Summary
임상 맥락에서, 국소췌암을 가진 환자는 부주 처리를 선행한 pancreatectomy를 겪게 될 것입니다. 여기에서 보고된 이 프로토콜은 말단 판생성 절제술 및 비장 절제술다음에 췌장암의 정형소 이식을 통해 누드 마우스에서 이 임상 시나리오를 모델링하는 안전하고 효과적인 방법을 확립하는 것을 목표로 합니다.
Abstract
췌장암(PC)의 수술을 고려중인 환자에서 보조 및/또는 신아주반트 요법을 연구하는 만족스러운 동물 모델의 부족이 있습니다. 이 결핍을 해결하기 위해, 우리는 말단 pancreatectomy 및 비장 절제술 다음에 PC의 직교 이식을 포함하는 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 보조 및 네오 보조 제 설정에서 다양한 치료 접근법의 연구에 안전하고 적절하게 유연하다는 것이 입증되었습니다.
본 모델에서 췌장종양은 인간 췌장암세포(luciferase-tagged AsPC-1) 및 인간암 관련 췌장 스텔레이트 세포를 Balb/c 아티믹 누드 마우스의 황실 췌장에 이식하여 먼저 생성된다. 3 주 후, 암은 재복복절, 해장 판 절제술 및 비장 절제술에 의해 제복됩니다. 이 모델에서, 생물 발광 화상 진찰은 암 발달의 진행 및 절제술/처리의 효력을 따르기 위하여 이용될 수 있습니다. 절제술 후 보조 요법을 받을 수 있습니다. 대안적으로, 네오아드주반트 치료는 절제 전에 투여될 수 있다.
45마우스의 대표적인 데이터가 제시된다. 모든 마우스는 hemostasis의 문제 없이 성공적인 말단 pancreatectomy/비장 절제술을 겪었습니다. 5mm를 초과하는 거시적 근위 췌장 마진은 43(96%)에서 달성되었습니다. 마우스. 췌장 절제술의 기술적 성공률은 100%였으며 0%의 조기 사망률과 이환율이었습니다. 절제술 후 일주일 동안 동물중 누구도 죽지 않았습니다.
요약하자면, 우리는 임상 시나리오를 모방하는 마우스에 있는 췌장암의 외과 절제술 모형을 위한 강력하고 재현가능한 기술을 기술합니다. 이 모델은 보조 및 신아주반트 치료의 테스트에 유용할 수 있다.
Introduction
췌장 덕트 아데노암 (췌장암 [PC])은 가난한 예후1과관련이 있다. 외과 절제술은 PC를 위한 유일한 잠재적으로 치료 처리 남아 있고 초기 단계 질병으로 제출하는 환자를 위해 고려되어야 합니다. 불행히도, R0 절제(즉, 종양이 없는 절제 마진)에서도 재발률(국소 또는 검출되지 않은 전이성 질환)은2,3이다. 따라서, 전신 보조요법은 절제술4를겪는 거의 모든 환자에서 표시된다. 더욱이, 네오아드주반트 요법은 이제 경계선 절제암에대해서만 권장되지만, 그 증상은 많은 임상 연구의 초점이될 정도로 확장되고 있다5,6,7,8. 절제술을 포함하는 PC를 위한 새로운 치료 접근을 개발하기 위하여는, 이 접근은 정확하게 임상 설정을 회수하는 전 임상 모형에서 첫째로 평가될 필요가 있습니다.
PC의 직교 마우스 모델은 과거에 약물 치료9,10을테스트하는 데 자주 사용되어 왔다. 이들 중 많은 마우스 췌장에 혼자 암 세포의 주입에 의해 생산 되었다, PC의 특징인 눈에 띄는 스트로마 부족 종양의 결과. 최근에는 인간 PC와 인간 췌장 스텔레이트 셀(PC내 콜라주기의 1차 생산업체인 PSC)의 혼합물을 주입하여 처음 개발한 것과 같은 공동 주입 직교 모델들이 정기적으로 사용되어11,12로정기적으로 사용된다. 이러한 암 및 기질 세포의 공동 주입에 의해 생성된 종양은 (i) PC의 암 원소 및 특성 기질(desmoplastic) 성분을 모두 나타내며, (ii) 향상된 암세포 증식 및전이(11). 따라서 이 모델은 인간 PC와 매우 유사합니다. 정형PC의 다수의 절제 모델이13,14,15,16으로설명되었지만, 인간에서 췌장 절제술의 임상적 현실을 본 모델만큼 정확하게 반영한 사람은 없으며, 따라서 보조제 또는 신아주반트 치료를 테스트하기 위한 최적이 아니다.
