Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.
Abstract
Fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) is een moleculaire techniek die de aanwezigheid en ruimtelijke verdeling van specifieke RNA-transcripten in cellen identificeert. Neurochemische fenotypering van functioneel geïdentificeerde neuronen vereist meestal gelijktijdige labeling met meerdere antilichamen (gericht op eiwit) met behulp van immunohistochemie (IHC) en optimalisatie van in situ hybridisatie (gericht op RNA), in tandem. Een "neurochemische handtekening" om bepaalde neuronen te karakteriseren kan worden bereikt, maar complicerende factoren zijn onder meer de noodzaak om FISH- en IHC-doelen te verifiëren voordat de methoden worden gecombineerd, en het beperkte aantal RNA's en eiwitten dat tegelijkertijd binnen dezelfde weefselsectie kan worden aangevallen.
Hier beschrijven we een protocol, met behulp van zowel vers ingevroren als vaste muizenhersenpreparaten, dat meerdere mRNA's en eiwitten in hetzelfde hersengedeelte detecteert met behulp van RNAscope FISH, gevolgd door respectievelijk fluorescentie-immunokleuring. We gebruiken de gecombineerde methode om het expressiepatroon van mRNA's met een lage abundantie (bijv. galaninereceptor 1) en mRNA's met een hoge abundantie (bijv. glycinetransporter 2) te beschrijven in immunohistochemisch geïdentificeerde hersenstamkernen.
De belangrijkste overwegingen voor eiwitetikettering stroomafwaarts van de FISH-test gaan verder dan weefselvoorbereiding en optimalisatie van de etikettering van de FISH-sonde. We ontdekten bijvoorbeeld dat de binding van antilichamen en de specificiteit van de etikettering nadelig kunnen worden beïnvloed door de proteasestap binnen de FISH-sondetest. Proteasen katalyseren hydrolytische splitsing van peptidebindingen, waardoor het binnendringen van de FISH-sonde in cellen wordt vergemakkelijkt, maar ze kunnen ook het eiwit verteren waarop de daaropvolgende IHC-test zich richt, waardoor off-target binding ontstaat. De subcellulaire locatie van het beoogde eiwit is een andere factor die bijdraagt aan het succes van IHC na de FISH-sondetest. We zagen dat IHC-specificiteit behouden bleef wanneer het beoogde eiwit membraangebonden is, terwijl IHC-gericht op cytoplasmatisch eiwit uitgebreide probleemoplossing vereiste. Ten slotte vonden we het hanteren van op objectglaasjes gemonteerd vast bevroren weefsel een grotere uitdaging dan vers ingevroren weefsel, maar de IHC-kwaliteit was over het algemeen beter met vast bevroren weefsel, in combinatie met RNAscope.
Introduction
Eiwitten en mRNA's die neurochemisch subpopulaties van neuronen definiëren, worden gewoonlijk geïdentificeerd met een combinatie van respectievelijk immunohistochemie (IHC) en/of in situ hybridisatie (ISH). Het combineren van ISH met IHC-technieken vergemakkelijkt de karakterisering van colokalisatiepatronen die uniek zijn voor functionele neuronen (neurochemische codering) door de multiplex-labelcapaciteit te maximaliseren.
Fluorescerende ISH (FISH)-methoden, waaronder RNAscope, hebben een hogere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met eerdere RNA-detectiemethoden zoals radioactief ISH en niet-radioactief chromogeen ISH. FISH maakt visualisatie mogelijk van enkelvoudige mRNA-transcripten als puntvormige gekleurde vlekken1. Bovendien maakt de RNAscope-assay het mogelijk om een groter aantal RNA-doelen tegelijk te labelen, met behulp van verschillende fluorofoortags. Ondanks deze voordelen kunnen technische beperkingen van invloed zijn op het aantal fluoroforen/chromogenen dat in een enkel experiment kan worden gebruikt. Deze omvatten de beschikbaarheid van microscoopfiltersets; dergelijke overwegingen worden nog verergerd wanneer neurochemische identificatie gebruik maakt van gecombineerde FISH en IHC, in vergelijking met het gebruik van elke techniek afzonderlijk, aangezien inherente stappen die optimaal zijn voor de ene methode schadelijk kunnen zijn voor de andere.
Eerdere toepassing van FISH in combinatie met IHC heeft de expressie van specifieke cellulaire doelwitten aangetoond in menselijke B-cellymfomen2, kuikenembryo's3, zebravisembryo's4, muizennetvlies5 en binnenoorcellen van muizen6. In deze onderzoeken was de weefselvoorbereiding ofwel in formaline gefixeerde paraffine ingebed (FFPE)2,3,5 ofwel verse hele montage 4,6. Andere studies pasten chromogene RNAscope toe op vaste preparaten van muizen en rattenhersenen 7,8,9. In het bijzonder Baleriola et al.8 beschreef twee verschillende weefselpreparaten voor gecombineerde ISH-IHC; vaste hersensecties van muizen en FFPE-hersensecties van mensen. In een recente publicatie combineerden we FISH en fluorescerende IHC op vers ingevroren secties, om tegelijkertijd mRNA met een lage abundantie (galaninereceptor 1, GalR1), mRNA met een hoge abundantie (glycinetransporter 2, GlyT2) en vesiculaire acetylcholinetransporter (vAChT) proteïne10 in de reticulaire formatie van de hersenstam te visualiseren.
