्लोन का परीक्षण "नकारात्मक पीसीआर" द्वारा किया गया था ताकि pAdTrack-GFP की अखंडता का आकलन किया जा सके, जो पुनर्संयोजन(चित्रा 3 ए)की कमी के संकेतक के रूप में या "सकारात्मक पीसीआर" द्वारा ब्याज के जीन की पहचान करने के लिए, हमारे मामले में GFP(चित्रा 3B)को आत्मसात किया गया । "नकारात्मक" और "सकारात्मक" पीसीआरएस दोनों में, हमने एक नियंत्रण टेम्पलेट के रूप में pAdTrack-GFP का उपयोग किया, जिसने पीएडट्रैक अखंडता(चित्रा 3 ए,लेन 1) के लिए 986 बीपी का एक बैंड दिया, और जीएफपी(चित्रा 3 बी,लेन 3) के लिए 264 बीपी का एक बैंड दिया। "नकारात्मक पीसीआर" के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर को PAdTrack-GFP में PmeI साइट युक्त ९८६ बीपी के एक टुकड़े को बढ़ाना डिजाइन किया गया था । इस डीएनए टुकड़े को पुनर्संयोजन के बाद काफी बढ़ा दिया जाता है और सकारात्मक पुनर्संयोजन क्लोन में परिलक्षित नहीं होता है। पुनर्संयोजन के लिए नकारात्मक क्लोन, जिसमें pAdTrack-GFP बरकरार रहे, चित्रा 3A, लेन 3,4, और 6 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । पुनर्संयोजन स्थल से सटे डीएनए दृश्यों पर प्राइमर एनील। संभावित सकारात्मक पुनर्संयोजन क्लोन(चित्रा 3 ए,लेन 2 और 5) ने जीएफपी को चित्र 3 B,लेन 1 और 2 में दिखाया गया है। इन क्लोन से प्लाज्मिड डीएनए अलग-थलग पड़ गया था और डीएनए की एक उच्च राशि प्राप्त करने के लिए DH5α परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया गया था। DH5α में परिलक्षित इन पूर्वचयनित पुनर्संयोजन प्लाज्मिड्स को तब एंजाइमेटिक पाचन द्वारा परीक्षण किया गया था। चित्रा 3सी-ई में हिंद III, पीएसटीआई, बाम्ही प्रतिबंध एंजाइम(चित्रा 3सी, डी, ई लेन 2) के साथ पचाने वाले एक पुनर्संयोजन-सकारात्मक क्लोन के एंजाइमीय पाचन के परिणामों को दर्शाया गया है। रीकॉम्बिनेंट क्लोन के हिंडीआइ और पीएसटी पाचन पैटर्न पीएडी-1 के लिए प्राप्त किए गए लोगों के समान थे क्योंकि हिंदआईआई और पीएसटीआई ने क्रमशः 24 और 25 बार pAdEasy-1 प्लाज्मिड में कटौती की,(चित्रा 3सी और डी,लेन 3); हिंडीआइ ने एक बार कटौती की और पीएसटीआई ने चार बार पीएडट्रैक-जीएफपी वेक्टर(चित्रा 3सी और डी,लेन 1) में कटौती की । BamHI दो बार pAdEasy-1 वेक्टर(चित्रा 3C, लेन 3)में कटौती, और एक बार pAdTrack-GFP(चित्रा 3C,लेन 1) ।

PacI ने रीकॉम्बिनेंट प्लाज्मिड(चित्रा 3F,लेन 2), pAdTrack-GFP (चित्रा 3F, लेन 1) से २८६३ बीपी का एकटुकड़ा,से ४.५ केबी के टुकड़े को काट दिया, और pAdEasy-1 वेक्टर(चित्रा 3F,लेन 3) को रैखिक कर दिया । डीएनए सीढ़ी चित्रा 3सी-एफमें प्रतिनिधित्व किया है, गलियों में 4 । REcombinant प्लाज्मिड AD293 ट्रांसफैक्शन के लिए आगे के उपयोग के लिए पीएसी I के साथ पचा गया था।

