Summary
我们通过切除L3–L5旋转过程以及超脊椎和间旋韧带和寄生肌肉分离，开发了腰椎间盘退化小鼠模型。
Abstract
椎间盘退化 （IDD） 是导致低背痛的常见病理变化。了解病理过程和评估新药需要适当的动物模型。在这里，我们介绍了一个手术诱导的腰椎不稳定（LSI）小鼠模型，从手术后1周开始开发DD。详细地，麻醉下的老鼠通过低背皮肤切口、L3-L5脊柱过程暴露、寄生肌肉分离、过程和韧带切除以及皮肤闭合来操作。L4–L5 IVD被选为观察结果。LSI 模型在早期通过末板的孔隙和肥大开发腰椎 IDD，椎间盘体积下降，中间阶段核纸浆收缩，晚期腰椎 （L5）骨质流失。LSI鼠标型号具有可操作性强、对特殊设备无要求、可重复性强、价格低廉、IDD开发周期相对较短等优点。然而，LSI手术仍然是在手术后第一周内引起炎症的创伤。因此，这种动物模型适合研究腰椎IDD。
Introduction
椎间盘退化（IDD）常见于衰老甚至年轻人造成的许多因素1。为患有 IDD、导致背痛和运动障碍的患者进行手术，通常在后期或严重情况下进行，并具有潜在的风险，如非团结或感染2。理想的非手术治疗需要全面了解 IDD 机制。IDD 动物模型是研究 IDD 机制和评估 IDD 治疗的重要工具。
大型动物被选为IDD模型，如灵长类动物、绵羊、山羊、狗和兔子，它们在很大程度上与人类解剖结构相似，而且椎间盘（IVDs）3、4、5、6、7、8的大小具有很强的可操作性。然而，这些动物模型是耗时和成本密集的9。鼠标IVD是基于纵横比的几何测量，核纸浆与圆盘面积比，以及规范化高度10的人类IVD的不良表现。尽管大小不同，小鼠腰椎IVD段表现出类似于人类IVD的机械特性，如压缩和躯干僵硬11。此外，小鼠IDD模型具有成本低、IDD开发时间相对较短等优点，在进一步机械研究12、13、14、15中，对转基因动物和抗体有更多的选择。
实验诱导的 IDD 模型因诱导器和应用而异。例如，拼贴酶引起的细胞外基质（ECM）退化是适合ECM再生研究16。转基因表型适用于研究基因功能在DD过程中和基因疗法17。安努卢斯纤维切口和烟雾模型模仿创伤和非炎症诱发的IDD12，18。
脊柱不稳定 （SI） 导致脊柱不稳定，而脊柱不处于最佳平衡状态。它可能是由腰椎运动段的异常运动引起的，因为周围支撑组织（如韧带和肌肉）的弱点。它也是常见的后脊髓融合操作19。SI 被认为是 IDD 的主要原因。因此，我们的目标是开发一个SI小鼠模型（专注于腰椎），模仿人类的IDD过程20，21。
在协议中，我们介绍了通过腰椎第三（L3）至腰椎第五（L5）旋转过程以及超脊椎和间断韧带（图1A，B）的切除建立腰椎不稳定（LSI）小鼠模型的程序。动物模型最早在手术后1周开发IDD，如末板（EPs）中的肥大和孔隙性所示。IVD 体积在手术后 2 周内开始减少，持续 16 周，同时 IVD 评分增加，这表示 IDD 的程度。我们相信，详细和可视化的程序是有用的研究人员建立LSI小鼠模型在他们的实验室，并适用于IDD研究的需要。
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Protocol
所描述的调查符合《国家卫生研究院实验室动物护理与使用指南》，并经上海中医药大学动物护理与使用委员会批准。所有的手术手术都是在深度麻醉下进行的，动物在手术的任何阶段都没有感到疼痛。
1. 手术前准备
- 仪器灭菌：手术前在高压灭菌器械中蒸灭（121 °C，15分钟）。将仪器装在金属容器中，并加以维护，直到用于手术。
- 手术平台设置：为手术分配至少 60 厘米 x 60 厘米的长凳区域。用75%的酒精清洁区域表面，用一次性医用毛巾盖住。将无菌手术器械包、试剂、手术用品放在区域上部 1/3 内的一次性医疗巾上。将剩余的 2/3 区域保持清洁，用于外科手术。在手术垫下方添加一个热垫，以获得热支持。
- 动物制备
- 将动物（C57BL/6J小鼠，雄性，8周大）放入感应室。以 4% 的感应水平打开蒸发器，用于异氟素，4 升/分钟的氧气。动物完全麻醉后，用鼻锥保持麻醉，在手术过程中将异氟烷和氧气的麻醉分娩维持在1.5%的水平。0.4升/分钟。监测动物呼吸。
- 在手术过程中应用盐酸氯环素眼药膏，以防止角膜干燥。
- 使用小型动物修剪器将下胸部区域的手术区域剃到囊性区域顶部。用纸巾去除剃光的毛皮。
- 将脱毛霜涂抹在剃须区域，并将其留在那里不超过3分钟。用纱布取出奶油，用 2 mL 的 0.9% 无菌盐水冲洗。
- 将定制的手术圆柱形垫（图2A）放在小鼠腹部下方，以抬起腰椎，促进手术。
2. 腰椎第三至腰椎第五 （L3– L5）旋转过程的暴露
