Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å kombinere fluorescens in situ hybridisering (FISH) og fluorescens immunhistokjemi (IHC) i både ferske frosne og faste musehjerneseksjoner, med mål om å oppnå multilabel FISH og fluorescens IHC-signal. IHC målrettet cytoplasmatiske og membranfestede proteiner.
Abstract
Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) er en molekylær teknikk som identifiserer tilstedeværelsen og romlig fordeling av spesifikke RNA-transkripter i celler. Nevrokjemisk fenotyping av funksjonelt identifiserte nevroner krever vanligvis samtidig merking med flere antistoffer (målrettingsprotein) ved bruk av immunhistokjemi (IHC) og optimalisering av in situ hybridisering (rettet mot RNA), i tandem. En "nevrokjemisk signatur" for å karakterisere bestemte nevroner kan oppnås, men kompliserende faktorer inkluderer behovet for å verifisere FISH- og IHC-mål før man kombinerer metodene, og det begrensede antallet RNA og proteiner som kan målrettes samtidig innenfor samme vevsseksjon.
Her beskriver vi en protokoll, ved hjelp av både ferske frosne og faste musehjernepreparater, som oppdager flere mRNA og proteiner i samme hjerneseksjon ved hjelp av henholdsvis RNAscope FISH etterfulgt av fluorescensimmunfarging. Vi bruker den kombinerte metoden for å beskrive ekspresjonsmønsteret av mRNA med lav overflod (f.eks. galaninreseptor 1) og mRNA med høy mengde (f.eks. glycintransportør 2), i immunhistokjemisk identifiserte hjernestammekjerner.
Viktige hensyn for proteinmerking nedstrøms for FISH-analysen strekker seg utover vevspreparering og optimalisering av FISH-sondemerking. For eksempel fant vi at antistoffbinding og merkingsspesifisitet kan bli skadelig påvirket av proteasetrinnet i FISH-sondeanalysen. Proteaser katalyserer hydrolytisk spaltning av peptidbindinger, noe som letter FISH-sondens inntreden i celler, men de kan også fordøye proteinet som er målrettet av den påfølgende IHC-analysen, og produsere målbinding. Den subcellulære plasseringen av det målrettede proteinet er en annen faktor som bidrar til IHC-suksess etter FISH-sondeanalysen. Vi observerte at IHC-spesifisiteten ble beholdt når det målrettede proteinet er membranbundet, mens IHC-målretting mot cytoplasmatisk protein krevde omfattende feilsøking. Til slutt fant vi håndtering av glidemontert fast frosset vev mer utfordrende enn ferskt frosset vev, men IHC-kvaliteten var generelt bedre med fast frosset vev, kombinert med RNAscope.
Introduction
Proteiner og mRNA som nevrokjemisk definerer subpopulasjoner av nevroner, identifiseres ofte med en kombinasjon av henholdsvis immunhistokjemi (IHC) og/eller in situ-hybridisering (ISH). Å kombinere ISH med IHC-teknikker letter karakteriseringen av kolokaliseringsmønstre som er unike for funksjonelle nevroner (nevrokjemisk koding) ved å maksimere multiplex merkingskapasitet.
Fluorescerende ISH (FISH) metoder, inkludert RNAscope, har høyere sensitivitet og spesifisitet sammenlignet med tidligere RNA-deteksjonsmetoder som radioaktivt ISH og ikke-radioaktivt kromogent ISH. FISH muliggjør visualisering av enkle mRNA-transkripter som punktfargede flekker1. Videre tillater RNAscope-analysen et økt antall RNA-mål å bli merket om gangen, ved hjelp av forskjellige fluoroformerker. Til tross for disse fordelene kan tekniske begrensninger påvirke antall fluoroforer / kromogener som kan brukes i et enkelt eksperiment. Disse inkluderer tilgjengeligheten av mikroskopfiltersett; Slike hensyn forsterkes når nevrokjemisk identifikasjon bruker kombinert FISH og IHC, sammenlignet med å bruke hver teknikk isolert, siden iboende trinn som er optimale for en metode, kan være skadelige for den andre.
Tidligere anvendelse av FISH kombinert med IHC har vist uttrykk for spesifikke cellulære mål i humane B-celle lymfomer2, kyllingembryoer3, sebrafiskembryoer4, musenetthinne5 og muse indre øreceller6. I disse studiene var vevspreparering enten formalinfiksert parafin innebygd (FFPE)2,3,5 eller fersk helmontering 4,6. Andre studier brukte kromogent RNAscope på faste mus- og rottehjernepreparater 7,8,9. Spesielt Baleriola et al.8 beskrev to forskjellige vevspreparater for kombinert ISH-IHC; faste musehjerneseksjoner og FFPE-menneskelige hjerneseksjoner. I en nylig publikasjon kombinerte vi FISH og fluorescerende IHC på ferske frosne seksjoner, for samtidig å visualisere mRNA med lav overflod (galaninreseptor 1, GalR1), mRNA med høy mengde (glycintransportør 2, GlyT2) og vesikulær acetylkolintransportør (vAChT) protein10 i hjernestammens retikulære formasjon.
Kjernen i ensomhetskanalen (NTS) er en stor hjernegruppe involvert i autonom funksjon. Ligger i bakveien, mottar og integrerer denne heterogene populasjonen av nevroner et stort antall autonome signaler, inkludert de som regulerer pusten. NTS har flere nevronpopulasjoner, som kan være fenotypisk preget av ekspresjonsmønsteret til mRNA-mål, inkludert GalR1 og GlyT2 og proteinmarkører for enzymet tyrosinhydroksylase (TH) og transkripsjonsfaktoren Par-lignende homeobox 2b (Phox2b).
