Summary
Ce protocole décrit une méthode permettant de combiner l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et l’immunohistochimie par fluorescence (IHC) dans des coupes de cerveau de souris fraîches, congelées et fixes, dans le but d’obtenir un signal FISH et IHC de fluorescence multimarqueur. L’IHC a ciblé les protéines cytoplasmiques et membranaires.
Abstract
L’hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet d’identifier la présence et la distribution spatiale de transcrits d’ARN spécifiques au sein des cellules. Le phénotypage neurochimique des neurones fonctionnellement identifiés nécessite généralement un marquage simultané avec plusieurs anticorps (protéine de ciblage) à l’aide de l’immunohistochimie (IHC) et une optimisation de l’hybridation in situ (ciblage de l’ARN), en tandem. Il est possible d’obtenir une « signature neurochimique » pour caractériser des neurones particuliers, mais les facteurs de complication incluent la nécessité de vérifier les cibles FISH et IHC avant de combiner les méthodes, et le nombre limité d’ARN et de protéines qui peuvent être ciblés simultanément dans la même section de tissu.
Nous décrivons ici un protocole, utilisant à la fois des préparations de cerveau de souris fraîches congelées et fixes, qui détecte plusieurs ARNm et protéines dans la même section du cerveau à l’aide de RNAscope FISH suivi d’un immunomarquage par fluorescence, respectivement. Nous utilisons la méthode combinée pour décrire le profil d’expression des ARNm de faible abondance (par exemple, le récepteur 1 de la galanine) et des ARNm de grande abondance (par exemple, le transporteur de glycine 2), dans les noyaux du tronc cérébral identifiés immunohistochimiquement.
Les considérations clés pour le marquage des protéines en aval de l’essai FISH vont au-delà de la préparation des tissus et de l’optimisation du marquage de la sonde FISH. Par exemple, nous avons constaté que la spécificité de la liaison et du marquage des anticorps peut être affectée de manière préjudiciable par l’étape de la protéase dans le test de sonde FISH. Les protéases catalysent le clivage hydrolytique des liaisons peptidiques, facilitant l’entrée de la sonde FISH dans les cellules, mais elles peuvent également digérer la protéine ciblée par le test IHC ultérieur, produisant une liaison hors cible. L’emplacement subcellulaire de la protéine ciblée est un autre facteur contribuant au succès de l’IHC après l’essai de la sonde FISH. Nous avons observé que la spécificité de l’IHC était conservée lorsque la protéine ciblée est liée à la membrane, alors que l’IHC ciblant la protéine cytoplasmique nécessitait un dépannage approfondi. Enfin, nous avons constaté que la manipulation des tissus congelés fixes montés sur lame était plus difficile que des tissus congelés frais, mais la qualité de l’IHC était globalement meilleure avec les tissus congelés fixes, lorsqu’ils étaient combinés avec RNAscope.
Introduction
Les protéines et les ARNm qui définissent neurochimiquement des sous-populations de neurones sont généralement identifiés par une combinaison d’immunohistochimie (IHC) et/ou d’hybridation in situ (ISH), respectivement. La combinaison de l’ISH avec les techniques IHC facilite la caractérisation des patrons de colocalisation propres aux neurones fonctionnels (codage neurochimique) en maximisant la capacité de marquage multiplex.
Les méthodes d’ISH fluorescentes (FISH), y compris l’ARNscope, ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les méthodes antérieures de détection de l’ARN telles que l’ISH radioactive et l’ISH chromogène non radioactive. FISH permet de visualiser des transcrits d’ARNm uniques sous forme de taches colorées ponctuées1. De plus, le test RNAscope permet de marquer un plus grand nombre de cibles d’ARN à la fois, à l’aide de différents marqueurs fluorophores. Malgré ces avantages, les limitations techniques peuvent affecter le nombre de fluorophores/chromogènes pouvant être utilisés dans une seule expérience. Il s’agit notamment de la disponibilité d’ensembles de filtres pour microscopes ; ces considérations sont aggravées lorsque l’identification neurochimique utilise la combinaison de la FISH et de l’IHC, par rapport à l’utilisation de chaque technique isolément, car les étapes inhérentes optimales à une méthode peuvent être préjudiciables à l’autre.
L’application antérieure de FISH combinée à l’IHC a démontré l’expression de cibles cellulaires spécifiques dans les lymphomes humains à cellules B2, les embryons de poussin3, les embryons de poisson-zèbre4, la rétine de souris5 et les cellules de l’oreille interne de souris6. Dans ces études, la préparation des tissus a consisté soit en une paraffine fixée au formol (FFPE)2,3,5, soit en une monture entière fraîche 4,6. D’autres études ont appliqué l’ARNscope chromogène à des préparations de cerveaux fixes de souris et de rats 7,8,9. En particulier, Baleriola et al.8 ont décrit deux préparations tissulaires différentes pour l’ISH-IHC combiné ; des sections de cerveau de souris fixes et des sections de cerveau humain FFPE. Dans une publication récente, nous avons combiné le FISH et l’IHC fluorescent sur des coupes fraîches congelées, afin de visualiser simultanément l’ARNm de faible abondance (récepteur de la galanine 1, GalR1), l’ARNm de haute abondance (transporteur de glycine 2, GlyT2) et la protéine vésiculaire transporteur d’acétylcholine (vAChT)10 dans la formation réticulaire du tronc cérébral.