- 使用食指触摸腰椎的皮下脊椎过程，后者更向外，并与胸椎和囊椎进行比较，以确定腰椎区域。
- 用75%的酒精冲洗皮肤。使用手术刀刀片在木材区域（从中胸区到臀部）上进行 3–4 厘米的中线皮肤切口，以暴露筋膜。
- 通过插入旋转过程尖端的后筋膜的形态识别腰椎。详细地说，第三个腰椎（L3）到第一个囊（S1）筋膜因其"V"形而不同于其他筋膜。最后一个"V"提示连接到第一个囊（S1）筋膜，第一个"V"提示对应L3旋转过程（图2B）。
- 使用手术刀刀片（图 2C）沿两侧从 L3到 L5的旋转过程进行后侧侧肌肉切口。控制切口深度朝向面，以减少出血。
- 使用两个眼力将肌肉层分开，以暴露 L3 到 L5 旋转过程和超脊髓。
3.L3-L5旋转过程连同韧带的切除
- 使用金星剪切（图2D）切断间夹韧带，从而分离单个旋转过程。
- 与金星剪切剂（图2E）的交叉韧带一起重构L3-L5旋转过程。
- 用无菌丝编织（缝合尺寸 5.0）缝合皮肤切口，无需重新连接副脑肌肉。
- 将盐酸氯环素眼药膏涂抹到手术部位。
- 在LSI镇痛手术后立即施用丁丙诺啡-SR（每克小鼠体重25毫升）。
- 将动物放在一个温暖的房间里，并在麻醉恢复期间进行监测。在将动物送回家庭笼子之前，先监测食物和水的摄入量。
- 在手术后的前3天，每天监测动物一次。动物应该能够有正常的食欲，应该愈合没有脓，出血，或肿胀的迹象。他们可能在运动方面有轻微的损伤。
- 仅通过从L3-L5椎骨分离后半椎肌肉进行虚假操作。
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Representative Results
LSI小鼠模型应用于EP20、21、22、23的IDD机理、IDD治疗、末板（EP）退化（如硬化症）和感官内向的研究。LSI 鼠标通过减少 IVD 体积和高度、增加 EP 体积以及增加 IVD 和 EP 分数来开发 IDD 和 EP 退行性变化（如所示）。
解剖和固定的下胸椎和腰椎由高分辨率微计算断层扫描（μCT）检查，如先前描述的20，21。包括带肋骨的下胸腰，用于识别L3–L5椎骨（图3A）。横向视图上 L3– L5脊柱的 X 射线表明沙姆和 LSI 组中存在和不存在旋转过程 （图 3B）。L 3 – L5脊柱的3D重建（图 3C）和 L 3 - L5椎骨的横向图像（图 3D）更清楚地说明了结果。
L4– L5 IVD 的冠状图像用于对 IVD20 （图 4A）进行 3D 组织形态分析。IVD 体积定义为涵盖 L4 和 L5 椎骨之间整个不可见空间的兴趣区域 （ROI）。参数：电视（总组织体积）用于3D结构分析（图4B）。IVD体积显著增加1周后，并开始减少从2周到16周后手术，如 图4C观察到。
IVD空间的高度从前部到后部（图4E，G）各不相同。LSI 对后部有显著影响。因此，选择IVD空间的后三分之一日冕平面进行IVD高度测量（图4D，E）。IVD高度从手术后2周降至16周（图4F），这与IVD体积（图4C）的发现一致。
L4– L5 IVD 空间的冠状图像应用于颅面和胸膜末板 （Eps） （图 5A）的 3D 组织形态分析。末板 （EP） 体积定义为覆盖靠近椎骨的可见骨板 （图5A，B）21。前四分之一的日冕平面连续五张颅EP图像用于3D重建（图5C），显示LSI小鼠颅EP内的腔增加（图5D）。结果还显示，血管分离值的百分比增加，大于或等于0.089（图5E）。同时，手术后的EP量显著增加（图5F）。Caudal EP 表现出 LSI （图 5G，H）的类似表型，表明 LSI 会导致 EP 肥大和蛀牙增加。
L5椎体通过绘制每个 L5椎体所有横向部分的轮廓（无配件）并将所有 2D 图像转换为 3D 模型进行了重建。施工和分析分别用商业软件（如NRecon v1.6和CTAn v1.9）完成。L5椎骨的体积在手术后略有增加，但只有假组和16周LSI组（图6B）之间的统计差异。BV/TV在手术后16周也显著减少，表明LSI在后期会导致椎骨流失（图6A，C）。
LSI 诱发 IVD 退化和 EP 退化，如 IVD 和 EP 分数增加 24（ 图7A，C）所示。LSI组（图7B）加速了细胞内细胞内细胞的减少。LSI EP （图7D） 的蛀牙增加，以及陷阱染色（图 7E，F）显示的骨质体数量增加。
这些数据显示为平均±。统计学意义是由 学生的考试决定的。意义级别被定义为p<0.05。所有数据分析均使用 SPSS 15.0 进行。
图1：LSI鼠标模型的示意图。（A） 小鼠下背部区域 L3-L5 椎骨解剖。（B） 脊柱过程的切除以及间歇性韧带和超脊髓（标记为苍白）。红色虚线表示部分平面。 请单击此处查看此图的更大版本。
