Summary
I klinisk sammenheng vil pasienter med lokalisert kreft i bukspyttkjertelen gjennomgå pankreatektomi etterfulgt av adjuvant behandling. Denne protokollen rapportert her tar sikte på å etablere en sikker og effektiv metode for modellering av dette kliniske scenariet hos nakne mus, gjennom ortotopisk implantasjon av bukspyttkjertelkreft etterfulgt av distal pankreatektomi og praktektomi.
Abstract
Det er mangel på tilfredsstillende dyremodeller for å studere adjuvans- og/eller neoadjuvantbehandling hos pasienter som vurderes for kirurgi av kreft i bukspyttkjertelen (PC). For å løse denne mangelen beskriver vi en musemodell som involverer ortotopisk implantasjon av PC etterfulgt av distal pankreatektomi og praktektomi. Modellen har vist seg å være trygg og passende fleksibel for studiet av ulike terapeutiske tilnærminger i adjuvante og neo adjuvante omgivelser.
I denne modellen genereres en bukspyttkjertelsvulst først ved å implantere en blanding av humane kreftceller i bukspyttkjertelen (luciferase-tagget AsPC-1) og human kreft forbundet bukspyttkjertel stellate celler i distal bukspyttkjertelen av Balb / c athymic naken mus. Etter tre uker blir kreften resected av re-laparotomi, distal pankreatektomi og praktektomi. I denne modellen kan bioluminescensavbildning brukes til å følge utviklingen av kreft og effekter av reseksjon/behandling. Etter reseksjon kan adjuvant terapi gis. Alternativt kan neoadjuvant behandling gis før reseksjon.
Representative data fra 45 mus presenteres. Alle mus gjennomgikk vellykket distal pankreatektomi / praktektomi uten problemer med hemostase. En makroskopisk proksimal bukspyttkjertelmargin større enn 5 mm ble oppnådd hos 43 (96 %) mus. Den tekniske suksessraten for reseksjon i bukspyttkjertelen var 100%, med 0% tidlig dødelighet og sykelighet. Ingen av dyrene døde i løpet av uken etter reseksjon.
Oppsummert beskriver vi en robust og reproduserbar teknikk for en kirurgisk reseksjonsmodell av bukspyttkjertelkreft hos mus som etterligner det kliniske scenariet. Modellen kan være nyttig for testing av både adjuvans- og neoadjuvantbehandlinger.
Introduction
Bukspyttkjertelkanal adenokarsinom (kreft i bukspyttkjertelen [PC]) er forbundet med en dårlig prognose1. Kirurgisk reseksjon er fortsatt den eneste potensielt kurative behandlingen for PC og bør vurderes for pasienter som presenterer med tidlig stadium sykdom. Dessverre, selv med R0 reseksjon (dvs. reseksjonsmarginer fri for svulst), er tilbakefallsraten (lokal eller fra uoppdaget metastatisk sykdom) høy2,3. Derfor er systemisk adjuvant terapi indikert hos nesten alle pasienter som gjennomgår reseksjon4. Videre, mens neoadjuvant terapi nå anbefales bare for borderline-resectable kreft, dens indikasjoner utvides slik at den rutinemessige bruken er fokus for mye klinisk forskning5,6,7,8. For å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for PC som involverer reseksjon, må disse tilnærmingene først vurderes i prekliniske modeller som nøyaktig recapitulate kliniske innstillinger.
Ortotopiske musemodeller av PC har tidligere blitt brukt til å teste narkotikabehandlinger9,10. Mange av disse ble produsert ved injeksjon av kreftceller alene i musen bukspyttkjertelen, noe som resulterte i svulster som manglet den fremtredende stroma som er karakteristisk for PC. Mer nylig har koinjeksjons ortotopiske modeller, som den vi først utviklet ved å injisere en blanding av human PC og humane bukspyttkjertel stellate celler (PSCer, de primære produsentene av kollagen stroma i PC), kommet i regelmessig bruk11,12. Svulstene produsert ved slik co-injeksjon av kreft og stromale celler viser (i) både kreftelementene og den karakteristiske stromale (desmoplastiske) komponenten av PC, og (ii) forbedret kreftcelleproliferasjon og metastase11. Dermed ligner denne modellen på menneskelig PC. Mens en rekke reseksjonelle modeller av ortotopisk PC har blitt beskrevet13,14,15,16, ingen har reflektert de kliniske realitetene av bukspyttkjertelen reseksjon hos mennesker så nøyaktig som denne modellen, og derfor har vært suboptimal for testing adjuvant eller neoadjuvant behandlinger.
