Summary
Desarrollamos un modelo de ratón de degeneración de disco intervertebral lumbar mediante la resección de procesos espinosos L3-L5 junto con ligamentos supra-e interespinosos y desprendimiento de músculos paraspinosos.
Abstract
La degeneración intervertebral del disco (IDD) es un cambio patológico común que conduce al dolor lumbar. Se desean modelos animales apropiados para entender los procesos patológicos y evaluar nuevos fármacos. Aquí, introdujimos un modelo de ratón de inestabilidad lumbar (LSI) inducido quirúrgicamente que desarrolla IDD a partir de 1 semana después de la operación. En detalle, el ratón bajo anestesia fue operado por incisión de la piel de espalda baja, exposición a procesos espinosos L3-L5, desprendimiento de músculos paraspinos, resección de procesos y ligamentos, y cierre de la piel. L4–L5 IVDs fueron elegidos para la observación. El modelo LSI desarrolla IDD lumbar por porosidad e hipertrofia en placas finales en una etapa temprana, disminución en el volumen de disco intervertebral, contracción en el núcleo pulposo en una etapa intermedia, y pérdida ósea en vértebras lumbares (L5)en una etapa posterior. El modelo de ratón LSI tiene las ventajas de una fuerte operatividad, sin necesidad de equipos especiales, reproducibilidad, barato y período relativamente corto de desarrollo de IDD. Sin embargo, la operación de LSI sigue siendo un trauma que causa inflamación dentro de la primera semana después de la operación. Por lo tanto, este modelo animal es adecuado para el estudio de IDD lumbar.
Introduction
La degeneración intervertebral del disco (IDD) se observa comúnmente en el envejecimiento e incluso en los jóvenes causados por muchos factores1. La cirugía para pacientes que sufren de IDD, causando dolor lumbar y movimiento deteriorado, generalmente se realiza en una etapa posterior o en casos graves y tiene riesgos potenciales como no unión o infección2. El tratamiento no operativo ideal requiere una comprensión integral del mecanismo IDD. El modelo animal IDD sirve como una herramienta crucial para los estudios del mecanismo IDD y la evaluación del tratamiento con IDD.
Los animales más grandes han sido elegidos para modelos IDD como primates, ovejas, cabras, perros y conejos debido a su similitud con la estructura anatómica humana en gran medida y la fuerte operatividad en términos de tamaño de discos intervertebrales (IVDs)3,4,5,6,7,8. Sin embargo, estos modelos animales consumen mucho tiempo y consumen un costo de9. La IVD del ratón es una mala representación de la IVD humana basada en mediciones geométricas de la relación de aspecto, relación de área de núcleo pulposo a disco y altura normalizada10. A pesar de la diferencia de tamaño, el segmento IVD lumbar del ratón exhibe propiedades mecánicas similares a la IVD humana como compresión y rigidez de torsión11. Además, el modelo IDD del ratón tiene la ventaja del desarrollo de IDD de bajo costo, relativamente corto, y más opciones para animales y anticuerpos genéticamente modificados utilizados en otros estudios mecanicistas12,13,14,15.
Los modelos de IDD inducidos experimentalmente varían de los inductores y las aplicaciones. Por ejemplo, la degeneración de la matriz extracelular (ECM) inducida por colágenona es adecuada para la investigación de regeneración ecm16. El fenotipo modificado genéticamente es adecuado para estudiar la función génica en el proceso IDD y en terapias genéticas17. Los modelos de incisión fibrosa y humo annulus imitan el trauma y la IDD inducida por no inflamación12,18.
La inestabilidad espinal (SI) conduce a una columna vertebral inestable que no está en un estado óptimo de equilibrio. Puede ser causado por el movimiento anormal de un segmento de movimiento lumbar debido a la debilidad del tejido de apoyo circundante, como ligamentos y músculos. También se ve comúnmente después de la operación de fusión espinal19. Si se considera como la causa principal del IDD. Por lo tanto, nuestro objetivo es desarrollar un modelo de ratones SI (centrado en la columna lumbar) que imita el proceso humano de IDD20,21.