제시된 마우스 모형의 목적은 (i) 성공적으로 자궁경부 췌장암을 이식하는 방법을 보여주기 위한 것이었으며, 부주의한 회대 보급을 최소화하고 (ii) 이후에 암을 완전히 절제술하였다. 이 문서는 이 기술의 팁과 잠재적인 함정을 강조합니다.
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Protocol
모든 절차는 뉴 사우스 웨일즈 대학의 동물 관리 및 윤리위원회 (17/109A)에 의해 승인되었습니다. 16-19g의 8-10주 나이 든 암컷 아티믹 Balb/c 누드 마우스가 이 프로토콜에 사용되었습니다. 마우스는 마이크로 이솔레이터 케이지에 보관되었고 시판되는 펠릿 식품및 물 광고 리비툼을공급하였다.
1. 정형외 췌장암 이식
- 이식을 위해 세포를 준비합니다. 먼저, 절차에 필요한 세포 수를 계산합니다(1 x 106 luciferase 태그된 AsPC-1 세포 및 1 x 106 암 관련 인간 췌장 스텔레이트 세포 [CAhPSC]는 각 동물에 대해 필요합니다).
- 가습 된 온도 제어 CO2 인큐베이터에서 이러한 세포를 유지하고 일상적인 마이코 플라즈마 테스트를 수행합니다. AsPC-1 및 CAhPSC에 사용되는 배양 배지는 RPMI 1640(300 mg/L-글루타민, 20% v/v 태아 소 혈청, 1% v/v 페니실린/스트렙토마이신) 및 IMDM(4m L-글루타민, 10% v/v 태아 소 혈청, 1% v/v/v 페니실린/연쇄절제술).
- 표준 세포 배양 기술을 사용하여 세포를 세포 현탁액으로 시험시화합니다. 트립신 용액의 두 배에서 각각의 완전한 배양 배지를 사용하여 트립신을 중화시다.
- 인산염 완충식식염(PBS)으로 이 세포를 두 번 세척하고 50 μL 세포 현탁액에서 1 x 106 AsPC-1 셀과 1 x 106 CAhPSC를 포함하는 혼합물로 다시 중단한다.
- 이 서스펜션을 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
- 절차에 대한 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 준비합니다. 멸균 플라스틱 커튼에 겹쳐진 가열 매트를 사용하십시오. 시술 중 배율의 경우 2.5x에서 3.5배 배율 수술용 루페 쌍을 사용하십시오.
- 직경 1cm의 구멍을 거즈 면봉으로 자르면 지갑 끈 면봉을 준비합니다. 지갑 끈 봉합사로 이 구멍을 고정하십시오. 모든 미세 편조 봉합사는 이것에 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 5/0 폴리 글리콜산 봉합사). 조임 후 느슨한 매듭이 제자리에 머무를 수 있으므로 편조 봉합사 소재를 추천합니다. 이것은 도 1a에설명되어 있습니다.
- 쥐를 80 mg/kg의 케타민과 10 mg/kg의 자일라진 주사로 마취시킵니다.
- 투여 5 mg/kg enrofloxacin 항생제 예방, 2.5 mg/kg 플루닉스진 진통 및 1 mL의 0.9% 식염수 피하.
- 일단 마취되면, 마우스를 멸균 장에 놓고 포비도네 요오드를 적용한 다음 피부 준비를 위해 70% 에탄올을 적용합니다.
- 복부의 왼쪽 두개골 사분면의 피부에 세로 절개를 한 다음 집게 사이의 근육 층을 절개하여 복부를 입력합니다.