De kern van het solitaire kanaal (NTS) is een belangrijk hersengebied dat betrokken is bij de autonome functie. Deze heterogene populatie van neuronen bevindt zich in de achterhersenen en ontvangt en integreert een groot aantal autonome signalen, waaronder signalen die de ademhaling reguleren. De NTS herbergt verschillende neuronale populaties, die fenotypisch kunnen worden gekenmerkt door het expressiepatroon van mRNA-doelen, waaronder GalR1 en GlyT2 en eiwitmarkers voor het enzym tyrosinehydroxylase (TH) en de transcriptiefactor Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
De eigenaar van RNAscope beveelt vers ingevroren weefselpreparaten aan, maar weefsel dat is voorbereid door transcardiale perfusiefixatie van hele dieren, samen met cryoprotectie op lange termijn (opslag bij -20 °C) van vaste ingevroren weefselsecties, is gebruikelijk in veel laboratoria. Daarom hebben we geprobeerd protocollen op te stellen voor FISH in combinatie met IHC met behulp van vers ingevroren en gefixeerde ingevroren weefselpreparaten. Hier voorzien we in vers ingevroren en gefixeerde ingevroren hersensecties: (1) een protocol voor gecombineerde FISH en fluorescerende IHC (2) een beschrijving van de kwaliteit van de geproduceerde mRNA- en eiwitetikettering bij gebruik van elk preparaat (3) een beschrijving van de expressie van GalR1 en GlyT2 in de NTS.
Onze studie toonde aan dat, in combinatie met RNAscope-methodologie, het IHC-succes varieerde in vers ingevroren en gefixeerde diepvriespreparaten en afhankelijk was van lokalisatie van de doeleiwitten in de cel. In onze handen was het labelen van membraangebonden eiwitten altijd succesvol. IHC voor cytoplasmatisch eiwit daarentegen vereiste probleemoplossing, zelfs in gevallen waarin het cytoplasmatische eiwit tot overexpressie werd gebracht in een transgeen dier (Phox2b-GFP)11. Ten slotte, terwijl GalR1 tot expressie wordt gebracht in niet-catecholaminerge neuronen in de NTS, is GlyT2-expressie afwezig in de NTS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een samenvatting van de stappen van de voorbewerking van het weefsel is te vinden in figuur 1. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care and Ethics Committee van de University of New South Wales in overeenstemming met de richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (Australian National Health and Medical Research Council).
1. Monstervoorbereiding van vers ingevroren hersenweefsel
- Transcardiale perfusie
- Bereid gehepariniseerde (2500 E/L) 0,1 M fosfaatbuffer (PB), pH 7,5. Maak droogijs ethanol slurry door droogijs te mengen met ethanol. Dit heeft een temperatuur van ongeveer −72 °C en wordt gebruikt voor het onmiddellijk invriezen van het geoogste weefsel.
- Euthanaseer volwassen C57BL/6 en Phox2b-GFP11 (Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) muizen door te verdoven met natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.), met behulp van een naaldmeter van 27,5 inch.
LET OP: Pentobarbital is een barbituraat. Het is acuut giftig in hoge doses en kan de dood veroorzaken door ademstilstand. Raadpleeg voor gebruik de plaatselijke richtlijnen voor gezondheidszorg, juridische en materiële veiligheid. - Leg het hart bloot en kanunnik de linker hartkamer met een optreknaald (23 inch gauge). Voer transcardiale perfusie uit met gehepariniseerde 0,1 M PB totdat het bloed is verdwenen (2-3 minuten) met een stroomsnelheid van 11-13 ml/min. Bepaal de bloedzuivering door de verkleuring van de lever en de uitvloeiing vanuit het rechter atriumte controleren 12.
- Isoleer de hersenen van de schedelholte, sluit ze onmiddellijk in Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) in een cryomal of aluminiumfolie in en plaats ze op het droogijs-ethanolbad. Bewaar het ingevroren ingebedde weefsel maximaal 3 maanden in een luchtdichte verpakking bij - 80 °C.
- Delen van vers ingevroren weefsel
- Stel de cryostaattemperatuur in op -20 °C. Laat het in OCT ingebedde weefsel en een cryostaathouder ~30 minuten in de cryostaat om evenwicht met de nieuwe temperatuur mogelijk te maken.
NOTITIE: Houd het weefsel te allen tijde bevroren; transporteer het weefsel van de vriezer van -80 °C naar de cryostaat op droogijs. - Bevestig het weefsel aan de voorgekoelde cryostaathouder met behulp van een OCT-verbinding. In dit protocol werden weefselblokken op de klauwplaat in het coronale vlak gemonteerd.
NOTITIE: Snijd overtollige OCT uit het weefsel met een scheermesje om de hoeveelheid OCT die door de cryostaat wordt gesneden en vervolgens op het glasglaasje wordt overgebracht, tot een minimum te beperken. - Snijd coronale secties van 14 μm dik en monteer ze op geladen glasmicroscopieglaasjes.
- Verwarm de geleiders tot kamertemperatuur voordat u de secties monteert. Nadat de sectie is gemonteerd, bewaart u de objectglaasjes in een glaasjesdoos in de cryostaat.
- Als er meer dan één sectie op één objectglaasje moet worden gemonteerd, verwarm dan het gebied voor het tweede glaasje door een vinger gedurende 5-10 seconden aan de andere kant van het glaasje te plaatsen om de hechting van het gedeelte aan het glaasje te bevorderen. Een koud weefselgedeelte hecht zich niet aan een koud glaasje. De secties moeten plat aan de dia's hechten; Door te vouwen vallen ze tijdens het wassen van de geleiders.
- Als er scheuren in de secties worden opgemerkt, verhoog dan de cryostaattemperatuur met 1-5 °C om dit te voorkomen. Het is vooral belangrijk om weefselsecties dicht bij elkaar op hetzelfde objectglaasje te plaatsen. Dit voorkomt verspilling van FISH-sondes en reagentia tijdens de test.
- Bewaar weefselcoupes die op objectglaasjes zijn gemonteerd maximaal 6 maanden in een luchtdichte verpakking bij -80 °C.
NOTITIE: Houd de secties te allen tijde bevroren en vermijd vriesdooicycli om afbraak van RNA te voorkomen. Transporteer de glaasjesdoos van binnenuit de cryostaat naar de vriezer van -80 °C op droogijs.
- Stel de cryostaattemperatuur in op -20 °C. Laat het in OCT ingebedde weefsel en een cryostaathouder ~30 minuten in de cryostaat om evenwicht met de nieuwe temperatuur mogelijk te maken.