En el protocolo, introdujimos el procedimiento de establecer el modelo de ratón de inestabilidad espinal lumbar (LSI) mediante la resección del tercio lumbar (L3)a los procesos espinosos lumbares quintos (L5)junto con los ligamentos supraespinosos e interspinos (Figura 1A,B). El modelo animal desarrolla IDD tan pronto como 1 semana después de la cirugía como lo demuestra la hipertrofia y la porosidad en las placas finales (EPs). El volumen de IVD comienza a disminuir 2 semanas después de la cirugía a través de 16 semanas junto con un aumento de la puntuación de IVD, lo que indica el grado de IDD. Creemos que el procedimiento detallado y visualizado es útil para que los investigadores establezcan el modelo de ratón LSI en su laboratorio y se apliquen a la investigación de IDD según sea necesario.
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Protocol
Las investigaciones descritas se ajustan a las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái. Todas las manipulaciones quirúrgicas se realizaron bajo anestesia profunda y los animales no experimentaron dolor en ninguna etapa durante el procedimiento.
1. Preparación previa a la operación
- Esterilización de instrumentos: Esterilizar a vapor los instrumentos quirúrgicos en un autoclave (121 °C durante 15 min) antes de la cirugía. Empaque los instrumentos en un recipiente metálico y mantenlos hasta que se utilicen en la cirugía.
- Configuración de la plataforma de cirugía: Asigne un área de banco de al menos 60 cm x 60 cm para la operación. Limpie la superficie de la zona con un 75% de alcohol y cubra con una toalla médica desechable. Coloque un paquete de instrumentos quirúrgicos estériles, reactivos, artículos quirúrgicos en una toalla médica desechable dentro de la parte superior 1/3 del área. Deje el 2/3 restante de área limpia para el funcionamiento quirúrgico. Agregue un hotpad debajo de la almohadilla quirúrgica para obtener apoyo térmico.
- Preparación de animales
- Coloque al animal (ratones C57BL/6J, macho, de 8 semanas) en la cámara de inducción. Encienda el vaporizador a un nivel de inducción del 4% para isofluranos y 4 L/min para oxígeno. Después de que el animal esté completamente anestesiado, mantenga el anestésico con el cono nasal y el parto anestésico a un nivel de 1,5% para isoflurano y 0,4 L/min para oxígeno durante la cirugía. Monitoree al animal para la respiración.
- Aplicar ungüento ocular de clortraciclina hidrocloruro para prevenir la sequedad corneal durante la cirugía.
- Afeite el área quirúrgica en la superficie dorsal desde la región torácica inferior hasta la parte superior de la región sacra utilizando una pequeña recortadora de animales. Retire el pelaje afeitado con toallitas de tejido.
- Aplicar crema depilatoria en el área afeitada y dejarla allí no más de 3 minutos. Retire la crema con gasa y enjuague con 2 ml de solución salina estéril al 0,9%.
- Coloque una almohadilla cilíndrica quirúrgica hecha a medida(Figura 2A)debajo del abdomen del ratón para levantar la columna lumbar y facilitar la operación quirúrgica.
2. Exposición del tercio lumbar a los procesos espinosos del quinto lumbar (L3–L5)
- Utilice el dedo índice para tocar los procesos espinosos subcutáneos de las vértebras lumbares, que son más externas, y comparar con las vértebras torácicas y las vértebras sacrales para identificar la región lumbar.
- Enjuague la piel con un 75% de alcohol. Realice una incisión cutánea de 3-4 cm en la mitad de la línea sobre la región maderera desde la región torácica media hasta la cadera utilizando una hoja de bisturí para exponer la fascia.