- 29 G 인슐린 주사기를 50 μL의 세포 서스펜션으로 로드합니다-이것은 인젝트당 1 x 106 CAhPSC 및 1 x 106 루시파라제 태그된 AsPC-1 세포와 동일합니다. 사출 장치에 장착합니다. 이 주입 장치의 설계 및 기능은 그림 1b와 그 전설에 자세히 설명되어 있습니다.
- 지갑 끈면봉을 복강경 절개 위에 놓고 비장과 췌장 꼬리를 이 면봉의 개통을 통해 외부화합니다. 지갑 끈을 조여 췌장의 본체를 부드럽게 둘러싸고 췌장 꼬리를 주입합니다. 거즈가 췌장에 대접하는 동시에 수축하지 않을 정도로 단단하게 하는 것이 중요합니다.
- 한 쌍의 집게를 사용하여 췌장의 꼬리를 잡고 측면 의 장력을 부드럽게 배치합니다. 얕은 각도에서 바늘로 복부 간음 표면에 구멍을 뚫은 다음 주사 장치와 함께 느리고 제어 된 방식으로 췌장에 세포 현탁액을 주입합니다.
- 주입 과정에서, 신중하게 누출에 대 한 관찰-주사 사이트 주위 (역류에서) 췌 장 소의 반대편에 (관통 및 관통의 경우). 눈에 보이는 누출이 발생하면 주사를 멈추고 주사기에 남은 주사의 양을 확인하여 누설의 양을 기록하십시오. 누설이 소량(<10 μL)인 경우 거즈로 누설을 흡수한 다음 바늘을 다른 췌장 로뷸러로 재배치하여 주사를 완료합니다.
- 비장과 췌장을 교체하고 복부벽을 5/0 폴리글리콜산 봉합사로 연속하여 닫습니다. 클립으로 피부를 닫습니다.
- 마취에서 회복 될 때까지 따뜻하게 된 케이지에서 마우스를 모니터링합니다. 일단 깨어 있고 경고하면 마우스를 다시 케이지로 옮습니다.
2. 암 절제술 수술 : 실산 췌장 절제술 및 비장 절제술
- 이식과 관련하여 절제의 타이밍은 실험 프로토콜에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 종양이 절제 전에 적어도 3 주 동안 성장하도록 허용하지만, 특정 이식 된 암 세포주에 대해 경험적으로 최적화.
- 절제 수술 전날, 동물에 대한 생물 발광 이미징을 수행하여 국소화된 1차 종양의 존재를 확인합니다. 이 화상 진찰 연구 결과는 단순히 절제에서 명백한 엑스트라 췌장 질병을 가진 마우스를 제외하기 위하여 이용됩니다. 크기나 복사플럭스를 절제 자격을 결정하기 위한 임계값으로 사용해서는 안 됩니다.
- 쥐의 무게와 D-루시페린 내과 함께 주입 (150 mg/kg).
- 루시페린 운동 곡선의 성능에 의해 각 실험에 대한 루시페린 주입과 관련하여 이미징 단계의 타이밍을 결정한다. 복사 플럭스가 최대의 90% 이상이되는 기간은 생체 발광 이미징에 대한 최적의 시간을 나타냅니다(이 실험에서 18~26분 후 주입).
- 마취를 유도하고 이소플루란(각각 4% 및 3%의 산소)을 사용하여 유지하며 생물발광성 이미징 장치(예를 들어, IVIS Lumina II)를 사용하여 이미징을 수행합니다. 자동 노출 및 비닝 설정을 사용합니다(그러나 예상되는 복사 플럭스에 최적화될 수 있음).
- 절차에 대한 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 준비합니다. 멸균 플라스틱 커튼에 겹쳐진 가열 매트를 사용하십시오. 해부 중 배율의 경우 2.5x에서 3.5배 배율 수술용 루페 쌍을 사용하십시오.
- 쥐를 80 mg/kg의 케타민과 10 mg/kg의 자일라진 주사로 마취시킵니다.
- 투여 5 mg/kg enrofloxacin 항생제 예방, 2.5 mg/kg 플루닉스진 진통 및 1 mL의 0.9% 식염수 피하.
- 마우스를 멸균 장에 놓아 수핀 위치에 놓고 포비도요오드를 바르고 피부 준비를 위해 70% 에탄올을 적용합니다.