Målene med musemodellen som ble presentert var å demonstrere hvordan man: (i) vellykket implantere ortotopisk kreft i bukspyttkjertelen samtidig minimere utilsiktet peritoneal formidling og (ii) deretter fullstendig resect kreft. Papiret fremhever tips og potensielle fallgruver i denne teknikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Animal Care and Ethics Committee ved University of New South Wales (17/109A). Kvinnelige athymic Balb / c naken mus, i alderen 8-10 uker som veier 16-19 g, ble brukt til denne protokollen. Mus ble plassert i mikroisolatorbur og matet kommersielt tilgjengelig pelletert mat og vann ad libitum.
1. Ortotopisk kreftimplantasjon i bukspyttkjertelen
- Forbered cellene for implantasjon. Beregn først antall celler som kreves for prosedyren (1 x 106 luciferase-tagget AsPC-1 celler og 1 x 106 kreftrelaterte humane bukspyttkjertel stellate celler [CAhPSCs] er nødvendig for hvert dyr).
- Vedlikehold disse cellene i en fuktet temperaturkontrollert CO 2-inkubator og utfør rutinemessig mykoplasmatesting. Kulturmedium som brukes for AsPC-1 og CAhPSCer er RPMI 1640 (med 300 mg/L L-glutamin, 20% v/v føtal bovint serum, 1% v/v penicillin/streptomycin) og IMDM (med 4 mM L-glutamin, 10% v/v føtal bovint serum, 1% v/v penicillin/streptomycin).
- Bruk standard cellekulturteknikker til å prøve å få cellene til en cellesuspensjon. Nøytraliser trypsin ved hjelp av det respektive komplette kulturmediet på et volum dobbelt så mye som trypsinløsningen som brukes.
- Vask disse cellene to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) og resuspend i en blanding som inneholder 1 x 106 AsPC-1 celler og 1 x10 6 CAhPSC i en 50 μL celle suspensjon.
- Hold denne fjæringen på is til bruk.
- Forbered et klasse II biosikkerhetsskap for prosedyren. Bruk en varmematte overlagt av en steril plastgardin. For forstørrelse under prosedyren, bruk et par 2,5x til 3,5x forstørrelses kirurgiske lupes.
- Forbered veskestrengspinner ved å kutte et hull, 1 cm i diameter, i en gasbindpinne. Fest dette hullet med en veskestreng sutur. Enhver fin flettet sutur kan brukes til dette (f.eks. 5/0 polyglykolsyre sutur). Flettet suturmateriale anbefales, da det gjør at den løse knuten kan holde seg på plass etter stramming. Dette er illustrert i Figur 1a.
- Bedøv musen med 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin ved intraperitoneal injeksjon.
- Administrer 5 mg/kg enrofloxacin antibiotikaprofylakse, 2,5 mg/kg flunixin analgesi og 1 ml 0,9% saltvann subkutant.
- Når du er bedøvet, plasser musen på det sterile feltet i en liggende stilling og påfør povidon-jod etterfulgt av 70% etanol for hudforberedelse.
- Lag et langsgående snitt i huden på venstre kranial kvadrant i magen, og gå deretter inn i magen ved å incising det muskulære laget mellom tang.
- Legg en 29 G insulinsprøyte med 50 μL cellefjæring – dette tilsvarer 1 x 106 CAhPSCer og 1 x 106 luciferasemerkede AsPC-1-celler per injisering. Monter den på injeksjonsenheten. Utformingen og funksjonen til denne injeksjonsenheten forklares i detalj i figur 1b og dens legende.
- Plasser veskestrengen vattpinne over laparotomi snittet og deretter eksteriør milten og bukspyttkjertelen halen gjennom åpningen av denne vattpinnen. Stram veskestrengen for å forsiktig omkranse bukspyttkjertelens kropp, og utsette bukspyttkjertelens hale for injeksjon. Det er viktig å være stram nok til at gasbindet kommer i kontakt med bukspyttkjertelen omkrets, samtidig som den ikke begrenser den.
- Bruk et par tang, ta tak i bukspyttkjertelens hale og legg forsiktig lateral spenning på den. Punkter den ventrale bukhinnen overflaten med nålen i en grunne vinkel og injiser deretter celle suspensjon i bukspyttkjertelen på en langsom og kontrollert måte (over 10-15 s) med injeksjonsanordningen.
- Under injeksjonsprosessen må du nøye observere for lekkasje – både rundt injeksjonsstedet (fra refluks) og på den andre siden av bukspyttkjertelens lobule (i tilfelle gjennom-og-gjennom-penetrasjon). Hvis synlig lekkasje oppstår, stopp injeksjonen og noter volumet av lekkasje ved å sjekke volumet av gjenværende injisering i sprøyten. Hvis lekkasjen er av lite volum (<10 μL), og absorber deretter eventuell lekkasje med gasbind og omplasser nålen til en annen bukspyttkjertellobul for å fullføre injeksjonen.