RNAscope-innehaveren anbefaler ferske frosne vevspreparater, men vev fremstilt ved heldyrs transkardiale perfusjonsfiksering, sammen med langvarig kryoproteksjon (lagring ved -20 °C) av faste frosne vevsseksjoner, er vanlig i mange laboratorier. Derfor søkte vi å etablere protokoller for FISH i kombinasjon med IHC ved bruk av ferske frosne og faste frosne vevspreparater. Her sørger vi for ferske frosne og faste frosne hjerneseksjoner: (1) en protokoll for kombinert FISH og fluorescerende IHC (2) en beskrivelse av kvaliteten på produsert mRNA og proteinmerking, ved bruk av hvert preparat (3) en beskrivelse av uttrykket av GalR1 og GlyT2 i NTS.
Vår studie viste at, kombinert med RNAscope-metodikk, varierte IHC-suksessen i ferske frosne og faste frosne preparater, og var avhengig av lokalisering av målproteinene i cellen. I våre hender var membranbundet proteinmerking alltid vellykket. IHC for cytoplasmatisk protein krevde derimot feilsøking selv i tilfeller der cytoplasmatisk protein ble overuttrykt i et transgent dyr (Phox2b-GFP)11. Til slutt, mens GalR1 uttrykkes i ikke-katekolaminerge nevroner i NTS, er GlyT2-uttrykk fraværende i NTS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Et sammendrag av trinnene i vevsforbehandling finnes i figur 1. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Animal Care and Ethics Committee ved University of New South Wales i samsvar med retningslinjene for bruk og pleie av dyr til vitenskapelige formål (Australian National Health and Medical Research Council).
1. Prøvepreparering av ferskt frosset hjernevev
- Transkardial perfusjon
- Forbered heparinisert (2500 U / L) 0,1 M fosfatbuffer (PB), pH 7,5. Lag tørris etanol slurry ved å blande tørris med etanol. Denne vil ha en temperatur på ca. -72 °C og vil bli brukt til umiddelbar frysing av det høstede vevet.
- Avlive voksne C57BL/6 og Phox2b-GFP11 (Mouse Genome Informatics database ID MGI:5776545) mus ved bedøvelse med natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p.), ved hjelp av en 27,5 tommers nålmåler.
FORSIKTIG: Pentobarbital er et barbiturat. Det er akutt giftig i høye doser og kan forårsake død ved åndedrettsstans. Rådfør deg med lokale retningslinjer for helsetjenester, juridiske og materielle sikkerhetsregler før bruk. - Eksponer hjertet og kanylere venstre ventrikkel med en opptrekksnål (23 tommers måler). Utfør transkardial perfusjon med heparinisert 0,1 M PB til blodet forsvinner (2-3 minutter) med en strømningshastighet på 11-13 ml / min. Bestem blodutskillelse ved å overvåke fargen på leveren og effusatet fra høyre atrium12.
- Isoler hjernen fra hodeskallen, legg den umiddelbart inn i Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) i en kryomold eller aluminiumsfolie og legg den på etanolbadet på tørrisen. Oppbevar det frosne innebygde vevet i en lufttett beholder ved - 80 °C i opptil 3 måneder.
- Snitting av ferskt frossent vev
- Sett kryostattemperaturen til -20 °C. La det OCT-innebygde vevet og en kryostatchuck ligge i kryostaten, i ~ 30 minutter for å tillate likevekt til den nye temperaturen.
NOTAT: Hold vevet frosset til enhver tid; transportere vevet fra -80 °C fryseren til kryostat på tørris. - Fest vevet til den forkjølte kryostatchucken ved hjelp av OCT-forbindelsen. I denne protokollen ble vevsblokker montert på chucken i koronalplanet.
MERK: Trim overflødig OCT fra vevet, ved hjelp av et barberblad, for å minimere mengden OCT som blir kuttet av kryostat og deretter overført til glassglasset. - Klipp 14 μm tykke koronale seksjoner og monter dem på ladede glassmikroskopilysbilder.
- Varm lysbildene til romtemperatur før du monterer seksjonene. Når seksjonen er montert, oppbevar lysbildene i en lysbildeboks i kryostaten.
- Hvis mer enn én seksjon må monteres på ett lysbilde, varmer du opp området for den andre delen ved å plassere en finger på motsatt side av lysbildet i 5-10 sekunder for å hjelpe seksjonen med å feste seg til lysbildet. En kald vevsseksjon vil ikke feste seg til et kaldt lysbilde. Seksjonene skal holde seg til lysbildene flate; Folding vil føre til at de faller av lysbildene under vasketrinn.
- Hvis du oppdager sprekker i seksjonene, øk kryostattemperaturen med 1-5 °C for å unngå dette. Det er spesielt viktig å plassere vevssnitt i nærheten av hverandre på samme lysbilde. Dette vil forhindre svinn av FISH-prober og reagenser under analysen.
- Oppbevar vevsseksjoner montert på glassglass i en lufttett beholder ved -80 °C i opptil 6 måneder.
MERK: Hold seksjonene frosset til enhver tid og unngå fryse-tinesykluser for å forhindre RNA-nedbrytning. Transporter glideboksen fra innsiden av kryostaten, til -80 °C fryseren på tørris.
- Sett kryostattemperaturen til -20 °C. La det OCT-innebygde vevet og en kryostatchuck ligge i kryostaten, i ~ 30 minutter for å tillate likevekt til den nye temperaturen.
- Fiksering av ferskt frosset vev
- Den dagen FISH-sondeanalysen skal utføres, tilberedes 4 % paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB, pH 7,5 (4 % PFA-løsning). Filtrer ved å føre gjennom filterpapir (grad 1: 11 μm, materialfortegnelse) i en Buchnertrakt eller digelfilter.
FORSIKTIG: PFA er skadelig og giftig ved hudkontakt eller innånding. Alle prosedyrer med PFA-løsning skal utføres i et avtrekkshetteskap. Avfall fra PFA-løsninger skal kastes nøye i henhold til institusjonelle sikkerhetsprotokoller. - Avkjøl 4 % PFA-oppløsningen til 4 °C. Transporter det glidemonterte vevet fra fryseren ved -80 °C i tørris og senk det umiddelbart i det forkjølte fiksativet i 15 minutter.
MERK: Det er viktig at dette fikseringstrinnet ikke overstiger 15 minutter, da overfiksering vil resultere i ikke-spesifikk bakgrunnsmerking.
