Summary
Dans le contexte clinique, les patients atteints d’un cancer pancréatique localisé subiront une pancréatectomie suivie d’un traitement adjuvant. Ce protocole rapporté ici vise à établir une méthode sûre et efficace de modélisation de ce scénario clinique chez les souris nues, par l’implantation orthotopic du cancer pancréatique suivie de pancreatectomy et de splenectomy distaux.
Abstract
Il y a un manque de modèles animaux satisfaisants pour étudier l’adjuvant et/ou la thérapie neoadjuvant dans les patients étant considérés pour la chirurgie du cancer pancréatique (PC). Pour adresser cette insuffisance, nous décrivons un modèle de souris impliquant l’implantation orthotopic du PC suivi de pancreatectomy et de splenectomy distaux. Il a été démontré que le modèle est sûr et suffisamment flexible pour l’étude de diverses approches thérapeutiques dans des arrangements adjuvants et néo-adjuvants.
Dans ce modèle, une tumeur pancréatique est d’abord générée en implantant un mélange de cellules cancéreuses pancréatiques humaines (AsPC-1 marqué par luciférase) et de cellules étoilées pancréatiques associées au cancer humain dans le pancréas distal de souris nues athymiques Balb/c. Après trois semaines, le cancer est réséqué par re-laparotomie, pancréatectomie distale et splénectomie. Dans ce modèle, l’imagerie par bioluminescence peut être utilisée pour suivre l’évolution du développement du cancer et les effets de la résection/des traitements. Après la résection, on peut donner un traitement adjuvant. Alternativement, le traitement neoadjuvant peut être donné avant la résection.
Des données représentatives de 45 souris sont présentées. Toutes les souris ont subi pancreatectomy/splenectomy distal réussi sans des issues de hemostasis. Une marge pancréatique proximale macroscopique plus grande que 5 millimètres a été réalisée dans 43 (96%) souris. Le taux de succès technique de la résection pancréatique était 100%, avec la mortalité et la morbidité tôt de 0%. Aucun des animaux n’est mort pendant la semaine après la résection.
En résumé, nous décrivons une technique robuste et reproductible pour un modèle chirurgical de résection du cancer pancréatique chez la souris qui imite le scénario clinique. Le modèle peut être utile pour l’essai des traitements adjuvants et néoadjuvants.
Introduction
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (cancer du pancréas [PC]) est associé à un pronostic pauvre1. La résection chirurgicale demeure le seul traitement potentiellement curatif pour le PC et devrait être considérée pour des patients présent avec la maladie de partie. Malheureusement, même avec la résection R0 (c’est-à-dire, marges de résection exemptes de tumeur), le taux de récidive (local ou de la maladie métastatique non détectée) est élevé2,3. Par conséquent, la thérapie adjuvante systémique est indiquée dans presque tous les patients qui subissent la résection4. En outre, alors que le traitement néoadjuvant n’est maintenant recommandé que pour les cancers borderline-résécables, ses indications se développent de telle sorte que son utilisation systématique est au centre de nombreuses recherches cliniques5,6,7,8. Afin de développer des approches thérapeutiques originales pour le PC impliquant la résection, ces approches doivent d’abord être évaluées dans les modèles précliniques qui récapitulent exactement les arrangements cliniques.
Des modèles murins orthotopiques de PC ont été fréquemment utilisés dans le passé pour tester des traitements médicamenteux9,10. Plusieurs de ces ceci ont été produits par l’injection des cellules cancéreuses seules dans le pancréas de souris, ayant pour résultat les tumeurs qui ont manqué du stroma en avant qui est caractéristique du PC. Plus récemment, les modèles orthotopiques de co-injection, tels que celui que nous avons d’abord développé en injectant un mélange de PC humain et de cellules étoilées pancréatiques humaines (PSCs, les producteurs primaires du stroma collagène dans le PC), sont entrés en usage régulier11,12. Les tumeurs produites par une telle co-injection du cancer et des cellules stromal montrent (i) les éléments de cancer et le composant stromal caractéristique (desmoplastic) du PC, et (ii) la prolifération et la métastase augmentées de cellule cancéreuse11. Ainsi, ce modèle ressemble étroitement au PC humain. Tandis qu’un certain nombre de modèles résectional de PC orthotopic ont été décrits13,14,15,16,aucun n’a reflété les réalités cliniques de la résection pancréatique chez l’homme aussi précis que ce modèle, et ont donc été sous-optimaux pour tester des traitements auxiliaires ou neoadjuvants.