- Bytt ut milten og bukspyttkjertelen og lukk bukveggen med 5/0 polyglykolsyre sutur på en kontinuerlig måte. Lukk huden med klips.
- Overvåk musen i et oppvarmet bur til den er gjenopprettet fra bedøvelsen. Når den er våken og våken, flytter du musen tilbake til buret.
2. Kreft reseksjon kirurgi: Distal pankreatektomi og praktektomi
- Tidspunktet for reseksjon i forhold til implantasjon kan variere avhengig av eksperimentell protokoll. Generelt, la svulstene vokse minst i 3 uker før reseksjon, men optimaliser dette empirisk for den bestemte implanterte kreftcellelinjen.
- På dagen før reseksjonsoperasjonen, utfør bioluminescensavbildning på dyrene for å bekrefte tilstedeværelsen av en lokalisert primærsvulst. Legg merke til at denne bildestudien ganske enkelt brukes til å utelukke mus med åpenbar ekstra bukspyttkjertelsykdom fra reseksjon. Verken størrelse eller strålefluks bør brukes som terskler for å bestemme kvalifisering for reseksjon.
- Vei mus og injiser med D-luciferin intraperitoneally (150 mg/kg).
- Bestem tidspunktet for bildetrinnet i forhold til luciferinininjeksjon for hvert eksperiment ved å utføre en luciferin kinetisk kurve. Tidsperioden der den strålende fluxen er over 90% av maksimumet, representerer den optimale tiden for bioluminescensavbildning (i dette eksperimentet, 18 til 26 minutter etter injeksjon)
- Induser anestesi og vedlikehold ved hjelp av isofluran (henholdsvis 4% og 3% med oksygen) og utfør avbildning ved hjelp av en bioluminescent bildebehandlingsenhet (f.eks. IVIS Lumina II). Bruk automatisk eksponering og innstillinger for binning (dette kan imidlertid optimaliseres for forventet strålefluks).
- Forbered klasse II biosikkerhetsskap for prosedyre. Bruk en varmematte overlagt av en steril plastgardin. For forstørrelse under disseksjon, bruk et par 2,5x til 3,5x forstørrelse kirurgiske lupes.
- Bedøv musen med 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin ved intraperitoneal injeksjon.
- Administrer 5 mg/kg enrofloxacin antibiotikaprofylakse, 2,5 mg/kg flunixin analgesi og 1 ml 0,9% saltvann subkutant.
- Plasser musen på det sterile feltet i en liggende stilling og påfør povidon-jod etterfulgt av 70% etanol for hudforberedelse.
- Lag et langsgående snitt i huden på venstre kranial kvadrant i magen, helst gjennom det forrige snittstedet.
- Disseker huden direkte fra den underliggende muskuløse bukveggen, og plasser deretter en Alm selvbevarende retraktor for å holde hudsåret åpent.
- Øk det muskulære laget mellom tang bare til den ene siden av suturlinjen i forrige operasjon, og utvid deretter snittet for å skille ut hele den forrige suturlinjen.
- Eksteriør milten og distal bukspyttkjertelen og trekk den kranialt tilbake. Ved det kaudale aspektet av bukspyttkjertelen kan tykktarmen bli funnet festet av filmaktige vedheft. Hvis dette blir funnet, må du direkte dissekere tykktarmen av.
- Pass forsiktig et par tang dorsal til bukspyttkjertelen og miltkarene og åpne dette rommet. Dette frigjør et segment av bukspyttkjertelen for etterfølgende ligasjon.
- Ligate kroppen av bukspyttkjertelen proksimal til svulsten med en titan ligation klipp, og deretter transect bukspyttkjertelen distal til dette med cautery. En alternativ måte å kontrollere bukspyttkjertelen stubben er å ligate den i kontinuitet med 5/0 polygllykolsyre sutur før transeksjon.
- Trekk bukspyttkjertelen tilbake årsaksmessig og cauterize de gastrospleniske karene mellom kranialpolen på milten og magen.
- Fjern prøven og bekreft hemostase.
- Lukk bukveggen med 5/0 polyglykolsyre sutur på en kontinuerlig måte. Lukk huden med klips.
3. Postoperativ ledelse
- I den umiddelbare postbedøvelsesperioden (for begge de ovennevnte prosedyrene), overvåke musen i et oppvarmet bur til den er gjenopprettet fra bedøvelsen. Når den er våken og våken, flytter du musen tilbake til buret. I den postoperative perioden, overvåke dyrene for smerte og tegn på nød. Administrer 0,05 mg/kg buprenorfin ved subkutan injeksjon og observer dyrene nøye i 12 timer.