Le noyau du tractus solitaire (NTS) est une région majeure du cerveau impliquée dans la fonction autonome. Située dans le cerveau postérieur, cette population hétérogène de neurones reçoit et intègre un grand nombre de signaux autonomes, dont ceux qui régulent la respiration. Le NTS abrite plusieurs populations neuronales, qui peuvent être phénotypiquement caractérisées par le modèle d’expression des cibles d’ARNm, y compris GalR1 et GlyT2 et des marqueurs protéiques de l’enzyme tyrosine hydroxylase (TH) et du facteur de transcription Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
Le propriétaire du RNAscope recommande des préparations de tissus frais congelés, mais les tissus préparés par fixation par perfusion transcardique d’animaux entiers, ainsi que la cryoprotection à long terme (stockage à -20 °C) de coupes de tissus congelés fixes, sont courants dans de nombreux laboratoires. Par conséquent, nous avons cherché à établir des protocoles pour le FISH en combinaison avec l’IHC en utilisant des préparations de tissus frais congelés et congelés fixes. Ici, nous fournissons pour les coupes de cerveau fraîches congelées et congelées fixes : (1) un protocole pour la combinaison de FISH et d’IHC fluorescent (2) une description de la qualité de l’ARNm et du marquage protéique produit, lors de l’utilisation de chaque préparation, (3) une description de l’expression de GalR1 et GlyT2 dans le NTS.
Notre étude a révélé que, lorsqu’il est combiné avec la méthodologie RNAscope, le succès de l’IHC variait dans les préparations fraîches congelées et fixées et dépendait de la localisation des protéines cibles dans la cellule. Entre nos mains, le marquage des protéines liées à la membrane a toujours été couronné de succès. En revanche, l’IHC pour la protéine cytoplasmique a nécessité un dépannage même dans les cas où la protéine cytoplasmique était surexprimée chez un animal transgénique (Phox2b-GFP)11. Enfin, alors que GalR1 est exprimé dans les neurones non catécholaminergiques du NTS, l’expression de GlyT2 est absente du NTS.
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Protocol
Un résumé des étapes de prétraitement des tissus se trouve à la figure 1. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Nouvelle-Galles du Sud, conformément aux directives relatives à l’utilisation et aux soins des animaux à des fins scientifiques (Australian National Health and Medical Research Council).
1. Préparation d’échantillons de tissus cérébraux frais congelés
- Perfusion transcardique
- Préparer un tampon phosphate (PB) hépariné (2500 U/L) de 0,1 M, pH 7,5. Fabriquez de la boue d’éthanol de glace carbonique en mélangeant de la glace carbonique avec de l’éthanol. Celui-ci aura une température d’environ −72 °C et sera utilisé pour la congélation immédiate du tissu récolté.
- Euthanasier des souris adultes C57BL/6 et Phox2b-GFP11 (identifiant MGI :5776545 de la base de données Mouse Genome Informatics) en les anesthésiant avec du pentobarbital de sodium (70 mg/kg, i.p.), à l’aide d’une aiguille de 27,5 pouces.
ATTENTION : Le pentobarbital est un barbiturique. Il est extrêmement toxique à fortes doses et peut entraîner la mort par arrêt respiratoire. Consultez les directives locales en matière de santé, de sécurité juridique et de sécurité des matériaux avant utilisation. - Exposez le cœur et canulez le ventricule gauche à l’aide d’une aiguille d’aspiration (calibre 23 pouces). Effectuer une perfusion transcardique avec un PB hépariné de 0,1 M jusqu’à ce que le sang s’éclaircisse (2-3 minutes) à un débit de 11-13 mL/min. Déterminer l’élimination du sang en surveillant la coloration du foie et de l’effusat de l’oreillette droite12.
- Isolez le cerveau de la cavité crânienne, incorporez-le immédiatement dans un composé à température de coupe optimale (OCT) dans un cryomoule ou une feuille d’aluminium et placez-le sur le bain d’éthanol de glace carbonique. Conservez le tissu incrusté congelé dans un récipient hermétique à - 80 °C jusqu’à 3 mois.
- Coupe de tissus frais congelés
- Réglez la température du cryostat à -20 °C. Laissez le tissu intégré à l’OCT et un mandrin de cryostat dans le cryostat pendant ~30 minutes pour permettre l’équilibrage à la nouvelle température.
REMARQUE : Gardez le tissu congelé en tout temps ; transporter les tissus du congélateur à -80 °C au cryostat sur de la glace carbonique. - Fixez le tissu au mandrin du cryostat pré-refroidi à l’aide d’un composé OCT. Dans ce protocole, des blocs de tissu ont été montés sur le mandrin dans le plan coronal.
REMARQUE : Coupez l’excès d’OCT du tissu, à l’aide d’une lame de rasoir, pour minimiser la quantité d’OCT coupée par le cryostat et ensuite transférée sur la lame de verre. - Découpez des sections coronales de 14 μm d’épaisseur et montez-les sur des lames de microscopie en verre chargées.
- Réchauffez les lames à température ambiante avant de monter les sections. Une fois la section montée, conservez les lames dans une boîte à lames dans le cryostat.
- Si plus d’une section doit être montée sur une diapositive, réchauffez la zone de la deuxième section en plaçant un doigt sur le côté opposé de la lame pendant 5 à 10 secondes pour faciliter l’adhérence de la section à la lame. Une section de tissu froid ne s’attachera pas à une lame froide. Les sections doivent adhérer aux glissières à plat ; Le pliage les fera tomber des glissières pendant les étapes de lavage.
- Si des fissures sont remarquées dans les sections, augmentez la température du cryostat de 1 à 5 °C pour éviter cela. Il est particulièrement important de placer des sections de tissus à proximité les unes des autres sur la même lame. Cela permettra d’éviter le gaspillage de sondes et de réactifs FISH pendant le test.
- Conservez les sections de mouchoirs montées sur des lames de verre dans un récipient hermétique à -80 °C jusqu’à 6 mois.
REMARQUE : Gardez les sections congelées en tout temps et évitez les cycles de congélation et de décongélation, afin d’éviter la dégradation de l’ARN. Transportez la boîte de lames de l’intérieur du cryostat au congélateur à -80 °C sur de la glace carbonique.