Les buts du modèle murin présenté étaient de démontrer comment : (i) implanter avec succès le cancer pancréatique orthotopic tout en réduisant au minimum la diffusion péritonéale négligente et (ii) plus tard réséquer complètement le cancer. L’article met en évidence les astuces et les pièges potentiels de cette technique.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Nouvelle-Galles du Sud (17/109A). Des souris nues athymiques femelles de Balb/c, âgées 8-10 semaines pesant 16-19 g, ont été employées pour ce protocole. Les souris ont été logées dans des cages de micro-isolateur et nourries ad libitum avecdes granulés disponibles dans le commerce.
1. Implantation orthotopique du cancer du pancréas
- Préparer les cellules pour l’implantation. Tout d’abord, calculer le nombre de cellules requises pour la procédure (1 x10 6 cellules AsPC-1 marquées par luciférase et 1 x 106 cellules étoilées pancréatiques humaines associées au cancer [CAhPSCs] sont nécessaires pour chaque animal).
- Maintenir ces cellules dans un incubateur de CO2 humidifié à température contrôlée et effectuer des tests de routine sur les mycoplasmes. Les milieux de culture utilisés pour l’AsPC-1 et les CAhPSC sont les RPMI 1640 (avec 300 mg/L de L-glutamine, 20 % v/v de sérum fœtal bovin, 1 % v/v pénicilline/streptomycine) et imdm (avec 4 mM de L-glutamine, 10 % v/v de sérum fœtal bovin, 1 % v/v pénicilline/streptomycine).
- Utilisez des techniques de culture cellulaire standard pour trypsiniser les cellules dans une suspension cellulaire. Neutraliser la trypsine en utilisant le milieu de culture complet respectif à un volume deux fois supérieur à celui de la solution de trypsine utilisée.
- Laver ces cellules deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les remettre en suspension dans un mélange contenant 1 x10 6 cellules AsPC-1 et 1 x 106 CAhPSCs dans une suspension cellulaire de 50 μL.
- Gardez cette suspension sur la glace jusqu’à son utilisation.
- Préparer une armoire de biosécurité de classe II pour la procédure. Utilisez un tapis chauffant recouvert d’un rideau en plastique stérile. Pour le grossissement pendant la procédure, utilisez une paire de loupes chirurgicales à grossissement de 2,5x à 3,5x.
- Préparez des écouvillons de cordon de bourse en coupant un trou de 1 cm de diamètre dans un écouvillon de gaze. Fixez ce trou avec une suture de cordon de bourse. Toute suture fine tressée peut être utilisée pour cela (par exemple, suture à l’acide polyglycolique 5/0). Le matériau de suture tressé est recommandé car il permet au nœud lâche de rester en place après le serrage. Ceci est illustré à la figure 1a.
- Anesthésier la souris avec 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale.
- Administrer 5 mg/kg d’antibiothérapie prophylactique à l’enrofloxacine, 2,5 mg/kg d’analgésie à la flunixine et 1 ml de solution saline à 0,9 % par voie sous-cutanée.
- Une fois anesthésiée, placez la souris sur le champ stérile en décubitus dorsal et appliquez de la povidone-iode suivie de 70% d’éthanol pour la préparation de la peau.
- Faites une incision longitudinale dans la peau du quadrant crânien gauche de l’abdomen, puis entrez dans l’abdomen en incisant la couche musculaire entre les pinces.
- Chargez une seringue à insuline de 29 G avec 50 μL de suspension cellulaire, ce qui équivaut à 1 x10 6 CAhPSCs et 1 x 106 cellules AsPC-1 marquées à la luciférase par injection. Montez-le sur le dispositif d’injection. La conception et la fonction de ce dispositif d’injection sont expliquées en détail à la figure 1b et dans sa légende.
- Placez l’écouvillon de la bourse sur l’incision de la laparotomie, puis extériorisez la rate et la queue pancréatique par l’ouverture de cet écouvillon. Serrez le cordon de la bourse pour encercler doucement le corps du pancréas, exposant la queue pancréatique pour injection. Il est important d’être suffisamment serré pour que la gaze entre en contact avec le pancréas de manière circonférentielle tout en ne le resserrant pas.
- À l’aide d’une paire de pinces, saisissez la queue du pancréas et placez-y doucement une tension latérale. Percer la surface péritonéale ventrale avec l’aiguille à un angle peu profond, puis injecter la suspension cellulaire dans le pancréas de manière lente et contrôlée (plus de 10−15 s) avec le dispositif d’injection.
- Au cours du processus d’injection, observez attentivement les fuites, à la fois autour du site d’injection (à partir du reflux) et de l’autre côté du lobule pancréatique (en cas de pénétration à travers et à travers). Si une fuite visible se produit, arrêtez l’injection et notez le volume de fuite en vérifiant le volume d’injection restant dans la seringue. Si la fuite est de petit volume (<10 μL), puis absorbez toute fuite avec de la gaze et repositionnez l’aiguille dans un lobule pancréatique différent pour compléter l’injection.