Figure 3
चित्रा 3: pAdEasy-1 प्लाज्मिड के साथ pAdTrack-GFP का पुनर्संयोजन। PAdTrack-GFP और pAdEasy-1 के पुनर्संयोजन के बाद प्राप्त प्लाज्मिड pAdTrack-GFP अखंडता (ए) के लिए "नकारात्मक" पीसीआर द्वारा परीक्षण किया गया । गैर-पुनर्संयोजन क्लोन को PAdTrack-GFP प्लाज्मिड (ए, लेन 3, 4, और 6) से परिलक्षित अनुक्रम के अनुरूप 986 बीपी बैंड की उपस्थिति से सबूत दिया गया था। पुनर्संयोजन (ए, लेन 2 और 5) के लिए संभावित रूप से सकारात्मक क्लोन भी प्राप्त किए गए थे। जब PAdTrack-GFP वेक्टर एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था, pAdTrack-GFP (ए, लेन 1) के लिए ९८६ बीपी का एक बैंड प्राप्त किया गया था । संभावित सकारात्मक पुनर्संयोजन क्लोन "सकारात्मक" पीसीआर (बी) द्वारा GFP अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण किया गया; 264 बीपी का एक बैंड संभावित रूप से पुनः संयोजन क्लोन (बी, लेन 1 और 2) के साथ-साथ पीएडट्रैक-जीएफपी प्लाज्मिड के लिए दिखाई देता है। एक संभावित रिकॉम्बिनेंट क्लोन से डीएनए का परीक्षण हिंदआईआई, पीएसटीआई, बाम्ही और पैसी प्रतिबंध एंजाइम (सी-एफ, लेन 2) के साथ किया गया था। नियंत्रण में, pAdEasy-1 वेक्टर (सी-एफ, लेन 3) और pAdTrack-GFP प्लाज्मिड (सी-एफ, लेन 1) एक ही एंजाइमों के साथ पचा रहे थे । डीएनए सीढ़ी सी-एफ लेन 4 में प्रतिनिधित्व किया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

AD293 कोशिकाओं में एडेनोवायरल पैकेजिंग और प्रवर्धन किया गया। एडेनोवायरल कणों (AdV-GFP) को AD293 सेल lysate के साथ-साथ सेल कल्चर मीडियम से शुद्ध किया गया था, जहां उन्हें संक्रमित कोशिकाओं द्वारा जारी किया गया था । कोशिका संस्कृति माध्यम में पाए जाने वाले एडेनोवायरस को केंद्रित करने के लिए, कणों को अमोनियम सल्फेट के साथ उपजी थी और फिर 10 एमएम ट्रिस एचसीएल पीएच 8 में 2 एमएमएम एमजीसीएल2के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया था, वही बफर जो सेल लाइसिस के लिए उपयोग किया जाता था। इसके बाद, कोशिका के लिसेट और संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों को सीएससीएल असतत ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा शुद्ध किया गया था। अल्ट्रासेन्ट्रफ्यूगेशन के बाद, शुद्ध एडीवी-जीएफपी का एक मजबूत बैंड प्राप्त किया गया था, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है।