- Den dagen FISH-sondeanalysen skal utføres, tilberedes 4 % paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PB, pH 7,5 (4 % PFA-løsning). Filtrer ved å føre gjennom filterpapir (grad 1: 11 μm, materialfortegnelse) i en Buchnertrakt eller digelfilter.
- Dehydrering av ferskt frosset vev
- Dehydrer vevssnitt ved å senke lysbildene i graderte konsentrasjoner av etanol. I en Coplin krukke, senk først i 50%, deretter 70% og til slutt absolutt etanol, i 5 minutter hver ved romtemperatur. Gjenta den endelige absolutte etanolikubasjonen en gang til.
- Lufttørre sklier og skissere gruppen av seksjoner ved hjelp av en hydrofob barrierepenn, slik at det indre området holdes på et minimum.
NOTAT: Forsikre deg om at glassglasset er helt tørt før du tegner den hydrofobe barrieren. Den hydrofobe barrieren skal omgi vevsseksjonene helt uten hull og må være tørr før videre behandling.
2. Prøvepreparering av fast frosset hjernevev
- Transkardial perfusjonsfiksering
- Avlive mus ved bedøvelse med natriumpentobarbital (70 mg/kg, i.p) etterfulgt av transkardial perfusjon, først med 0.1 M PB deretter 4% PFA-løsning. Fiks med 10 minutters perfusjon ved 11-13 ml / min.
- Isoler hjernen fra skallehulen etter perfusjonsfiksering og senk ned over natten i 4 % PFA-oppløsning ved 4 °C.
- Vevssnitt av fiksert vev
- Skyll hjernen i sterilt 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS) før du fjerner meningeallagene, ved hjelp av et dissekerende mikroskop, ved hjelp av fine tang.
- Skjær hjernen nøyaktig i blokker (separer hjernestammen fra forhjernen før vibratomsnitt) ved hjelp av en hjernematrise (materialfortegnelse). Nærmere bestemt, kutt hjernestammen kaudalt ved pyramidal decussation og dissekere bort cerebellum. På samme måte kutter du forhjernen umiddelbart rostral til optisk chiasme.
- Fest vevet på en vibrerende mikrotome chuck ved hjelp av cyanoakrylat og legg inn i 2% agaroppløsning.
- Skjær 30 μm tykke vevsseksjoner ved hjelp av en vibrerende mikrotome og lagre kuttseksjoner i kryobeskyttelsesmiddelløsning (30% RNasefri sukrose, 30% etylenglykol, 1% polyvinylpyrrolidon (PVP-40), i 0,1 M PB, pH 7,4). Vevssnitt kan oppbevares i kryobeskyttelsesmiddel ved -20 °C i opptil 6 måneder.
- Klargjøring av faste seksjoner før FISH
- På dagen for FISH, vask frittflytende seksjoner tre ganger, i 10 minutter per vask, for å fjerne kryobeskyttelsesmiddelløsningen. For å vaske, plasser seksjoner i 0,1 M PBS i en 12-brønns cellekulturplate og beveg på en roterende plattformrister (90 - 100 o / min).
- Etter vask, bruk en pensel til å montere seksjoner på glassmikroskopiglass og lufttørke i minst 2 timer.
MERK: Seksjonene skal feste seg flatt på lysbildene, da eventuelle markerte folder vil føre til at de løsner under vask. - Bruk en hydrofob barrierepenn til å tegne en barriere rundt seksjonene for å begrense FISH-reagensene til seksjonene. Nok en gang er det viktig å minimere det indre området av omrisset tegnet med barrierepennen.
MULIG KNEKKPUNKT: Seksjonene kunne oppbevares i romtemperatur, over natten, for å fortsette analysen neste dag.
3. FISK analyse
MERK: Resten av protokollen gjelder både ferskt frosset og fast frosset vev.
- Forbered reagensene og instrumentene for hybridiserings- og forsterkningstrinn.
- Sett en benkekuvøse og vannbad til 40 °C.
- Forbered et fuktet, lysbeskyttet kammer for inkubering av lysbilder. Fuktighet forhindrer tørking av vev - lysbildene er sikkert plassert over et fuktig reservoar. Ideelt sett er kammeret laget av kraftig polystyren, det er lysttett og lufttett for å opprettholde en mettet vanndampatmosfære. Lukking av kammeret er avhengig av minimal friksjon for å unngå bevegelse. Vi brukte en glideboks foret med våtservietter (materialfortegnelse) nederst. Plasser glideboksen inne i inkubatoren for å forvarme den til 40 °C.
- Varm 50x vaskebuffer (materialfortegnelse) og sonder til 40 °C i 10 minutter, bruk vannbadet, avkjøl deretter til romtemperatur.
- Forbered 1 l 1x vaskebuffer fra 50x lagerkonsentrasjon.
- Forbered sondeblanding (materialfortegnelse): C1-sonden er klar til bruk ved lagerkonsentrasjon, mens C2- og C3-sonder sendes som 50x konsentrasjon og krever fortynning med fortynningsmiddelet som følger med i settet.
MERK: Sondeblandinger kan oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.
- Protease-behandling
- Inkuber seksjoner med Protease III (materialfortegnelse) ved romtemperatur i 30 minutter.
MERK: Sørg for at Protease III og inkubasjonsreagenser i nedstrømsprosesser (sondeblanding, amplifikasjonsløsninger, blokkeringsbuffer og antistoffsera) dekker seksjonene helt. En pipetspiss kan brukes til å spre reagenset på seksjonen for å dekke hele området inne i den hydrofobe barrieren. - Vask lysbildene to ganger med 0,1 M PBS, i 2 min hver gang, i en stor plastfirkantet petriskål. Her ble det brukt en 245 mm x 245 mm firkantet bioassay-tallerken (Table of Materials). Hold fra den ene siden av fatet og vipp forsiktig 3-5 ganger. Etter vask, flikk overflødig 0,1 M PBS fra lysbildet og tilsett umiddelbart neste reagens. Ikke la vevsseksjoner tørke.