- Remplacez la rate et le pancréas et fermez la paroi abdominale par une suture d’acide polyglycolique 5/0 de manière continue. Fermez la peau avec des clips.
- Surveillez la souris dans une cage réchauffée jusqu’à ce qu’elle soit remise de l’anesthésique. Une fois éveillé et alerte, ramenez la souris à sa cage.
2. Chirurgie de résection du cancer : Pancréatectomie distale et splénectomie
- Le moment de la résection par rapport à l’implantation peut varier selon le protocole expérimental. En général, permettre aux tumeurs de se développer au moins pendant 3 semaines avant la résection, mais optimiser empiriquement cela pour la lignée cellulaire cancéreuse implantée particulière.
- La veille de la chirurgie de résection, effectuez une imagerie par bioluminescence sur les animaux pour confirmer la présence d’une tumeur primaire localisée. Notez que cette étude d’imagerie est simplement utilisée pour exclure de la résection les souris atteintes d’une maladie extra-pancréatique évidente. Ni la taille ni le flux radiant ne devraient être utilisés comme seuils pour déterminer l’admissibilité à la résection.
- Peser les souris et injecter de la D-luciférine par voie intrapéritonéale (150 mg/kg).
- Déterminer le moment de l’étape d’imagerie par rapport à l’injection de luciférine pour chaque expérience par l’exécution d’une courbe cinétique de luciférine. La période de temps où le flux radiant est supérieur à 90% de son maximum représente le temps optimal pour l’imagerie par bioluminescence (dans cette expérience, 18 à 26 minutes après l’injection)
- Induire une anesthésie et maintenir l’utilisation d’isoflurane (4% et 3% avec de l’oxygène, respectivement) et effectuer l’imagerie à l’aide d’un dispositif d’imagerie bioluminescente (par exemple, IVIS Lumina II). Utilisez les paramètres d’exposition et de binning automatiques (cela peut toutefois être optimisé pour le flux radiant attendu).
- Préparer l’armoire de biosécurité de classe II pour la procédure. Utilisez un tapis chauffant recouvert d’un rideau en plastique stérile. Pour le grossissement pendant la dissection, utilisez une paire de loupes chirurgicales à grossissement de 2,5x à 3,5x.
- Anesthésier la souris avec 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale.
- Administrer 5 mg/kg d’antibiothérapie prophylactique à l’enrofloxacine, 2,5 mg/kg d’analgésie à la flunixine et 1 ml de solution saline à 0,9 % par voie sous-cutanée.
- Placez la souris sur le champ stérile en décubitus dorsal et appliquez de la povidone-iode suivie d’éthanol à 70% pour la préparation de la peau.
- Faire une incision longitudinale dans la peau du quadrant crânien gauche de l’abdomen, de préférence par le site d’incision précédent.
- Disséquer brutalement la peau de la paroi abdominale musculaire sous-jacente, puis placer un rétracteur auto-retenant Alm pour maintenir la plaie de la peau ouverte.
- Inciser la couche musculaire entre les pinces juste d’un côté de la ligne de suture de l’opération précédente, puis étendre l’incision pour exciser toute la ligne de suture précédente.
- Extérioriser la rate et le pancréas distal et le rétracter crânien. À l’aspect caudal du pancréas, les deux points peuvent être trouvés attachés par des adhérences filmiques. Si cela est trouvé, disséquer carrément le côlon.
- Passez soigneusement une paire de pinces dorsales au corps du pancréas et des vaisseaux spléniques et ouvrez cet espace. Cela libère un segment du pancréas pour une ligature ultérieure.
- Ligate le corps du pancréas proximal à la tumeur avec un clip titane de ligature, et puis transecter le pancréas distal à ceci avec la cautérisation. Une autre manière de contrôler le moignon pancréatique est de le ligater dans la continuité avec la suture acide polyglycolique 5/0 avant transection.
- Rétracter le pancréas caudalement et cautériser les vaisseaux gastrospléniques entre le pôle crânien de la rate et l’estomac.
- Retirer l’échantillon et confirmer l’hémostase.
- Fermez la paroi abdominale avec une suture d’acide polyglycolique 5/0 de manière continue. Fermez la peau avec des clips.
3. Prise en charge postopératoire
- Dans la période post-anesthésique immédiate (pour les deux procédures ci-dessus), surveiller la souris dans une cage réchauffée jusqu’à ce qu’elle soit récupérée de l’anesthésique. Une fois éveillé et alerte, ramenez la souris à sa cage. Dans la période postopératoire, surveillez les animaux pour la douleur et les signes de détresse. Administrer 0,05 mg/kg de buprénorphine par injection sous-cutanée et observer de près les animaux pendant 12 heures.
