Summary
В клиническом контексте пациенты с локализованным раком поджелудочной железы будут подвергаться панкреатэктомии с последующим адъювантным лечением. Этот протокол, о котором здесь сообщается, направлен на создание безопасного и эффективного метода моделирования этого клинического сценария у обнаженных мышей путем ортотопической имплантации рака поджелудочной железы с последующей дистальной панкреатэктомией и спленэктомией.
Abstract
Не хватает удовлетворительных моделей на животных для изучения адъювантной и/или неоадъювантной терапии у пациентов, рассматриваемых для хирургии рака поджелудочной железы (ПК). Чтобы устранить этот недостаток, мы описываем модель мыши, включавшую ортотопическую имплантацию ПК с последующей дистальной панкреатэктомией и спленэктомией. Было продемонстрировано, что модель безопасна и достаточно гибка для изучения различных терапевтических подходов в адъювантных и неоадъювантных условиях.
В этой модели опухоль поджелудочной железы сначала генерируется путем имплантации смеси раковых клеток поджелудочной железы человека (помеченных люциферазой AsPC-1) и связанных с раком человека звездчатых клеток поджелудочной железы в дистальную поджелудочную железу атипичных обнаженных мышей Balb / c. Через три недели рак резецируется путем релапаротомии, дистальной панкреатэктомии и спленэктомии. В этой модели биолюминесцентная визуализация может быть использована для отслеживания прогресса развития рака и эффектов резекции / лечения. После резекции может быть дана адъювантная терапия. Альтернативно, неоадъювантное лечение может быть дано до резекции.
Представлены репрезентативные данные 45 мышей. Все мыши прошли успешную дистальную панкреатэктомию / спленэктомию без проблем с гемостазом. Макроскопический проксимальный запас поджелудочной железы более 5 мм был достигнут у 43 (96%) Мышей. Уровень технического успеха резекции поджелудочной железы составил 100%, с 0% ранней смертностью и заболеваемостью. Ни одно из животных не умерло в течение недели после резекции.
Таким образом, мы описываем надежную и воспроизводимую технику для модели хирургической резекции рака поджелудочной железы у мышей, которая имитирует клинический сценарий. Модель может быть полезна для тестирования как адъювантных, так и неоадъювантных методов лечения.
Introduction
Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (рак поджелудочной железы [ПК]) связана с плохим прогнозом1. Хирургическая резекция остается единственным потенциально лечебным лечением ПК и должна рассматриваться для пациентов с ранней стадией заболевания. К сожалению, даже при резекции R0 (т.е. резекционных полях, свободных от опухоли), частота рецидивов (местная или от невыявленной метастатической болезни) высока2,3. Поэтому системная адъювантная терапия показана практически всем пациентам, которые проходят резекцию4. Кроме того, в то время как неоадъювантная терапия в настоящее время рекомендуется только для погранично-резектабельных раковых заболеваний, ее показания расширяются таким образом, что ее рутинное использование находится в центре внимания многих клинических исследований5,6,7,8. Чтобы разработать новые терапевтические подходы к ПК, включающие резекцию, эти подходы должны быть сначала оценены в доклинических моделях, которые точно повторяют клинические условия.
Ортотопические мышиные модели ПК часто использовались в прошлом для тестирования медикаментозноголечения 9,10. Многие из них были получены путем инъекции раковых клеток только в поджелудочную железу мыши, что привело к опухолям, в которых отсутствовала заметная строма, характерная для ПК. Совсем недавно ортотопические модели совместной инъекции, такие как та, которую мы впервые разработали путем инъекции смеси человеческого ПК и звездчатых клеток поджелудочной железы человека (PSC, первичные продуценты коллагеновой стромы в ПК), в регулярное использованиестали использовать 11,12. Опухоли, образуемые при такой совместной инъекции раковых и стромальных клеток, демонстрируют (i) как раковые элементы, так и характерный стромальный (десмопластический) компонент ПК, и (ii) усиленную пролиферацию и метастазирование раковых клеток11. Таким образом, эта модель очень напоминает человеческий ПК. Хотя ряд резекционных моделей ортотопического ПК были описаны13,14,15,16,ни одна из них не отражала клинические реалии резекции поджелудочной железы у людей так же точно, как эта модель, и, следовательно, была неоптимальной для тестирования адъювантных или неоадъювантных методов лечения.