- Deretter overvåker musene daglig for vekt, matinntak og aktivitet. Undersøk snittsteder og palpate for tumorstørrelse. Fjern skallklipp på den syvende postoperative dagen.
- Avlivet musen hvis humane endepunkter nås. Disse humane endepunktene inkluderer: tap av kroppsvekt >20%, egenskaper av ubehandlet nød (inkludert hunched holdning, mangel på bevegelse eller grooming) og tumorstørrelse større enn 1 cm3 som estimert ved ekstern palpasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
59 påfølgende mus gjennomgikk implantasjonskirurgi. Det oppstod grov lekkasje hos åtte (14 %) mus. Graden av lekkasje på injeksjonstidspunktet er estimert som beskrevet ovenfor i protokolldelen. Etter tre uker for å tillate disse implanterte svulstene å vokse, ble pre-reseksjon bioluminescence imaging utført for å utelukke mus med grov metastatisk sykdom før reseksjon. Førtifem (76 %) mus gjennomgikk kirurgisk reseksjon.
Alle 45 (100%) mus gjennomgikk vellykket distal pankreatektomi/praktektomi uten problemer med hemostase. En makroskopisk proksimal bukspyttkjertelmargin større enn 5 mm ble oppnådd hos 43 (96 %) mus.
På tidspunktet for reseksjon ble lokal metastase funnet i 9/45 (20%) mus - for det meste i suturlinjen (diskontinuerlig med primærsvulsten) med tre av de ni som viser ekstra isolerte knuter på den større kurven i magen og en som viser en subkapsulær knute på leveren. Den primære bukspyttkjertelsvulsten ble fulgt til suturlinjen i fem (11%) mus og leveren i en (2%) mus. Disse tilhengerstrukturene ble utskilt en blokk.
Gjennomsnittlig (SEM) operasjonstid (induksjon til lukking) var 22 (0,9) minutter. Ingen av dyrene døde innen 1 uke etter reseksjon.
En ukes postreseksjon gjennomgikk mus bioluminescensavbildning for å oppdage gjenværende sykdom. Forholdet mellom maksimal utstråling over musens ventrale overflate ble sammenlignet med bakgrunnen. 32 (71 %) mus hadde et maksimalt utstrålingsforhold (mus:bakgrunn) på <10, noe som indikerer minimal eller ingen gjenværende sykdom.
Figur 1: Skreddersydde enheter for å lette tumorimplantasjon. (a) Veskestreng gasbindpinne: (i) Sentralt hull, ca. 1 cm i diameter, hvorved bukspyttkjertelen halen vil bli plassert på injeksjonstidspunktet; (ii) Veskestreng sutur rundt hullet; (iii) Dobbeltlags gasbind; (iv) Enkeltkast knute; (v) En lem av suturmaterialet er festet til gasbindet med steriliseringsindikatorbånd; (vi) Et håndtak, laget av indikatorbånd, er laget i den andre enden av suturmaterialet. (b) Injeksjonsanordning: (I) Aktiveringssprøyte. Spor kuttet gjennom kroppen av denne sprøyten gjør at injeksjonssprøyten (med cellefjæringsinjektoren, ikke vist) kan monteres på denne sprøytekroppen; (II) Kontrollersprøyte. Dette er fylt med vann. Depresjon av stempelet på den mindre kontrollersprøyten av kirurgisk assistent forårsaker forskyvning av det større aktiveringssprøytestempeet. Forskyvningen av aktuerende stempel er mindre, men med en mekanisk fordel som gjør at injeksjonen kan overvinne motstanden forbundet med injeksjonssprøytemekanismen samt vevets motstand mot ekspansjon av injektatet. Dette gir presis og jevn injeksjon på 50 μL over 10-15 sekunder; (III) Polytetrafluoretylen (PTFE) tilkoblingsrør med innvendig diameter på 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En reseksjonell ortotopisk musemodell av kreft i bukspyttkjertelen er viktig fordi den tillater testing av adjuvante og neoadjuvante behandlinger. Dette er spesielt viktig i bukspyttkjertelen kreft der kirurgi forblir den mest effektive behandlingen, men er forbundet med høy risiko for tilbakefall. Dette dokumentet beskriver en metode som på en pålitelig måte vil produsere en kreft i bukspyttkjertelen som potensielt kan kureres med reseksjon, og gjenskape det kliniske scenariet der neoadjuvant / adjuvant terapi er nødvendig.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Til tross for betydningen av adjuvante og neoadjuvante terapier i bukspyttkjertelkreft, er det få godt beskrevne ortotopiske reseksjonelle musemodeller i litteraturen. Disse beskrevne reseksjonsmodellene varierte i deres gjengivelse av replikering av den kliniske situasjonen hos mennesker. Disse tidligere modellene kan bare klassifiseres bredt i: (i) tumoreksisjon, med fluorescensveiledning; (ii) subtotal pankreas reseksjon uten praktektomi; (iii) distal pankreatektomi/praktektomi.