- Par la suite, surveillez quotidiennement le poids, l’apport alimentaire et l’activité des souris. Examinez les sites d’incision et palpez pour la taille de la tumeur. Enlever les clips cutanés le septième jour postopératoire.
- Euthanasier la souris si des extrémités sans cruauté sont atteintes. Ces critères d’évaluation sans cruauté comprennent : la perte de poids corporel >20 %, les caractéristiques de détresse incurable (y compris la posture voûtée, le manque de mouvement ou de toilettage) et la taille de la tumeur supérieure à 1 cm3 telle qu’estimée par palpation externe.
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Representative Results
Cinquante-neuf souris consécutives ont subi une chirurgie d’implantation. Une fuite grossière s’est produite dans huit (14 %) souris. Le degré de fuite au moment de l’injection est estimé comme décrit ci-dessus dans la section protocole. Après trois semaines pour permettre à ces tumeurs implantées de se développer, la formation image de bioluminescence de pré-résection a été exécutée pour exclure des souris avec la maladie métastatique brute avant la résection. Quarante-cinq (76 %) Les souris ont subi la résection chirurgicale.
Les 45 (100 %) Les souris ont subi pancreatectomy/splenectomy distal réussis sans des questions d’hémostase. Une marge pancréatique proximale macroscopique plus grande que 5 millimètres a été réalisée dans 43 (96%) souris.
À l’heure de la résection, la métastase locale a été trouvée dans 9/45 (20%) souris – principalement dans la ligne de suture (discontinue avec la tumeur primaire) avec trois des neuf montrant des nodules isolés supplémentaires sur la plus grande courbe de l’estomac et un montrant un nodule sous-capsulaire sur le foie. La tumeur pancréatique primaire était adhérente à la ligne de suture dans cinq (11%) et au foie dans un (2%) souris. Ces structures adhérentes ont été excisées en bloc.
Le temps moyen (SEM) de chirurgie (induction à la fermeture) était de 22 (0.9) minutes. Aucun des animaux n’est mort dans un délai de 1 semaine après la résection.
Une semaine après la résection, les souris ont subi une imagerie par bioluminescence pour détecter la maladie résiduelle. Le rapport de l’éclat maximal sur la surface ventrale de la souris a été comparé à celui de l’arrière-plan. Trente-deux (71 %) les souris avaient un rapport d’éclat maximal (souris : fond) de <10, indiquant une maladie résiduelle minimale ou nulle.
Figure 1 : Dispositifs sur mesure pour faciliter l’implantation tumorale. a)Écouvillon de gaze à cordes coulants: i) trou central d’environ 1 cm de diamètre, à travers lequel la queue pancréatique sera placée au moment de l’injection; ii) Suture à cordes de bourse autour du trou; iii) Gaze à double couche; iv) Nœud à jet unique; v) Un membre du matériau de suture est fixé à la gaze à l’munie d’un ruban indicateur de stérilisation; vi) Une poignée, fabriquée à partir de ruban indicateur, est façonnée à l’autre extrémité du matériau de suture. b)Dispositif d’injection: I) Seringue actionnante. Les fentes coupées à travers le corps de cette seringue permettent à la seringue d’injection (avec la suspension cellulaire injectée; non montrée) d’être montée sur ce corps de seringue; II) Seringue contrôleur. Ceci est rempli d’eau. La dépression du piston sur la seringue de contrôleur plus petite par l’assistant chirurgical provoque le déplacement du piston de seringue d’actionnement plus grand. Le déplacement du piston d’actionnement est plus petit, mais avec un avantage mécanique qui permet à l’injection de surmonter la résistance associée au mécanisme de la seringue d’injection ainsi que la résistance du tissu à l’expansion par l’injectate. Cela permet une injection précise et fluide de 50 μL sur 10 à 15 secondes; (III) Tubes de connexion en polytétrafluoroéthylène (PTFE) d’un diamètre intérieur de 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un modèle de souris orthotopic résectional de cancer pancréatique est important parce qu’il tient compte de l’essai des traitements auxiliaires et néoadjuvants. Ceci est particulièrement important dans le cancer du pancréas où la chirurgie reste le traitement le plus efficace, mais est associée à un risque élevé de récidive. Cet article décrit une méthode qui produira sûrement un cancer pancréatique qui est potentiellement curable avec la résection, reproduisant le scénario clinique où la thérapie neoadjuvant/auxiliaire est exigée.