- Réglez la température du cryostat à -20 °C. Laissez le tissu intégré à l’OCT et un mandrin de cryostat dans le cryostat pendant ~30 minutes pour permettre l’équilibrage à la nouvelle température.
- Fixation de tissus frais congelés
- Le jour où le test de la sonde FISH doit être effectué, préparer du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans 0,1 M PB, pH 7,5 (solution de PFA à 4 %). Filtrer en passant à travers du papier filtre (Grade 1 : 11 μm, Table des matériaux) dans un entonnoir Buchner ou un filtre à creuset.
ATTENTION : Le PFA est nocif et toxique par contact cutané ou par inhalation. Toutes les procédures avec une solution de PFA doivent être effectuées dans une hotte. Les déchets de solution de PFA doivent être éliminés avec soin, conformément aux protocoles de sécurité de l’établissement. - Refroidir la solution de PFA à 4 % à 4 °C. Transportez le mouchoir monté sur lame du congélateur à -80 °C dans de la glace carbonique et plongez-le immédiatement dans le fixateur pré-refroidi pendant 15 minutes.
REMARQUE : Il est important que cette étape de fixation ne dépasse pas 15 minutes, car une fixation excessive entraînera un marquage de fond non spécifique.
- Le jour où le test de la sonde FISH doit être effectué, préparer du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans 0,1 M PB, pH 7,5 (solution de PFA à 4 %). Filtrer en passant à travers du papier filtre (Grade 1 : 11 μm, Table des matériaux) dans un entonnoir Buchner ou un filtre à creuset.
- Déshydratation de tissus frais congelés
- Déshydrater les coupes de tissus en immergeant les lames dans des concentrations graduées d’éthanol. Dans un bocal Coplin, immergez-les d’abord dans 50 %, puis 70 % et enfin dans de l’éthanol absolu, pendant 5 minutes chacun à température ambiante. Répétez l’incubation finale à l’éthanol absolu une deuxième fois.
- Séchez les lames à l’air libre et tracez le contour du groupe de sections à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, en veillant à ce que la zone interne soit réduite au minimum.
REMARQUE : Assurez-vous que la lame de verre est complètement sèche avant de tirer la barrière hydrophobe. La barrière hydrophobe doit entourer complètement les sections de tissu sans espaces et doit être sèche avant tout traitement ultérieur.
2. Préparation d’échantillons de tissus cérébraux congelés fixes
- Fixation de la perfusion transcardique
- Euthanasier les souris par anesthésie avec du pentobarbital sodique (70 mg/kg, i.p.) suivi d’une perfusion transcardique, d’abord avec 0,1 M PB puis une solution de PFA à 4 %. Fixer avec 10 minutes de perfusion à 11-13 mL/min.
- Isolez le cerveau de la cavité crânienne après perfusion-fixation et immergez-le pendant une nuit dans une solution de PFA à 4 %, à 4 °C.
- Coupe tissulaire de tissus fixés
- Rincer le cerveau dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile de 0,1 M avant de retirer les couches méningées, à l’aide d’un microscope à dissection, à l’aide d’une pince fine.
- Découpez le cerveau avec précision en blocs (séparez le tronc cérébral du cerveau antérieur avant la section du vibratome) à l’aide d’une matrice cérébrale (Table des matériaux). Plus précisément, coupez le tronc cérébral caudalement au niveau de la décussation pyramidale et disséquez le cervelet. De même, coupez immédiatement le cerveau antérieur rostral au chiasma optique.
- Fixez le tissu sur un mandrin de microtome vibrant à l’aide de cyanoacrylate et incorporez-le dans une solution de gélose à 2 %.
- Découper des coupes de tissu de 30 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome vibrant et conserver les coupes coupées dans une solution cryoprotectrice (saccharose sans RNase à 30 %, 30 % d’éthylène glycol, 1 % de polyvinylpyrrolidone (PVP-40), dans 0,1 M PB, pH 7,4). Les coupes de tissus peuvent être conservées dans un cryoprotecteur à -20 °C jusqu’à 6 mois.
- Préparation des sections fixes avant le FISH
- Le jour du FISH, lavez les sections flottantes trois fois, pendant 10 minutes par lavage, pour éliminer la solution cryoprotectrice. Pour le lavage, placer les sections dans du PBS de 0,1 M dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits et agiter sur un agitateur à plate-forme rotative (90 - 100 tr/min).
- Après les lavages, utilisez un pinceau pour monter des sections sur des lames de microscopie en verre et séchez à l’air libre pendant au moins 2 heures.
REMARQUE : Les sections doivent adhérer à plat sur les lames car tout pli prononcé les fera se détacher pendant les lavages. - À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, tracez une barrière autour des sections pour limiter les réactifs FISH aux sections. Encore une fois, il est important de minimiser la surface interne du contour tracé avec le stylo barrière.
POINT DE RUPTURE POSSIBLE : Les sections peuvent être entreposées à température ambiante, pendant la nuit, pour poursuivre l’analyse le lendemain.
3. Dosage FISH
REMARQUE : Le reste du protocole s’applique à la fois aux tissus frais congelés et aux tissus congelés fixes.
- Préparer les réactifs et les instruments pour les étapes d’hybridation et d’amplification.
- Réglez un incubateur de paillasse et un bain-marie à 40 °C.
- Préparez une chambre humidifiée et à l’abri de la lumière pour l’incubation des lames. L’humidification empêche le dessèchement des tissus - les lames sont solidement placées au-dessus d’un réservoir humide. Idéalement, la chambre est en polystyrène robuste, elle est étanche à la lumière et à l’air pour maintenir une atmosphère saturée de vapeur d’eau. La fermeture de la chambre repose sur un frottement minimal pour éviter tout mouvement. Nous avons utilisé une boîte à lames doublée de lingettes de laboratoire humides (Table of Materials) en bas. Placez la boîte à lames à l’intérieur de l’incubateur pour la préchauffer à 40 °C.