NOTAT: Under hver vask blir lysbildene nedsenket i oppløsning ved romtemperatur. Dette er arbeidsflyten for alle påfølgende vasketrinn. De faste 30 μm tykke seksjonene løsner lettere fra lysbilder enn 14 μm tykke seksjoner, vær forsiktig under vaskene.
- Inkuber seksjoner med Protease III (materialfortegnelse) ved romtemperatur i 30 minutter.
- Hybridisering og forsterkning
- Etter å ha vasket av proteaseoppløsningen, plasser lysbildene i det fuktige, forvarmede kammeret. Inkuber seksjoner med sondeblanding (materialfortegnelse) i 2 timer ved 40 °C inne i en stasjonær inkubator.
MERK: Sørg for at det er satt av minst 2 seksjoner for positive og negative kontrollprober for å vurdere prøve-RNA-kvalitet og optimal permeabilisering. Positive kontrollprober retter seg mot husholdningsgener; her var disse en cocktail av RNA rettet mot ubiquitin C (UBC; høy overflod), peptidylpropylisomerase B (PPIB; moderat overflod) og RNA-polymerase 2a (POLR2A; lav overflod). Negative kontrollprober retter seg mot det bakterielle 4-hydroksy-tetrahydrodipicolinate reduktase (DapB) -genet, som normalt er fraværende i musehjerneprøver. Positivt DapB-signal indikerer uspesifikt signal og/eller bakteriell kontaminering av prøven. - Etter hybridisering med sondeblandingen består signalforsterkningstrinnene av inkubasjon med Amp 1-FL (30 minutter), deretter med Amp 2-FL (15 minutter), etterfulgt av Amp 3-FL (30 minutter) og til slutt Amp 4-FL (15 minutter) - hver ved 40 °C. Bruk dråpeflaskene som følger med, dekk vevsseksjoner med amplifikasjonsløsning. Fortsett til IHC-analysen etter det siste forsterkningstrinnet.
- Skyll glidene med vaskebuffer to ganger i 2 minutter mellom sondehybridisering og hvert forsterkningstrinn.
- Etter å ha vasket av proteaseoppløsningen, plasser lysbildene i det fuktige, forvarmede kammeret. Inkuber seksjoner med sondeblanding (materialfortegnelse) i 2 timer ved 40 °C inne i en stasjonær inkubator.
4. IHC-analyse
- Trinnet for IHC-blokkering
- For å forhindre uspesifikk binding av antistoffer, inkuber seksjonene i 1 time ved romtemperatur med blokkeringsoppløsning inneholdende 10% normalt hesteserum, 0,3% Tween20 i 1x TBSm (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% mertiolat) etter FISH-analysen. Klargjør primære antistoffer i en fortynningsbuffer som inneholder 1x TBSm, 5 % normalt hesteserum og 0,1 % Tween20. Leverandører av primære antistoffer er oppført i materialfortegnelsen.
- Immunhistokjemi
- Fjern overflødig blokkeringsbuffer ved å flikke på lysbildet og inkuber seksjoner med primære antistoffer over natten ved 4 °C.
- Vask lysbildene 3 ganger (5 minutter hver) med 1x TBSm og inkuber med sekundært antistoff i fortynningsmiddel som inneholder 1x TBSm, 1% normalt hesteserum og 0,1% Tween20 i 2 timer ved romtemperatur. Sekundære antistoffer som brukes i denne protokollen er oppført i materialfortegnelsen.
- Vask slides 3 ganger med 1x TBSm (5 minutter hver) før du dekker med monteringsmedium med eller uten DAPI (Table of Materials).
5. Bildebehandling
- Undersøk immunfarging under et epifluorescensmikroskop utstyrt med et kamera (se materialfortegnelse for detaljer). Skaff representative bilder ved 20x forstørrelse og lagre som TIFF-filer.
- Eksporter representative bilder til et bildebehandlingsprogram (materialfortegnelse) for justering av lysstyrke/kontrast for å øke klarheten og gjenspeile sann gjengivelse.
6. VALGFRITT: Kvantitativ analyse av måltranskripsjoner
MERK: Dette er en metodeartikkel og kvantitative resultater er ikke gitt. Kvantifiseringsmetoden som presenteres her er hentet fra Dereli et al.10.
- Ta bilder fra interesseområdene som forklart i 5.1, og bruk de samme mikroskop- og kamerainnstillingene (for eksempel eksponeringstid og lysintensitet) på alle bilder av samme fluorofor.
- Plott nevronprofilene ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare (Table of Materials).
- Juster seksjonene med referanse til Bregma-nivå i henhold til et stereotaktisk hjerneatlas13.
- Bruk samme lysstyrke og kontrast på alle bildene av samme fluorofor. Tenk bare på nevronene med DAPI-fargede kjerner.
- Tell manuelt antall mRNA, proteinuttrykkende, mRNA / mRNA, protein / protein og mRNA / protein som uttrykker celler innenfor interesseområdet.
- For å redusere skjevhet i eksperimentelle resultater, må personen kvantifisere eksperimentelle utfall blindet for eksperimentelle grupper.
- Bruk Abercrombie-korreksjon14 på totalt antall celler ved å bruke følgende Abercombie-formel:
Korrigert celletall = manuell celletelling x seksjonstykkelse / (seksjonstykkelse + nukleær størrelse)
For eksempel, for 14 μm tykke seksjoner, er gjennomsnittlig kjernefysisk bredde beregnet til å være 7, 7 ± 0, 3 μm og gjennomsnittlig seksjonstykkelse er 14 ± 1 μm basert på henholdsvis 30 celler og 10 seksjoner i 5 dyr10. Ifølge Abercrombie-ligningen vil korrigert celletall være manuell celletelling x 14/(14+7,7).