Tumoreksisjon med fluorescensveiledning er beskrevet i flest rapporter15,17,18,19,20,21. Mange av disse papirene stammer fra samme forskningsgruppe. Dessverre, hos mennesker, utføres ikke lokal eksisjon av svulsten alene (enucleation) for bukspyttkjertel adenokarsinom (PC) på grunn av den høye sannsynligheten for lokal tilbakefall, samt manglende evne til å vurdere lymfeknutestatus22,23. Derfor skyer bruken av en ikke-klinisk relevant komparatorgruppe (ikke-fluorescensstyrt enukleasjon) rapporteringen av de onkologiske resultatene i papirer som beskriver denne teknikken. Ikke overraskende hadde ikke-fluorescens enucleation grupper alltid hatt overdreven rate av lokal tilbakefall15,20,21. Torgenson et al.14 beskrev derimot en lignende fluorescensstyrt reseksjonsteknikk, og rapporterte en rimelig lav tilbakefallsrate på 58% (ved åtte uker etter reseksjon). Samlet sett ser disse studiene ut til å demonstrere nytten av fluorescensveiledning for visualisering av restsykdom under operasjonen. Dette er imidlertid ennå ikke standarden på omsorg hos mennesker, noe som er en begrensning når det gjelder bruk i en musemodell som tar sikte på å gjenskape det kliniske scenariet. Selvfølgelig kan dette endre seg hvis fluorescensstyrt kirurgi skulle bli allment vedtatt i klinisk praksis.
En annen reseksjonsmodell var basert på subtotal pankreatektomi uten praktektomi for en svulst implantert i bukspyttkjertelens kropp 13,24. Den kliniske relevansen av dette er også stilt spørsmålstegn ved da operasjonen som ble beskrevet, verken var en pankreaticoduodenektomi eller distal pankreatektomi som utført hos mennesker. Ikke overraskende led disse musene også av høye forekomster av tumor tilbakefall, både fjernt og lokalt. Spesielt oppmerksom er at splenic tilbakefall var vanlig, noe som tyder på enten utilstrekkelig reseksjon eller mulig peritoneal tumor såing ved implantasjon24.
Ni et al.16 beskrev en distal pankreatektomi/praktektomimodell utført med fluorescensavbildningsveiledning. Skuffende, til tross for bruk av en klinisk relevant operasjon (med fluorescensveiledning), var overlevelsen svært kort (gjennomsnittlig overlevelse på 18 dager), selv i den distale pankreatektomigruppen. Denne graden av progressiv sykdom ser ut til å være enda verre enn palliative behandlingsmodeller25,26,27, noe som tyder på mulig tilstedeværelse av grov gjenværende sykdom etter reseksjon. Senest rapporterte Giri et al.28 en distal pankreatektomi og delvis praktektomimusmodell. Denne studien er bemerkelsesverdig ved at den representerer en immunokokk musemodell av kreft. Imidlertid rapporterte denne studien nesten universell lokal og annen intraperitoneal tumor tilbakefall, muligens indikerer okkult iatrogene metastase ved implantasjon.
Bruk av musemodeller der det er grov restsykdom etter reseksjon for testing av adjuvante behandlinger kan være upassende. Problemet er at behandling for grov restsykdom ikke virkelig kan klassifiseres som adjuvant behandling, men heller bør anses å være behandling med palliativ hensikt. I så fall gir slike musemodeller ingen fordel sammenlignet med ikke-reseksjonelle modeller med lavvolumsykdom.
Tips og fallgruver for kritiske trinn
Tumor implantasjon prosedyre
For å gjenskape det kliniske scenariet er det tydelige utfordringer i denne modellen som er relatert til implantasjons- og reseksjonsprosedyrene. For implantasjonsprosedyren er de store utfordringene som må overvinnes vellykket implantasjon og forebygging av lekkasje. Disse to problemene henger sammen, da svikt i injeksjonen vil føre til grov lekkasje av tumorcellefjæringen i bukhulen. Dette vil produsere en musemodell med peritoneal metastase, som vil utvikle seg uavhengig av pankreas reseksjon. Dette gjenspeiler det velkjente kliniske scenariet hos mennesker der pankreas reseksjon i metastatisk PC ikke påvirker pasientutfallet. Dette er grunnlaget for iscenesettelse laparoskopi hos mennesker29.