Figure 4
चित्र 4: एक असतत सीसीएल ढाल पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा एडेनोवायरल शुद्धिकरण। माध्यम से उपजी कोशिका समरूप और एडेनोवायरस को निम्न और उच्च घनत्व वाले सीएससीएल समाधानों द्वारा गठित एक असतत ढाल पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन के अधीन किया गया था। दोनों मामलों में जीएफपी-एडेनोवायरस के मजबूत बैंड का सबूत था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक एमएल (टीयू/एमएल) प्रति ट्रांसड्यूसिंग इकाइयों में व्यक्त वायरल टाइटर का निर्धारण करने के लिए, AD293 कोशिकाएं एडीवी-जीएफपी के धारावाहिक कमजोर पड़ने से संक्रमित थीं । 48 घंटे के बाद, संक्रमित कोशिकाओं ने वायरल निलंबन के कमजोर पड़ने के कारक के साथ एक विपरीत संबंध में GFP व्यक्त किया। यह फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया था और जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 5)द्वारा निर्धारित किया गया था। टिटर की गणना करने के लिए, जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के 5 - 20% प्रेरित वायरल कमजोर पड़ने पर विचार किया गया(चित्रा 5C)। आमतौर पर, हम जीएफपी-एडिनोवायरस के लिए ~10 10 (टीयू/एमएल) का वायरल टाइटर प्राप्त करते हैं।

नीचे, हम एक विशिष्ट एडेनोवायरल बैच के लिए एक एडेनोवायरल टिटर गणना का एक उदाहरण प्रदान करते हैं जिसमें 300000 कोशिकाओं (सी) को 1 मिलियन एडेनोवायरल समाधान (वी) के साथ 1 मिलियन 1 मिलियन एडेनोवायरल समाधान (वी) के साथ स्थानांतरित किया गया था, 106 (डी) के कमजोर पड़ने वाले कारक पर, जिसके लिए 6% जीएफपी-सकारात्मक कोशिकाएं (एफ) प्राप्त की गई थीं:

टाइटर (टीयू/एमएल) = डी एक्स एफ/100 एक्स सी/वी = 106 x 6/100 x 300000/1 = 1.8 x 1010 टीयू/एमएल

Figure 5
चित्र 5: एडेनोवायरल टाइटर का आकलन। AD293 कोशिकाएं विभिन्न एडेनोवायरल कमजोर पड़ने से संक्रमित थीं। ४८ घंटे बाद, कोशिकाओं को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया और विभिन्न एडेनोवायरल कमजोर पड़ने (ए-डी) द्वारा प्रेरित जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए गेट स्थापित करने के लिए, गैर-ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं का भी विश्लेषण किया गया (ई)। तनु पड़ने कारक 106के लिए गणना की गई टाइटर, जब 6% कोशिकाएं जीएफपी सकारात्मक थीं, 1.8 x 1010 टीयू/एमएल थीं। पैनल ए-ई के लिए, सलाखों: 100μm . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तैयार एडेनोवायरस की ट्रांसडक्शन क्षमता का परीक्षण करने के लिए, चार सेल लाइनों का उपयोग किया गया: मानव एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईए.hy926), गोजातीय महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाएं (बीएईसी), मुरीन हेपेटोसाइट्स (हेपा 1-6), और मुरीन मेसेन्चिमल स्ट्रोमल कोशिकाएं (एमएससी)। एंडोथेलियल कोशिकाओं (EA.hy926 और BAEC) को 25 टीयू/सेल के साथ स्थानांतरित किया गया था, हेपेटोसाइट्स को 5 टीयू/सेल के साथ स्थानांतरित किया गया था और एमएससी को २५० टीयू/सेल के साथ स्थानांतरित किया गया था ।

यहां एक उदाहरण है कि कैसे 25 टीयू/सेल के साथ 3 x 106 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए आवश्यक एडेनोवायरल निलंबन की मात्रा, 1.8 x 1010 टीयू/एमएल के साथ एडेनोवायरल निलंबन का उपयोग करके, गणना की गई थी ।

1 सेल के लिए .............. 25 टीयू
3 x 106 कोशिकाओं .............. एक्स टीयू Equation 1 एक्स = 75 x 106 टू
यदि वायरल स्टॉक में शामिल है
1.8 x 1010 टीयू .............. 1 एमएल
75 x 106 टीयू .............. वाई एमएल Equation 1 वाई = 4.2 x 10-3 एमएल = वायरल स्टॉक का 4.2μL