Цель представленной мышиной модели состоит в том, чтобы продемонстрировать, как: (i) успешно имплантировать ортотопический рак поджелудочной железы, сводя к минимуму непреднамеренную перитонеальную диссеминацию и (ii) впоследствии полностью резецировать рак. В статье освещаются советы и потенциальные подводные камни этой техники.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и этике Университета Нового Южного Уэльса (17/109A). Для этого протокола использовались самки атипичных balb/c обнаженных мышей в возрасте 8-10 недель с массой тела 16-19 г. Мышей размещали в клетках с микроизоляторами и кормили коммерчески доступной гранулированной пищей и водой ad libitum.
1. Ортотопическая имплантация рака поджелудочной железы
- Подготовьте клетки к имплантации. Во-первых, рассчитайте количество клеток, необходимых для процедуры (для каждого животного требуется1 x 10 6 клеток AsPC-1 с меткой люциферазы и 1 x10 6 связанных с раком звездчатых клеток поджелудочной железы человека [CAhPSCs]).
- Поддерживайте эти клетки в увлажненный инкубатор CO 2 сконтролируемой температурой и выполняйте рутинное тестирование микоплазмы. Культуральная среда, используемая для AsPC-1 и CAhPSCs, - это RPMI 1640 (с 300 мг/л L-глутамина, 20% v/v плодной бычий сыворотки, 1% v/v пенициллина/стрептомицина) и IMDM (с 4 мМ L-глутамином, 10% v/v фетальной бычий сыворотки, 1% v/v пенициллина/стрептомицина).
- Используйте стандартные методы клеточной культуры, чтобы трипсинизировать клетки в клеточную суспензию. Нейтрализуют трипсин, используя соответствующую полную питательную среду в объеме, в два раза большем, чем используемый раствор трипсина.
- Промыть эти клетки дважды фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и повторно суспендировать в смесь, содержащую 1 х10 6 клеток AsPC-1 и 1 х 106 КахПСК в клеточной суспензии 50 мкл.
- Держите эту суспензию на льду до использования.
- Подготовьте кабинет биобезопасности класса II для этой процедуры. Используйте нагревательный коврик, наложенный стерильной пластиковой драпировкой. Для увеличения во время процедуры используйте пару хирургических луп с увеличением от 2,5 до 3,5 раз.
- Подготовьте тампоны из кошелька, разрезав отверстие диаметром 1 см в марлевой тампон. Закрепите это отверстие швом из кошелька. Для этого может быть использован любой тонкий плетеный шов (например, шов полигликолевой кислоты 5/0). Рекомендуется плетеный шовной материал, так как он позволяет рыхлому узлу оставаться на месте после затягивания. Это показано на рисунке 1a.
- Обезболить мышь 80 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина внутрибрюшинной инъекцией.
- Назначают 5 мг/кг энрофлоксацина для профилактики антибиотиками, 2,5 мг/кг флуниксина и 1 мл 0,9% физиологического раствора подкожно.
- После обезболивать поместите мышь на стерильное поле в лежачем положении и нанесите повидон-йод с последующим 70% этанолом для приготовления кожи.
- Сделайте продольный разрез в коже левого черепного квадранта живота, а затем войдите в брюшную полость, разрезав мышечный слой между щипцами.
- Загрузите шприц инсулина 29 г с 50 мкл клеточной суспензии - это соответствует 1 х 106 КахПСК и 1 х 106 клеток с люциферазой, помеченных AsPC-1 на инъекцию. Установите его на инъекционное устройство. Конструкция и функции этого инъекционного устройства подробно описаны на рисунке 1b и его легенде.
- Поместите тампон из кошелька над разрезом лапаротомии, а затем экстериоризировать селезенку и хвост поджелудочной железы через отверстие этого тампона. Затяните кошелек-нить, чтобы мягко окружить тело поджелудочной железы, обнажив хвост поджелудочной железы для инъекций. Важно быть достаточно плотным, чтобы марля контактирует с поджелудочной железой по окружности, в то же время не сжимая ее.
- С помощью пары щипцов обхватите хвост поджелудочной железы и осторожно наложите на него боковое натяжение. Проколите брюшную брюшинную поверхность иглой под неглубоким углом, а затем медленно и контролируемо (более 10−15 с) с помощью инъекционного устройства вводят клеточную суспензию в поджелудочную железу.
- Во время процесса инъекции тщательно следите за утечкой — как вокруг места инъекции (от рефлюкса), так и по другую сторону дольки поджелудочной железы (в случае сквозного проникновения). Если происходит видимая утечка, остановите инъекцию и обратите внимание на объем утечки, проверив объем оставшегося инъектора в шприце. Если утечка имеет небольшой объем (<10 мкл), а затем поглотить любую утечку марлей и переместить иглу в другую дольку поджелудочной железы для завершения инъекции.