Suksessen med implantasjon av svulsten kan ses intraoperativt som den vellykkede generasjonen av en "boble" av cellefjæring uten åpenbar lekkasje. Av største betydning for å oppnå et godt resultat er den nøyaktige plasseringen av nålen i bukspyttkjertelen parenchyma. Dette kunne bare oppnås ved å "strekke ut" bukspyttkjertelen slik at bukspyttkjertelen er stram. Punktering skal skje med nålen skrå bakovervendt oppover (ventrally). Når nålen punkterer peritonealoverflaten, bør den fremskyndes mens nålespissen løftes litt opp slik at den skrå overflaten glir like under bukhinnen. Dette vil forhindre utilsiktet gjennom-og-gjennom punktering av bukspyttkjertelen, en vanlig fallgruve på grunn av de små dimensjonene av mus bukspyttkjertel lobules. Når hele skråkanten er innenfor bukspyttkjertelens substans, injiseres celleopphenget. Forstørrelse av syn med kirurgiske lupes er svært ønskelig å visualisere nøyaktig dybden av nålen penetrasjon.
En rekke teknikker kan brukes til å minimere risikoen for utilsiktet lekkasje ytterligere.
Valg av en stor lobule til injeksjon. Små lobler krever høyere trykk for å blåse opp (etter Laplaces lov), og dermed øke risikoen for lekkasje rundt nålen på punkteringsstedet.
Optimalisering av injeksjonshastigheten. Bruk av en injeksjonsenhet (figur 1b) som gjør at cellesuspensjonen kan injiseres over 10-15 sekunder, tjener tre formål. For det første reduserer det trykkhastigheten i bukspyttkjertelen, noe som gir vevet tid til å deformere og reduserer risikoen for refluks av suspensjonen. For det andre gjør det at injeksjonsprosessen kan overvåkes og om nødvendig stoppes og nålen omplasseres. Enhver lekkasje kan bli mopped opp av en povidone-jod-gjennomvåt gasbind. For det tredje frigjør den operatøren fra å måtte trykke på stempelet, slik at operatøren kan fokusere på å holde nålespissen i bukspyttkjertelen mens assistenten injiserer celleopphenget.
Bruk av en dobbeltlags veskestrenggass. Denne gasbindet danner en krage rundt bukspyttkjertelen halen som vil absorbere lekkasje av celle suspensjon og derfor minimere forurensning i bukhulen.
Noen studier i litteraturen har brukt en ekstracellulær matriseblanding (Matrigel) som størkner med tiden etter injeksjon13,15,24. Dette kan redusere risikoen for lekkasje etter injeksjon. En potensiell ulempe ved denne strategien er imidlertid at Matrigel eller andre lignende ekstracellulære matriseløsninger kan utøve ikke-fysiologiske effekter på PSC30. For eksempel har Matrigel vist seg å gjengi PSCer passivisere og dermed potensielt effekten av PSCer i modellen31,32. Et alternativ til injeksjon av kreftceller er ortotopisk implantasjon av tumorvev (enten direkte fra pasienter eller fra subkutane musemodeller). Imidlertid har disse tilnærmingene sine egne ulemper. For det første kan heterogenitet oppstå ved prøvetakingsfeil eller fra variasjoner i volumet av vev implantert. Slik heterogenitet kan redusere kraften i etterfølgende behandlingssammenligninger. For det andre kan passivring av tumorvev med en subkutan musemodell føre til valg av underkloner som har forskjellig biologisk atferd til den opprinnelige pasientsvulsten.
Tumor reseksjon prosedyre
I denne modellen har vi brukt en distal pankreatektomi / praktektomiprosedyre som ligner den som utføres hos mennesker. Utfordringene knyttet til reseksjonell kirurgi avhenger av patologiske og anatomiske faktorer.
Den viktigste patologiske faktoren er tumorformidling. Lokal spredning med lavt volum kan resekteres på tidspunktet for pankreasreseksjon, selv om det kan indikere muligheten for mer fjern peritoneal og annen metastase. Vi utskiller rutinemessig suturlinjen fra den første operasjonen, da det er et mulig område med lokal tilbakefall. Hvis svulsten er festet til omkringliggende strukturer, for eksempel bukveggen eller venstre lobe i leveren, kan disse resected en bloc. Anatomisk er nøkkeltrinnet å dissekere plan dorsal til bukspyttkjertelens kropp. Den spleniske venen kan ofte visualiseres bak bukspyttkjertelen når bukspyttkjertelen er eksteriørisert. Dette er et viktig landemerke, da det embryologiske blodløse flyet umiddelbart er dorsal til dette.