- 복부의 왼쪽 두개골 사분면의 피부에 세로 절개를, 바람직하게는 이전 절개 부위를 통해.
- 근본적인 근육 복벽에서 피부를 무뚝뚝하게 해부한 다음 Alm 자가 유지 리트랙터를 배치하여 피부 상처를 열어 놓습니다.
- 이전 작업의 봉합선의 한쪽에 집게 사이의 근육 층을 절인 다음 절개를 확장하여 이전 봉합사 라인 전체를 축출한다.
- 비장과 말단 췌장을 외부화하고 craniis로 철회하십시오. 췌장의 소달 양상에서, 결장은 필름 접착에 의해 부착된 것을 발견할 수 있다. 이 발견 되면 결장의 결장해제를 무뚝뚝하게 해부합니다.
- 조심스럽게 한 쌍의 집게 를 췌장과 비장 용기의 몸에 전달하고이 공간을 엽니다. 이렇게 하면 후속 결찰을 위해 췌장 세그먼트가 확보됩니다.
- 췌장의 본체를 티타늄 결찰 클립으로 종양으로 옮기고, 배설물을 소터리와 함께 이것으로 변환합니다. 췌장 그루터기를 제어하는 또 다른 방법은 트랜섹션 전에 5/0 폴리글리콜산 봉합사로 연속성을 유지하는 것입니다.
- 췌장을 소생시키고 비장의 두개골 장대와 위 사이의 위장 혈관을 소생시킵니다.
- 시편을 제거하고 해모를 확인합니다.
- 5/0 폴리글리콜산 봉합사로 복벽을 연속하여 닫습니다. 클립으로 피부를 닫습니다.
3. 수술 후 관리
- 즉각적인 포스트 마취 기간 (위의 절차 모두에 대해) 마취에서 회복 될 때까지 따뜻하게 된 케이지에서 마우스를 모니터링하십시오. 일단 깨어 있고 경고하면 마우스를 다시 케이지로 옮습니다. 수술 후 기간에 동물에게 통증과 고통의 징후를 모니터링하십시오. 피하 주사에 의해 0.05 mg/kg buprenorphine를 관리하고 밀접하게 12 시간 동안 동물을 관찰.
- 그 후, 체중, 음식 섭취 및 활동에 대 한 매일 쥐를 모니터링. 절개 부위를 검사하고 종양 크기에 대한 각지. 수술 후 일곱 번째 날에 피부 클립을 제거합니다.
- 인도적 엔드포인트에 도달하면 마우스를 안락사시합니다. 이러한 인도적 종점은 다음과 같습니다 : 체중 >20%, 치료 할 수없는 고민의 특징 (구부러진 자세, 운동 또는 그루밍의 부족 포함) 및 외부 심백에 의해 추정된 1cm3 보다 큰 종양 크기.
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Representative Results
59마리의 연속 마우스가 이식 수술을 받았습니다. 총 누출은 8명(14%)에서 발생했습니다. 마우스. 주사 시의 누설 정도는 프로토콜 섹션에 상술한 바와 같이 추정된다. 이러한 이식된 종양이 증가할 수 있도록 3주 후, 절제 전 생물발광 이미징은 절제 전에 총 전이성 질환을 가진 마우스를 배제하기 위해 수행되었다. 45명 (76%) 마우스는 외과 절제술을 받았습니다.
모든 45 (100%) 마우스는 해모증의 문제 없이 성공적인 말단 판절제술/비장 절제술을 받았습니다. 5mm를 초과하는 거시적 근위 췌장 마진은 43(96%)에서 달성되었습니다. 마우스.
절제술 시, 지역 전이9/45 (20%)에서 발견되었습니다. 마우스 – 주로 봉합사 선 (1 차 종양으로 불연속) 9의 3 위장의 큰 곡선에 추가 고립 된 결절을 보여주는 하나 간상한 결절을 보여주는 하나. 1차 췌장종양은 5명(11%)에서 봉합사라인을 부착하였다. 마우스와 간을 1개(2%) 마우스. 이러한 신봉구조는 en bloc을절제하였다.
평균 (SEM) 수술 시간 (폐쇄 유도) 22 (0.9) 분이었다. 절제술 후 1주일 이내에 사망한 동물은 없습니다.