- Réchauffez le tampon de lavage 50x (table des matériaux) et les sondes à 40 °C pendant 10 minutes, à l’aide du bain-marie, puis refroidissez-les à température ambiante.
- Préparez 1 L de tampon de lavage 1x à partir de la concentration de bouillon 50x.
- Préparer le mélange de sondes (Table des matériaux) : la sonde C1 est prête à l’emploi à la concentration de base tandis que les sondes C2 et C3 sont expédiées en concentration 50x et nécessitent une dilution avec le diluant fourni dans le kit.
REMARQUE : Les mélanges de sondes peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 6 mois.
- Traitement par protéase
- Incuber les sections avec la protéase III (tableau des matériaux) à température ambiante pendant 30 minutes.
REMARQUE : S’assurer que la protéase III et les réactifs d’incubation dans les processus en aval (mélange de sonde, solutions d’amplification, tampon de blocage et sérums d’anticorps) couvrent entièrement les sections. Une pointe de pipette peut être utilisée pour étaler le réactif sur la section afin de couvrir toute la zone à l’intérieur de la barrière hydrophobe. - Laver les lames deux fois avec 0,1 M PBS, pendant 2 min à chaque fois, dans une grande boîte de Pétri carrée en plastique. Ici, une boîte d’essai biologique carrée de 245 mm x 245 mm a été utilisée (Table des matériaux). Tenez d’un côté du plat et inclinez-le doucement 3 à 5 fois. Après les lavages, retirez l’excédent de 0,1 M de PBS de la lame et ajoutez immédiatement le réactif suivant. Ne laissez pas sécher les sections de tissus.
REMARQUE : Lors de chaque lavage, les lames sont immergées dans une solution à température ambiante. Il s’agit du flux de travail pour toutes les étapes de lavage suivantes. Les sections fixes de 30 μm d’épaisseur se délogent des lames plus facilement que les sections de 14 μm d’épaisseur, soyez doux pendant les lavages.
- Incuber les sections avec la protéase III (tableau des matériaux) à température ambiante pendant 30 minutes.
- Hybridation et amplification
- Après avoir lavé la solution de protéase, placez les lames dans la chambre humidifiée et préchauffée. Incuber les sections avec un mélange de sondes (Table des matériaux) pendant 2 heures à 40 °C à l’intérieur d’un incubateur de paillasse.
REMARQUE : Assurez-vous qu’il y a au moins 2 sections réservées aux sondes de contrôle positives et négatives afin d’évaluer la qualité de l’ARN de l’échantillon et la perméabilisation optimale. Les sondes de contrôle positif ciblent les gènes d’entretien ménager ; ici, il s’agissait d’un cocktail d’ARN ciblant l’ubiquitine C (UBC ; haute abondance), la peptidylpropyl isomérase B (PPIB ; abondance modérée) et l’ARN polymérase 2a (POLR2A ; faible abondance). Les sondes de contrôle négatives ciblent le gène bactérien de la 4-hydroxy-tétrahydrodipicolinate réductase (DapB), qui est normalement absent dans les échantillons de cerveau de souris. Un signal DapB positif indique un signal non spécifique et/ou une contamination bactérienne de l’échantillon. - Après hybridation avec le mélange de sondes, les étapes d’amplification du signal consistent en une incubation avec l’ampli 1-FL (30 minutes), puis avec l’ampli 2-FL (15 minutes), suivie de l’ampli 3-FL (30 minutes) et enfin de l’ampli 4-FL (15 minutes) - chacune à 40 °C. À l’aide des flacons compte-gouttes fournis, recouvrez les sections de tissu avec une solution d’amplification. Procéder au test IHC après la dernière étape d’amplification.
- Rincez les lames avec le tampon de lavage deux fois pendant 2 minutes entre l’hybridation de la sonde et chaque étape d’amplification.
- Après avoir lavé la solution de protéase, placez les lames dans la chambre humidifiée et préchauffée. Incuber les sections avec un mélange de sondes (Table des matériaux) pendant 2 heures à 40 °C à l’intérieur d’un incubateur de paillasse.
4. Dosage IHC
- Étape de blocage IHC
- Pour éviter la liaison non spécifique des anticorps, incuber les coupes pendant 1 h à température ambiante avec une solution bloquante contenant 10 % de sérum de cheval normal, 0,3 % de Tween20 dans 1x TBSm (50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,05 % de merthiolate) après le test FISH. Préparer les anticorps primaires dans un tampon de dilution contenant 1 TBSm, 5 % de sérum de cheval normal et 0,1 % de Tween20. Les principaux fournisseurs d’anticorps sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
- Immunohistochimie
- Retirez l’excès de tampon bloquant en effleurant la lame et incubez les sections avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C.
- Laver les lames 3 fois (5 minutes chacune) avec 1x TBSm et incuber avec de l’anticorps secondaire dans un diluant contenant 1x TBSm, 1% de sérum de cheval normal et 0,1% Tween20 pendant 2 heures à température ambiante. Les anticorps secondaires utilisés dans ce protocole sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
- Laver les lames 3 fois avec 1x TBSm (5 minutes chacune) avant de les recouvrir avec un support de montage avec ou sans DAPI (Table of Materials).
5. Imagerie
- Examiner l’immunomarquage à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’une caméra (voir le tableau des matériaux pour plus de détails). Acquérez des images représentatives à un grossissement de 20x et enregistrez-les sous forme de fichiers TIFF.
- Exportez des images représentatives dans un logiciel de traitement d’image (Table of Materials) pour le réglage de la luminosité et du contraste afin d’augmenter la clarté et de refléter un rendu fidèle.