- Fixatie van vers ingevroren weefsel
- Bereid op de dag dat de FISH-sondetest moet worden uitgevoerd 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PB, pH 7,5 (4% PFA-oplossing). Filtreer door filtreerpapier (klasse 1: 11 μm, tabel met materialen) in een Buchner-trechter of kroesfilter te halen.
LET OP: PFA is schadelijk en giftig bij contact met de huid of inademing. Alle procedures met PFA-oplossing moeten worden uitgevoerd in een zuurkast. Afval van PFA-oplossingen moet zorgvuldig worden verwijderd volgens de institutionele veiligheidsprotocollen. - Koel de 4% PFA-oplossing af tot 4 °C. Transporteer het op de dia gemonteerde weefsel uit de vriezer van -80 °C in droogijs en dompel het onmiddellijk gedurende 15 minuten onder in het voorgekoelde fixeermiddel.
OPMERKING: Het is belangrijk dat deze fixatiestap niet langer duurt dan 15 minuten, omdat overfixatie zal resulteren in niet-specifieke achtergrondmarkering.
- Bereid op de dag dat de FISH-sondetest moet worden uitgevoerd 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PB, pH 7,5 (4% PFA-oplossing). Filtreer door filtreerpapier (klasse 1: 11 μm, tabel met materialen) in een Buchner-trechter of kroesfilter te halen.
- Uitdroging van vers ingevroren weefsel
- Dehydrateer weefselsecties door de objectglaasjes onder te dompelen in graduele concentraties ethanol. In een Coplin-pot eerst onderdompelen in 50%, dan 70% en tenslotte absolute ethanol, elk gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Herhaal de laatste absolute ethanolincubatie een tweede keer.
- Laat de dia's aan de lucht drogen en schets de groep secties met behulp van een hydrofobe barrièrepen, waarbij u ervoor zorgt dat het binnengebied tot een minimum wordt beperkt.
NOTITIE: Zorg ervoor dat het glasplaatje volledig droog is voordat u de hydrofobe barrière trekt. De hydrofobe barrière moet de weefselsecties volledig zonder openingen omringen en moet droog zijn voordat deze verder wordt verwerkt.
2. Monstervoorbereiding van gefixeerd ingevroren hersenweefsel
- Transcardiale perfusie fixatie
- Euthanaseer muizen door te verdoven met natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.) gevolgd door transcardiale perfusie, eerst met 0,1 M PB en vervolgens met 4% PFA-oplossing. Fixeer met 10 minuten perfusie op 11-13 ml/min.
- Isoleer de hersenen van de schedelholte na perfusiefixatie en dompel ze een nacht onder in 4% PFA-oplossing bij 4 °C.
- Weefseldoorsnede van vast weefsel
- Spoel de hersenen met een fijne pincet af met een steriele 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat u de meningeale lagen verwijdert, met behulp van een ontleedmicroscoop.
- Snijd de hersenen nauwkeurig in blokken (scheid de hersenstam van de voorhersenen voorafgaand aan de vibratomesectie) met behulp van een hersenmatrix (Tabel met materialen). Snijd in het bijzonder de hersenstam caudaal door bij de piramidale decussatie en ontleed het cerebellum. Snijd op dezelfde manier de voorhersenen onmiddellijk rostraal naar het optische chiasma.
- Zet het weefsel vast op een vibrerende microtoomboorkop met cyanoacrylaat en veranker het in 2% agar-oplossing.
- Snijd 30 μm dikke weefselsecties met behulp van een vibrerende microtoom en bewaar gesneden secties in cryoprotectieve oplossing (30% RNasevrije sucrose, 30% ethyleenglycol, 1% polyvinylpyrrolidon (PVP-40), in 0,1 M PB, pH 7,4). Weefselcoupes kunnen maximaal 6 maanden in cryoprotectant bij -20 °C worden bewaard.
- Voorbereiding van vaste secties voorafgaand aan FISH
- Was op de dag van FISH vrij zwevende secties drie keer, gedurende 10 minuten per wasbeurt, om de cryoprotectieve oplossing te verwijderen. Om te wassen, plaatst u secties in 0,1 M PBS in een celkweekplaat met 12 putjes en schudt u ze op een roterende platformschudder (90 - 100 tpm).
- Gebruik na het wassen een penseel om secties op glasmicroscopieglaasjes te monteren en laat ze minimaal 2 uur aan de lucht drogen.
NOTITIE: De secties moeten plat op de dia's hechten, omdat ze bij uitgesproken plooien tijdens het wassen losraken. - Teken met behulp van een hydrofobe barrièrepen een barrière rond de secties om de FISH-reagentia te beperken tot de secties. Nogmaals, het is belangrijk om het interne gebied van de omtrek die met de barrièrepen is getekend te minimaliseren.
MOGELIJK BREEKPUNT: De secties kunnen 's nachts bij kamertemperatuur worden bewaard om de volgende dag door te gaan met de test.
3. FISH-test
OPMERKING: De rest van het protocol is van toepassing op zowel vers ingevroren als vast ingevroren weefsel.
- Bereid de reagentia en instrumenten voor op hybridisatie- en amplificatiestappen.
- Stel een tafelincubator en een waterbad in op 40 °C.
- Bereid een bevochtigde, tegen licht beschermde kamer voor voor het incuberen van objectglaasjes. Bevochtiging voorkomt uitdroging van tissues - dia's bevinden zich veilig boven een vochtig reservoir. Idealiter is de kamer gemaakt van stevig polystyreen, het is lichtdicht en luchtdicht om een verzadigde waterdampatmosfeer te behouden. Het sluiten van de kamer is afhankelijk van minimale wrijving om beweging te voorkomen. We gebruikten een glaasjesdoos bekleed met natte laboratoriumdoekjes (Table of Materials) aan de onderkant. Plaats de glaasjesbak in de broedstoof om deze voor te verwarmen tot 40 °C.