४८ घंटे के बाद, कोशिकाओं फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । जैसा कि चित्र 6में दिखाया गया है, मानव या गोजातीय एंडोथेलियल कोशिकाओं को अच्छी दक्षता (~ 50%) 25 टीयू/सेल के लिए(चित्रा 6 EA.hy926 और BAEC) । मुरीन हेपेटोसाइट्स (हेपा 1-6) को एडेनोवायरस कणों (5 टीयू/सेल) की कम मात्रा में एडेनोवायरस द्वारा कुशलतापूर्वक स्थानांतरित किया गया था, लेकिन वे एडेनोवायरस के प्रति भी संवेदनशील हैं क्योंकि मृत कोशिकाओं (पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं) का एक उच्च प्रतिशत दर्ज किया गया था (~ 16%) अन्य सेल प्रकारों की तुलना में। विशिष्ट एडेनोवायरल रिसेप्टर्स (अप्रकाशित डेटा) की कमी के कारण मेसेंचिमल स्ट्रोमल कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करना सबसे कठिन था(चित्रा 6)।

Figure 6
चित्र 6: एडेनोवायरस की संक्रामकता और ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं में जीएफपी अभिव्यक्ति का समावेश। मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं (EA.hy926), गोजातीय महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (BAEC), murine hepatocytes (हेपा 1-6), और murine mesenchymal stromal कोशिकाओं (एमएससी) adenovirus की इंगित राशि के साथ स्थानांतरित किया गया । जीएफपी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया गया था और जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित पीआई-पॉजिटिव कोशिकाएं वायरल ट्रांसडक्शन द्वारा निर्धारित सेल मृत्यु दर को दर्शाती हैं। EA.hy926 कोशिकाओं, गोजातीय महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं, और हेपा 1-6 कोशिकाओं को एडेनोवायरस द्वारा अत्यधिक स्थानांतरित किया गया था, 41 - 52% से लेकर ट्रांसडक्शन की उपज। एमएससी के लिए, वायरस की एक उच्च मात्रा (२५० टीयू/कोशिकाओं) ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं के केवल 27% GFP सकारात्मक प्रेरित । सलाखों: 100μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

जीन वितरण और अभिव्यक्ति के लिए एक बहुमुखी उपकरण है12 , 13,14. एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन द्वारा मजबूत प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, ब्याज के जीन का एन्कोडिंग अनुक्रम एडेनोवायरस के जीनोम में डाला जाता है। बर्ट वोगेलस्टीन की प्रयोगशाला में विकसित एडीसी एडेनोवायरल सिस्टम में एक बैकबोन प्लाज्मिड (पीएडीसी-1) शामिल है जिसमें अधिकांश जंगली प्रकार के एडेनोवायरस सेरोटाइप 5 जीनोम, और एक शटल वेक्टर (pAdTrack), जीन क्लोनिंग2,10के लिए डिज़ाइन किया गया है। एडेनोवायरल जीन E1 (संक्रामक वायरस कणों की असेंबली के लिए जिम्मेदार) और E3 (मेजबान प्रतिरक्षा से बचने में शामिल एन्कोडिंग प्रोटीन) के विलोपन ने एडेनोवायरल जीनोम में एक स्थान बनाया, जिसमें 6.5-7.5 केबी के हित का जीन2,3डाला जा सकता है। यह आकार कई जीनों के लिए पर्याप्त है, खासकर छोटे इंट्रोन15,16, 17वाले लोगोंकेलिए। शोधकर्ता भी हैं जो ट्रांसजीन18 , 19,20के सीडीएनए को ले जाने वाले एडेनोवायरस के उत्पादन की सूचना दे रहे हैं । हालांकि, हमने सीडीएनए-ले जाने वाले एडेनोवायरस के लिए ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की कम उपज प्राप्त की, जो उनके समकक्षों के लिए जीन या एक मिनी-जीन (डेटा नहीं दिखाया गया) ले जा रहा है।