1 주일 후 절제술, 마우스는 잔류 질병을 검출하기 위하여 생물 발광 화상 진찰을 겪었습니다. 마우스의 복부 표면에 대한 최대 광채의 비율은 배경의 비율과 비교되었다. 32명 (71%) 마우스는 <10의 최대 광채 비율(마우스:배경)을 가졌으며, 이는 최소또는 잔류 질환을 나타내지 않았다.
그림 1: 종양 이식을 용이하게 하기 위해 맞춤형 장치. (a)지갑 끈 거즈 면봉 : (i) 중앙 구멍, 직경 약 1cm, 췌장 꼬리는 주사 시에 배치될 것이다; (ii) 구멍 주위의 지갑 끈 봉합사; (iii) 이중 층 거즈; (iv) 단일 던지기 매듭; (v) 봉합사 물질의 1개의 사지가 살균 표시기 테이프로 거즈에 고정되어; (vi) 표시기 테이프로 만든 손잡이는 봉합사 재료의 다른 쪽 끝에 서식합니다. (b)주사 장치 : (I) 주사기를 작동. 이 주사기의 본체를 통해 절단 슬롯은 주사 주사기 (셀 서스펜션 주사와 함께, 표시되지 않음)이 주사기 본문에 장착 할 수 있습니다; (II) 컨트롤러 주사기. 이것은 물로 가득합니다. 수술 조수에 의해 작은 컨트롤러 주사기에 플런저의 우울증은 더 큰 작동 주사기 플런저의 변위를 일으키는 원인이됩니다. 작동 플런거의 변위는 작지만, 주사 주사기 메커니즘과 관련된 저항뿐만 아니라 주사에 의한 팽창에 대한 조직의 저항을 극복할 수 있는 기계적 이점이 있다. 이를 통해 10-15초 동안 50 μL을 정밀하고 매끄럽게 주입할 수 있습니다. (III) 내부 직경 0.5mm의 다각형 플루오로틸렌(PTFE) 연결 튜브는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
췌장암의 절제 성 교정 마우스 모델은 보조 및 신아주반트 치료의 검사를 허용하기 때문에 중요합니다. 이것은 수술이 가장 효과적인 처리남아 그러나 재발의 고위험과 연관되는 췌장암에서 특히 중요합니다. 이 논문은 신중하게 절제술로 치료 할 수있는 췌장암을 안정적으로 생성하는 방법을 설명하며, neoadjuvant / 보조 치료가 필요한 임상 시나리오를 복제합니다.
기존 방법에 대한 중요성
췌장암에서 보조및 신학 치료의 중요성에도 불구하고, 문학에 있는 몇몇 잘 기술된 치열 교정 절제술 마우스 모형이 있습니다. 이 설명된 절제 모형은 인간에 있는 임상 상황의 복제의 그들의 충실도에서 변화했습니다. 이러한 이전 모델은 광범위하게 분류 될 수있다: (i) 종양 절제만, 형광 지침; (ii) 비장 절제술없이 하위 총 췌장 절제술; (iii) 실태적인 범분 절제술/비장 절제술.
형광 유도를 가진 종양 절제는보고15,17,18,19,20,21의가장 큰 수로 기술되었다. 이 논문의 대부분은 동일한 연구 그룹에서 유래. 불행하게도, 인간에서는, 종양의 국소 절제만으로는 췌장 선암(PC)에 대해 수행되지 않는 국소 재발의 높은 가능성뿐만 아니라 림프절 상태를 평가할 수 없는22,23. 따라서, 비임상적으로 관련된 비교기 군(비형광 유도 enucleation)의 사용은 이 기술을 설명하는 논문에서 종양학 결과의 보고를 흐리게 한다. 당연히, 비형광 방출 단은 변함없이 국소 재발의 과도한 비율을 가졌다15,20,21. 대조적으로, Torgenson외. 14 유사한 형광 유도 절제 기술을 설명하고, 58 %의 합리적으로 낮은 재발률을보고 (8 주 후 절제시). 전반적으로, 이 연구 결과는 수술 도중 잔류 질병의 시각화를 위한 형광 지도의 유용성을 보여주기 위하여 보입니다. 그러나, 이것은 아직 인간에 있는 배려의 표준이 아닙니다, 임상 시나리오를 복제하는 것을 목표로 하는 마우스 모형에 있는 그것의 사용의 관점에서 한계입니다. 물론, 형광 유도 수술이 임상 실습에서 널리 채택될 경우 이러한 변화가 있을 수 있습니다.