Importance par rapport aux méthodes existantes
En dépit de l’importance des thérapies auxiliaires et neoadjuvant dans le cancer pancréatique, il y a peu de modèles de souris résectional orthotopic bien-décrits dans la littérature. Ces modèles résectionnels décrits variaient dans leur fidélité de réplication de la situation clinique chez l’homme. Ces modèles précédents peuvent être largement classifiés dans : (i) excision de tumeur seulement, avec des conseils de fluorescence ; (ii) résection pancréatique de total partiel sans le splenectomy ; (iii) pancreatectomy distal/splenectomy.
L’excision tumorale avec des conseils de fluorescence a été décrite dans le plus grand nombre de rapports15,17,18,19,20,21. Bon nombre de ces articles provenaient du même groupe de recherche. Malheureusement, chez l’homme, l’excision locale de la tumeur seule (énucléation) n’est pas réalisée pour l’adénocarcinome pancréatique (PC) en raison de la forte probabilité de récidive locale, ainsi que de l’incapacité d’évaluer le statut des ganglions lymphatiques22,23. Par conséquent, l’utilisation d’un groupe de comparaison non cliniquement pertinent (énucléation guidée par non-fluorescence) obscurcit la déclaration des résultats oncologiques dans les articles décrivant cette technique. Sans surprise, les groupes d’énucléation de non-fluorescence ont invariablement eu des taux excessifs de répétition locale15,20,21. En revanche, Torgenson et coll.14 ont décrit une technique de résection guidée par fluorescence similaire et ont signalé un taux de récurrence raisonnablement faible de 58 % (à huit semaines après la résection). Dans l’ensemble, ces études semblent démontrer l’utilité des conseils de fluorescence pour la visualisation de la maladie résiduelle pendant la chirurgie. Cependant, ce n’est pas encore la norme de soins chez l’homme, ce qui est une limitation en termes d’utilisation dans un modèle murin visant à reproduire le scénario clinique. Bien sûr, cela peut changer si la chirurgie guidée par fluorescence devait être largement adoptée dans la pratique clinique.
Un autre modèle de résection a été basé sur le sous-total pancréatectomie sans splénectomie pour une tumeur implantée dans le corps du pancréas13,24. La pertinence clinique de ceci est également remise en question car l’opération décrite n’était ni un pancreaticoduodenectomy ni un pancreatectomy distal comme exécuté chez l’homme. Sans surprise, ces souris ont également souffert des taux élevés de répétition de tumeur, à la fois distant et local. De la note particulière est que la répétition splénique était commune, suggérant la résection inadéquate ou l’ensemencement péritonéal possible de tumeur à l’implantation24.
Ni et coll.16 ont décrit un modèle pancréatologique/splénectomie distal réalisé avec des conseils d’imagerie par fluorescence. Décevant, en dépit de l’utilisation d’une opération médicalement appropriée (avec des conseils de fluorescence), la survie était très courte (survie moyenne de 18 jours), même dans le groupe pancreatectomy distal. Ce degré de maladie progressive semble être encore pire que les modèles de traitement palliatif25,26,27,suggérant la présence possible de la maladie résiduelle brute après résection. Plus récemment, Giri et coll.28 ont signalé un modèle murin pancréctomie distale et de splénectomie partielle. Cette étude est remarquable en ce qu’elle représente un modèle murin immunocompétent du cancer. Cependant, cette étude a rapporté la répétition locale et autre intrapéritonéale presque universelle de tumeur, indiquant probablement la métastase iatrogenic occulte à l’implantation.
L’utilisation de modèles murins où il y a une maladie résiduelle brute après la résection pour tester des traitements adjuvants peut être inappropriée. Le problème est que le traitement de la maladie résiduelle brute ne peut pas vraiment être classé comme traitement adjuvant, mais devrait plutôt être considéré comme un traitement à intention palliative. Dans ce cas, de tels modèles murins n’offrent aucun avantage par rapport aux modèles non résectionnels avec une maladie à faible volume.
Conseils et pièges des étapes critiques
Procédure d’implantation tumorale
Afin de reproduire le scénario clinique, il y a des défis distincts dans ce modèle qui se rapportent aux procédures d’implantation et de résection. Pour la procédure d’implantation, les défis majeurs qui doivent être surmontés sont l’implantation réussie et la prévention des fuites. Ces deux questions sont interdépendantes car l’échec de l’injection aurait comme conséquence la fuite brute de la suspension de cellules de tumeur dans la cavité abdominale. Ceci produirait un modèle de souris avec la métastase péritonéale, qui progressera indépendamment de la résection pancréatique. Ceci reflète le scénario clinique bien connu chez l’homme où la résection pancréatique dans le PC métastatique n’affecte pas les résultats patients. C’est la base de la laparoscopie de stadification chez l’homme29.