- Verwarm de 50x Wash Buffer (materiaaltabel) en sondes gedurende 10 minuten tot 40 °C met behulp van het waterbad en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Bereid 1 L van 1x Wash Buffer van de 50x voorraadconcentratie.
- Bereid het sondemengsel voor (materiaaltabel): de C1-sonde is klaar voor gebruik bij voorraadconcentratie, terwijl C2- en C3-sondes worden verzonden als een concentratie van 50x en moeten worden verdund met het verdunningsmiddel dat in de set is meegeleverd.
OPMERKING: Sondemengsels kunnen maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
- Protease behandeling
- Incubeer secties met Protease III (Tabel met materialen) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat Protease III en incubatiereagentia in stroomafwaartse processen (sondemengsel, amplificatieoplossingen, blokkeerbuffer en antilichaamsera) de secties volledig bedekken. Een pipetpunt kan worden gebruikt om het reagens op de sectie te verspreiden om het hele gebied binnen de hydrofobe barrière te bedekken. - Was de glaasjes twee keer met 0,1 M PBS, telkens gedurende 2 minuten, in een grote plastic vierkante petrischaal. Hier werd een vierkante bioassayschaal van 245 mm x 245 mm gebruikt (Tabel met materialen). Houd de schaal aan één kant vast en kantel deze 3-5 keer voorzichtig. Veeg na het wassen overtollig 0.1 M PBS van het objectglaasje en voeg onmiddellijk het volgende reagens toe. Laat weefselsecties niet opdrogen.
NOTITIE: Tijdens elke wasbeurt worden de objectglaasjes ondergedompeld in oplossing bij kamertemperatuur. Dit is de workflow voor alle volgende wasstappen. De vaste secties van 30 μm dik komen gemakkelijker los van de geleiders dan secties met een dikte van 14 μm, wees voorzichtig tijdens het wassen.
- Incubeer secties met Protease III (Tabel met materialen) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Hybridisatie en amplificatie
- Plaats na het afwassen van de protease-oplossing de objectglaasjes in de bevochtigde, voorverwarmde kamer. Incubeer secties met sondemengsel (Tabel met materialen) gedurende 2 uur bij 40 °C in een benchtop incubator.
NOTITIE: Zorg ervoor dat er ten minste 2 secties zijn gereserveerd voor positieve en negatieve controlesondes om de kwaliteit van het monster-RNA en de optimale permeabilisatie te beoordelen. Positieve controlesondes richten zich op genen voor het huishouden; hier waren dit een cocktail van RNA's gericht op ubiquitine C (UBC; hoge overvloed), peptidylpropylisomerase B (PPIB; matige overvloed) en RNA-polymerase 2a (POLR2A; lage overvloed). Negatieve controlesondes richten zich op het bacteriële 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinaatreductase (DapB)-gen, dat normaal afwezig is in hersenmonsters van muizen. Een positief DapB-signaal duidt op een niet-specifiek signaal en/of bacteriële besmetting van het monster. - Na hybridisatie met het sondemengsel bestaan de signaalversterkingsstappen uit incubatie met Amp 1-FL (30 minuten), vervolgens met Amp 2-FL (15 minuten), gevolgd door Amp 3-FL (30 minuten) en tenslotte Amp 4-FL (15 minuten) - elk bij 40 °C. Gebruik de meegeleverde druppelflesjes om weefselsecties af te dekken met een amplificatieoplossing. Ga verder met de IHC-test na de laatste versterkingsstap.
- Spoel de objectglaasjes tweemaal af met Wash Buffer gedurende 2 minuten tussen de hybridisatie van de sonde en elke versterkingsstap.
- Plaats na het afwassen van de protease-oplossing de objectglaasjes in de bevochtigde, voorverwarmde kamer. Incubeer secties met sondemengsel (Tabel met materialen) gedurende 2 uur bij 40 °C in een benchtop incubator.
4. IHC-test
- IHC-blokkeringsstap
- Om niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen, incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een blokkeringsoplossing met 10% normaal paardenserum, 0,3% Tween20 in 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% merthiolaat) na de FISH-test. Bereid primaire antilichamen in een verdunningsbuffer met 1x TBSm, 5% normaal paardenserum en 0,1% Tween20. Leveranciers van primaire antilichamen worden vermeld in de materiaaltabel.
- Immunohistochemie
- Verwijder overtollige blokkeerbuffer door op het glaasje te tikken en incubeer secties met primaire antilichamen gedurende een nacht bij 4 °C.
- Was de glaasjes 3 keer (elk 5 minuten) met 1x TBSm en incubeer met secundair antilichaam in verdunningsmiddel met 1x TBSm, 1% normaal paardenserum en 0,1% Tween20 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Secundaire antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel.
- Was de glaasjes 3 keer met 1x TBSm (elk 5 minuten) voordat u ze onder het dekglaasje gooit met montagemedium met of zonder DAPI (Tabel met materialen).
5. Beeldvorming
- Onderzoek immunokleuring onder een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een camera (zie de materiaaltabel voor details). Verkrijg representatieve afbeeldingen met een vergroting van 20x en sla ze op als TIFF-bestanden.
- Exporteer representatieve afbeeldingen naar beeldverwerkingssoftware (Tabel met materialen) voor aanpassing van de helderheid/contrast om de helderheid te vergroten en de waarheidsgetrouwe weergave weer te geven.
6. OPTIONEEL: Kwantitatieve analyse van doeltranscripties
OPMERKING: Dit is een artikel over methoden en er worden geen kwantitatieve resultaten verstrekt. De hier gepresenteerde kwantificeringsmethode is afkomstig van Dereli et al.10. okt.
- Verkrijg beelden van de interessegebieden zoals uitgelegd in 5.1 en pas dezelfde microscoop- en camera-instellingen (zoals belichtingstijd en lichtintensiteit) toe op alle beelden van dezelfde fluorofoor.