पिछले तरीकों में सुधार और अनुकूल2,10,14,18,21,एडेनोवायरल उत्पादन के लिए प्रौद्योगिकी के लिए कम समय, कम लागत और कम प्रयास की आवश्यकता होती है। पूर्ण लंबाई adenoviral डीएनए शटल वेक्टर और अनुरूप पुनर्संयोजन प्रवण ई. कोलाई तनाव, BJ5183 में pAdEasy-1 प्लाज्मिड के बीच पुनर्संयोजन द्वारा प्राप्त किया जाता है । प्रोटोकॉल AdEasier-1 कोशिकाओं (BJ5183 pAdEasy-1 युक्त बैक्टीरिया) के रासायनिक परिवर्तन का तात्पर्य है । इस तकनीक के लिए एक इलेक्ट्रोपोरेटर की आवश्यकता नहीं होती है जो कुछ प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हो सकती है, बहुत सरल है, पुनर्संयोजन उपज को बढ़ाती है, और सक्षम कोशिकाओं को प्राप्त करने और परिवर्तन करने के लिए आवश्यक समय को कम करती है। पीसीआर द्वारा किए गए पुनर्संयोजन क्लोन का चयन समय को और छोटा करता है और पूरी प्रक्रिया को आसान बनाता है। इसीतरहकी प्रक्रिया का उपयोग झाओ और सहकर्मियों द्वारा किया गया था, हालांकि, प्रोटोकॉल में, हमने प्राइमर के दृश्यों को अनुकूलित किया।

जीएफपी-एडेनोवायरस पैकेजिंग और प्रवर्धन के लिए, एक HEK293 व्युत्पन्न सेल लाइन का उपयोग किया गया था, अर्थात् AD293 कोशिकाएं, जो संस्कृति प्लेट के अधिक अनुयायी हैं। आमतौर पर एडेनोवायरल उत्पादन के लिए उपयोग की जाने वाली अन्य सेल लाइनें निम्नलिखित हैं: 911, 293FT, pTG6559 (A549 व्युत्पन्न), प्रति। C6 (उसे व्युत्पन्न), GH329 (HeLa व्युत्पन्न), N52 । E6, और HeLa-E123,24,25,26। हमारे हाथों में, एडेनोवायरल उत्पादन में कोई सुधार प्राप्त नहीं किया गया था जब 911 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया था)। K2 रिएजेंट का उपयोग करके पुनर्संयोजन प्लाज्मिड के साथ AD293 कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन ने वायरल पैकेजिंग चरण की दक्षता में अत्यधिक वृद्धि की। एडेनोवायरस उत्पादन के बाद, एडीनोवायरस का ~ 70% तक अभी भी कोशिकाओं के अंदर है और तीन ठंड और विगलन चक्रों द्वारा जारी किया जाता है। चक्रों की संख्या बढ़ाना उपयुक्त नहीं है क्योंकि यह एडेनोवायरस को नष्ट कर देता है।

नियमित एडेनोवायरल उत्पादन प्रक्रिया के दौरान, सेल संस्कृति माध्यम में कई वायरल कण जारी किए जाते हैं। संक्रमित AD293 कोशिकाओं की कटाई के दौरान इस सेल संस्कृति माध्यम को त्यागने से एक महत्वपूर्ण वायरल नुकसान होगा। हमने अमोनियम सल्फेट27के साथ वर्षा करके सेल संस्कृति माध्यम से एडेनोवायरल कणों को शुद्ध करने के लिए Schagen और सहकर्मियों द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। पॉलीथीन ग्लाइकोल28का उपयोग करने की विधि की तुलना में सेल कल्चर माध्यम से एडेनोवायरस रिकवरी में इस विधि की दक्षता अधिक होती है । उपजी एडेनोवायरस को अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा तुरंत शुद्ध किया जाना चाहिए या कुछ दिनों के लिए फ्रिज में रखा जाना चाहिए लेकिन डायलिसिस के बाद ही नमक की अधिकता को दूर करना चाहिए। डायलिसिस के बिना कुछ घंटों से अधिक समय तक अवाण करना वायरस के लिए हानिकारक है।