Figur 1 Parallell arbeidsflyt av vevsforbehandlingstrinn for både ferskfryst og paraformaldehydfiksert vev. Behandlingstrinn for ferskfrosset vev vises i de røde skisserte boksene, mens trinnene for paraformaldehyd (PFA) fast vev vises i de blå skisserte boksene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammendrag av kombinert FISH-sonde og immunhistokjemisk prosedyre. Etter vevsforbehandling omkranses det glidemonterte vevet ved hjelp av en hydrofob barrierepenn, som vist i den første rammen, og inkuberes i en proteaseløsning ved romtemperatur. Etter vask overføres vev til en stasjonær inkubator for hybridisering i 2 timer før sekvensielle amplifikasjonstrinn. In situ hybridiseringssystemet benytter en proprietær 'Z probe' design, forforsterkere og forsterkere som sett i rammene 3-66. Når vevet har gjennomgått FISH-sondebehandling, vaskes det før det blokkeres med vanlig hesteserum. Den primære antistoffinkubasjonen utføres over natten ved 4 °C for å maksimere antistoff-antigenbindingen. Den sekundære antistoffinkubasjonen (2 timer) ble utført ved romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her skisserer vi en metode for å kombinere multiplex FISH med fluorescerende IHC for å lokalisere mRNA-uttrykk for GalR1 og GlyT2 ved bruk av henholdsvis ferskfrosset og paraformaldehydfiksert vev i musens NTS. En pipeline av vevsprosesserings-, FISH- og IHC-prosedyrene beskrevet i metodene er vist i figur 1 og figur 2. Tabell 1 gir et sammendrag av FISH-sonden og antistoffkombinasjonene som er brukt i hver figur.
Kontrollsonder analyseres rutinemessig samtidig med målsonden for å sikre integriteten til arbeidsflyten og bekrefte prøvekvaliteten. Fravær av DapB-merking bekrefter lydvevets kvalitet og integritet, og fravær av bakteriell forurensning (figur 3A). Merking fra positive kontrollprober rettet mot ubiquitin C (UBC, høy forekomst), peptidylpropylisomerase B (PPIB, moderat mengde) og RNA-polymerase 2a (POLR2A, lav overflod) mRNA bekrefter RNA-integritet, og signalet observert mellom analysene kan brukes til å kalibrere variasjonen mellom analysene (figur 3B). For å validere FISH-probeuttrykk brukte vi kontrollvev som tidligere er beskrevet for å uttrykke mRNA-transkriptet. For eksempel ble GalR1 mRNA-uttrykk bekreftet å være positiv i thalamus som tidligere beskrevet10,15. Phox2b mRNA-distribusjon ble i tillegg verifisert ved samtidig merking med Phox2b antistoff; vi bekreftet at FISH-merking kun fantes i nevroner som også var positivt farget med Phox2b-antistoffet (figur 5).
For å skille GalR1+-nevroner i NTS fra nabokjerner brukte vi flere nevrokjemiske markører. TH, Phox2b eller Phox2b-GFP immunoreaktivitet (figur 4-6) og Phox2b FISH (figur 5 og figur 6) differensierte NTS fra andre kjerner i dorsalhjernestammen da NTS-nevroner tidligere har blitt rapportert å uttrykke Phox2b og TH 16,17. Siden NTS ligger ved kolinerge kjerner - den ligger dorsalt til den hypoglossale kjernen og den dorsale motorkjernen i vagus (DMNX), og ventral til den vestibulære kjernen - merket vi sammen med den kolinerge markøren vAChT18 (figur 4). Derfor ble uttrykket av GalR1 i NTS vurdert i forhold til TH og Phox2b, mens vAChT-merking hjalp romlig orientering med hensyn til rostrokaudale, dorsoventrale og mediolaterale koordinater. Vi fant at alle TH-immunoreaktive og GalR1 mRNA-positive nevroner i NTS var Phox2b-GFP immunoreaktive, men ikke alle Phox2b-GFP immunoreaktive nevroner i NTS var TH-immunoreaktive eller GalR1 mRNA-positive (figur 4). Vi viste også at mRNA for den lave overflodsreseptoren GalR1 var fraværende i TH og vAChT immunoreaktive nevroner.
I ferske frosne preparater, kombinert med FISH-sondeanalysen, var IHC-suksess avhengig av subcellulær lokalisering av målproteinet. For eksempel var vAChT (et synaptisk vesikkelmembranbundet protein) tydelig immunmerket, mens TH og GFP (cytoplasmatiske proteiner) var immunmerket på ubestemt tid og bare svakt observert (figur 4). Vi beskriver denne ubestemte merkingen som "flokkulent" fordi cellene manglet et klart omriss og viste seg vanskelig å skille fra bakgrunnen. På samme ferske frysevevssnitt var GalR1 FISH-sondemerking av cytoplasmatisk GalR1 mRNA punktert og tydelig observert (figur 4).
Videre, siden TH- og vAChT-antistoffene er hevet i samme vert, ble begge proteinene merket med samme sekundære antistoff og derfor samme fargefluorofor (eksitasjonslys: 594). De er enkle å skille mellom av to grunner: de merker aldri sammen i de samme nevronene, og den subcellulære lokaliseringen er forskjellig for disse proteinene; vAChT i vesikler som viser et punktert utseende, og TH i cytoplasma og nevronale prosesser.
For å støtte vår hypotese om at IHC-kvalitet (i ferske frosne preparater) er avhengig av subcellulær proteinlokalisering, sammenlignet vi merking for Phox2b mRNA (lokalisert i cytoplasma), GFP (overuttrykt i cytoplasma) og Phox2b-protein (hovedsakelig funnet i kjernen) i nevroner. Som forventet viser resultatene overlapp mellom Phox2b mRNA, GFP og Phox2b antistoffmerking i individuelle nevroner i NTS (figur 5). Celler med cytoplasmatisk mRNA-merking korresponderte med celler med nukleær merking av Phox2b-proteinet som ga validering av den kombinerte FISH-IHC-metoden. Selv om cytoplasmatisk Phox2b-GFP hadde et flokkulent utseende, var nukleært Phox2b-proteinsignal klart og spesifikt. Konklusjonen, når de kombineres med FISH på ferske frosne preparater, viser membranbundne proteiner, inkludert vAChT og Phox2B, immunmerking av høyere kvalitet enn cytoplasmatiske proteiner.