- Plot de neuronale profielen met behulp van beeldanalysesoftware (Tabel met materialen).
- Lijn de secties uit met betrekking tot het Bregma-niveau volgens een stereotactische hersenatlas13.
- Pas dezelfde helderheid en hetzelfde contrast toe op alle afbeeldingen van dezelfde fluorofoor. Beschouw alleen de neuronen met DAPI-gekleurde kernen.
- Tel handmatig het aantal mRNA-, eiwitexpressie-, mRNA/mRNA-, eiwit/eiwit- en mRNA/eiwit-co-expressiecellen binnen het interessegebied.
- Om vertekening in de experimentele resultaten te verminderen, moet u de persoon die de experimentele resultaten kwantificeert, blind maken voor de experimentele groepen.
- Pas Abercrombie-correctie14 toe op het totale aantal cellen met behulp van de volgende Abercombie-vergelijking:
Gecorrigeerd celgetal = handmatig celgetal x sectiedikte / (sectiedikte + kerngrootte)
Voor secties met een dikte van 14 μm wordt bijvoorbeeld de gemiddelde kernbreedte berekend op 7,7 ± 0,3 μm en de gemiddelde sectiedikte is 14 ± 1 μm op basis van respectievelijk 30 cellen en 10 secties bij 5 dieren10. Volgens de Abercrombie-vergelijking zou het gecorrigeerde aantal cellen handmatig zijn aantal cellen x 14/(14+7,7).
Figuur 1: Parallelle workflow van weefselvoorbewerkingsstappen voor zowel vers ingevroren als paraformaldehyde-gefixeerd weefsel. Verwerkingsstappen voor vers ingevroren weefsel worden weergegeven in de rood omlijnde vakken, terwijl die voor paraformaldehyde (PFA) vast weefsel worden weergegeven in de blauw omlijnde vakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Samenvatting van de gecombineerde procedure voor de FISH-sonde en de immunohistochemie. Na de voorbewerking van het weefsel wordt het op het objectglaasje gemonteerde weefsel omcirkeld met behulp van een hydrofobe barrièrepen, zoals te zien is in het eerste frame, en geïncubeerd in een protease-oplossing bij kamertemperatuur. Na wasbeurten wordt het weefsel gedurende 2 uur overgebracht naar een benchtop-incubator voor hybridisatie vóór opeenvolgende versterkingsstappen. Het in situ hybridisatiesysteem maakt gebruik van een gepatenteerd 'Z-sonde'-ontwerp, voorversterkers en versterkers zoals te zien is in frames 3-66. Zodra het weefsel een FISH-sondeverwerking heeft ondergaan, wordt het gewassen voordat het wordt geblokkeerd met normaal paardenserum. De primaire incubatie van antilichamen wordt 's nachts bij 4 °C uitgevoerd om de antilichaam-antigeenbinding te maximaliseren. De secundaire incubatie van antilichamen (2 uur) werd uitgevoerd bij kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier schetsen we een methode voor het combineren van multiplex FISH met fluorescerende IHC om mRNA-expressie voor GalR1 en GlyT2 te lokaliseren met behulp van respectievelijk vers ingevroren en paraformaldehyde-gefixeerde weefsels in de NTS van de muis. Een pijplijn van de weefselbewerking, FISH- en IHC-procedures die in de methoden worden beschreven, wordt weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Tabel 1 geeft een samenvatting van de FISH-sonde- en antilichaamcombinaties die in elke figuur worden gebruikt.
Controlesondes worden routinematig gelijktijdig met de doelsonde getest om de integriteit van de workflow te waarborgen en de monsterkwaliteit te bevestigen. Het ontbreken van DapB-etikettering bevestigt de kwaliteit en integriteit van gezond weefsel en de afwezigheid van bacteriële besmetting (figuur 3A). Etikettering van positieve controlesondes gericht op ubiquitine C (UBC, hoge abundantie), peptidylpropylisomerase B (PPIB, matige abundantie) en RNA-polymerase 2a (POLR2A, lage abundantie) mRNA bevestigt de RNA-integriteit en het signaal dat tussen assays wordt waargenomen, kan worden gebruikt om de variabiliteit tussen assays te kalibreren (Figuur 3B). Om de expressie van de FISH-sonde te valideren, gebruikten we controleweefsels die eerder zijn beschreven om het mRNA-transcript tot expressie te brengen. Zo werd bijvoorbeeld bevestigd dat GalR1-mRNA-expressie positief was in de thalamus, zoals eerder beschreven10,15. De verdeling van het mRNA van Phox2b werd bovendien geverifieerd door colabeling met Phox2b-antilichaam; we bevestigden dat FISH-etikettering alleen aanwezig was in neuronen die ook positief gekleurd waren met behulp van het Phox2b-antilichaam (Figuur 5).
Om GalR1+ neuronen in de NTS te onderscheiden van naburige kernen, gebruikten we aanvullende neurochemische markers. TH, Phox2b of Phox2b-GFP immunoreactiviteit (Figuur 4-6) en Phox2b FISH (Figuur 5 en Figuur 6) differentieerden de NTS van andere kernen in de dorsale hersenstam, aangezien eerder is gemeld dat NTS-neuronen Phox2b en TH 16,17 tot expressie brengen. Omdat de NTS is genesteld door cholinerge kernen - het ligt dorsaal aan de hypoglossale kern en dorsale motorische kern van de vagus (DMNX), en ventraal aan de vestibulaire kern - hebben we gecolabeld met de cholinerge marker vAChT18 (Figuur 4). Daarom werd de expressie van GalR1 binnen de NTS beoordeeld in relatie tot TH en Phox2b, terwijl vAChT-etikettering de ruimtelijke oriëntatie met betrekking tot rostrocaudale, dorsoventrale en mediolaterale coördinaten bevorderde. We ontdekten dat alle TH-immunoreactieve en GalR1-mRNA-positieve neuronen in de NTS Phox2b-GFP-immunoreactief waren, maar niet alle Phox2b-GFP-immunoreactieve neuronen in de NTS waren TH-immunoreactief of GalR1-mRNA-positief (Figuur 4). Ook toonden we aan dat mRNA voor de lage abundantiereceptor GalR1 afwezig was in TH- en vAChT-immunoreactieve neuronen.