- Identifique la columna lumbar mediante la morfología de la fascia posterior insertada en las puntas de los procesos espinosos. En detalle, el tercer lumbar (L3)a la primera fachada sacra (S1)son distintos de otras fasciae por sus formas "V". La última punta "V" se conecta a la primera fascia sacra (S1)y la primera punta "V" corresponde al proceso espinoso L3 (Figura 2B).
- Hacer las incisiones musculares paraspinas posteriores a lo largo de los procesos espinosos de L3 a L5 en ambos lados lateralmente con una hoja del bisturí (Figura 2C). Controle la profundidad de incisión hacia las facetas para reducir la hemorragia.
- Separe las capas musculares usando dos fórceps oftálmicos para exponer los procesos espinosos de L3 a L5 y los ligamentos supraespinosos.
3. Resección de L3–L5 procesos espinosos junto con los ligamentos
- Separe los procesos espinosos individuales cortando los ligamentos interespinosos usando cizallos Venus(Figura 2D).
- Resecciona los procesos espinosos L3-L5 junto con los ligamentos interespinosos con cizalla Venus (Figura 2E).
- Sutura la incisión de la piel con trenzada de seda estéril (tamaño de sutura 5.0) sin reasociar los músculos paravertebrales.
- Aplique ungüento ocular de clortraciclina clortraciclina en el sitio quirúrgico.
- Administrar Buprenorphine-SR (25 uL por gramo de peso del ratón) inmediatamente después de la cirugía LSI para la analgesia.
- Coloque a los animales en una cámara caliente y monitoree durante la recuperación de la anestesia. Monitoree la ingesta de alimentos y agua antes de devolver a los animales a la jaula de origen.
- Monitoree al animal una vez al día durante los primeros 3 días después de la operación. El animal debe ser capaz de tener un apetito normal y debe sanar sin signos de pus, hemorragia o hinchazón. Pueden tener un deterioro menor en la locomoción.
- Llevar a cabo operaciones falsas sólo por el desprendimiento de los músculos paravertebrales posteriores de las vértebras L3–L5.
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Representative Results
El modelo de ratón LSI se aplica en los estudios de mecanismo IDD, tratamiento IDD, degeneración endplate (EP) como esclerosis, e invation sensorial en EP20,21,22,23. El ratón LSI desarrolla cambios degenerativos de IDD y EP, identificados, por disminución del volumen y la altura de la IVD, aumento del volumen ep y aumento de las puntuaciones de IVD y EP.
La columna vertebral torácica y lumbar inferior diseccionada y fija fue examinada por la Tomografía Micro Computed de alta resolución (μCT) como se describió anteriormente20,21. El lumbar torácico inferior con costillas se incluyó para la identificación de L3–L5 vértebras(Figura 3A). Los rayos X de la columna vertebral L3–L5 en una vista lateral indican la existencia e inexistencia de procesos espinosos en grupos Sham y LSI(Figura 3B). Los resultados son más claros por reconstrucción 3D de L3–L5 de columna vertebral en una vista oblicua anterior izquierda(Figura 3C)y por imagen transversal de unavértebraL 3 –L5 (Figura 3D).
Las imágenes coronales de la L4–L5 IVD se utilizaron para realizar análisis histomorfométricos 3D de IVD20 (Figura 4A). El volumen IVD se define como la región de interés (ROI) que cubre todo el espacio invisible entre las vértebras L4 y L5. Parámetro: TV (volumen total de tejido) se utilizó para análisis estructural 3D (Figura 4B). El volumen de IVD aumentó significativamente 1 semana después de la cirugía y comenzó a disminuir de 2 semanas a 16 semanas después de la operación como se observa en la Figura 4C.
La altura del espacio IVD varió de la anterior a la posterior(Figura 4E,G). LSI tuvo un efecto significativo en el sitio trasero. Así, se eligió el plano coronal posterior de un tercio del espacio IVD para la medición de altura IVD(Figura 4D,E). La altura de la FIV disminuyó de 2 semanas a 16 semanas después de la cirugía(Figura 4F),que fue consistente con los hallazgos en el volumen de LAV (Figura 4C).