Det er to andre potensielle anatomiske fallgruver i modellen som er beskrevet her. Tykktarmen kan være tilhenger av det kaudale aspektet av bukspyttkjertelen. Unnlatelse av å mobilisere denne strukturen bort kan føre til utilsiktet kolonisk skade på tidspunktet for bukspyttkjertel divisjon eller ligation. De gastrospleniske karene er små og kan lett blø hvis avulsed eller utilstrekkelig cauterized. Videre, når avulsed, blødning punktet ofte trekker seg dypt inn i magen bak større kurven i magen, noe som gjør etterfølgende kontroll av blødning mer utfordrende. Derfor er det nødvendig med forsiktig tilbaketrekking av milten og cautery av de gastrospleniske karene. En tilnærming for vellykket hemostase er å cauterize disse fartøyene på hilar aspektet av milten som minimerer risikoen for utilsiktet termisk skade på omkringliggende hule viscera.
Vi har funnet ut at bruk av en titan ligation klipp, mye brukt i menneskelig kirurgi for ligasjon av fartøy, er en rask og effektiv måte å kontrollere bukspyttkjertelen stubbe, med påfølgende reduksjon i total operativ tid sammenlignet med bruk av ligaturer. Dette ble også brukt av Giri et al.28.
Begrensninger av teknikken
Det er begrensninger i denne reseksjonelle modellen av bukspyttkjertelen. En begrensning er knyttet til tiden det tar å produsere tilbakefall/metastase. På den ene siden må man maksimere utviklingen av metastatisk sykdom, men på den annen side må man resect svulsten før den ble lokalt avansert. Perioden mellom implantasjon og reseksjon kan derfor måtte justeres for det spesielle kliniske scenariet man ønsker å replikere. En annen begrensning er knyttet til utilsiktet søl og påfølgende peritoneal metastase av kreftceller som er diskutert ovenfor.
En stor utfordring med adjuvante behandlingsmodeller er å dissekere adjuvant behandlingseffekt fra den kirurgiske behandlingseffekten. Det er klart at en godt designet studie som er randomisert, med en kontrollgruppe som gjennomgår reseksjonskirurgi er nødvendig. For å forbedre vurderingen av de relative behandlingseffektene ytterligere, foreslår vi å vurdere tumorbyrde in vivo (for eksempel ved å bruke luciferase-taggede kreftceller og utføre in vivo bioluminescence imaging). Til tross for den semi-kvantitative karakteren av denne vurderingen i ortotopiske modeller (som bioluminescenssignalet dempes ved passasje gjennom det overdrevne vevet), tillater denne tilnærmingen langsgående vurdering av tumorbyrde, inkludert vurderingen av den postkirurgiske restsykdommen.
Modifikasjoner og fremtidige applikasjoner
Den implanterte cellelinjen og/eller cellenumrene med eller uten stellate-celler i bukspyttkjertelen kan endres for å gjenspeile det kliniske målscenarioet12. Varigheten mellom implantasjon og reseksjon kan også endres for å endre risikoen for metastasedannelse. Andre variasjoner kan være implantasjon av pasient- eller mus-avledede xenografter eller organoider33.
Neoadjuvant terapi kan også testes innenfor de grunnleggende egenskapene til modellen som er beskrevet her. Det ville ganske enkelt kreve oppstart av narkotikabehandling før kirurgisk reseksjon34. På samme måte kan både neoadjuvant og adjuvant terapi studeres hos de samme musene.
Til slutt, mens vi har beskrevet bruken av athymic Balb / c nakenmus som representerer en immunodeficient modell, kan en alternativ immunodumpent modell innebære KPC tumorceller implantert i C57B6 mus28. Dette kan være et nyttig alternativ for testing av adjuvant / neoadjuvant immunbehandling.
Oppsummert beskriver vi en robust og reproduserbar teknikk for en kirurgisk reseksjonsmodell av bukspyttkjertelkreft hos mus som etterligner det kliniske scenariet og ikke krever spesialisert utstyr. Denne modellen kan være nyttig for testing av både adjuvans- og neoadjuvantbehandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre med hensyn til dette prosjektet.
Acknowledgments
Forfattere har fått støtte fra Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
- Noone, A. M., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute. , Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2015/ (2018).
- Sugiura, T., et al. Margin status, recurrence pattern, and prognosis after resection of pancreatic cancer. Surgery. 154 (5), 1078-1086 (2013).
- Hishinuma, S., et al. Patterns of recurrence after curative resection of pancreatic cancer, based on autopsy findings. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (4), 511-518 (2006).
- NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology - Pancreatic Adenocarcinoma (Version 3.2019). National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Breslin, T. M., et al. Neoadjuvant chemoradiotherapy for adenocarcinoma of the pancreas: treatment variables and survival duration. Annals of Surgical Oncology. 8 (2), 123-132 (2001).