6. OPTIONNEL : Analyse quantitative des transcriptions cibles
REMARQUE : Il s’agit d’un article sur les méthodes et les résultats quantitatifs ne sont pas fournis. La méthode de quantification présentée ici provient de Dereli et al.10. Le Chapitre 10.
- Acquérir des images des régions d’intérêt comme expliqué dans la section 5.1 et appliquer les mêmes paramètres de microscope et d’appareil photo (tels que le temps d’exposition et l’intensité lumineuse) à toutes les images du même fluorophore.
- Tracez les profils neuronaux à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (Table of Materials).
- Aligner les sections par rapport au niveau de Bregma selon un atlas cérébral stéréotaxique13.
- Appliquez la même luminosité et le même contraste à toutes les images du même fluorophore. Ne considérez que les neurones avec des noyaux colorés par DAPI.
- Comptez manuellement le nombre de cellules co-exprimant l’ARNm, exprimant les protéines, l’ARNm/ARNm, la protéine/protéine et l’ARNm/protéine dans la région d’intérêt.
- Pour réduire les biais dans les résultats expérimentaux, demandez à la personne qui quantifie les résultats expérimentaux de ne pas tenir compte des groupes expérimentaux.
- Appliquez la correction d’Abercrombie14 au nombre total de cellules à l’aide de l’équation d’Abercombie suivante :
Nombre de cellules corrigé = nombre de cellules manuel x épaisseur de section / (épaisseur de section + taille nucléaire)
Par exemple, pour des sections de 14 μm d’épaisseur, la largeur nucléaire moyenne est calculée à 7,7 ± 0,3 μm et l’épaisseur moyenne de la section est de 14 ± 1 μm sur la base de 30 cellules et 10 sections respectivement chez 5 animaux10. Selon l’équation d’Abercrombie, le nombre de cellules corrigé serait le nombre de cellules manuelles x 14/(14+7,7).
Figure 1 : Flux de travail parallèle des étapes de prétraitement des tissus pour les tissus frais congelés et les tissus fixés au paraformaldéhyde. Les étapes de transformation des tissus frais congelés sont indiquées dans les cases encadrées en rouge, tandis que celles des mouchoirs fixes en paraformaldéhyde (PFA) sont affichées dans les cases encadrées en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résumé de la sonde FISH et de la procédure d’immunohistochimie. Après le prétraitement des tissus, le tissu monté sur lame est encerclé à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, comme on le voit dans la première image, et incubé dans une solution de protéase à température ambiante. Après les lavages, les tissus sont transférés dans un incubateur de paillasse pour hybridation pendant 2 heures avant les étapes d’amplification séquentielle. Le système d’hybridation in situ utilise une conception exclusive de « sonde Z », des préamplificateurs et des amplificateurs, comme on le voit dans les images 3 à6 6. Une fois que le tissu a subi un traitement par sonde FISH, il est lavé avant d’être bloqué avec du sérum de cheval normal. L’incubation primaire de l’anticorps est effectuée pendant la nuit à 4 °C pour maximiser la liaison anticorps-antigène. L’incubation secondaire des anticorps (2 heures) a été réalisée à température ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Ici, nous décrivons une méthode pour combiner le FISH multiplex avec l’IHC fluorescent pour localiser l’expression de l’ARNm pour GalR1 et GlyT2 en utilisant respectivement des tissus frais congelés et fixés au paraformaldéhyde dans le NTS de souris. Les figures 1 et 2 présentent un pipeline des procédures de traitement des tissus, de FISH et d’IHC décrites dans les méthodes. Le tableau 1 présente un résumé des combinaisons de sondes FISH et d’anticorps utilisées dans chaque figure.
Les sondes de contrôle sont systématiquement analysées en même temps que la sonde cible, afin de garantir l’intégrité du flux de travail et de confirmer la qualité de l’échantillon. L’absence de marquage DapB confirme la qualité et l’intégrité des tissus, ainsi que l’absence de contamination bactérienne (figure 3A). Le marquage à partir de sondes témoins positives ciblant l’ubiquitine C (UBC, abondance élevée), l’ARNm de peptidylpropyl isomérase B (PPIB, abondance modérée) et l’ARN polymérase 2a (POLR2A, faible abondance) confirme l’intégrité de l’ARN et le signal observé entre les essais peut être utilisé pour calibrer la variabilité inter-essais (Figure 3B). Pour valider l’expression de la sonde FISH, nous avons utilisé des tissus témoins qui ont été précédemment décrits pour exprimer le transcrit de l’ARNm. Par exemple, l’expression de l’ARNm de GalR1 s’est avérée positive dans le thalamus, comme décrit précédemment10,15. La distribution de l’ARNm de Phox2b a également été vérifiée par comarquage avec l’anticorps Phox2b ; nous avons confirmé que le marquage FISH n’était présent que dans les neurones qui ont également été colorés positivement à l’aide de l’anticorps Phox2b (Figure 5).
Pour distinguer les neurones GalR1+ du NTS des noyaux voisins, nous avons utilisé des marqueurs neurochimiques supplémentaires. L’immunoréactivité TH, Phox2b ou Phox2b-GFP (Figure 4-6) et Phox2b FISH (Figure 5 et Figure 6) a différencié le NTS des autres noyaux du tronc cérébral dorsal, car il a déjà été rapporté que les neurones NTS exprimaient Phox2b et TH16,17. Étant donné que le NTS est niché par des noyaux cholinergiques - il se trouve dorsal au noyau hypoglosse et au noyau moteur dorsal du vague (DMNX), et ventral au noyau vestibulaire - nous avons co-marqué avec le marqueur cholinergique vAChT18 (Figure 4). Par conséquent, l’expression de GalR1 au sein du NTS a été évaluée par rapport à TH et Phox2b, tandis que le marquage vAChT a aidé à l’orientation spatiale par rapport aux coordonnées rostrocaudales, dorso-ventrales et médiolatérales. Nous avons constaté que tous les neurones immunoréactifs TH et à ARNm GalR1 positifs dans le NTS étaient immunoréactifs au Phox2b-GFP, mais tous les neurones immunoréactifs au Phox2b-GFP dans le NTS n’étaient pas immunoréactifs au TH ou positifs pour l’ARNm GalR1 (Figure 4). De plus, nous avons démontré que l’ARNm du récepteur de faible abondance GalR1 était absent dans les neurones immunoréactifs TH et vAChT.