- Замените селезенку и поджелудочную железу и закройте брюшную стенку швом полигликолевой кислоты 5/0 непрерывным образом. Закройте кожу клипсами.
- Следите за мышью в подогретой клетке до тех пор, пока она не оправится от анестезии. Проснувшись и предупредив, переместите мышь обратно в клетку.
2. Хирургия резекции рака: дистальная панкреатэктомия и спленэктомия
- Сроки резекции по отношению к имплантации могут варьироваться в зависимости от протокола эксперимента. В общем, позвольте опухолям расти, по крайней мере, в течение 3 недель до резекции, но оптимизируйте это эмпирически для конкретной имплантированной линии раковых клеток.
- За день до операции резекции выполните биолюминесцентную визуализацию на животных, чтобы подтвердить наличие локализованной первичной опухоли. Обратите внимание, что это исследование изображений просто используется для исключения мышей с явным внепоточном заболеванием из резекции. Ни размер, ни поток излучения не должны использоваться в качестве пороговых значений для определения права на резекцию.
- Взвешивают мышей и вводят D-люциферин внутрибрюшинно (150 мг/кг).
- Определите время этапа визуализации по отношению к инъекции люциферина для каждого эксперимента по выполнению кинетической кривой люциферина. Период времени, когда поток излучения превышает 90% от его максимума, представляет собой оптимальное время для визуализации биолюминесценции (в этом эксперименте от 18 до 26 минут после инъекции)
- Индуцировать анестезию и поддерживать использование изофлурана (4% и 3% с кислородом соответственно) и выполнять визуализацию с использованием биолюминесцентного устройства визуализации (например, IVIS Lumina II). Используйте автоматические настройки экспозиции и биннинга (это, однако, может быть оптимизировано для ожидаемого потока излучения).
- Подготовьте кабинет биобезопасности класса II к процедуре. Используйте нагревательный коврик, наложенный стерильной пластиковой драпировкой. Для увеличения во время рассечения используйте пару хирургических луп с увеличением от 2,5 до 3,5 раз.
- Обезболить мышь 80 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина внутрибрюшинной инъекцией.
- Назначают 5 мг/кг энрофлоксацина для профилактики антибиотиками, 2,5 мг/кг флуниксина и 1 мл 0,9% физиологического раствора подкожно.
- Поместите мышь на стерильное поле в лежачем положении и нанесите повидон-йод с последующим 70% этанолом для приготовления кожи.
- Сделать продольный разрез в коже левого черепного квадранта живота, желательно через предыдущий участок разреза.
- Тупо рассекайте кожу от нижележащей мышечной брюшной стенки, а затем поместите самоудерживающийся ретрактор Alm, чтобы держать рану кожи открытой.
- Разрезайте мышечный слой между щипцами только с одной стороны от линии шва предыдущей операции, а затем вытяните разрез, чтобы иссечить всю предыдущую линию шва.
- Экстериоризуйте селезенку и дистальную поджелудочную железу и втягивайте ее в черепно. В каудальном аспекте поджелудочной железы толстая кишка может быть обнаружена прикрепленной пленочными спайкими. Если это обнаружено, тупо рассекают двоеточие.
- Осторожно пройдите парой щипцов дорсально к телу поджелудочной железы и селезеночных сосудов и откройте это пространство. Это освобождает сегмент поджелудочной железы для последующего лигирования.
- Обжигайте тело поджелудочной железы проксимально к опухоли титановым перевязочным клипсом, а затем переведите дистально к этому поджелудочную железу с помощью прижигания. Альтернативным способом контроля культи поджелудочной железы является ее непрерывность с помощью шва полигликолевой кислоты 5/0 перед трансекцией.
- Втягивайте поджелудочную железу каудально и прижигайте гастроспленические сосуды между черепным полюсом селезенки и желудком.
- Удалите образец и подтвердите гемостаз.
- Закройте брюшную стенку швом 5/0 полигликолевой кислоты непрерывным образом. Закройте кожу клипсами.
3. Послеоперационное лечение
- В непосредственной после анестезиологического периода (для обеих вышеуказанных процедур) наведите наблюдение за мышью в подогретой клетке до тех пор, пока она не оправится от анестезии. Проснувшись и предупредив, переместите мышь обратно в клетку. В послеоперационном периоде следите за животными на наличие болевых ощущений и признаков дистресса. Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина путем подкожной инъекции и внимательно наблюдают за животными в течение 12 часов.
