Summary
In de klinische context zullen patiënten met gelokaliseerde alvleesklierkanker pancreatectomie ondergaan, gevolgd door adjuvante behandeling. Dit hier gerapporteerde protocol is bedoeld om een veilige en effectieve methode vast te stellen om dit klinische scenario bij naakte muizen te modelleren, door orthotopische implantatie van alvleesklierkanker gevolgd door distale pancreatectomie en splenectomie.
Abstract
Er is een gebrek aan bevredigende diermodellen om adjuvante en/of neoadjuvante therapie te bestuderen bij patiënten die in aanmerking komen voor een operatie van alvleesklierkanker (PC). Om dit tekort aan te pakken, beschrijven we een muismodel met orthotopische implantatie van pc gevolgd door distale pancreatectomie en splenectomie. Het model is veilig en passend flexibel gebleken voor de studie van verschillende therapeutische benaderingen in adjuvante en neo-adjuvante omgevingen.
In dit model wordt een pancreastumor voor het eerst gegenereerd door een mengsel van menselijke pancreaskankercellen (luciferase-gelabeld AsPC-1) en met menselijke kanker geassocieerde pancreas stellate cellen te implanteren in de distale alvleesklier van Balb / c athymische naakte muizen. Na drie weken wordt de kanker gereseceerd door re-laparotomie, distale pancreatectomie en splenectomie. In dit model kan bioluminescentiebeeldvorming worden gebruikt om de voortgang van de ontwikkeling van kanker en de effecten van resectie/ behandelingen te volgen. Na resectie kan adjuvante therapie worden gegeven. Als alternatief kan een neoadjuvante behandeling worden gegeven voorafgaand aan de resectie.
Representatieve gegevens van 45 muizen worden gepresenteerd. Alle muizen ondergingen een succesvolle distale pancreatectomie/splenectomie zonder problemen met hemostase. Een macroscopische proximale pancreasmarge van meer dan 5 mm werd bereikt in 43 (96%) Muizen. Het technische slagingspercentage van pancreasresectie was 100%, met 0% vroege mortaliteit en morbiditeit. Geen van de dieren stierf in de week na de resectie.
Samenvattend beschrijven we een robuuste en reproduceerbare techniek voor een chirurgisch resectiemodel van alvleesklierkanker bij muizen dat het klinische scenario nabootst. Het model kan nuttig zijn voor het testen van zowel adjuvante als neoadjuvante behandelingen.
Introduction
Pancreas ductaal adenocarcinoom (alvleesklierkanker [PC]) wordt geassocieerd met een slechteprognose 1. Chirurgische resectie blijft de enige potentieel curatieve behandeling voor pc en moet worden overwogen voor patiënten met een ziekte in een vroeg stadium. Helaas is zelfs bij R0-resectie (d.w.z. resectiemarges vrij van tumor) het recidiefpercentage (lokaal of van onopgemerkte gemetastaseerde ziekte) hoog2,3. Daarom is systemische adjuvante therapie geïndiceerd bij bijna alle patiënten die resectie4ondergaan . Bovendien, terwijl neoadjuvante therapie nu alleen wordt aanbevolen voor borderline-reseceerbare kankers, breiden de indicaties zich zodanig uit dat het routinematige gebruik ervan de focus is van veel klinisch onderzoek5,6,7,8. Om nieuwe therapeutische benaderingen voor pc's met resectie te ontwikkelen, moeten deze benaderingen eerst worden beoordeeld in preklinische modellen die de klinische instellingen nauwkeurig samenvatten.