Las imágenes coronales del espacio L4-L5 IVD se aplicaron a los análisis histomorfométricos 3D de las placas finales craneales y caudales (Eps)(Figura 5A). El volumen de endplate (EP) se define para cubrir la placa ósea visible cerca de las vértebras (Figura 5A,B)21. El plano coronal anterior de un cuarto de cinco imágenes consecutivas de EP craneal se utilizó para la reconstrucción 3D(Figura 5C),que mostró un aumento de las cavidades dentro del EP craneal en ratones LSI(Figura 5D). Los resultados también fueron indicados por un mayor porcentaje de valores de separación trabeculares que eran mayores o iguales a 0,089 (Figura 5E). Mientras tanto, los volúmenes ep aumentaron significativamente después de la cirugía(Figura 5F). Los ECU caudales exhiben fenotipo similar por LSI(Figura 5G,H),lo que indica que LSI conduce a hipertrofia EP y un aumento de las caries.
Los cuerpos vertebrales L5 fueron reconstruidos dibujando el contorno de todas las secciones transversales de cada cuerpo vertebral L5 sin accesorios y convirtiendo todas las imágenes 2D en un modelo 3D. La construcción y el análisis se realizaron con software comercial (por ejemplo, NRecon v1.6 y CTAn v1.9, respectivamente). Los volúmenes de vértebra L5 aumentan ligeramente después de la cirugía, pero sólo tienen diferencia estadística entre el grupo sham y el grupo LSI de 16 semanas (Figura 6B). Una disminución significativa en BV/TV también estuvo presente 16 semanas después de la cirugía, lo que indica que LSI causa pérdida ósea vertebral en una etapa posterior (Figura 6A,C).
LSI induce degeneración por IVD y degeneración de EP, como se indica en el aumento de las puntuaciones IVD y EP24 (Figura 7A,C). Se aceleró una reducción de las vacuolas intracelulares de las células del núcleo pulposo en grupos LSI(Figura 7B). Las cavidades aumentan en los EPs LSI(Figura 7D)acompañados de un mayor número de osteoclastas, como lo indica la Tinción trampa (Figura 7E,F).
Los datos se mostraron como ± s.d. La significación estadística fue determinada por la prueba t de un estudiante. El nivel de significancia se definió como p < 0.05. Todos los análisis de datos se realizaron mediante SPSS 15.0.
Figura 1: Esquema del modelo de ratón LSI. (A) Anatomía de L3–L5 vértebras en el área inferior de la espalda del ratón. (B) Resección de procesos espinosos junto con ligamentos interespiosos y ligamentos supraespinosos (marcados pálida). Una línea de puntos roja indica un plano de sección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Exposición de procesos espinosos L3–L5 y funcionamiento LSI. (A) Se coloca una almohadilla cilíndrica hecha a medida debajo del abdomen del ratón. (B) Exposición de la fasciae lumbar e identificación de procesos espinosos L3 a S1 por formas "V". (C) Incisiones musculares paraspinas laterales a ambos lados de los procesos espinosos de L3 a L5. (D) Exposición de procesos espinosos individuales cortando ligamentos interespiosos. (E) Resección de L3–L5 procesos espinosos con ligamentos inter y supraespinosos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Identificación LSI por μCT. (A) Localización de L3–L5 vértebras por costillas con vértebras torácicas en rayos X. (B) Radiografías en una vista lateral y (C) reconstrucción 3D en una vista oblicua anterior izquierda de L3–L5 vértebras en grupos Sham y LSI. (D) Plano transversal de vértebra lumbar con la resección del proceso espinoso. (D) ha sido modificado de Bian et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: LSI reduce el volumen IVD. (A) Las imágenes consecutivas del espacio invisible (rojo) entre L4 y L5 EPs se utilizan