In vers ingevroren preparaten, in combinatie met de FISH-sondetest, was het IHC-succes afhankelijk van de subcellulaire locatie van het doeleiwit. VAChT (een membraangebonden eiwit van synaptische blaasjes) was bijvoorbeeld duidelijk immunogelabeld, terwijl TH en GFP (cytoplasmatische eiwitten) voor onbepaalde tijd immuungelabeld waren en slechts vaag werden waargenomen (Figuur 4). We beschrijven deze onbepaalde etikettering als 'flocculent' omdat cellen geen duidelijke omtrek hadden en moeilijk te onderscheiden bleken van de achtergrond. Op dezelfde vers ingevroren weefselsectie was de GalR1 FISH-sondelabeling van cytoplasmatisch GalR1-mRNA punctaat en duidelijk waargenomen (Figuur 4).
Bovendien, aangezien de TH- en vAChT-antilichamen in dezelfde gastheer worden opgewekt, werden beide eiwitten gelabeld met hetzelfde secundaire antilichaam en dus dezelfde kleur fluorofoor (excitatielicht: 594). Ze zijn gemakkelijk te onderscheiden om twee redenen: ze co-labelen nooit in dezelfde neuronen, en de subcellulaire lokalisatie is anders voor deze eiwitten; vAChT in blaasjes die een puntig uiterlijk vertonen, en TH in het cytoplasma en neuronale processen.
Om onze hypothese te ondersteunen dat IHC-kwaliteit (in vriesverse preparaten) afhankelijk is van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten, vergeleken we de etikettering voor Phox2b-mRNA (gelokaliseerd in het cytoplasma), GFP (overexpressie in cytoplasma) en Phox2b-eiwit (voornamelijk te vinden in de kern) in neuronen. Zoals verwacht tonen onze resultaten overlap van Phox2b-mRNA-, GFP- en Phox2b-antilichaamlabeling in individuele neuronen van de NTS (Figuur 5). Cellen met cytoplasmatische mRNA-etikettering kwamen overeen met cellen die nucleaire etikettering van het Phox2b-eiwit vertoonden, wat validatie van de gecombineerde FISH-IHC-methode opleverde. Hoewel cytoplasmatisch Phox2b-GFP er vlokkig uitzag, was het nucleaire Phox2b-eiwitsignaal duidelijk en specifiek. Concluderend kan worden gesteld dat membraangebonden eiwitten, waaronder vAChT en Phox2B, in combinatie met FISH op vriesverse preparaten een hogere kwaliteit immunolabeling vertonen dan cytoplasmatische eiwitten.
IHC daarentegen was betrouwbaar, ongeacht de subcellulaire lokalisatie, wanneer het werd uitgevoerd op vaste bevroren secties in combinatie met FISH. Multiplex FISH voor GlyT2-mRNA en Phox2b-mRNA was succesvol, zoals weergegeven in figuur 6. GlyT2 mRNA-positieve neuronen bevonden zich ventraal ten opzichte van de NTS en niet binnen de NTS. GlyT2+ en Phox2b+ neuronen colocaliseerden niet. Een subpopulatie van Phox2b+ NTS-neuronen was TH immunoreactief en geen enkele bevatte GlyT2-mRNA. TH-immunoreactieve neuronen zijn zichtbaar op hetzelfde weefselgedeelte en vertonen positief gelabelde soma- en neuronale processen (Figuur 6). Dit staat in contrast met het 'vlokke' uiterlijk van TH-immunoreactieve neuronen in vers ingevroren weefselsecties. Het hier beschreven vaste ingevroren preparaat is dus een alternatieve methode van weefselpreparatie die een betrouwbare targeting van cytoplasmatische eiwitten immunohistochemisch mogelijk maakt, in combinatie met RNAscope.
Figuur 3: Representatieve microscopische beelden van voorhersensecties van coronale muizen ter hoogte van het laterale septum (Bregma 1,1 tot -0,1) waarop de positieve en negatieve controlesondes zijn gelabeld . (A) Een gebrek aan signaal na ISH met bacterieel 4-hydroxytetrahydrodipicolinaatreductase (DapB) bevestigt de afwezigheid van achtergrondsignalen. (B) Etikettering met positieve controlesondes die gericht zijn op ubiquitine C (UBC), peptidylpropylisomerase B (PPIB) en RNA-polymerase 2a (POLR2A) illustreert het signaal dat moet worden verwacht van respectievelijk doelen met een hoge, matige en lage abundantie. Schaalbalken zijn 50 μm. Alle foto's zijn gemaakt met een 20x objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve microscopische beelden van een vers ingevroren coronale hersenstamsectie van een Phox2b-GFP-muis met gecombineerde etikettering van GalR1-mRNA (FISH) en 3-eiwitten (IHC) in de kern van het solitaire kanaal (NTS) -gebied. Inzetstukken in A worden vergroot in B. GalR1-mRNA wordt aangegeven door puntige FISH-sondelabels (pijlpunten). Antilichamen gericht op de cytoplasmatische eiwitten GFP en tyrosinehydroxylase (TH) vertoonden een "vlokke" etikettering (pijlen). De immunoreactiviteit van de vesiculaire acetylcholinetransporter (vAChT) wordt aangetoond (rode puntvormige etikettering) in de hypoglossale kern (XII). Schaalbalken zijn 100 μm in A en 25 μm in B. Alle foto's zijn gemaakt met een 20x objectief. Andere afkortingen: area postrema (AP), mediale vestibulaire kern (MVe). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve microscopische beelden van een vers ingevroren coronale hersenstamsectie van een Phox2b-GFP-muis, die het richten van Phox2b in de kern van het solitaire kanaal (NTS) illustreert met drie verschillende benaderingen: Phox2b mRNA (FISH), GFP (IHC) en Phox2b proteïne (IHC). Phox2b-eiwit is gelokaliseerd in de kern. Inzet in A wordt vergroot in B. Pijlen geven neuronen aan die drievoudig zijn gelabeld met Phox2b-sonde (oranje-550), GFP-antilichaam (groen-488) en Phox2b-antilichaam (rood-647). Schaalbalken zijn 100 μm in A en 25 μm in B. Alle beelden zijn verkregen met een 20x objectief. Andere afkortingen: area postrema (AP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve beelden van gefixeerde ingevroren coronale hersenstamsecties die succesvolle FISH aantonen in combinatie met betrouwbare immunolabeling van cytoplasmatische eiwitten (tyrosinehydroxylase [TH]). Dubbele FISH met glycinetransporter 2 (GlyT2-rood-647, gevulde pijlpunten) en Phox2b (geel-550, pijlen) mRNA-etikettering in de kern van het solitaire kanaal (NTS) gebied. FISH werd gecombineerd met IHC voor TH-eiwit (blauw-346, lege pijlpunten). Inzetstukken in A zijn vergroot in B. Schaalbalken zijn 25 μm. Alle foto's zijn gemaakt met een 20x objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primaire antilichaam- of RNAscope-sonde | Secundair antilichaam of Ampère 4-FL-Alt Display-module |
Excitatie (nm) | Weefsel preparatie | ||
| Figuur 3 | sonde | POLR2A (C1) | Ampère 4-FL-Alt B Display-module | 647 | Vriesvers |
| sonde | PPIB (C2) | Ampère 4-FL-Alt B Display-module | 488 | ||
| sonde | UBC (C3) | Ampère 4-FL-Alt B Display-module | 550 | ||
| sonde | DapB (C1, C2, C3) | Ampère 4-FL-Alt B Display-module | 647, 488, 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figuur 4 | antistof | konijn-anti-GFP | ezel-anti-konijn | 488 | Vriesvers |
| antistof | schapen-anti-TH | ezel-anti-schaap | 647 | ||
| antistof | geit-anti-vAChT | ezel-anti-geit | 647 | ||
| sonde | GalR1 (C1) | Ampère 4-FL-Alt B Display-module | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figuur 5 | antistof | konijn-anti-GFP | ezel-anti-konijn | 488 | Vriesvers |
| antistof | muis-anti-Phox2b | ezel-anti-muis | 647 | ||
| sonde | Phox2b (C2) | Ampère 4-FL-Alt A Display-module | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figuur 6 | antistof | muis-anti-TH | ezel-anti-muis | 346 | vast |
| sonde | GlyT2 | Ampère 4-FL-Alt A Display-module | 647 | ||
| sonde | Phox2b | Ampère 4-FL-Alt A Display-module | 550 |
Tabel 1: FISH-sonde, antilichaam en overeenkomstige fluroforencombinaties gebruikt in figuren 3-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de neurowetenschappen worden FISH en IHC routinematig gebruikt om de ruimtelijke organisatie en functionele betekenis van mRNA of eiwitten binnen neuronale subpopulaties te onderzoeken. Het protocol dat in deze studie wordt beschreven, vergroot de capaciteit voor gelijktijdige detectie van mRNA's en eiwitten in hersensecties. Onze gecombineerde multiplex FISH-IHC-test maakte fenotypische identificatie mogelijk van verschillende neuronale subpopulaties in de NTS in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersenpreparaten. FISH-IHC in gefixeerde preparaten voor ingevroren weefsel leverde betrouwbare IHC-resultaten op. Bijvoorbeeld, multiplex FISH voor mRNA's met lage en hoge abundantie (respectievelijk GalR1 en GlyT2) en IHC (gericht op tyrosinehydroxylase) onthulden dat GalR1 en GlyT2 tot expressie worden gebracht in niet-catecholaminerge NTS-neuronen. IHC voor TH was niet succesvol in vers ingevroren weefsel, wat de beperkte capaciteit van FISH-IHC in vriesverse bereidingen benadrukt.
ISH kan in een aantal scenario's geschikter zijn dan IHC. Ten eerste presteert IHC mogelijk niet goed bij het detecteren van eiwitten met een lage abundantie, zoals receptoren. Het gebruik van ISH om mRNA's met een relatief hogere abundantie voor deze eiwitten te targeten, verbetert de detecteerbaarheid1. Ten tweede worden eiwitten zoals neuropeptiden vaak naar de axonale terminals getransporteerd na translatie in de cel soma19. Wanneer neuropeptiden het doelwit zijn van IHC, labelen de axonale processen en uiteinden van cellen met het antilichaam, maar niet met de soma, waardoor het vermogen om de cel van oorsprong te identificeren of kwantitatieve analyse van het aantal cellen uit te voeren, wordt verminderd. Aangezien mRNA's die coderen voor alle eiwitten echter gelokaliseerd in de soma worden gevonden, is de ISH-techniek voordelig. Ten slotte zijn antilichamen niet direct beschikbaar voor sommige eiwitsoorten, of zijn de beschikbare antilichamen geschikt voor andere proteomics-technieken (bijv. Western blot) maar niet voor IHC. In deze omstandigheden blijken mRNA-etiketteringsmethoden nuttig. Een voorbehoud is dat mRNA's niet altijd worden vertaald in eiwitten, en dus bieden ze alleen een proxy voor eiwitidentificatie. Aangezien commerciële FISH-kits duur kunnen zijn en de ISH-sondes minder snel in de handel verkrijgbaar zijn in vergelijking met antilichamen, biedt het combineren van FISH met IHC een kosten- en tijdbesparende strategie voor het vergroten van het aantal doelen dat tegelijkertijd kan worden geëtiketteerd.