Orthotopische muismodellen van PC zijn in het verleden vaak gebruikt om medicamenteuze behandelingen te testen9,10. Veel van deze werden geproduceerd door injectie van kankercellen alleen in de alvleesklier van de muis, wat resulteerde in tumoren die het prominente stroma misten dat kenmerkend is voor pc. Meer recentelijk, co-injectie orthotopische modellen, zoals degene die we voor het eerst ontwikkeld door het injecteren van een mengsel van menselijke PC en menselijke pancreas stellate cellen (PSC's, de primaire producenten van de collageenachtige stroma in PC), zijn gekomen in regelmatig gebruik11,12. De tumoren die worden geproduceerd door een dergelijke co-injectie van kanker en stromale cellen vertonen (i) zowel de kankerelementen als de karakteristieke stromale (desmoplastische) component van pc, en (ii) verbeterde proliferatie van kankercellen en metastase11. Dit model lijkt dus sterk op menselijke pc. Hoewel een aantal resectiemodellen van orthotopische PC zijn beschreven13,14,15,16, geen enkele hebben weerspiegeld de klinische realiteit van pancreas resectie bij de mens zo nauwkeurig als dit model, en daarom zijn suboptimaal voor het testen van adjuvante of neoadjuvante behandelingen.
Het doel van het gepresenteerde muismodel was om te laten zien hoe: (i) orthotopische alvleesklierkanker met succes kan worden geïmplanteerd terwijl onbedoelde peritoneale verspreiding wordt geminimaliseerd en (ii) vervolgens de kanker volledig kan worden gereseceerd. Het artikel belicht tips en mogelijke valkuilen van deze techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Care and Ethics Committee van de University of New South Wales (17/109A). Vrouwelijke athymische Balb/c naakte muizen, in de leeftijd van 8-10 weken met een gewicht van 16-19 g, werden gebruikt voor dit protocol. Muizen werden gehuisvest in micro-isolator kooien en gevoed commercieel beschikbaar pelleted voedsel en water ad libitum.
1. Orthotopische alvleesklierkanker implantatie
- Bereid de cellen voor op implantatie. Bereken eerst het aantal cellen dat nodig is voor de procedure (1 x 106 luciferase-gelabelde AsPC-1-cellen en 1 x 106 kankergerelateerde menselijke pancreas stellate cellen [CAhPSCs] zijn vereist voor elk dier).
- Onderhoud deze cellen in een bevochtigde temperatuurgecontroleerde CO2-incubator en voer routinematige mycoplasmatests uit. Kweekmedium gebruikt voor AsPC-1 en CAhPSCs zijn RPMI 1640 (met 300 mg/L L-glutamine, 20% v/v foetale runderserum, 1% v/v penicilline/streptomycine) en IMDM (met 4 mM L-glutamine, 10% v/v foetale runderserum, 1% v/v penicilline/streptomycine).
- Gebruik standaard celkweektechnieken om de cellen te proberen in een celsuspensie te brengen. Neutraliseer de trypsine met behulp van het betreffende volledige kweekmedium op een volume dat tweemaal zo groot is als dat van de gebruikte trypsineoplossing.
- Was deze cellen tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspend in een mengsel dat 1 x 106 AsPC-1 cellen en 1 x 106 CAhPSC's bevat in een celsuspensie van 50 μL.
- Houd deze suspensie op ijs tot gebruik.
- Bereid een bioveiligheidskast van klasse II voor op de procedure. Gebruik een verwarmingsmat bedekt met een steriel plastic laken. Gebruik voor vergroting tijdens de procedure een paar 2,5x tot 3,5x vergroting chirurgische loepen.
- Bereid portemonnee-string swabs door het snijden van een gat, 1 cm in diameter, in een gaasje swab. Beveilig dit gat met een ring-string hechtdraad. Elke fijne gevlochten hechtdraad kan hiervoor worden gebruikt (bijv. 5/0 polyglycolzuur hechtdraad). Gevlochten hechtmateriaal wordt aanbevolen omdat het de losse knoop op zijn plaats laat blijven na het aandraaien. Dit wordt geïllustreerd in figuur 1a.
- Verdoof de muis met 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine door intraperitoneale injectie.
- Dien 5 mg/kg enrofloxacine antibioticum profylaxe, 2,5 mg/kg flunixine analgesie en 1 ml 0,9% zoutoplossing subcutaan toe.