- Впоследствии ежедневно контролируйте мышей за весом, потреблением пищи и активностью. Исследуйте места разреза и пальпировать на размер опухоли. Снимите кожные клипсы на седьмой послеоперационный день.
- Усыплите мышь, если достигнуты гуманные конечные точки. Эти гуманные конечные точки включают: потерю массы тела >20%, особенности неизлечимого дистресса (включая сгорбленную осанку, отсутствие движения или груминга) и размер опухоли более 1см3 по оценке внешней пальпации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пятьдесят девять последовательных мышей перенесли операцию по имплантации. Валовая утечка произошла в восьми (14%) Мышей. Степень утечки в момент инъекции оценивается так, как описано выше в разделе протокола. Через три недели, чтобы позволить этим имплантированным опухолям расти, была выполнена биолюминесцентная визуализация до резекции, чтобы исключить мышей с грубым метастатическим заболеванием до резекции. Сорок пять (76%) мыши подверглись хирургической резекции.
Все 45 (100%) мыши прошли успешную дистальную панкреатэктомию / спленэктомию без проблем с гемостазом. Макроскопический проксимальный запас поджелудочной железы более 5 мм был достигнут у 43 (96%) Мышей.
На момент резекции местное метастазирование было обнаружено у 9/45 (20%) мыши — в основном в линии шва (прерывисто с первичной опухолью), причем три из девяти показывают дополнительные изолированные узелки на большей кривой желудка и один показывает субкапсулярный узелок на печени. Первичная опухоль поджелудочной железы была прилипать к шовной линии у пяти (11%) мышам и печени в одном (2%) мышь. Эти адепты структуры были исечены блоком.
Среднее время операции (SEM) (индукция к закрытию) составило 22 (0,9) минуты. Ни одно из животных не умерло в течение 1 недели после резекции.
Через неделю после резекции мыши прошли биолюминесцентную визуализацию для выявления остаточного заболевания. Соотношение максимального сияния над вентральной поверхностью мыши сравнивали с соотношением фонового. Тридцать два (71%) мыши имели максимальное соотношение сияния (мышь: фон) <10, что указывает на минимальное или отсутствующее остаточное заболевание.
Рисунок 1: Изготовленные на заказ устройства для облегчения имплантации опухоли. а) марлевый тампон из кошельковой веревки: i) центральное отверстиедиаметромпримерно 1 см, через которое в момент инъекции будет помещен хвост поджелудочной железы; ii) швы вокруг отверстия; iii) двухслойная марля; iv) узел одиночного броска; v) одна конечность шовного материала крепится к марле стерилизующей индикаторной лентой; vi) Ручка, изготовленная из индикаторной ленты, изготовлена на другом конце шовного материала. b)Инъекционное устройство: I) Приводной шприц. Прорези, прорезанные через корпус этого шприца, позволяют установить на корпус этого шприца инъекцию (с инъекцией клеточной суспензии; не показан); II) Шприц контроллера. Он заполняется водой. Вдвивание плунжера на меньшем шприце контроллера хирургическим помощником вызывает смещение плунжера большего приводного шприца. Смещение приводного плунжера меньше, но с механическим преимуществом, которое позволяет инъекции преодолевать сопротивление, связанное с механизмом шприца для инъекции, а также устойчивость ткани к расширению инъекционным путем. Это позволяет точно и плавно впрыскивание 50 мкл в течение 10–15 секунд; (III) Соединительные трубки из политетрафторэтилена (PTFE) с внутренним диаметром 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Резекционная ортотопическая мышиная модель рака поджелудочной железы важна, потому что она позволяет тестировать адъювантные и неоадъювантные методы лечения. Это особенно важно при раке поджелудочной железы, где хирургия остается наиболее эффективным лечением, но связана с высоким риском рецидива. В этой статье описывается метод, который будет надежно производить рак поджелудочной железы, который потенциально излечим с помощью резекции, повторяя клинический сценарий, где требуется неоадъювантная / адъювантная терапия.
Значение по отношению к существующим методам
Несмотря на важность адъювантной и неоадъювантной терапии при раке поджелудочной железы, в литературе мало хорошо описанных ортотопических резекционных моделей мышей. Эти описанные резекционные модели различались по своей точности воспроизведения клинической ситуации у людей. Эти предыдущие модели можно в целом классифицировать следующим образом: (i) только иссечение опухоли с флуоресцентным руководством; ii) субтотальная резекция поджелудочной железы без спленэктомии; iii) дистальная панкреатэктомия/спленэктомия.