图2：L3–L5旋转过程和LSI操作的暴露。（A） 将定制圆柱形垫放在鼠标腹部下方。（B） 通过"V"形暴露腰筋和识别L3至S1旋转过程。（C） L3至 L5旋转过程两侧的横向寄生肌肉切口。（D） 通过切断间断韧带来暴露单个旋转过程。（E） 切除 L3–L 5旋转过程与交叉和超旋转韧带。请单击此处查看此图的更大版本。
图3：按μCT进行LSI标识。（A） L3– L5椎骨在 X 射线中用胸椎进行肋骨本地化。（B） 横向视图上的 X 射线和LSI组 L 3 -L5椎骨左前斜视图的 3D 重建。（D） 腰椎的横向平面与旋转过程的切除。（D） 已从比安等人21日修改。请单击此处查看此图的更大版本。
图4：LSI可减少IVD体积。（A） L 4 和 L5 IP 之间不可见空间（红色）的连续图像用于 3D 重建。（B） IVD 音量由（A） 的电视定义。（C） 手术后五个时间点对 L4–L5 IVD 体积进行量化。N =每组8。数据显示为平均±*p&0.05，**p&0.01与沙姆。（D） 横向平面和 （E） 腰椎体的中下垂平面。蓝色双箭头表示前柱径。黄线表示后 1/3 平面。（F） 使用L4-L5的后1/3日冕平面的五张连续图像重建颅面和冠状EP。红色表示 IVD 空间。（G） L4-L5的中晶平面。（C） 已从比安等人20日修改。（F ， G） 已从比安等人21修改。请单击此处查看此图的更大版本。
图5：LSI诱发EP肥大和孔隙度。（A） 科罗纳飞机 L4–L5.红色虚线表示用于 3D 构造的审计 EP 图像。（B） 重建考达尔L4和颅L5。蓝色卡通表示L4-L 5的审计EP。（C）L4-L 5的中晶平面。蓝色双箭头表示前柱径。黄线表示前 1/4 平面。（D） 通过连续五张 L4–L 5 前 1/4 平面的图像重建颅面EP。（E，G）从 μCT 分析中获得的颅（E）和 caudal（G）EPs 的颅内分离分布百分比。（F， H）颅（F）和 caudal（H）的量化。L4–L5 EP音量在指示的时间点。N =每组8。数据显示为平均± s.d. * p .lt; 0.05 与.假。（D–H）已从比安等人21日修改。请单击此处查看此图的更大版本。
图6：LSI在后期导致椎骨流失。（A） 在为期16周的沙姆和LSI小组重建L5 椎体。（B ， C）L5 椎电视（B）和 BV/TV（C）的量化。N =每组8。数据显示为平均± s. d. * p .lt; 0.05， ** p lt; 0.01 与.假。（B） 已从比安等人21日修改。 请单击此处查看此图的更大版本。
图7：LSI导致IVD和EP退化。（A） LSI 或假小鼠的 IVD 评分作为 IVD 退化的迹象。（B） L4–L5 IVD中NP的萨夫拉宁O染色的代表图像。白色表示真空。红色表示蛋白原蛋白。（C） EP 得分在 LSI 或虚假组作为 Ep 退化的迹象。（D） 萨夫拉宁 O - 快速绿色染色的代表图像， 用于考达尔 L4- L5 Eps 。绿色/蓝色污渍钙化腔。（E） 具有代表性的图像陷阱染色为考达尔 L4– L5 Eps 。紫色表示陷阱+。N =每组6。数据显示为平均± s. d. * p .lt; 0.05， ** p lt; 0.01 与.假。（F） 在 （E） 中对陷阱+骨质的量化。（A ， B） 已从比安等人20修改。（C–F）已从比安等人21日修改。请单击此处查看此图的更大版本。
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Discussion
我们开发了腰椎不稳定小鼠模型的基础上，颈椎侧弯小鼠模型，其中从椎骨的后半椎肌肉分离，脊柱过程以及超脊椎和交叉韧带被重新切除25。我们在腰椎上做了类似的手术，腰椎有更突出的脊柱过程。LSI 鼠标模型在腰椎中开发了类似的 IDD。
LSI 模型的优势包括可操作性强、无需特殊设备、可重复性和 IDD 开发周期相对较短。
此处介绍了一些要点，以帮助提高操作期间的成功率。这些也是关键步骤。首先，尽可能清晰地去除下背部的头发，因为伤口上留下的任何剃光的头发都可能导致过敏反应。其次，建议使用圆柱形垫或任何其他垫子来提升腰椎。第三，用微剪刀控制切口深度和出血。当在手术过程中注意到造鼠时，停止手术并牺牲小鼠，因为小鼠在手术期间或手术后无法存活。第四，不建议重新连接寄生肌肉，因为重新连接可能弥补不稳定。第五，对整个L3–L 5旋转过程进行全面切除，可减少单个模型的变异性。第六，避免伤害周围的神经和血管，否则，小鼠可能会发生非犬病变。如果模型没有显示结果中显示的典型表型，请检查上述六点。