- Eenmaal verdoofd, plaatst u de muis op het steriele veld in een liggende positie en breng u povidonjodium aan, gevolgd door 70% ethanol voor huidvoorbereiding.
- Maak een longitudinale incisie in de huid van het linker craniale kwadrant van de buik en ga vervolgens de buik in door de spierlaag tussen de tang in te stoken.
- Plaats een insulinespuit van 29 G met 50 μL celsuspensie– dit komt overeen met 1 x 106 CAhPSC's en 1 x10 6 luciferase-gelabelde AsPC-1 cellen per injectaat. Monteer het op het injectieapparaat. Het ontwerp en de functie van dit injectieapparaat worden in detail uitgelegd in figuur 1b en de bijbehorende legenda.
- Plaats het portemonneesnaardoekje over de laparotomie-incisie en maak vervolgens de milt en de alvleesklierstaart buiten door de opening van dit wattenstaafje. Draai de portemonnee-string aan om het lichaam van de alvleesklier voorzichtig te omringen, waardoor de pancreasstaart wordt blootgesteld voor injectie. Het is belangrijk om strak genoeg te zijn dat het gaas de alvleesklier omtrekcontacten geeft en tegelijkertijd niet vernauwt.
- Pak met behulp van een tang de staart van de alvleesklier vast en plaats er voorzichtig laterale spanning op. Prik het ventrale peritoneale oppervlak met de naald onder een ondiepe hoek en injecteer vervolgens de celsuspensie in de alvleesklier op een langzame en gecontroleerde manier (meer dan 10−15 s) met het injectieapparaat.
- Let tijdens het injectieproces zorgvuldig op lekkage, zowel rond de injectieplaats (van reflux) als aan de andere kant van de pancreaslobule (in geval van door-en-door-penetratie). Als zichtbare lekkage optreedt, stop dan de injectie en noteer het volume van de lekkage door het volume van het resterende injectaat in de spuit te controleren. Als de lekkage van klein volume is (<10 μL), en absorbeer dan elke lekkage met gaas en plaats de naald in een andere pancreaslobule om de injectie te voltooien.
- Vervang de milt en alvleesklier en sluit de buikwand met 5/0 polyglycolzuur hechtdraad op een continue manier. Sluit de huid met clips.
- Bewaak de muis in een opgewarmde kooi totdat deze is hersteld van de verdoving. Eenmaal wakker en alert, verplaats je de muis terug naar zijn kooi.
2. Kankerresectiechirurgie: Distale pancreatectomie en splenectomie
- De timing van resectie in relatie tot implantatie kan variëren, afhankelijk van het experimentele protocol. Laat de tumoren over het algemeen ten minste 3 weken vóór de resectie groeien, maar optimaliseer dit empirisch voor de specifieke geïmplanteerde kankercellijn.
- Voer op de dag voorafgaand aan de resectieoperatie bioluminescentiebeeldvorming uit op de dieren om de aanwezigheid van een gelokaliseerde primaire tumor te bevestigen. Merk op dat deze beeldvormingsstudie eenvoudig wordt gebruikt om muizen met een duidelijke extra-pancreasziekte uit te sluiten van resectie. Noch de grootte, noch de stralingsflux mogen worden gebruikt als drempels om te bepalen of zij in aanmerking komen voor resectie.
- Weeg muizen en injecteer intraperitoneaal met D-luciferine (150 mg/kg).
- Bepaal de timing van de beeldvormingsstap in relatie tot luciferine-injectie voor elk experiment door de uitvoering van een luciferinekinetische curve. De periode waarin de stralingsstroom boven 90% van het maximum ligt, vertegenwoordigt de optimale tijd voor bioluminescentiebeeldvorming (in dit experiment, 18 tot 26 minuten na injectie)
- Induceer anesthesie en blijf isofluraan gebruiken (respectievelijk 4% en 3% met zuurstof) en voer beeldvorming uit met behulp van een bioluminescerend beeldvormingsapparaat (bijv. IVIS Lumina II). Gebruik automatische belichtings- en binning-instellingen (dit kan echter worden geoptimaliseerd voor de verwachte stralingsstroom).