IHC var derimot pålitelig uavhengig av subcellulær lokalisasjon, når den ble utført på faste fryste seksjoner i kombinasjon med FISH. Multiplex FISH for GlyT2 mRNA og Phox2b mRNA var vellykket, som vist i figur 6. GlyT2 mRNA-positive nevroner var lokalisert ventrale til NTS og ikke innenfor NTS. GlyT2+- og Phox2b+-nevroner kolokaliserte ikke. En underpopulasjon av Phox2b+ NTS-nevroner var TH-immunoreaktive og ingen inneholdt GlyT2 mRNA. TH-immunreaktive nevroner er synlige på samme vevssnitt, og viser positivt merkede soma- og nevronprosesser (figur 6). Dette står i kontrast til det "flokkulente" utseendet til TH-immunoreaktive nevroner i ferske frosne vevsseksjoner. Dermed er det faste frosne preparatet beskrevet her en alternativ metode for vevspreparasjon som muliggjør pålitelig målretting av cytoplasmatiske proteiner immunhistokjemisk, i kombinasjon med RNAscope.
Figur 3 Representative mikroskopiske bilder fra koronale forhjernesnitt fra koronal mus i nivå med lateral septum (Bregma 1.1 til -0.1) som viser merking av positive og negative kontrollprober. (A) Mangel på signal etter ISH med bakteriell 4-hydroksy-tetrahydrodipicolinate reduktase (DapB) bekrefter fraværet av bakgrunnssignaler. (B) Merking med positive kontrollprober rettet mot ubiquitin C (UBC), peptidylpropylisomerase B (PPIB) og RNA-polymerase 2a (POLR2A) illustrerer signalet som kan forventes fra henholdsvis høye, moderate og lave mengdemål. Skalastenger er 50 μm. Alle bildene ble anskaffet med 20x objektiv. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative mikroskopiske bilder av et ferskt frossent koronalt hjernestammesnitt fra en Phox2b-GFP-mus som viser kombinert merking av GalR1 mRNA (FISH) og 3 proteiner (IHC) i kjernen i solitærkanalen (NTS) regionen. Innsatser i A er forstørret i B. GalR1 mRNA er indikert med punktert FISH-sondemerking (pilspisser). Antistoffer rettet mot de cytoplasmatiske proteinene GFP og tyrosinhydroksylase (TH) viste "flokkulent" merking (piler). Vesikulær acetylkolintransportør (vAChT) immunoreaktivitet er påvist (rød punktatmerking) i hypoglossalkjernen (XII). Skalastenger er 100 μm i A og 25 μm i B. Alle bildene ble anskaffet med 20x objektiv. Andre forkortelser: area postrema (AP), mediale vestibulære kjernen (MVe). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative mikroskopiske bilder av et ferskt frossent koronalt hjernestammesnitt fra en Phox2b-GFP-mus, som illustrerer målretting av Phox2b i kjernen i ensomhetskanalen (NTS) med tre ulike tilnærminger: Phox2b mRNA (FISH), GFP (IHC) og Phox2b protein (IHC). Phox2b protein er lokalisert til kjernen. Innsatser i A er forstørret i B. Piler indikerer nevroner som er trippelmerket med Phox2b-sonde (oransje-550), GFP-antistoff (grønn-488) og Phox2b-antistoff (rød-647). Skalastenger er 100 μm i A og 25 μm i B. Alle bilder er anskaffet med et 20x mål. Andre forkortelser: area postrema (AP). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative bilder fra faste frosne koronale hjernestammesnitt som viser vellykket FISH kombinert med pålitelig immunmerking av cytoplasmatiske proteiner (tyrosinhydroksylase [TH]). Dobbel FISH som viser glycintransportør 2 (GlyT2-rød-647, fylte pilspisser) og Phox2b (gul-550, piler) mRNA-merking i kjernen i Solitary Tract (NTS) -regionen. FISH ble kombinert med IHC for TH-protein (blå-346, tomme pilspisser). Innsatser i A forstørres i B. Skalastenger er 25 μm. Alle bildene ble anskaffet med et 20x mål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primær antistoff eller RNAscope-sonde | Sekundært antistoff eller Amp 4-FL-Alt skjermmodul |
Eksitasjon (nm) | Vev forberedelse | ||
| Figur 3 | sonde | POLR2A (C1) | Amp 4-FL-Alt B-skjermmodul | 647 | fersk frossen |
| sonde | PPIB (C2) | Amp 4-FL-Alt B-skjermmodul | 488 | ||
| sonde | UBC (C3) | Amp 4-FL-Alt B-skjermmodul | 550 | ||
| sonde | DapB (C1, C2, C3) | Amp 4-FL-Alt B-skjermmodul | 647, 488, 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 4 | antistoff | kanin-anti-GFP | esel-anti-kanin | 488 | fersk frossen |
| antistoff | sau-anti-TH | esel-anti-sau | 647 | ||
| antistoff | geit-anti-vAChT | esel-anti-geit | 647 | ||
| sonde | GalR1 (C1) | Amp 4-FL-Alt B-skjermmodul | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 5 | antistoff | kanin-anti-GFP | esel-anti-kanin | 488 | fersk frossen |
| antistoff | mus-anti-Phox2b | esel-anti-mus | 647 | ||
| sonde | Phox2b (C2) | Amp 4-FL-Alt A-skjermmodul | 550 | ||
| DAPI | 346 | ||||
| Figur 6 | antistoff | mus-anti-TH | esel-anti-mus | 346 | fast |
| sonde | GlyT2 | Amp 4-FL-Alt A-skjermmodul | 647 | ||
| sonde | Phox2b | Amp 4-FL-Alt A-skjermmodul | 550 |
Tabell 1: FISH-sonde, antistoff og tilsvarende fluroforkombinasjoner brukt i figur 3-6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I nevrovitenskapen brukes FISH og IHC rutinemessig til å undersøke den romlige organisasjonen og funksjonelle betydningen av mRNA eller proteiner i nevronale subpopulasjoner. Protokollen beskrevet i denne studien øker kapasiteten for samtidig påvisning av mRNA og proteiner i hjerneseksjoner. Vår kombinerte multiplex FISH-IHC-analyse muliggjorde fenotypisk identifisering av distinkte nevronale subpopulasjoner i NTS i både ferske frosne og faste hjernepreparater. FISH-IHC i faste frosne vevspreparater ga pålitelige IHC-resultater. For eksempel viste multiplex FISH for mRNA med lav og høy overflod (henholdsvis GalR1 og GlyT2) og IHC (rettet mot tyrosinhydroksylase) at GalR1 og GlyT2 uttrykkes i ikke-katekolaminerge NTS-nevroner. IHC for TH var ikke vellykket i ferskt frosset vev, noe som fremhever den begrensede kapasiteten for FISH-IHC i ferske frosne preparater.