Le succès de l’implantation de la tumeur peut être vu peropératoirement comme génération réussie d’une « bulle » de suspension cellulaire sans fuite évidente. Le placement précis de l’aiguille dans le parenchyme pancréatique est le plus important pour obtenir un bon résultat. Cela ne pourrait être réalisé qu’en « étirant » le pancréas de sorte que la surface péritonéale soit tendue. La ponction doit se produire avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut (ventralement). Une fois que l’aiguille perce la surface péritonéale, elle doit être avancée pendant que l’extrémité de l’aiguille est légèrement soulevée de sorte que la surface biseautée glisse juste sous le péritoine. Cela empêchera la perforation accidentelle du pancréas, un piège courant dû aux petites dimensions des lobules pancréatiques de la souris. Une fois que le biseau entier est dans la substance du pancréas, la suspension cellulaire est injectée. Le grossissement de la vision avec des loupes chirurgicales est fortement souhaitable pour visualiser avec précision la profondeur de la pénétration de l’aiguille.
Un certain nombre de techniques peuvent être utilisées pour réduire davantage le risque de fuite accidentelle.
Sélection d’un grand lobule pour injection. Les petits lobules nécessitent des pressions plus élevées pour gonfler (selon la loi de Laplace), augmentant ainsi le risque de fuite autour de l’aiguille au site de ponction.
Optimisation de la vitesse d’injection. L’utilisation d’un dispositifd’injection (figure 1b)qui permet d’injecter la suspension cellulaire sur 10 à 15 secondes sert à trois fins. Tout d’abord, il diminue le taux de changement de pression dans le pancréas, donnant aux tissus le temps de se déformer et réduit le risque de reflux de la suspension. Deuxièmement, il permet de surveiller le processus d’injection et, si nécessaire, d’arrêter et de repositionner l’aiguille. Toute fuite peut être nettoyée par une gaze imbibée de povidone-iode. Troisièmement, il libère l’opérateur de la nécessité de baisser le piston, ce qui lui permet de se concentrer sur le maintien de la pointe de l’aiguille dans le pancréas pendant que l’assistant injecte la suspension cellulaire.
Utilisation d’une gaze à cordon de bourse à double couche. Cette gaze forme un collier autour de la queue pancréatique qui absorbera toute fuite de la suspension cellulaire et minimisera donc la contamination dans la cavité abdominale.
Certaines études dans la littérature ont utilisé un mélange de matrice extracellulaire (Matrigel) qui se solidifie avec le temps après l’injection13,15,24. Cela peut réduire le risque de fuite après l’injection. Cependant, un inconvénient potentiel de cette stratégie est que Matrigel ou d’autres solutions matricielles extracellulaires similaires peuvent exercer des effets non physiologiques sur les CSP30. Par exemple, Il a été démontré que Matrigel rend les CSP tranquilles, annulant ainsi potentiellement les effets des CSP dans le modèle31,32. Une alternative à l’injection de cellules cancéreuses est l’implantation orthotopique de tissu tumoral (soit directement à partir de patients, soit à partir de modèles murins sous-cutanés). Toutefois, ces approches ont leurs propres inconvénients. Premièrement, l’hétérogénéité peut résulter d’une erreur d’échantillonnage ou de variations dans le volume de tissu implanté. Une telle hétérogénéité peut réduire la puissance des comparaisons ultérieures de traitement. Deuxièmement, le passaging du tissu tumoral avec un modèle murin sous-cutané peut mener à la sélection des sous-clones qui ont des comportements biologiques différents de la tumeur patiente originale.
Procédure de résection tumorale
Dans ce modèle, nous avons utilisé un procédé distal de pancreatectomy/splenectomy semblable à cela exécuté chez l’homme. Les défis relatifs à la chirurgie de résectional dépendent des facteurs pathologiques et anatomiques.
Le facteur pathologique clé est la dissémination tumorale. La basse diffusion locale de volume peut être réséquée à l’heure de la résection pancréatique, bien qu’elle puisse indiquer la possibilité de métastase péritonéale et autre plus éloignée. Nous excédons par habitude la ligne de suture de la première opération car c’est un secteur possible de répétition locale. Si la tumeur est attachée aux structures environnantes, telles que la paroi abdominale ou le lobe gauche du foie, celles-ci peuvent être réséquées en bloc. Anatomiquement, l’étape clé est de disséquer le plan dorsal au corps du pancréas. La veine splénique peut souvent être visualisée derrière le pancréas une fois que le pancréas est extériorisé. C’est un point de repère clé, car le plan embryologique sans effusion de sang est immédiatement dorsal à cela.