Иссечение опухоли с флуоресцентным руководством было описано в наибольшем количестве сообщений15,17,18,19,20,21. Многие из этих работ были получены от одной и той же исследовательской группы. К сожалению, у человека местное иссечение опухоли самостоятельно (энуклеация) не проводится при аденокарциноме поджелудочной железы (ПК) из-за высокой вероятности местного рецидива, а также невозможности оценить состояние лимфатических узлов22,23. Таким образом, использование неклинической группы компаратора (нефлуоресцентная энуклеация) затуманило отчетность об онкологических исходах в работах, описывающих этот метод. Неудивительно, что группы нефлуоресцентной энуклеации неизменно имели чрезмерные показатели локального рецидива15,20,21. Напротив, Torgenson et al.14 описали аналогичный метод резекции с флуоресцентным управлением и сообщили о достаточно низкой частоте рецидивов в 58% (через восемь недель после резекции). В целом, эти исследования, по-видимому, демонстрируют полезность флуоресцентного руководства для визуализации остаточного заболевания во время операции. Тем не менее, это еще не стандарт ухода за людьми, что является ограничением с точки зрения его использования в мышиной модели, направленной на повторение клинического сценария. Конечно, это может измениться, если флуоресцентная хирургия будет широко принята в клинической практике.
Другая резекционная модель была основана на субтотальной панкреатэктомии без спленэктомии для опухоли, имплантированной в тело поджелудочной железы13,24. Клиническая значимость этого также ставится под сомнение, поскольку описанная операция не была ни панкреатодуоденэктомией, ни дистальной панкреатэктомией, как это было выполнено у людей. Неудивительно, что эти мыши также страдали от высоких показателей рецидивов опухолей, как отдаленных, так и местных. Особо следует отметить, что рецидив селезенки был распространенным явлением, что предполагает либо неадекватную резекцию, либо возможный посев перитонеальной опухоли при имплантации24.
Ni et al.16 описали модель дистальной панкреатэктомии/спленэктомии, выполненную с помощью флуоресцентной визуализации. К сожалению, несмотря на использование клинически значимой операции (с флуоресцентным руководством), выживаемость была очень короткой (средняя выживаемость 18 дней) даже в группе дистальной панкреатэктомии. Эта степень прогрессирующего заболевания, по-видимому, даже хуже, чем паллиативное лечение моделями25,26,27,предполагающими возможное наличие грубого остаточного заболевания после резекции. Совсем недавно Giri et al.28 сообщили о дистальной панкреатэктомии и частичной спленэктомии мышиной модели. Это исследование примечательно тем, что оно представляет собой иммунокомпетентную мышиную модель рака. Тем не менее, в этом исследовании сообщалось о почти универсальном местном и другом внутрибрюшинном рецидиве опухоли, что, возможно, указывает на скрытные ятрогенные метастазы при имплантации.
Использование мышиных моделей, где есть грубое остаточное заболевание после резекции, для тестирования адъювантного лечения может быть неуместным. Проблема в том, что лечение грубого остаточного заболевания не может быть действительно классифицировано как адъювантное лечение, а скорее должно рассматриваться как лечение с паллиативным намерением. В этом случае такие мышиные модели не дают никаких преимуществ по сравнению с нересекционными моделями с заболеванием низкого объема.
Советы и подводные камни критических шагов
Процедура имплантации опухоли
Чтобы воспроизвести клинический сценарий, в этой модели существуют различные проблемы, связанные с процедурами имплантации и резекции. Для процедуры имплантации основными проблемами, которые необходимо преодолеть, являются успешная имплантация и предотвращение утечки. Эти две проблемы взаимосвязаны, так как неудача инъекции приведет к грубой утечке суспензии опухолевых клеток в брюшную полость. Это приведет к созданию мышиной модели с перитонеальным метастазированием, которое будет прогрессировать независимо от резекции поджелудочной железы. Это отражает хорошо известный клинический сценарий у людей, когда резекция поджелудочной железы при метастатическом ПК не влияет на исход пациента. Это основа постановки лапароскопии у человека29.