एक चरण में किए गए अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा एडेनोवायरल कणों का शुद्धिकरण एडेनोविरल स्टॉक के हेरफेर को कम करता है और लगातार अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन चरणों का उपयोग करके प्रोटोकॉल की तुलना में प्रक्रिया को आसान बनाता है14,29। सीज़ियम क्लोराइड को हटाने के लिए शुद्ध एडेनोवायरस का डायलिसिस आवश्यक है जो आगे लेनदेन को प्रभावित कर सकता है। प्रोटोकॉल में, हमने एमजीसीएल2 वाले ट्रिस बफर का उपयोग किया, लेकिन डायलिसिस के लिए सुक्रोज नहीं, क्योंकि इसके लिए एक विशाल, अनुचित मात्रा में सुक्रोज की आवश्यकता होती है जिसे ठंड के लिए परिरक्षक के रूप में अन्यथा आवश्यक है। इस प्रकार, हमने बाद में सुक्रोज को ठंड के लिए तैयार एडेनोवायरल स्टॉक्स में सीधे जोड़ा। शुद्ध एडेनोवायरस की लगातार ठंड और विगलन से बचने के लिए, एडेनोवायरल स्टॉक को अलीकोट करने और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की सलाह दी जाती है। एडेनोवायरल टाइटर का मूल्यांकन जीएफपी रिपोर्टर जीन और एक विशिष्ट वायरल कमजोर पड़ने के लिए ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं के प्रतिशत पर विचार करते हुए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था । यह विधि शास्त्रीय "पट्टिका परख" की तुलना में तेज है और कैप्सिड प्रोटीन (एलिसा या प्रवाह साइटोमेट्री जैसे विभिन्न तरीकों से) के मूल्यांकन की तुलना में अधिक विश्वसनीय है जो एडेनोवायरल कणों के संक्रमण की क्षमता को प्रकट नहीं करता है। हालांकि, एलिसा-आधारित मात्राकरण, क्यू-पीसीआर, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके पट्टिका परख वैकल्पिक तरीके हैं, विशेष रूप से एडेनोवायरस के टिटरेशन के लिए उपयोगी हैं जिनमें फ्लोरोसेंट ट्रेसर नहीं होता है।

यह देखते हुए कि pAdTrack adenoviruses मानव adenoviruses से प्राप्त कर रहे हैं जो कॉक्ससैकीवायरस और एडेनोवायरस रिसेप्टर्स (सीएआर) द्वारा मान्यता प्राप्त है, हमने जीएफपी-ए की क्षमता का प्रदर्शन किया मानव मूल (एंडोथेलियल कोशिकाओं) की कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिएडेनोवायरस, लेकिन अन्य मूल की कोशिकाएं भी: गोजातीय (एंडोथेलियल कोशिकाएं) और मुरीन (मेसेन्चिमल स्ट्रोमल कोशिकाएं और हेपेटोसाइट्स)। आंकड़ों से पता चला है कि जीएफपी-एडेनोवायरस ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्रेरित कर सकता है ।

अंत में, हम समय, लागत को कम करने के लिए इस श्रमसाध्य प्रौद्योगिकी का अनुकूलन किया, और adenoviral कणों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रयास । तैयार एडेनोवायरस विभिन्न कोशिका प्रकारों को संक्रमित करने और ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में सक्षम है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रयोगों में किया जा सकता है क्योंकि एडेनोवायरल-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण आधुनिक जीन उपचारों के विकास के लिए मुख्य उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है।