Il y a deux autres pièges anatomiques potentiels dans le modèle décrit ici. Le côlon peut adhérer à l’aspect caudal du corps pancréatique. Le manque de mobiliser cette structure loin a pu mener aux dommages du côlon négligents à l’heure de la division pancréatique ou de la ligature. Les vaisseaux gastrospléniques sont petits et peuvent facilement saigner s’ils sont avulsés ou insuffisamment cautérisés. En outre, une fois avulsed, le point de saignement se rétracte souvent profondément dans l’abdomen derrière la plus grande courbe de l’estomac, rendant le contrôle ultérieur des saignements plus difficile. Par conséquent, une rétraction soigneuse de la rate et une cautérisation des vaisseaux gastrospléniques sont nécessaires. Une approche pour le hemostasis réussi est de cautériser ces navires sur l’aspect hilar de la rate qui réduit au minimum le risque de dommages thermiques négligents aux viscères creux environnants.
Nous avons constaté que l’utilisation d’un clip de ligature en titane, largement utilisé en chirurgie humaine pour la ligature des vaisseaux, est un moyen rapide et efficace de contrôler le moignon pancréatique, avec une réduction conséquente du temps opératoire total par rapport à l’utilisation de ligatures. Cela a également été utilisé par Giri et al.28.
Limites de la technique
Il y a des limites à ce modèle résectional du pancréas. Une limitation concerne le temps accordé pour produire la récurrence/métastase. D’une part, il faut maximiser le développement de la maladie métastatique, mais d’autre part, il faut réséquer la tumeur avant qu’elle ne devienne localement avancée. La période entre l’implantation et la résection peut donc devoir être ajustée pour le scénario clinique particulier que l’on souhaite reproduire. Une autre limitation se rapporte au déversement négligent et à la métastase péritonéale suivante des cellules cancéreuses qui est discutée ci-dessus.
Un défi majeur des modèles de traitement auxiliaire est de disséquer l’effet adjuvant de traitement de l’effet chirurgical de traitement. Clairement, une étude bien conçue qui est randomisée, avec un groupe témoin subissant la chirurgie de résection est exigée. Pour améliorer davantage l’évaluation des effets relatifs du traitement, nous vous suggérons d’évaluer la charge tumorale in vivo (par exemple, en utilisant des cellules cancéreuses marquées par luciférase et en effectuant une imagerie par bioluminescence in vivo). Malgré la nature semi-quantitative de cette évaluation dans les modèles orthotopiques (car le signal de bioluminescence est atténué par le passage à travers les tissus terrestres), cette approche permet une évaluation longitudinale de la charge tumorale, y compris l’évaluation de la maladie résiduelle post-chirurgicale.
Modifications et applications futures
La lignée cellulaire implantée et/ou les numéros de cellules avec ou sans cellules étoilées pancréatiques pourraient être modifiés pour refléter le scénario clinique cible12. La durée entre l’implantation et la résection a également pu être modifiée pour changer le risque de formation de métastases. D’autres variantes pourraient inclure l’implantation de xénogreffes ou d’organoïdes dérivés de patients ou de souris33.
La thérapie néoadjuvante peut également être testée dans les caractéristiques de base du modèle décrit ici. Il faudrait simplement commencer le traitement médicamenteux avant la résection chirurgicale34. De même, le traitement néoadjuvant et adjuvant a pu être étudié chez les mêmes souris.
Enfin, alors que nous avons décrit l’utilisation de souris nues athymiques Balb/c qui représente un modèle immunodéficitaire, un modèle immunocompétent alternatif peut impliquer des cellules tumorales KPC implantées sur des souris C57B628. Ceci peut être une alternative utile pour l’essai des thérapies immunitaires auxiliaires/néoadjuvantes.
En résumé, nous décrivons une technique robuste et reproductible pour un modèle chirurgical de résection du cancer pancréatique chez la souris qui imite le scénario clinique et ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Ce modèle peut être utile pour l’essai des traitements adjuvants et néoadjuvants.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer en ce qui concerne ce projet.
Acknowledgments
Les auteurs ont reçu le soutien de la Fondation avner du cancer pancréatique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
- Noone, A. M., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute. , Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2015/ (2018).
- Sugiura, T., et al. Margin status, recurrence pattern, and prognosis after resection of pancreatic cancer. Surgery. 154 (5), 1078-1086 (2013).
- Hishinuma, S., et al. Patterns of recurrence after curative resection of pancreatic cancer, based on autopsy findings. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (4), 511-518 (2006).
- NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology - Pancreatic Adenocarcinoma (Version 3.2019). National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Breslin, T. M., et al. Neoadjuvant chemoradiotherapy for adenocarcinoma of the pancreas: treatment variables and survival duration. Annals of Surgical Oncology. 8 (2), 123-132 (2001).