ISH kan være mer hensiktsmessig enn IHC i en rekke scenarier. For det første kan IHC ikke fungere bra når det oppdages proteiner med lav overflod, for eksempel reseptorer. Bruk av ISH for å målrette relativt høyere overflod mRNA for disse proteinene forbedrer detekterbarheten1. For det andre blir proteiner som nevropeptider ofte smuglet til aksonale terminaler etter oversettelse i cellen soma19. Når nevropeptider er målrettet med IHC, merker de aksonale prosessene og terminalene av celler med antistoffet, men ikke soma, noe som reduserer kapasiteten til å identifisere opprinnelsescellen eller utføre kvantitativ analyse av antall celler. Men siden mRNA som koder for alle proteiner finnes lokalisert til soma, er ISH-teknikken fordelaktig. Endelig er antistoffer ikke lett tilgjengelige for noen proteinarter, eller de tilgjengelige antistoffene er passende for andre proteomikkteknikker (f.eks. Western blot), men ikke IHC. Under disse omstendighetene viser mRNA-merkingsmetoder seg nyttige. En advarsel er at mRNA ikke alltid kan oversettes til protein, og derfor gir de bare en proxy for proteinidentifikasjon. Siden kommersielle FISH-sett kan være kostbare og det er mindre sannsynlig at ISH-sondene er kommersielt tilgjengelige sammenlignet med antistoffer, gir kombinasjon av FISH med IHC en kostnadseffektiv og tidseffektiv strategi for å øke antall mål som kan merkes samtidig.
Fersk frossen versus fast vevspreparering var en faktor som ga vellykket IHC etter FISH-sondeanalysen. Vi testet IHC ved hjelp av antistoffer rettet mot kjernefysiske, vesikulære og cytoplasmatiske proteiner og fant pålitelig merking av membranbundne proteiner (vAChT og Phox2b) på ferske frosne prøver, men ikke cytoplasmatiske proteiner (TH og GFP). Koekspresjon av Phox2b-protein og mRNA med "flokkulent" Phox2b-GFP-merking validerte at nevroner som uttrykker transkripsjonen også uttrykte det relaterte proteinet, og bekreftet nevronenes nevrokemiske identitet (figur 5). I motsetning til dette ga faste frosne vevspreparater pålitelig IHC-merking uavhengig av subcellulær lokalisering av antigenet. Tidligere studier har vist at protease (f.eks. pronase 8,20) forbehandling kan ha en skadelig effekt på IHC. Innholdet i proteaseløsningen som brukes i RNAscope-protokollen er proprietær, og permeabilisering ved protease anbefales for RNAscope-sondetilgang til celler. Merking av cytoplasmatiske proteiner ved bruk av antistoffene beskrevet her er tidligere verifisert på frittflytende 30 μm faste frosne musehjerneseksjoner 10,21,22. Vi skyvemonterte 30 μm tykke faste prøver og utførte FISH-IHC-protokollen, i motsetning til de 14 μm tykke ferske frosne seksjonene som anbefales av produsenten. I fravær av analysemodifikasjoner eller endring av andre variabler (antigenuthenting, høyere antistoffkonsentrasjon, endring av protease) ble pålitelig IHC oppnådd på tykke, faste prøver med demonstrert merking av cytoplasma og aksonale prosesser sammen med FISH-sondemerking (figur 6). Mens lignende tilnærminger ble brukt av andre forskningsgrupper 7,8,9, oppnådde den nåværende studien kombinert ISH-IHC på nevroner og i et fluorescerende oppsett.
Det var en rekke kritiske skritt i metodene å merke seg. For det ferske frosne preparatet bør fikseringstiden ikke overstige 15 minutter; Lengre fikseringstid fremkalte høyere bakgrunnsmerking. Protease-trinnet ble optimalisert siden vev av forskjellig tykkelse og fra forskjellige organer krever forskjellige typer protease for å oppnå permeabilisering. Faste frosne seksjoner fester seg mindre til glassglass og løsner lettere under vasketrinn. Derfor må det utvises ekstra forsiktighet ved manuell håndtering av faste frosne seksjoner, for å unngå vevstap eller skade.
Selv om vi fant kombinert FISH og IHC å være en effektiv strategi, inkluderer ulempene kostnad og teknisk krevende analyse når man kombinerer de to metodene. En begrensning ved studien er at en side-ved-side-sammenligning av de to vevsprepareringsprotokollene ikke ble utført. Vår evaluering av resultatene var også begrenset av antall kanaler det epifluorescerende mikroskopet kunne romme; Oppsettet tillot maksimalt 4 kanaler på et gitt tidspunkt: 346, 488, 550 og 647 nm (eksitasjonslys). Vi var i stand til å oppnå multipleksmerking av 5 mål ved å merke to proteiner med forskjellige subcellulære lokaliseringer ved bruk av samme fluropfor (figur 4, tabell 1). Ved å bruke et konfokalmikroskop kan diskret eksitasjon av mange ekstra fluoroforer brukes til individuell proteinmerking via IHC, eller for avbildning av fluorescerende molekyler uttrykt av transgener.