Dans les préparations fraîches congelées, lorsqu’elles sont combinées avec le test de sonde FISH, le succès de l’IHC dépendait de la localisation subcellulaire de la protéine cible. Par exemple, vAChT (une protéine liée à la membrane de la vésicule synaptique) a été clairement immunomarquée, tandis que TH et GFP (protéines cytoplasmiques) ont été immunomarquées indéfiniment et n’ont été que faiblement observées (Figure 4). Nous décrivons ce marquage indéfini comme « floculant » parce que les cellules n’avaient pas de contour clair et se sont avérées difficiles à distinguer du fond. Sur la même coupe de tissu frais congelé, le marquage de l’ARNm cytoplasmique GalR1 par la sonde GalR1 était ponctué et clairement observé (Figure 4).
De plus, étant donné que les anticorps TH et vAChT sont élevés chez le même hôte, les deux protéines ont été marquées à l’aide du même anticorps secondaire et donc du même fluorophore de couleur (lumière d’excitation : 594). Elles se distinguent facilement pour deux raisons : elles ne sont jamais co-marquées dans les mêmes neurones, et la localisation subcellulaire est différente pour ces protéines ; vAChT dans les vésicules présentant un aspect ponctué, et TH dans le cytoplasme et les processus neuronaux.
Pour étayer notre hypothèse selon laquelle la qualité de l’IHC (dans les préparations fraîches congelées) dépend de la localisation subcellulaire des protéines, nous avons comparé le marquage de l’ARNm Phox2b (situé dans le cytoplasme), de la GFP (surexprimée dans le cytoplasme) et de la protéine Phox2b (principalement présente dans le noyau) dans les neurones. Comme prévu, nos résultats montrent un chevauchement de l’ARNm Phox2b, de la GFP et du marquage des anticorps Phox2b dans les neurones individuels du NTS (Figure 5). Les cellules avec un marquage cytoplasmique de l’ARNm correspondaient à des cellules présentant un marquage nucléaire de la protéine Phox2b, ce qui a permis de valider la méthode combinée FISH-IHC. Bien que le Phox2b-GFP cytoplasmique ait un aspect floculant, le signal de la protéine Phox2b nucléaire était clair et spécifique. En conclusion, lorsqu’elles sont combinées avec du FISH sur des préparations fraîches congelées, les protéines liées à la membrane, y compris vAChT et Phox2B, présentent un immunomarquage de meilleure qualité que les protéines cytoplasmiques.
En revanche, l’IHC s’est avérée fiable quelle que soit la localisation subcellulaire, lorsqu’elle a été réalisée sur des coupes congelées fixes en combinaison avec FISH. Le FISH multiplex pour l’ARNm GlyT2 et l’ARNm Phox2b a été couronné de succès, comme le montre la figure 6. Les neurones positifs à l’ARNm GlyT2 étaient situés ventralement par rapport au NTS et non à l’intérieur du NTS. Les neurones GlyT2+ et Phox2b+ n’ont pas colocalisé. Une sous-population de neurones Phox2b+ NTS était immunoréactive TH et aucun ne contenait d’ARNm GlyT2. Les neurones immunoréactifs TH sont apparents sur la même coupe de tissu, présentant un soma et des processus neuronaux marqués positivement (Figure 6). Cela contraste avec l’aspect « floculant » des neurones immunoréactifs TH dans des coupes de tissus frais congelés. Ainsi, la préparation congelée fixe décrite ici est une méthode alternative de préparation tissulaire qui permet un ciblage fiable des protéines cytoplasmiques par immunohistochimie, en combinaison avec RNAscope.
Figure 3 : Images microscopiques représentatives de coupes coronales du cerveau antérieur de souris au niveau du septum latéral (Bregma 1,1 à -0,1) montrant le marquage des sondes témoins positives et négatives. (A) L’absence de signal après l’ISH avec la 4-hydroxy-tétrahydrodipicolinate réductase bactérienne (DapB) confirme l’absence de signaux de fond. (B) Le marquage à l’aide de sondes témoins positives ciblant l’ubiquitine C (UBC), la peptidylpropyl isomérase B (PPIB) et l’ARN polymérase 2a (POLR2A) illustre le signal auquel on peut s’attendre de la part de cibles d’abondance élevée, modérée et faible, respectivement. Les barres d’échelle sont de 50 μm. Toutes les images ont été acquises avec un objectif 20x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images microscopiques représentatives d’une coupe coronale fraîche et congelée du tronc cérébral d’une souris Phox2b-GFP montrant le marquage combiné de l’ARNm GalR1 (FISH) et de 3 protéines (IHC) dans le noyau de la région du tractus solitaire (NTS). Les encarts en A sont agrandis en B. L’ARNm GalR1 est indiqué par un marquage de sonde FISH ponctué (pointes de flèches). Les anticorps ciblant les protéines cytoplasmiques GFP et tyrosine hydroxylase (TH) présentaient un marquage « floculant » (flèches). L’immunoréactivité du transporteur vésiculaire de l’acétylcholine (vAChT) est démontrée (marquage ponctué rouge) dans le noyau hypoglosse (XII). Les barres d’échelle sont de 100 μm en A et de 25 μm en B. Toutes les images ont été acquises avec un objectif 20x. Autres abréviations : aire postrema (AP), noyau vestibulaire médial (MVe). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images microscopiques représentatives d’une coupe coronale fraîche congelée du tronc cérébral d’une souris Phox2b-GFP, illustrant le ciblage de Phox2b dans le noyau du tractus solitaire (NTS) avec trois approches différentes : l’ARNm Phox2b (poisson), le GFP (IHC) et la protéine Phox2b (IHC). La protéine Phox2b est localisée dans le noyau. Les encarts en A sont agrandis en B. Les flèches indiquent les neurones qui sont marqués trois fois avec la sonde Phox2b (orange-550), l’anticorps GFP (vert-488) et l’anticorps Phox2b (rouge-647). Les barres d’échelle sont de 100 μm en A et de 25 μm en B. Toutes les images sont acquises avec un objectif 20x. Autres abréviations : area postrema (AP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Images représentatives de coupes de tronc cérébral coronaires congelées fixes démontrant une FISH réussie combinée à un immunomarquage fiable des protéines cytoplasmiques (tyrosine hydroxylase [TH]). Double FISH montrant le marquage de l’ARNm du transporteur de glycine 2 (GlyT2-rouge-647, pointes de flèches remplies) et du Phox2b (jaune-550, flèches) dans le noyau de la région du tractus solitaire (NTS). FISH a été combiné avec l’IHC pour la protéine TH (bleu-346, pointes de flèches vides). Les médaillons en A sont agrandis en B. Les barres d’échelle sont de 25 μm. Toutes les images ont été acquises avec un objectif 20x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Sonde primaire d’anticorps ou d’ARN | Anticorps secondaire ou Module d’affichage Amp 4-FL-Alt |
Excitation (nm) | Préparation des tissus | ||
| Graphique 3 | sonde | POLR2A (C1) | Module d’affichage Amp 4-FL-Alt B | 647 | frais congelé |
| sonde | Pépite (C2) | Module d’affichage Amp 4-FL-Alt B | 488 | ||
| sonde | Université de la Colombie-Britannique (C3) | Module d’affichage Amp 4-FL-Alt B | 550 | ||
| sonde | DapB (C1, C2, C3) | Module d’affichage Amp 4-FL-Alt B | 647, 488, 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Graphique 4 | anticorps | lapin-anti-GFP | âne-anti-lapin | 488 | frais congelé |
| anticorps | moutons-anti-TH | âne-anti-mouton | 647 | ||
| anticorps | anti-vAChT de chèvre | âne-anti-chèvre | 647 | ||
| sonde | GalR1 (C1) | Module d’affichage Amp 4-FL-Alt B | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Graphique 5 | anticorps | lapin-anti-GFP | âne-anti-lapin | 488 | frais congelé |
| anticorps | souris-anti-Phox2b | âne-anti-souris | 647 | ||
| sonde | Phox2b (C2) | Module d’affichage Amp 4-FL-Alt A | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Graphique 6 | anticorps | souris-anti-TH | âne-anti-souris | 346 | fixe |
| sonde | GlyT2 | Module d’affichage Amp 4-FL-Alt A | 647 | ||
| sonde | Phox2b | Module d’affichage Amp 4-FL-Alt A | 550 |
Tableau 1 : Sonde FISH, combinaisons d’anticorps et de flurophores correspondantes utilisées dans les figures 3 à 6.
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Discussion
Dans le domaine des neurosciences, FISH et IHC sont couramment utilisés pour étudier l’organisation spatiale et la signification fonctionnelle de l’ARNm ou des protéines au sein des sous-populations neuronales. Le protocole décrit dans cette étude améliore la capacité de détection simultanée des ARNm et des protéines dans les sections du cerveau. Notre test multiplex combiné FISH-IHC a permis l’identification phénotypique de sous-populations neuronales distinctes dans le NTS dans les préparations de cerveau frais congelé et fixe. FISH-IHC dans des préparations de tissus congelés fixés a produit des résultats fiables de l’IHC. Par exemple, le FISH multiplex pour les ARNm de faible et de haute abondance (GalR1 et GlyT2 respectivement) et l’IHC (ciblant la tyrosine hydroxylase) a révélé que GalR1 et GlyT2 sont exprimés dans les neurones NTS non catécholaminergiques. L’IHC pour le TH n’a pas été efficace dans les tissus frais congelés, ce qui met en évidence la capacité limitée du FISH-IHC dans les préparations fraîches congelées.
L’ISH peut être plus approprié que l’IHC dans une gamme de scénarios. Premièrement, l’IHC peut ne pas être performante lors de la détection de protéines de faible abondance, telles que les récepteurs. L’utilisation de l’ISH pour cibler des ARNm d’abondance relativement plus élevée pour ces protéines améliore la détectabilité1. Deuxièmement, des protéines telles que les neuropeptides sont souvent trafiquées vers les terminaisons axonales après la traduction dans le somacellulaire 19. Lorsque les neuropeptides sont ciblés par l’IHC, les processus axonaux et les terminaisons des cellules sont marqués avec l’anticorps, mais pas avec le soma, ce qui réduit la capacité d’identifier la cellule d’origine ou d’effectuer une analyse quantitative du nombre de cellules. Cependant, comme les ARNm qui codent pour toutes les protéines se trouvent localisés dans le soma, la technique ISH est avantageuse. Enfin, les anticorps ne sont pas facilement disponibles pour certaines espèces de protéines, ou les anticorps disponibles sont appropriés pour d’autres techniques de protéomique (p. ex., transfert Western), mais pas pour l’IHC. Dans ces circonstances, les méthodes de marquage de l’ARNm s’avèrent utiles. Une mise en garde est que les ARNm ne sont pas toujours traduits en protéines et qu’ils ne fournissent donc qu’un substitut pour l’identification des protéines. Étant donné que les kits FISH commerciaux peuvent être coûteux et que les sondes ISH sont moins susceptibles d’être disponibles dans le commerce que les anticorps, la combinaison de FISH avec IHC présente une stratégie rentable et rapide pour augmenter le nombre de cibles pouvant être marquées simultanément.