Успех имплантации опухоли можно рассматривать интраоперационно как успешную генерацию «пузыря» клеточной суспензии без явной утечки. Наибольшее значение в достижении хорошего результата имеет точное размещение иглы внутри паренхимы поджелудочной железы. Этого можно было достичь, только «растягнул» поджелудочную железу так, чтобы поверхность брюшины была подтянутой. Пункция должна происходить со скосом иглы, обращенным вверх (вентрально). Как только игла проколет поверхность брюшины, ее следует выдвинуть, пока кончик иглы слегка приподнят вверх, чтобы скошенная поверхность скользила прямо под брюшиной. Это предотвратит непреднамеренную сквозную пункцию поджелудочной железы, распространенную ловушку из-за небольших размеров долек поджелудочной железы мыши. Как только весь скос окажется в веществе поджелудочной железы, вводится клеточная суспензия. Увеличение зрения хирургическими лупами крайне желательно для точной визуализации глубины проникновения иглы.
Для дальнейшей минимизации риска непреднамеренной утечки может быть использован ряд методов.
Подбор большой дольки для инъекций. Небольшие дольки требуют более высокого давления для раздувания (следуя закону Лапласа), тем самым увеличивая риск утечки вокруг иглы в месте прокола.
Оптимизация скорости впрыска. Использование инъекционного устройства(рисунок 1b),которое позволяет вводить клеточную суспензию в течение 10-15 секунд, служит трем целям. Во-первых, он снижает скорость изменения давления в поджелудочной железе, давая тканям время на деформацию и снижая риск рефлюкса суспензии. Во-вторых, это позволяет контролировать процесс инъекции и, при необходимости, останавливать и перемещать иглу. Любая утечка может быть стерта с помощью пропитанной повидоном йодом марли. В-третьих, это освобождает оператора от необходимости нажимать на плунжер, позволяя оператору сосредоточиться на удержании кончика иглы в поджелудочной железе, в то время как помощник вводит клеточную суспензию.
Использование двухслойной кошельковой марли. Эта марля образует воротник вокруг хвоста поджелудочной железы, который будет поглощать любую утечку клеточной суспензии и, следовательно, сводит к минимуму загрязнение в брюшной полости.
В некоторых исследованиях в литературе использовалась внеклеточная матричная смесь (Matrigel), которая затвердева со временем послеинъекции13,15,24. Это может снизить риск утечки после инъекции. Однако потенциальным недостатком этой стратегии является то, что Matrigel или другие подобные растворы внеклеточного матрикса могут оказывать нефизиологическое воздействие на PSC30. Например, было показано, что Matrigel делает PSC покоя, тем самым потенциально сводя на нет эффекты PSC в модели31,32. Альтернативой инъекции раковых клеток является ортотопическая имплантация опухолевой ткани (либо непосредственно от пациентов, либо от подкожных моделей мышей). Однако у этих подходов есть свои недостатки. Во-первых, гетерогенность может возникнуть из-за ошибки отбора проб или из-за изменений в объеме имплантируемой ткани. Такая неоднородность может снизить силу последующих сравнений лечения. Во-вторых, прохождение опухолевой ткани с помощью подкожной мышиной модели может привести к выбору субклонов, которые имеют различное биологическое поведение по отношению к исходной опухоли пациента.
Процедура резекции опухоли
В этой модели мы использовали процедуру дистальной панкреатэктомии / спленэктомии, сродни той, которая выполняется у людей. Проблемы, связанные с резекционной хирургией, зависят от патологических и анатомических факторов.
Ключевым патологическим фактором является распространение опухоли. Небольшой объем местного распространения может быть резектирован в момент резекции поджелудочной железы, хотя это может указывать на возможность более отдаленного перитонеального и другого метастазирования. Мы регулярно иссекаем линию шва с первой операции, так как это возможная область местного рецидива. Если опухоль прикреплена к окружающим структурам, таким как брюшная стенка или левая доля печени, они могут быть резецированы в блоке. Анатомически ключевым шагом является рассечение плоскости дорсальной к телу поджелудочной железы. Селезеночная вена часто может быть визуализирована позади поджелудочной железы, как только поджелудочная железа экстериоризируется. Это ключевой ориентир, так как эмбриологический бескровный самолет сразу же дорсальный к этому.