- Bereid de bioveiligheidskast van klasse II voor op de procedure. Gebruik een verwarmingsmat bedekt met een steriel plastic laken. Gebruik voor vergroting tijdens dissectie een paar 2,5x tot 3,5x vergroting chirurgische loepen.
- Verdoof de muis met 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine door intraperitoneale injectie.
- Dien 5 mg/kg enrofloxacine antibioticum profylaxe, 2,5 mg/kg flunixine analgesie en 1 ml 0,9% zoutoplossing subcutaan toe.
- Plaats de muis op het steriele veld in een liggende positie en breng povidonjodium aan, gevolgd door 70% ethanol voor huidvoorbereiding.
- Maak een longitudinale incisie in de huid van het linker craniale kwadrant van de buik, bij voorkeur via de vorige incisieplaats.
- Ontleed de huid bot van de onderliggende spierbuikwand en plaats vervolgens een Alm zelfkerende retractor om de huidwond open te houden.
- Insnijd de spierlaag tussen de tangen aan één kant van de hechtlijn van de vorige operatie en breid vervolgens de incisie uit om de hele vorige hechtlijn te verwijderen.
- Buiten de milt en distale alvleesklier en trek deze cranially in. Bij het caudale aspect van de alvleesklier kan de dikke darm worden gevonden die is bevestigd door filmische verklevingen. Als dit wordt gevonden, ontleed dan botweg de dikke darm.
- Geef voorzichtig een tang dorsaal door aan het lichaam van de alvleesklier en miltvaten en open deze ruimte. Dit maakt een segment van de alvleesklier vrij voor daaropvolgende ligatie.
- Ligateer het lichaam van de alvleesklier proximaal aan de tumor met een titanium ligatieclip en transect vervolgens de alvleesklier distaal naar dit met cauterie. Een alternatieve manier om de pancreasstomp te controleren, is door deze in continuïteit te ligateren met 5/0 polyglycolzuur hechting vóór transsectie.
- Trek de alvleesklier caudaal in en cauteriseer de maag-darmvaten tussen de schedelpool van de milt en de maag.
- Verwijder het monster en bevestig hemostase.
- Sluit de buikwand continu met 5/0 polyglycolzuur hechtdraad. Sluit de huid met clips.
3. Postoperatieve leiding
- Controleer de muis in de onmiddellijke anesthesieperiode na de anesthesieperiode (voor beide bovengenoemde procedures) in een opgewarmde kooi totdat deze is hersteld van de verdoving. Eenmaal wakker en alert, verplaats je de muis terug naar zijn kooi. Controleer de dieren in de postoperatieve periode op pijn en tekenen van nood. Dien 0,05 mg/kg buprenorfine toe via subcutane injectie en observeer de dieren gedurende 12 uur nauwgezet.
- Controleer vervolgens muizen dagelijks op gewicht, voedselinname en activiteit. Onderzoek incisieplaatsen en palpate op tumorgrootte. Verwijder huidclips op de zevende postoperatieve dag.
- Euthanaseer de muis als humane eindpunten worden bereikt. Deze humane eindpunten omvatten: verlies van lichaamsgewicht >20%, kenmerken van onbehandelbaar leed (inclusief gebochelde houding, gebrek aan beweging of verzorging) en tumorgrootte groter dan 1 cm3 zoals geschat door externe palpatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Negenenvijftig opeenvolgende muizen ondergingen een implantatieoperatie. Bruto lekkage trad op bij acht (14%) Muizen. De mate van lekkage op het moment van injectie wordt geschat zoals hierboven beschreven in de protocolsectie. Na drie weken om deze geïmplanteerde tumoren te laten groeien, werd pre-resectie bioluminescentie beeldvorming uitgevoerd om muizen met grove gemetastaseerde ziekte uit te sluiten voorafgaand aan resectie. Vijfenveertig (76%) muizen ondergingen een chirurgische resectie.