- Mokdad, A. A., et al. Neoadjuvant Therapy Followed by Resection Versus Upfront Resection for Resectable Pancreatic Cancer: A Propensity Score Matched Analysis. Journal of Clinical Oncology. 35 (5), 515-522 (2017).
- Tachezy, M., et al. Sequential neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT) followed by curative surgery vs. primary surgery alone for resectable, non-metastasized pancreatic adenocarcinoma: NEOPA- a randomized multicenter phase III study (NCT01900327, DRKS00003893, ISRCTN82191749). BMC Cancer. 14, 411 (2014).
- Barbour, A. P., et al. The AGITG GAP Study: A Phase II Study of Perioperative Gemcitabine and Nab-Paclitaxel for Resectable Pancreas Cancer. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (12), 5645-5649 (1992).
- Marincola, F., Taylor-Edwards, C., Drucker, B., Holder, W. D. Orthotopic and heterotopic xenotransplantation of human pancreatic cancer in nude mice. Current Surgery. 44 (4), 294-297 (1987).
- Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Research. 68 (7), 2085-2093 (2008).
- Xu, Z., et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. American Journal of Pathology. 177 (5), 2585-2596 (2010).
- Tepel, J., et al. Adjuvant treatment of pancreatic carcinoma in a clinically adapted mouse resection model. Pancreatology. 6 (3), 240-247 (2006).
- Torgenson, M. J., et al. Natural history of pancreatic cancer recurrence following "curative" resection in athymic mice. Journal Surgical Research. 149 (1), 57-61 (2008).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models. Journal of the American College of Surgeons. 215 (1), 126-135 (2012).
- Ni, X., Yang, J., Li, M. Imaging-guided curative surgical resection of pancreatic cancer in a xenograft mouse model. Cancer Letters. 324 (2), 179-185 (2012).
- Hiroshima, Y., et al. Hand-held high-resolution fluorescence imaging system for fluorescence-guided surgery of patient and cell-line pancreatic tumors growing orthotopically in nude mice. Journal of Surgical Research. 187 (2), 510-517 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model is inhibited by neoadjuvant chemotherapy in combination with fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore. PLoS One. 9 (12), 114310 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. PLoS One. 9 (6), 99977 (2014).
- Metildi, C. A., et al. Ratiometric activatable cell-penetrating peptides label pancreatic cancer, enabling fluorescence-guided surgery, which reduces metastases and recurrence in orthotopic mouse models. Annals of Surgical Oncology. 22 (6), 2082-2087 (2015).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery with a fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA), that highlights the tumor, improves surgical resection and increases survival in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer. Annals of Surgical Oncology. 21 (4), 1405-1411 (2014).
- NCCN Guidelines: Pancreatic Adenocarcinoma. National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Maithel, S. K., Allen, P. J. Blumgart's Surgery of the Liver, Biliary Tract and Pancreas, 2-Volume Set (Sixth Edition). Jarnagin, W. R. , Content Repository Only 1007-1023 (2017).
- Egberts, J. H., et al. Dexamethasone reduces tumor recurrence and metastasis after pancreatic tumor resection in SCID mice. Cancer Biology & Therapy. 7 (7), 1044-1050 (2008).
- Xu, Z. H., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway in advanced pancreatic cancer: a key element of treatment that limits primary tumor growth and eliminates metastasis. British Journal of Cancer. , (2020).
- Pothula, S. P., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway: stromal remodelling in pancreatic cancer. Oncotarget. 8 (44), 76722-76739 (2017).
- Pothula, S. P., et al. Hepatocyte growth factor inhibition: a novel therapeutic approach in pancreatic cancer. British Journal of Cancer. 114 (3), 269-280 (2016).
- Giri, B., et al. An Immunocompetent Model of Pancreatic Cancer Resection and Recurrence. Journal of Gastrointestinal Surgery. , (2020).
- Allen, V. B., Gurusamy, K. S., Takwoingi, Y., Kalia, A., Davidson, B. R. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. (11), 009323 (2013).
- Vaillant, F., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Jekyll or Hyde: does Matrigel provide a more or less physiological environment in mammary repopulating assays. Breast Cancer Research. 13 (3), 108 (2011).
- Jesnowski, R., et al. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Laboratory Investigation. 85 (10), 1276-1291 (2005).
- Phillips, P. A., et al. Cell migration: a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut. 52 (5), 677-682 (2003).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Egberts, J. H., et al. Superiority of extended neoadjuvant chemotherapy with gemcitabine in pancreatic cancer: a comparative analysis in a clinically adapted orthotopic xenotransplantation model in SCID beige mice. Cancer Biology & Therapy. 6 (8), 1227-1232 (2007).