Есть две другие потенциальные анатомические ловушки в модели, описанной здесь. Толстая кишка может быть прилипательной к каудальному аспекту тела поджелудочной железы. Неспособность мобилизовать эту структуру может привести к непреднамеренному повреждению толстой кишки во время деления поджелудочной железы или перевязки. Гастроспленические сосуды маленькие и могут легко кровоточить, если их прижигать или недостаточно прижигать. Кроме того, после авульсии точка кровотечения часто втягивается глубоко в брюшную полость за большим изгибом желудка, что делает последующий контроль кровотечения более сложным. Поэтому требуется тщательное втягивание селезенки и прижигание гастроспленических сосудов. Одним из подходов к успешному гемостазу является прижигание этих сосудов на хиларном аспекте селезенки, что сводит к минимуму риск непреднамеренного термического повреждения окружающих полых внутренностей.
Мы обнаружили, что использование титанового лигирующего клипса, широко используемого в хирургии человека для перевязки сосудов, является быстрым и эффективным способом контроля культи поджелудочной железы с последующим сокращением общего времени работы по сравнению с использованием лигатур. Это также использовалось Giri et al.28.
Ограничения техники
Существуют ограничения для этой резекционной модели поджелудочной железы. Одно ограничение связано со временем, разрешенным для производства рецидива / метастазирования. С одной стороны, нужно максимально увеличить развитие метастатического заболевания, но с другой стороны, нужно резецировать опухоль до того, как она стала локально запущенной. Поэтому период между имплантацией и резекцией, возможно, потребуется скорректировать для конкретного клинического сценария, который вы хотите воспроизвести. Другое ограничение связано с непреднамеренным разливом и последующим перитонеальным метастазированием раковых клеток, которое обсуждалось выше.
Основной проблемой моделей адъювантного лечения является препарирование эффекта адъювантного лечения от эффекта хирургического лечения. Очевидно, что требуется хорошо спланированное исследование, которое рандомизировано, с контрольной группой, проходящей резекционную операцию. Чтобы еще больше улучшить оценку относительных эффектов лечения, мы предлагаем оценить опухолевую нагрузку in vivo (например, с помощью раковых клеток, помеченных люциферазой, и выполнения визуализации биолюминесценции in vivo). Несмотря на полуколичественный характер данной оценки в ортотопических моделях (поскольку сигнал биолюминесценции ослаблен при прохождении через шелушащиеся ткани), такой подход позволяет продольно оценить опухолевую нагрузку, включая оценку послеоперационного остаточного заболевания.
Модификации и будущие применения
Имплантированная клеточная линия и/или номера клеток с звездчатыми клетками поджелудочной железы или без нее могут быть модифицированы для отражения целевого клинического сценария12. Продолжительность между имплантацией и резекцией также может быть изменена, чтобы изменить риск образования метастазов. Другие варианты могут включать имплантацию ксенотрансплантатов или органоидов33,полученных от пациентов или мышей.
Неоадъювантная терапия также может быть протестирована в рамках основных особенностей модели, описанной здесь. Это просто потребует начала медикаментозного лечения до хирургической резекции34. Аналогичным образом, как неоадъювантная, так и адъювантная терапия могут быть изучены на одних и тех же мышах.
Наконец, хотя мы описали использование атимических balb/c обнаженных мышей, которые представляют собой иммунодефицитную модель, альтернативная иммунокомпетентная модель может включать опухолевые клетки KPC, имплантированные мышам C57B628. Это может быть полезной альтернативой для тестирования адъювантной / неоадъювантной иммунной терапии.
Таким образом, мы описываем надежную и воспроизводимую технику для модели хирургической резекции рака поджелудочной железы у мышей, которая имитирует клинический сценарий и не требует специализированного оборудования. Эта модель может быть полезна для тестирования как адъювантных, так и неоадъювантных методов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать в отношении этого проекта.
Acknowledgments
Авторы получили поддержку от Фонда рака поджелудочной железы Авнера.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
- Noone, A. M., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute. , Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2015/ (2018).
- Sugiura, T., et al. Margin status, recurrence pattern, and prognosis after resection of pancreatic cancer. Surgery. 154 (5), 1078-1086 (2013).
- Hishinuma, S., et al. Patterns of recurrence after curative resection of pancreatic cancer, based on autopsy findings. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (4), 511-518 (2006).
- NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology - Pancreatic Adenocarcinoma (Version 3.2019). National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Breslin, T. M., et al. Neoadjuvant chemoradiotherapy for adenocarcinoma of the pancreas: treatment variables and survival duration. Annals of Surgical Oncology. 8 (2), 123-132 (2001).
- Mokdad, A. A., et al. Neoadjuvant Therapy Followed by Resection Versus Upfront Resection for Resectable Pancreatic Cancer: A Propensity Score Matched Analysis. Journal of Clinical Oncology. 35 (5), 515-522 (2017).