संक्षिप्त रूप: AdV-GFP, adenoviral कणों; बीएईसी, गोजातीय महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाएं; सीएससीएल, सीज़ियम क्लोराइड; जीएफपी, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एमएससी, मेसेंचिमल स्ट्रोमल सेल; टीयू, ट्रांसड्यूसिंग इकाइयां।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष से प्रतिस्पर्धात्मकता परिचालन कार्यक्रम 2014-2020 (पीओसी-ए-1-ए.1.1.4-ई-2015, के माध्यम से सह-वित्तपोषित परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था। आईडी: P_37_668; परिवर्णी शब्द DIABETER), रोमानियाई अनुसंधान और नवाचार पीसीसीडीआई मंत्रालय का अनुदान-UEFISCDI, परियोजना संख्या पीएन-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 पीएनसीडी III के भीतर और रोमानियाई अकादमी द्वारा । लेखक अपनी उदार और प्रासंगिक सलाह के लिए किरियाकोस काइप्रोस (पासास विश्वविद्यालय, ग्रीस) को धन्यवाद देते हैं, ओविडियू क्रोइटू (ललित कला विश्वविद्यालय, बुखारेस्ट, रोमानिया) फिल्मांकन, फिल्म संपादन और ग्राफिकल डिजाइन, और तकनीकी सहायता के लिए मिहेला ब्रातु।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AD293 cells Agilent Technologies 240085
AdEasier-1 cells Addgene 16399
Agarose I (for electrophoresis) Thermo Scientific 17850
Ammonium sulfate Sigma A4418
Ampicillin sodium salt Sigma A0166
BamH I Thermo Scientific FD0054
Cell culture plates 100 mm Eppendorf 30702115
Cesium chloride Sigma L4036
DH5alpha bacteria Thermo Scientific 18265017
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) Gibco 3240-027
EA.hy926 cells ATCC CRL-2922
EDTA Sigma E5134
Ethanol (99.8%) Roth 5054.2
Fetal Bovine Serum Sigma F7524
Flasks T25, T75, T175 Eppendorf 30712129
Glucose Sigma G7021
Hepa 1-6 murine hepatocytes ATCC CRL-1830
Hind III Thermo Scientific FD0504
Kanamycin Sulfate Thermo Scientific 15160054
K2 Transfection System Biontex T060-5.0
LB medium Formedium LBx0102
LB-agar Formedium LBx0202
Mix & Go E. coli Transformation kit Zymo Research T3001
Midori Green Advanced DNA stain Nippon Genetics Europe MG-04
NaOH Sigma S8045
Opti-MEM Thermo Scientific 31985070
Pac I Thermo Scientific FD2204
pAdEasy-1 Addgene 16400
pAdTrack-CMV Addgene 16405
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) Invitrogen 15593-031
Polymerase GoTaq Promega M3005
Pme I (Mss I) Thermo Scientific FD1344
Potassium acetate VWR Chemicals 43065P
Pst I Thermo Scientific FD0614
Qiagen Midi Prep kit Qiagen 12125
Cell Scraper TPP 99003
SDS Thermo Scientific 28365
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes Thermo Scientific 66330
Sodium pyruvate SIGMA P5280-100G
Syringe with 23G neeedle B Braun 464BR
Tris HCl Sigma 1185-53-1
Trypan blue Roth CN76.1
Tubes 50ml TPP 91050
Ultra-Clear Tubes (14x89 mm) Beckman Coulter 344059
Centrifuge (refrigerated) Sigma Sartorius 3-19KS
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor Beckman Coulter Optima L-80 XP
Culture Hood Thermo Scientific Class II
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) Thermo Scientific
Dry Block Heating Thermostat Biosan TDB-120
Thermocycle SensoQuest 012-103
Water Bath Memmert WNB 14

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References

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Dumitrescu, M., Trusca, V. G., Fenyo, I. M., Gafencu, A. V. An Efficient Method for Adenovirus Production. J. Vis. Exp. (172), e61691, doi:10.3791/61691 (2021).

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