Alle 45 (100%) muizen ondergingen een succesvolle distale pancreatectomie/splenectomie zonder problemen met hemostase. Een macroscopische proximale pancreasmarge van meer dan 5 mm werd bereikt in 43 (96%) Muizen.
Op het moment van resectie werd lokale metastase gevonden in 9/45 (20%) muizen – meestal in de hechtlijn (discontinu met de primaire tumor) met drie van de negen met extra geïsoleerde knobbeltjes op de grotere kromming van de maag en één met een subcapsulaire knobbel op de lever. De primaire pancreastumor was bij vijf (11%) muizen en naar de lever in één (2%) muis. Deze aanhangend structuren werden en bloc verwijderd.
De gemiddelde (SEM) operatietijd (inductie tot sluiting) was 22 (0,9) minuten. Geen van de dieren stierf binnen 1 week na de resectie.
Een week na de resectie ondergingen muizen bioluminescentiebeeldvorming om restziekte op te sporen. De verhouding van de maximale uitstraling over het ventrale oppervlak van de muis werd vergeleken met die van de achtergrond. Tweeëndertig (71%) muizen hadden een maximale stralingsverhouding (muis:achtergrond) van <10, wat wijst op een minimale of geen restziekte.
Figuur 1: Op maat gemaakte apparaten om tumorimplantatie te vergemakkelijken. a) gaasdoekje: i) centraal gat met een diameter van ongeveer 1 cm, waardoor de pancreasstaart op het moment van injectie wordt geplaatst; ii) ringsnaar hechtdraad rond het gat; iii) dubbellaags gaas; iv) knoop met één worp; v) een ledemaat van het hechtmateriaal wordt met sterilisatie-indicatortape aan het gaas bevestigd; vi) Aan de andere kant van het hechtmateriaal wordt een handvat, gemaakt van indicatortape, gevormd. b) Injectieapparaat: I) Inwerkende spuit. Door de door het lichaam van deze spuit gesneden sleuven kan de injectiespuit (met het injectaat van de celsuspensie; niet afgebeeld) op dit spuitlichaam worden gemonteerd; (II) Controller spuit. Dit is gevuld met water. Depressie van de zuiger op de kleinere controllerspuit door de chirurgische assistent veroorzaakt verplaatsing van de grotere zuiger van de aanwerkende spuit. De verplaatsing van de aanwerkende zuiger is kleiner, maar met een mechanisch voordeel waarmee de injectie de weerstand kan overwinnen die gepaard gaat met het injectiespuitmechanisme en de weerstand van het weefsel tegen uitzetting door het injectaat. Dit zorgt voor een nauwkeurige en soepele injectie van 50 μL gedurende 10-15 seconden; (III) Polytetrafluorethyleen (PTFE) verbindingsslang met een inwendige diameter van 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een resectie orthotopisch muismodel van alvleesklierkanker is belangrijk omdat het het testen van adjuvante en neoadjuvante behandelingen mogelijk maakt. Dit is vooral belangrijk bij alvleesklierkanker, waar chirurgie de meest effectieve behandeling blijft, maar geassocieerd is met een hoog risico op recidief. Dit artikel beschrijft een methode die op betrouwbare wijze een alvleesklierkanker zal produceren die mogelijk kan worden genezen met resectie, waarbij het klinische scenario wordt gerepliceert waarin neoadjuvante / adjuvante therapie vereist is.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Ondanks het belang van adjuvante en neoadjuvante therapieën bij alvleesklierkanker, zijn er weinig goed beschreven orthotopische resectiemuismodellen in de literatuur. Deze beschreven resectiemodellen varieerden in hun getrouwheid van replicatie van de klinische situatie bij mensen. Deze eerdere modellen kunnen in grote lijnen worden ingedeeld in: (i) tumor excisie alleen, met fluorescentiebegeleiding; ii) subtotale pancreasresectie zonder splenectomie; iii) distale pancreatectomie/splenectomie.