- Tachezy, M., et al. Sequential neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT) followed by curative surgery vs. primary surgery alone for resectable, non-metastasized pancreatic adenocarcinoma: NEOPA- a randomized multicenter phase III study (NCT01900327, DRKS00003893, ISRCTN82191749). BMC Cancer. 14, 411 (2014).
- Barbour, A. P., et al. The AGITG GAP Study: A Phase II Study of Perioperative Gemcitabine and Nab-Paclitaxel for Resectable Pancreas Cancer. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (12), 5645-5649 (1992).
- Marincola, F., Taylor-Edwards, C., Drucker, B., Holder, W. D. Orthotopic and heterotopic xenotransplantation of human pancreatic cancer in nude mice. Current Surgery. 44 (4), 294-297 (1987).
- Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Research. 68 (7), 2085-2093 (2008).
- Xu, Z., et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. American Journal of Pathology. 177 (5), 2585-2596 (2010).
- Tepel, J., et al. Adjuvant treatment of pancreatic carcinoma in a clinically adapted mouse resection model. Pancreatology. 6 (3), 240-247 (2006).
- Torgenson, M. J., et al. Natural history of pancreatic cancer recurrence following "curative" resection in athymic mice. Journal Surgical Research. 149 (1), 57-61 (2008).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models. Journal of the American College of Surgeons. 215 (1), 126-135 (2012).
- Ni, X., Yang, J., Li, M. Imaging-guided curative surgical resection of pancreatic cancer in a xenograft mouse model. Cancer Letters. 324 (2), 179-185 (2012).
- Hiroshima, Y., et al. Hand-held high-resolution fluorescence imaging system for fluorescence-guided surgery of patient and cell-line pancreatic tumors growing orthotopically in nude mice. Journal of Surgical Research. 187 (2), 510-517 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model is inhibited by neoadjuvant chemotherapy in combination with fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore. PLoS One. 9 (12), 114310 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. PLoS One. 9 (6), 99977 (2014).
- Metildi, C. A., et al. Ratiometric activatable cell-penetrating peptides label pancreatic cancer, enabling fluorescence-guided surgery, which reduces metastases and recurrence in orthotopic mouse models. Annals of Surgical Oncology. 22 (6), 2082-2087 (2015).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery with a fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA), that highlights the tumor, improves surgical resection and increases survival in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer. Annals of Surgical Oncology. 21 (4), 1405-1411 (2014).
- NCCN Guidelines: Pancreatic Adenocarcinoma. National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Maithel, S. K., Allen, P. J. Blumgart's Surgery of the Liver, Biliary Tract and Pancreas, 2-Volume Set (Sixth Edition). Jarnagin, W. R. , Content Repository Only 1007-1023 (2017).
- Egberts, J. H., et al. Dexamethasone reduces tumor recurrence and metastasis after pancreatic tumor resection in SCID mice. Cancer Biology & Therapy. 7 (7), 1044-1050 (2008).
- Xu, Z. H., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway in advanced pancreatic cancer: a key element of treatment that limits primary tumor growth and eliminates metastasis. British Journal of Cancer. , (2020).
- Pothula, S. P., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway: stromal remodelling in pancreatic cancer. Oncotarget. 8 (44), 76722-76739 (2017).
- Pothula, S. P., et al. Hepatocyte growth factor inhibition: a novel therapeutic approach in pancreatic cancer. British Journal of Cancer. 114 (3), 269-280 (2016).
- Giri, B., et al. An Immunocompetent Model of Pancreatic Cancer Resection and Recurrence. Journal of Gastrointestinal Surgery. , (2020).
- Allen, V. B., Gurusamy, K. S., Takwoingi, Y., Kalia, A., Davidson, B. R. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. (11), 009323 (2013).
- Vaillant, F., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Jekyll or Hyde: does Matrigel provide a more or less physiological environment in mammary repopulating assays. Breast Cancer Research. 13 (3), 108 (2011).
- Jesnowski, R., et al. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Laboratory Investigation. 85 (10), 1276-1291 (2005).
- Phillips, P. A., et al. Cell migration: a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut. 52 (5), 677-682 (2003).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Egberts, J. H., et al. Superiority of extended neoadjuvant chemotherapy with gemcitabine in pancreatic cancer: a comparative analysis in a clinically adapted orthotopic xenotransplantation model in SCID beige mice. Cancer Biology & Therapy. 6 (8), 1227-1232 (2007).