Vers ingevroren versus gefixeerde weefselbereiding was een factor die een succesvolle IHC na de FISH-sondetest verleende. We hebben IHC getest met behulp van antilichamen gericht op nucleaire, vesiculaire en cytoplasmatische eiwitten en vonden betrouwbare etikettering van membraangebonden eiwitten (vAChT en Phox2b) op vers ingevroren monsters, maar niet op cytoplasmatische eiwitten (TH en GFP). Co-expressie van Phox2b-eiwit en mRNA met 'vlokvormige' Phox2b-GFP-etikettering valideerde dat neuronen die het transcript tot expressie brengen ook het gerelateerde eiwit tot expressie brachten, wat de neurochemische identiteit van de neuronen bevestigt (Figuur 5). Daarentegen leverden gefixeerde preparaten van bevroren weefsel betrouwbare IHC-etikettering op, ongeacht de subcellulaire lokalisatie van het antigeen. Eerdere studies hebben aangetoond dat voorbehandeling met protease (bijv. pronase 8,20) een nadelig effect kan hebben op IHC. De inhoud van de protease-oplossing die in het RNAscope-protocol wordt gebruikt, is gepatenteerd en permeabilisatie door protease wordt aanbevolen voor toegang tot de RNAscope-sonde in cellen. Etikettering van cytoplasmatische eiwitten met behulp van de hier beschreven antilichamen is eerder geverifieerd op vrij zwevende 30 μm vaste bevroren muizenhersensecties 10,21,22. We hebben 30 μm dikke vaste monsters op een schuif gemonteerd en het FISH-IHC-protocol uitgevoerd, in tegenstelling tot de 14 μm dikke vriesverse secties die door de fabrikant worden aanbevolen. Bij afwezigheid van assaymodificaties of verandering van andere variabelen (antigeenextractie, hogere antilichaamconcentratie, verandering van protease), werd betrouwbare IHC bereikt op dikke, gefixeerde monsters met aangetoonde labeling van het cytoplasma en axonale processen samen met FISH-sondelabeling (Figuur 6). Terwijl vergelijkbare benaderingen werden gebruikt door andere onderzoeksgroepen 7,8,9, bereikte de huidige studie gecombineerde ISH-IHC op neuronen en in een fluorescerende opstelling.
Er waren een aantal cruciale stappen in de methoden om kennis van te nemen. Voor de vers ingevroren bereiding mag de fixatietijd niet langer zijn dan 15 minuten; Langere fixatietijden leidden tot een hogere achtergrondlabeling. De proteasestap werd geoptimaliseerd omdat weefsels van verschillende dikte en van verschillende organen verschillende soorten protease nodig hebben om permeabilisatie te bereiken. Vaste bevroren delen hechten minder aan glasplaatjes en komen gemakkelijker los tijdens het wassen. Daarom moet extra voorzichtig worden omgegaan met het manueel hanteren van vaste bevroren secties, om weefselverlies of beschadiging te voorkomen.
Hoewel we vonden dat de combinatie van FISH en IHC een effectieve strategie is, zijn de nadelen onder meer de kosten en technisch veeleisende tests bij het combineren van de twee methoden. Een beperking van de studie is dat er geen zij-aan-zij vergelijking van de twee weefselvoorbereidingsprotocollen is uitgevoerd. Ook werd onze evaluatie van de resultaten beperkt door het aantal kanalen dat de epifluorescentiemicroscoop kon herbergen; De opstelling liet maximaal 4 kanalen tegelijk toe: 346, 488, 550 en 647 nm (excitatielicht). We waren in staat om multiplex labeling van 5 doelen te bereiken door twee eiwitten met verschillende subcellulaire lokalisaties te labelen met behulp van dezelfde flurofoor (Figuur 4, Tabel 1). Door gebruik te maken van een confocale microscoop kan discrete excitatie van veel extra fluoroforen worden gebruikt voor individuele eiwitetikettering via IHC, of voor beeldvorming van fluorescerende moleculen die tot expressie worden gebracht door transgenen.
De combinatie van FISH en fluorescerend IHC kan de betrouwbaarheid van elke techniek afzonderlijk verminderen. In de toekomst willen we de cytoplasmatische eiwitetikettering op vers ingevroren weefsel verbeteren met een antigeenretrievalbehandeling23. Eerdere studies tonen aan dat door warmte geïnduceerde antigeenextractie de toegankelijkheid van het eiwitepitoop24,25,26 verhoogt. Warmtebehandeling splitst de crosslinks en methylolgroepen van het eiwit en ontvouwt de antigenen in weefsels, waardoor epitopen bloot komen te liggen die anders onder biologische omstandigheden verborgen zouden zijn in de tertiaire eiwitstructuur. Deze toegankelijkheid kan het succes van eiwitetikettering verbeteren26,27. Daarnaast zullen we ons richten op verschillende epitopen van hetzelfde cytoplasmatische eiwit om te bepalen of het succes van eiwit-antilichaametikettering afhangt van de specifieke antilichaamklonen die worden gebruikt.
Concluderend is de combinatie van FISH en IHC nuttig voor neurochemische identificatie van heterogene populaties van cellen in de hersenen, zoals die in de NTS. Deze studie presenteert twee protocollen die verschillende hersenstamweefselpreparaten van muizen testen - vers ingevroren of gefixeerd - voor gelijktijdige multiplex fluorescerende etikettering van mRNA en eiwitten in situ. Beide protocollen kunnen op grote schaal worden toegepast om het expressiepatroon van mRNA's met een lage abundantie, zoals GalR1, te detecteren. Dikke (30 μm) gefixeerde diepvriespreparaten gepermeabiliseerd met protease zorgden voor een betrouwbaardere cytoplasmatische eiwitdetectie en meer uitdagingen bij het hanteren van weefsel, in vergelijking met dunne (14 μm) vers ingevroren preparaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Australian Research Council Discovery Project-subsidie DP180101890 en Rebecca L Cooper Medical Research Foundation-projectsubsidie PG2018110
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A.
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