또 다른 절제술 모델은췌장(13,24)의 본문에 이식된 종양에 대한 비장 절제술 없이 서브토탈 판창조절제술을 기반으로 했다. 이것의 임상 관련성은 또한 기술된 수술이 인간에서 행한 것과 같이 췌장두십증 절제술도 또는 불실판 절제술도 아니었기 때문에 의문을 불러일으킵니다. 당연히, 이 마우스는 또한 먼 현지 둘 다 종양 재발의 높은 비율 때문에 손해를 입었습니다. 특히 비장 재발이 일반적이었다는 점, 부적절한 절제술 또는 이식24에서가능한 복막 종양 파종 을 제안.
Ni외. 16은 형광 화상 진찰 지도로 수행된 불순한 pancreatectomy/splenectomy 모형을 기술했습니다. 실망스럽게도, 임상적으로 관련된 수술 (형광 지침)의 사용에도 불구하고 생존은 매우 짧습니다 (18 일의 평균 생존), 심지어 말단 판창조제 그룹에서. 이러한 정도의 진행성 질환은 완화 치료모델(25,26,27)보다더 나빠진 것으로 보이며, 이는 절제 후 중증 잔류 질환의 존재 가능성을 시사한다. 가장 최근에는 기리외(28)가 경상남도 및 부분 비장 절제술 마우스 모델을 보고했다. 이 연구는 암의 면역 무능한 마우스 모형을 나타낸다는 점에서 주목할 만합니다. 그러나, 이 연구 결과는 이식에 신비한 iatrogenic 전이를 나타내는 거의 보편적인 현지 및 그밖 관면 종양 재발을 보고했습니다.
보조 치료 테스트를 위한 총 잔류 질환 사후 절제술이 있는 마우스 모델의 사용은 부적절할 수 있다. 문제는 총 잔류 질환에 대한 치료가 진정으로 보조 치료로 분류 될 수 없다는 것입니다 오히려 완화 의도로 치료로 간주되어야한다. 이 경우 이러한 마우스 모델은 부피 질환을 가진 비절제 모델에 비해 이점을 제공하지 않습니다.
중요한 단계의 팁과 함정
종양 이식 절차
임상 시나리오를 복제하기 위해 이식 및 절제술 절차와 관련된이 모델에는 뚜렷한 문제가 있습니다. 이식 절차의 경우 극복해야 할 주요 과제는 성공적인 이식 및 누출 예방입니다. 이 두 가지 문제는 주입의 실패가 복강으로 종양 세포 현탁액의 총 누설귀로 상호 관련된다. 이것은 췌장 절제술에 관계없이 진행됩니다 회간 전이를 가진 마우스 모델을 생성합니다. 이것은 전이성 PC에 있는 췌장 절제술이 참을성 있는 결과에 영향을 미치지 않는 인간에 있는 잘 알려진 임상 시나리오를 반영합니다. 이것은 인간29에서기림 복강경 검사의 기초입니다.
종양의 이식의 성공은 명백한 누설 없이 세포 현탁액의 "거품"의 성공적인 세대로서 수술 내로 볼 수 있다. 좋은 결과를 달성하는 데 있어 가장 중요한 것은 췌장 가판증 내의 바늘을 정확하게 배치하는 것입니다. 이것은 단지 간면 표면이 팽팽해할 수 있도록 췌장을 "스트레칭"하여 달성 될 수 있습니다. 펑크는 위쪽으로 향하는 바늘 벨 (ventrally)으로 발생해야합니다. 바늘이 회막 표면에 구멍을 뚫으면 바늘 끝이 약간 들어 올려져 서 베벨 표면이 회리음 바로 아래에서 미끄러지는 동안 진행되어야합니다. 이렇게 하면 마우스 췌장 소어리의 작은 치수로 인해 일반적인 함정인 췌장의 실수로 관통및 관통하는 구멍을 방지할 수 있습니다. 전체 벨이 췌장의 물질 내에 있으면 세포 현탁액이 주입됩니다. 외과 용 루페로 시력을 확대하는 것은 바늘 침투의 깊이를 정확하게 시각화하는 것이 매우 바람직합니다.