para la reconstrucción 3D. (B) El volumen IVD se define mediante el televisor de (A). (C) Cuantificación del volumen L4–L5 IVD a cinco puntos de tiempo después de la operación. N = 8 por grupo. Los datos se muestran como media ± s.d. *p < 0.05, **p < 0.01 versus Sham. (D) Plano transversal y (E) plano sagital medio de cuerpos vertebrales lumbares. Las flechas dobles azules indican el diámetro del anteroposterior. La línea amarilla indica el plano posterior 1/3. (F) Reconstrucción de EPs craneales y caudales utilizando cinco imágenes consecutivas del plano coronal posterior 1/3 de L4–L5. El rojo indica el espacio ivd. (G) Plano sagital medio de L4–L5. (C) ha sido modificado de Bian et al.20. (F,G) han sido modificados de Bian et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: LSI induce hipertrofia EP y porosidad. (A) Plano coronal de L4–L5. La línea de puntos rojos indica la imagen del EP caudal utilizado para la construcción 3D. (B) Reconstrucción del caudal L4 y craneal L5. Dibujos animados azules indica EP caudal de L4–L5. (C) Plano sagital medio de L4–L5. Las flechas dobles azules indican el diámetro del anteroposterior. La línea amarilla indica el plano anterior 1/4. (D) Reconstrucción de EPs craneales mediante cinco imágenes consecutivas del plano anterior 1/4 de L4–L5. (E,G) Porcentaje de distribución de separación trabecular de los EPS craneales(E)y caudales (G) obtenidos de análisis μCT. (F,H) Cuantificación de craneal (F) y caudal (H). L4–L5 VOLUMEN EP en puntos de tiempo indicados. N = 8 por grupo. Los datos se muestran como media ± s.d.* p < 0.05 frente a. fingir. (D–H) han sido modificados de Bian et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: LSI causa pérdida ósea vertebral en etapa tardía. (A) Reconstrucción de cuerpos L5 vertebrales en grupos Sham y LSI de 16 semanas. (B,C) Cuantificación de L5 vertebra TV (B) y BV/TV (C). N = 8 por grupo. Los datos se muestran como media ± s.d.* p < 0.05, ** p < 0.01 frente a. fingir. (B) ha sido modificado de Bian et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: LSI conduce a ivd y degeneración EP. (A) puntuación ivd en LSI o ratones falsos como una indicación de degeneración por IVD. B) Imágenes representativas de la tinción Safranin O para NPs en L4–L5 IVD. El blanco indica vacuoles. El rojo indica proteoglycan. (C) Puntuación del PE en LSI o grupo falso como indicación de la degeneración del PE. (D) Imágenes representativas de la tinción verde safranin O-Fast para los puntos de acceso caudal L4–L5. Manchas verdes/azules cavidades calcificadas. (E) Imágenes representativas de manchas de trampa para los PUNTOS caudal L4–L5. Púrpura indica Trampa+. N = 6 por grupo. Los datos se muestran como media ± s.d.* p < 0.05, ** p < 0.01 frente a. fingir. (F) Cuantificación de trampa+ osteoclastas en (E). (A,B) han sido modificados de Bian et al.20. (C–F) han sido modificados de Bian et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Desarrollamos el modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral basado en el modelo de ratón de espondilosis cervical en el que se separaron los músculos paravertebrales posteriores de las vértebras y los procesos espinosos junto con los ligamentos supraespinosos e interespinosos se reseccionaron25. Realizamos una operación similar en la columna lumbar, que tiene procesos espinosos más prominentes. El modelo de ratón LSI desarrolló un IDD similar en la columna lumbar.
Las ventajas del modelo LSI incluyen una fuerte operatividad, ningún requisito de un equipo especial, reproducibilidad y un período relativamente corto de desarrollo de IDD.