Kombinert FISH og fluorescerende IHC kan redusere påliteligheten til hver teknikk isolert. I fremtiden tar vi sikte på å forbedre cytoplasmatisk proteinmerking på ferskt frosset vev med antigenuthentingsbehandling23. Tidligere studier viser at varmeindusert antigenuthenting øker tilgjengeligheten til proteinepitopen24,25,26. Varmebehandling spalter tverrbindingene og metylolgruppene av proteinet og utfolder antigenene i vev, og eksponerer epitoper som ellers ville være skjult i den tertiære proteinstrukturen under biologiske forhold. Denne tilgjengeligheten kan gjøre proteinmerkingen bedre26,27. I tillegg vil vi målrette mot forskjellige epitoper av det samme cytoplasmatiske proteinet for å avgjøre om suksessen til protein-antistoffmerking avhenger av de spesifikke antistoffklonene som brukes.
Avslutningsvis er kombinert FISH og IHC nyttig for nevrokjemisk identifisering av heterogene populasjoner av celler i hjernen, som de i NTS. Denne studien presenterer to protokoller som analyserer forskjellige musehjernestammevevspreparater - fersk frosset eller fast - for samtidig multiplex fluorescerende merking av mRNA og proteiner in situ. Begge protokollene kan brukes mye for å oppdage uttrykksmønsteret til mRNA med lav overflod, for eksempel GalR1. Tykke (30 μm) faste frosne preparater permeabilisert med protease ga mer pålitelig cytoplasmatisk proteindeteksjon og flere vevshåndteringsutfordringer, sammenlignet med tynne (14 μm) ferske frosne preparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Australian Research Council Discovery Project grant DP180101890 og Rebecca L Cooper Medical Research Foundation prosjektstipend PG2018110
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANIMALS | |||
| C57BL/6 mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 2159769 | |
| Phox2b-eGFP mouse | Australian BioResources, Moss Vale | MGI: 5776545 | |
| REAGENTS | |||
| Cyanoacrylate | Loctite | ||
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Heparin-Sodium | Clifford Hallam Healthcare | 1070760 | Consult local veterinary supplier or pharmacy. |
| Lethabarb (Sodium Pentabarbitol) Euthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | N/A | Consult a veterinarian for local pharmaceutical regulations regarding Sodium Pentabarbitol |
| Molecular grade agarose powder | Sigma Aldrich | 5077 | |
| OCT Compound, 118mL | Scigen Ltd | 4586 | |
| Paraformaldehyde, prilled, 95% | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidone, average mol wt 40,000 (PVP-40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | With or without DAPI |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (up to 3-plex capability) | Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio) | ADV320850 | Includes 50x Wash buffer and Protease III |
| RNase Away | Thermo-Fisher Scientific | 7003 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Tween-20, for molecular biology | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop incubator | Thermoline scientific micro incubator | Model: TEI-13G | |
| Brain Matrix, Mouse, 30g Adult, Coronal, 1mm | Ted Pella | 15050 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Drawing-up needle (23 inch gauge) | BD | 0288U07 | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector labs | H-4000 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes | Kimberley Clark Professional | 34120 | |
| Olympus BX51 | Olympus | BX-51 | |
| Peristaltic pump | Coleparmer Masterflex | L/S Series | |
| Retiga 2000R Digital Camera | QImaging | RET-2000R-F-CLR | colour camera |
| SuperFrost Plus Glass Slides (White) | Thermo-Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| Vibrating Microtome (Vibratome) | Leica | VT1200S | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1, 110 mm diameter | Merck | WHA1001110 | |
| SOFTWARES | |||
| CorelDRAW | Corel Corporation | Version 7 | |
| FIJI (ImageJ Distribution) | Open Source/GNU General Public Licence (GPL) | N/A | ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z and Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: an open-source platform for biological-image analysis", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 |
| PRIMARY ANTIBODIES | |||
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Millipore Sigma | AB1542 | Sheep polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_90755 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody, clone LNC1 | Millipore Sigma | MAB318 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2201528 |
| Anti-Vesicular Acetylcholine Transporter (VAchT) Antibody | Sigma-Aldrich | ABN100 | Goat polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2630394 |
| GFP Antibody | Novus Biologicals | NB600-308 | Rabbit polyclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_10003058 |
| Phox2b Antibody (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | Mouse monoclonal (1:1000 dilution), RRID: AB_2813765 |
| SECONDARY ANTIBODIES | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | Donkey anti-Rabbit (1:400 dilution), RRID: AB_2313584 |
| AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-155-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_AB_2340725 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | Donkey anti-Goat (1:400 dilution), RRID: AB_2340415 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | Donkey anti-Mouse (1:400 dilution), RRID: AB_2619678 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot) | Jackson ImmunoResearch | 713-175-147 | Donkey anti-Sheep (1:400 dilution), RRID: AB_2340730 |
| RNASCOPE PROBES | |||
| Galanin Receptor 1 oligonucleotide probe | ACDBio | 448821-C1 | targets bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2) |
| Glycine transporter 2 oligonucleotide probe | ACDBio | 409741-C3 | targets bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3) |
| Phox2b oligonucleotide probe | ACDBio | 407861-C2 | targets bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3) |
References
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Annese, T., et al. RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas. Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).
- Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method. Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, 55 (2014).
- Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina. Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS One. 10 (3), 0120120 (2015).
- Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (100), e52799 (2015).
- Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
- Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN. Frontiers in Neuroscience. 13, 1343 (2019).
- Lazarenko, R. M., et al. Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice. Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
- Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).
- Kerr, N., et al. The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2. Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).
- Kachidian, P., Pickel, V. M. Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat. Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).
- Stornetta, R. L., et al. Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).
- Gilmor, M. L., et al. Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).
- Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported. Cell. 54 (6), 813-822 (1988).
- Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).
- Biancardi, V., et al. Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats. Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).
- Matthews, D. W., et al. Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).
- Ramos-Vara, J. A.
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Yamashita, S., Katsumata, O. Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications. Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