这种 LSI 模型的成功可以通过两个黄金标准进行评估，包括通过小动物 MRI 或 μCT 测量的 IVD 体积减少，以及基于组织学观察的 IVD 评分。LSI 模型早在 LSI 手术后 2 周就开发了 IDD，但正如观察到的，在末板中发展出孔隙度最早为 1 周。它适用于核纸浆收缩、末板硬化症、与骨质疏松素有关的 IDD、IDD 引起的骨质疏松症（LSI 后 16 周）等研究。
LSI 模型存在一些限制。LSI 操作对鼠标来说是一个相对较大的创伤。炎症是不可避免的，通常在手术后7天内看到。因此，该模型不适合观察 IDD 的早期病理变化，尤其是在机械装载变化引起的 7 天内。
模型可以通过针对不同的腰椎，如L5 或从L1 到L5进行修改。除了假团体外，还建议进行健康控制。
总之，我们开发了一个手术诱导的腰椎 IDD 鼠标模型，并可视化该程序，以帮助他人复制动物模型并将其应用于 IDD 研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（81973607）和中国科技部基本药物研发（2019ZX09201004-003-032）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chlortetracycline Hydrochloride Eye Ointment | Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd. | H31021931 | Prevent eye dry, Prevent wound infection |
| C57BL/6J male mice | Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN) | SCXK2018-0004 | Animal model |
| Disposable medical towel | Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd. | 20160090 | Platform for surgical operation |
| Inhalant anesthesia equipment | MIDMARK | Matrx 3000 | Anesthesia |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd. | 1903715 | Anesthesia |
| Lidocaine hydrochloride | Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd. | H37022839 | Pain relief |
| Medical suture needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 20S0401J | Suture skin |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | JD1050 | Clip the skin |
| Ophthalmic scissors(10cm) | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | Y00030 | Skin incision |
| silk braided | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 11V0820 | Suture skin |
| Small animal trimmer | Shanghai Feike Electric Co., Ltd. | FC5910 | Hair removal |
| Sterile surgical blades(12#) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 35T0707 | Muscle incision |
| Veet hair removal cream | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Hair removal |
| Venus shears | Mingren medical equipment | Length:12.5cm | Clip the muscle and spinous process |
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