Algunos puntos clave se presentan aquí para ayudar a mejorar la tasa de éxito durante la operación. Estos son también los pasos críticos. En primer lugar, retire el cabello en la parte inferior de la espalda, lo más claro posible, porque cualquier cabello afeitado que quede en la herida puede causar reacción anafiláctica. En segundo lugar, se recomienda una almohadilla cilíndrica o cualquier otra almohadilla para elevar las vértebras lumbares. En tercer lugar, utilice micro tijeras para controlar la profundidad de la incisión y la hemorragia. Cuando se note hematocoelia durante la operación, detenga la operación y sacrifique al ratón ya que el ratón no sobrevivirá durante o después de la cirugía. En cuarto lugar, no se recomienda el reajuste del músculo paraspinoso porque el reajuste puede compensar la inestabilidad. En quinto lugar, una resección completa de todos los procesos espinosos L3-L5 reduce la variabilidad en el modelo individual. En sexto lugar, evitar lesionar los nervios circundantes y los vasos sanguíneos, de lo contrario, el ratón puede desarrollar cambios patológicos no canónicos. Si los modelos no exhiben el fenotipo típico como se muestra en los resultados, compruebe los seis puntos anteriores.
El éxito de este modelo LSI puede evaluarse mediante dos estándares dorados, incluyendo la disminución del volumen de IDH medido por resonancia magnética de animales pequeños o por μCT, y una puntuación de IVD basada en la observación histológica. El modelo LSI desarrolla IDD tan pronto como 2 semanas después de la cirugía LSI, pero desarrolla porosidad en endplate tan pronto como 1 semana, como se observó. Es adecuado para el estudio sobre contracción pulposa del núcleo, esclerosis endplate, IDD relacionado con citoquinas inducidas por osteoclasta, osteoporosis inducida por IDD (16 semanas después de LSI) etc.
Hay algunas limitaciones en el modelo LSI. La operación LSI es un trauma relativamente grande para el ratón. La inflamación es inevitable y generalmente se ve dentro de los 7 días posteriores a la operación. Por lo tanto, este modelo no es adecuado para observar los primeros cambios patológicos del IDD, especialmente dentro de los 7 días causados por cambios de carga mecánica.
El modelo se puede modificar apuntando a diferentes vértebras lumbares como L5 solamente o de L1 a L5. También se recomienda un control saludable además de grupos falsos.
En resumen, desarrollamos un modelo de ratón IDD lumbar inducido quirúrgicamente y tenemos el procedimiento visualizado para ayudar a otros a reproducir el modelo animal y aplicarlo en estudios de IDD.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81973607) y Essential Drug Research and Development (2019ZX09201004-003-032) del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chlortetracycline Hydrochloride Eye Ointment | Shanghai General Pharmaceutical Co., Ltd. | H31021931 | Prevent eye dry, Prevent wound infection |
| C57BL/6J male mice | Tian-jiang Pharmaceuticals Company (Jiangsu, CN) | SCXK2018-0004 | Animal model |
| Disposable medical towel | Henan Huayu Medical Devices Co., Ltd. | 20160090 | Platform for surgical operation |
| Inhalant anesthesia equipment | MIDMARK | Matrx 3000 | Anesthesia |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd. | 1903715 | Anesthesia |
| Lidocaine hydrochloride | Shandong Hualu Pharmaceutical Co., Ltd. | H37022839 | Pain relief |
| Medical suture needle | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 20S0401J | Suture skin |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | JD1050 | Clip the skin |
| Ophthalmic scissors(10cm) | Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Surgical Instruments Factory | Y00030 | Skin incision |
| silk braided | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 11V0820 | Suture skin |
| Small animal trimmer | Shanghai Feike Electric Co., Ltd. | FC5910 | Hair removal |
| Sterile surgical blades(12#) | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 35T0707 | Muscle incision |
| Veet hair removal cream | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Hair removal |
| Venus shears | Mingren medical equipment | Length:12.5cm | Clip the muscle and spinous process |
References
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