- Mokdad, A. A., et al. Neoadjuvant Therapy Followed by Resection Versus Upfront Resection for Resectable Pancreatic Cancer: A Propensity Score Matched Analysis. Journal of Clinical Oncology. 35 (5), 515-522 (2017).
- Tachezy, M., et al. Sequential neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT) followed by curative surgery vs. primary surgery alone for resectable, non-metastasized pancreatic adenocarcinoma: NEOPA- a randomized multicenter phase III study (NCT01900327, DRKS00003893, ISRCTN82191749). BMC Cancer. 14, 411 (2014).
- Barbour, A. P., et al. The AGITG GAP Study: A Phase II Study of Perioperative Gemcitabine and Nab-Paclitaxel for Resectable Pancreas Cancer. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (12), 5645-5649 (1992).
- Marincola, F., Taylor-Edwards, C., Drucker, B., Holder, W. D. Orthotopic and heterotopic xenotransplantation of human pancreatic cancer in nude mice. Current Surgery. 44 (4), 294-297 (1987).
- Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Research. 68 (7), 2085-2093 (2008).
- Xu, Z., et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. American Journal of Pathology. 177 (5), 2585-2596 (2010).
- Tepel, J., et al. Adjuvant treatment of pancreatic carcinoma in a clinically adapted mouse resection model. Pancreatology. 6 (3), 240-247 (2006).
- Torgenson, M. J., et al. Natural history of pancreatic cancer recurrence following "curative" resection in athymic mice. Journal Surgical Research. 149 (1), 57-61 (2008).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models. Journal of the American College of Surgeons. 215 (1), 126-135 (2012).
- Ni, X., Yang, J., Li, M. Imaging-guided curative surgical resection of pancreatic cancer in a xenograft mouse model. Cancer Letters. 324 (2), 179-185 (2012).
- Hiroshima, Y., et al. Hand-held high-resolution fluorescence imaging system for fluorescence-guided surgery of patient and cell-line pancreatic tumors growing orthotopically in nude mice. Journal of Surgical Research. 187 (2), 510-517 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model is inhibited by neoadjuvant chemotherapy in combination with fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore. PLoS One. 9 (12), 114310 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. PLoS One. 9 (6), 99977 (2014).
- Metildi, C. A., et al. Ratiometric activatable cell-penetrating peptides label pancreatic cancer, enabling fluorescence-guided surgery, which reduces metastases and recurrence in orthotopic mouse models. Annals of Surgical Oncology. 22 (6), 2082-2087 (2015).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery with a fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA), that highlights the tumor, improves surgical resection and increases survival in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer. Annals of Surgical Oncology. 21 (4), 1405-1411 (2014).
- NCCN Guidelines: Pancreatic Adenocarcinoma. National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Maithel, S. K., Allen, P. J. Blumgart's Surgery of the Liver, Biliary Tract and Pancreas, 2-Volume Set (Sixth Edition). Jarnagin, W. R. , Content Repository Only 1007-1023 (2017).
- Egberts, J. H., et al. Dexamethasone reduces tumor recurrence and metastasis after pancreatic tumor resection in SCID mice. Cancer Biology & Therapy. 7 (7), 1044-1050 (2008).
- Xu, Z. H., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway in advanced pancreatic cancer: a key element of treatment that limits primary tumor growth and eliminates metastasis. British Journal of Cancer. , (2020).
- Pothula, S. P., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway: stromal remodelling in pancreatic cancer. Oncotarget. 8 (44), 76722-76739 (2017).
- Pothula, S. P., et al. Hepatocyte growth factor inhibition: a novel therapeutic approach in pancreatic cancer. British Journal of Cancer. 114 (3), 269-280 (2016).
- Giri, B., et al. An Immunocompetent Model of Pancreatic Cancer Resection and Recurrence. Journal of Gastrointestinal Surgery. , (2020).
- Allen, V. B., Gurusamy, K. S., Takwoingi, Y., Kalia, A., Davidson, B. R. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. (11), 009323 (2013).
- Vaillant, F., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Jekyll or Hyde: does Matrigel provide a more or less physiological environment in mammary repopulating assays. Breast Cancer Research. 13 (3), 108 (2011).
- Jesnowski, R., et al. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Laboratory Investigation. 85 (10), 1276-1291 (2005).
- Phillips, P. A., et al. Cell migration: a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut. 52 (5), 677-682 (2003).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Egberts, J. H., et al. Superiority of extended neoadjuvant chemotherapy with gemcitabine in pancreatic cancer: a comparative analysis in a clinically adapted orthotopic xenotransplantation model in SCID beige mice. Cancer Biology & Therapy. 6 (8), 1227-1232 (2007).