La préparation des tissus frais congelés par rapport à la préparation des tissus fixes a été un facteur conférant la réussite de l’IHC après l’essai de la sonde FISH. Nous avons testé l’IHC à l’aide d’anticorps ciblant les protéines nucléaires, vésiculaires et cytoplasmiques et avons trouvé un marquage fiable des protéines liées à la membrane (vAChT et Phox2b) sur des échantillons frais congelés, mais pas des protéines cytoplasmiques (TH et GFP). La co-expression de la protéine Phox2b et de l’ARNm avec le marquage « floculant » Phox2b-GFP a validé que les neurones exprimant le transcrit exprimaient également la protéine apparentée, confirmant l’identité neurochimique des neurones (Figure 5). En revanche, les préparations de tissus congelés fixes ont permis d’obtenir un marquage IHC fiable, quelle que soit la localisation subcellulaire de l’antigène. Des études antérieures ont démontré que le prétraitement de la protéase (p. ex., pronase 8,20) peut avoir un effet néfaste sur l’IHC. Le contenu de la solution de protéase utilisée dans le protocole RNAscope est exclusif, et la perméabilisation par protéase est recommandée pour l’accès de la sonde RNAscope dans les cellules. Le marquage des protéines cytoplasmiques à l’aide des anticorps décrits ici a déjà été vérifié sur des coupes de cerveau de souris congelées fixes flottantesde 30 μm 10,21,22. Nous avons monté sur lame des échantillons fixes de 30 μm d’épaisseur et exécuté le protocole FISH-IHC, par opposition aux sections fraîches congelées de 14 μm d’épaisseur recommandées par le fabricant. En l’absence de modifications du test ou d’altération d’autres variables (prélèvement d’antigène, concentration plus élevée d’anticorps, changement de protéase), une IHC fiable a été obtenue sur des échantillons épais et fixes avec un marquage démontré du cytoplasme et des processus axonaux ainsi qu’un marquage par sonde FISH (Figure 6). Alors que des approches similaires ont été employées par d’autres groupes de recherche 7,8,9, la présente étude a permis d’obtenir une combinaison ISH-IHC sur les neurones et dans une configuration fluorescente.
Il y avait une série d’étapes critiques dans les méthodes à prendre en compte. Pour la préparation fraîche congelée, le temps de fixation ne doit pas dépasser 15 minutes ; Des temps de fixation plus longs ont permis d’obtenir un marquage de fond plus élevé. L’étape de la protéase a été optimisée puisque des tissus d’épaisseur différente et provenant de divers organes nécessitent différents types de protéase pour atteindre la perméabilisation. Les sections fixes congelées adhèrent moins aux lames de verre et se délogent plus facilement pendant les étapes de lavage. Par conséquent, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de la manipulation manuelle des sections congelées fixes, afin d’éviter la perte ou l’endommagement des tissus.
Bien que nous ayons trouvé que la combinaison de la FISH et de l’IHC était une stratégie efficace, les inconvénients incluent le coût et le test techniquement exigeant lors de la combinaison des deux méthodes. L’une des limites de l’étude est qu’une comparaison côte à côte des deux protocoles de préparation des tissus n’a pas été effectuée. De plus, notre évaluation des résultats a été limitée par le nombre de canaux que le microscope à épifluorescence pouvait accueillir ; La configuration permettait un maximum de 4 canaux à un moment donné : 346, 488, 550 et 647 nm (lumière d’excitation). Nous avons pu réaliser le marquage multiplex de 5 cibles en marquant deux protéines avec des localisations subcellulaires différentes en utilisant le même flurophore (Figure 4, Tableau 1). En utilisant un microscope confocal, l’excitation discrète de nombreux fluorophores supplémentaires peut être utilisée pour le marquage individuel des protéines via IHC, ou pour l’imagerie de molécules fluorescentes exprimées par des transgènes.
La combinaison du FISH et de l’IHC fluorescent peut réduire la fiabilité de chaque technique de manière isolée. À l’avenir, nous visons à améliorer le marquage des protéines cytoplasmiques sur les tissus frais congelés grâce à un traitement de récupération d’antigènes23. Des études antérieures montrent que la récupération de l’antigène induite par la chaleur augmente l’accessibilité de l’épitope protéique24,25,26. Le traitement thermique clive les groupes réticulation et méthylol de la protéine et déploie les antigènes dans les tissus, exposant des épitopes qui, autrement, seraient cachés dans la structure tertiaire de la protéine dans des conditions biologiques. Cette accessibilité peut améliorer le succès de l’étiquetage des protéines26,27. De plus, nous ciblerons différents épitopes d’une même protéine cytoplasmique afin de déterminer si le succès du marquage protéine-anticorps dépend des clones d’anticorps spécifiques utilisés.
En conclusion, la combinaison de la FISH et de l’IHC est utile pour l’identification neurochimique de populations hétérogènes de cellules dans le cerveau, telles que celles du NTS. Cette étude présente deux protocoles testant différentes préparations de tissus du tronc cérébral de souris - frais, congelés ou fixés - pour le marquage fluorescent multiplex simultané de l’ARNm et des protéines in situ. Les deux protocoles peuvent être largement appliqués pour détecter le profil d’expression des ARNm de faible abondance, tels que GalR1. Les préparations congelées fixes épaisses (30 μm) perméabilisées avec de la protéase ont conféré une détection plus fiable des protéines cytoplasmiques et plus de défis dans la manipulation des tissus, par rapport aux préparations congelées fraîches minces (14 μm).
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Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par la subvention du projet de découverte du Conseil australien de la recherche DP180101890 et la subvention de projet de la Fondation de recherche médicale Rebecca L. Cooper PG2018110
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
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