여러 가지 기술을 사용하여 실수로 누출될 위험을 더욱 최소화할 수 있습니다.
주사를 위한 큰 소반의 선택. 작은 소구는 팽창하기 위해 더 높은 압력이 필요합니다 (Laplace의 법칙에 따라), 따라서 펑크 부위의 바늘 주위에 누출의 위험을 증가시다.
주입 속도의 최적화. 세포 현탁액을 10-15초 이상 주입할 수 있는 주사장치(도 1b)의사용은 세 가지 목적을 제공한다. 첫째, 췌장의 압력 변화 속도를 감소시켜 조직에 변형시간을 주고 현탁액의 역류 위험을 줄입니다. 둘째, 주사 과정을 모니터링하고 필요한 경우 중지및 바늘 재배치를 허용합니다. 모든 누설은 포비도네 요오드에 흠뻑 젖은 거즈에 의해 걸레질 될 수 있습니다. 셋째, 작업자가 플런저를 우울하게 할 필요가 없도록 하여 작업자가 세포 현탁액을 주입하는 동안 작업자가 췌장 내의 바늘 끝을 유지하는 데 집중할 수 있게 합니다.
이중 레이어 지갑 문자열 거즈를 사용합니다. 이 거즈는 췌장 꼬리 주위에 칼라를 형성하여 세포 현탁액의 누출을 흡수하여 복강내 오염을 최소화합니다.
문학에 있는 몇몇 연구 결과는 주입 후 시간으로 고화하는 세포외 매트릭스 혼합물 (Matrigel)를 사용했습니다13,15,24. 이 누출 후 주입의 위험을 줄일 수 있습니다. 그러나, 이 전략의 잠재적인 단점은 Matrigel 또는 그밖 유사한 세포외 매트릭스 해결책이 PSCs30에비생리적 효과를 발휘할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, Matrigel은 PSC가 정지하여 잠재적으로 모델31,32에서PSC의 효과를 부정하는 것으로 나타났습니다. 암세포의 주입에 대한 대안은 종양 조직의 직교 이식 (환자 또는 피하 마우스 모델에서 직접)입니다. 그러나 이러한 접근 방식은 자신의 단점이 있습니다. 첫째, 이질성은 샘플링 오류 또는 이식된 조직의 부피의 변이에서 발생할 수 있다. 이러한 이질성은 후속 치료 비교의 힘을 감소시킬 수 있다. 둘째, 피하 마우스 모델을 갖는 종양 조직의 패는 원래 환자 종양에 상이한 생물학적 행동을 갖는 서브 클론의 선택으로 이어질 수 있다.
종양 절제술 절차
이 모델에서는 인간에서 수행된 것과 유사한 불경한 범장 절제술/비장 절제술 절차를 활용했습니다. 절제 수술과 관련된 도전은 병리학 및 해부학 적 요인에 달려 있습니다.
주요 병리학적 인자는 종양 보급입니다. 낮은 부피 국소 스프레드는 췌장 절제술 시 절제될 수 있지만, 더 먼 하막 및 기타 전이의 가능성을 나타낼 수 있다. 우리는 정기적으로 로컬 재발의 가능한 영역으로 첫 번째 작업에서 봉합사 라인을 소비. 종양이 복부 벽 또는 간 좌엽과 같은 주변 구조물에 부착되는 경우, 이들은 en bloc에서제복될 수 있다. 해부학적으로, 핵심 단계는 췌장의 몸에 비행기 등주를 해부하는 것입니다. 비장 정맥은 췌장이 외부화되면 종종 췌장 뒤에 시각화 될 수 있습니다. 이것은 배아 무혈 비행기가 즉시 이것에 등등이기 때문에 중요한 랜드 마크입니다.
여기에 설명된 모형에 있는 2개의 그밖 잠재적인 해부학 적인 함정이 있습니다. 결장은 췌장 체의 소달 측면을 준수 할 수있다. 이 구조물을 동원하지 못하면 췌장 분열이나 결찰 시 의도하지 않은 대장 상해가 발생할 수 있습니다. 위장 혈관은 작고, 비약또는 부적절하게 소화하면 쉽게 출혈할 수 있습니다. 또한, 일단 avulsed, 출혈 점은 종종 위장의 큰 곡선 뒤에 복부에 깊은 후퇴, 출혈의 후속 제어를 더 도전 만들기. 따라서 위장혈관의 비장과 소생을 신중하게 철회해야 한다. 성공적인 hemostasis에 대 한 한 가지 방법은 주변 중공 내장에 실수로 열 부상의 위험을 최소화 비장의 hilar 측면에 이러한 혈관을 소생하는 것입니다.
우리는 혈관의 결찰을 위해 인간 수술에 널리 사용되는 티타늄 결찰 클립을 사용하여, 합자 사용에 비해 총 수술 시간이 감소와 함께 췌장 그루터기를 제어하는 신속하고 효과적인 방법임을 발견했다. 이것은 또한 Giri 외28에의해 사용되었다.
기술의 한계
췌장의 이 절제 모델에는 제한이 있습니다. 한 가지 제한은 재발/전이를 생성할 수 있는 시간과 관련이 있습니다. 한편으로는 전이성 질환의 발병을 최대화해야 하지만, 다른 한편으로는 국소적으로 진행되기 전에 종양을 절제해야 합니다. 이식과 절제술 사이의 기간은 따라서 복제하고자하는 특정 임상 시나리오에 맞게 조정될 필요가 있을 수 있습니다. 또 다른 제한은 위에서 논의되는 암세포의 의도하지 않은 유출 및 후속 간발성 전이에 관한 것입니다.
보조 치료 모델의 주요 과제는 외과 치료 효과로부터 보조 치료 효과를 해부하는 것입니다. 분명히, 무작위화되는 잘 설계된 연구가 필요하며, 절제술 수술을 받는 대조군이 필요합니다. 상대적 치료 효과의 평가를 더욱 개선하기 위해 생체 내에서 종양 부담을 평가하는 것이 좋습니다 (예를 들어, luciferase 태그 암 세포를 사용하고 생체 생물 발광 이미징에서 수행함으로써). 직교 모델에서 이 평가의 반정성 특성에도 불구하고 (생물 발광 신호가 과대 조직을 통과하여 감쇠되기 때문에), 이 접근법은 수술 후 잔류 질환의 평가를 포함하여 종양 부담의 세로 평가를 허용합니다.
수정 및 향후 응용 프로그램
이식된 세포주 및/또는 췌장 스텔레이트 세포의 유무에 관계없이 표적 임상시나리오(12)를반영하도록 변형될 수 있다. 이식과 절제술 사이의 기간은 또한 전이 형성의 위험을 변경하도록 수정 될 수있다. 그밖 변이는 환자- 또는 마우스 유래 이종이이식 또는 오르가노이드33의이식을 포함할 수 있었다.
Neoadjuvant 치료는 또한 여기에 설명된 모형의 기본적인 특징 내에서 시험될 수 있습니다. 그것은 단순히 수술 절제술34전에 약물 치료의 개시를 요구할 것이다. 유사하게, neoadjuvant및 보조 치료 둘 다 같은 마우스에서 공부될 수 있었습니다.
마지막으로, 면역형 모델을 나타내는 아티믹 발브/c 누드 마우스의 사용을 설명했지만, 대체 면역능력 모델은 C57B6마우스(28)에이식된 KPC 종양 세포를 포함할 수 있다. 이것은 보조/neoadjuvant 면역 치료의 시험을 위한 유용한 대안일지도 모릅니다.
요약하자면, 우리는 임상 시나리오를 모방하고 특수 장비를 필요로하지 않는 마우스에서 췌장암의 외과 절제술 모델에 대한 견고하고 재현 가능한 기술을 설명합니다. 이 모델은 보조 및 신아주반트 치료의 테스트에 유용할 수 있다.
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Disclosures
저자는이 프로젝트에 대해 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 아브너 췌장암 재단의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
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