Tumor excisie met fluorescentie begeleiding is beschreven in het grootste aantal rapporten15,17,18,19,20,21. Veel van deze artikelen zijn afkomstig van dezelfde onderzoeksgroep. Helaas wordt bij mensen lokale excisie van de tumor alleen (enucleatie) niet uitgevoerd voor pancreasadenocarcinoom (PC) vanwege de grote kans op lokaal recidief, evenals het onvermogen om de lymfeklierstatus22,23te beoordelen . Daarom vertroebelt het gebruik van een niet-klinisch relevante vergelijkingsgroep (niet-fluorescentiegeleide enucleatie) de rapportage van de oncologische resultaten in documenten die deze techniek beschrijven. Het is niet verwonderlijk dat de niet-fluorescentie-enucleatiegroepen steevast buitensporige percentages lokaal recidief hadden15,20,21. Torgenson et al.14 beschreven daarentegen een vergelijkbare fluorescentiegeleide resectietechniek en rapporteerden een redelijk laag recidiefpercentage van 58% (na acht weken na de resectie). Over het algemeen lijken deze studies het nut aan te tonen van fluorescentiebegeleiding voor visualisatie van restziekte tijdens de operatie. Dit is echter nog niet de standaard van zorg bij mensen, wat een beperking is in termen van het gebruik ervan in een muismodel dat gericht is op het repliceren van het klinische scenario. Natuurlijk kan dit veranderen als fluorescentiegeleide chirurgie op grote schaal zou worden toegepast in de klinische praktijk.
Een ander resectiemodel was gebaseerd op subtotale pancreatectomie zonder splenectomie voor een tumor die in het lichaam van de alvleesklier werd geïmplanteerd13,24. De klinische relevantie hiervan wordt ook in twijfel getrokken, aangezien de beschreven operatie noch een pancreaticoduodenectomie noch distale pancreatectomie was zoals uitgevoerd bij mensen. Het is niet verrassend dat deze muizen ook leden aan hoge percentages tumorrecidief, zowel ver weg als lokaal. Van bijzonder belang is dat miltrecidief vaak voorkwam, wat wijst op onvoldoende resectie of mogelijke peritoneale tumorzaden bij implantatie24.
Ni et al.16 beschreven een distaal pancreatectomie/splenectomiemodel uitgevoerd met fluorescentie beeldvormingsbegeleiding. Teleurstellend, ondanks het gebruik van een klinisch relevante operatie (met fluorescentiebegeleiding), was de overleving zeer kort (gemiddelde overleving van 18 dagen), zelfs in de distale pancreatectomiegroep. Deze mate van progressieve ziekte lijkt nog erger te zijn dan palliatieve behandelingsmodellen25,26,27, wat wijst op de mogelijke aanwezigheid van een grove restziekte na resectie. Meest recent meldden Giri et al.28 een distale pancreatectomie en gedeeltelijk splenectomie muismodel. Deze studie is opmerkelijk in die zin dat het een immunocompetent muismodel van kanker vertegenwoordigt. Deze studie rapporteerde echter bijna universeel lokaal en ander intraperitoneaal tumorrecidief, wat mogelijk wijst op occulte iatrogene metastase bij implantatie.
Het gebruik van muismodellen waarbij er sprake is van een grove restziekte na resectie voor het testen van adjuvante behandelingen kan ongepast zijn. Het probleem is dat behandeling voor grove restziekte niet echt kan worden geclassificeerd als adjuvante behandeling, maar eerder moet worden beschouwd als een behandeling met palliatieve bedoelingen. In dat geval bieden dergelijke muismodellen geen voordeel in vergelijking met niet-resectiemodellen met een ziekte met een laag volume.
Tips en valkuilen van kritische stappen
Tumorimplantatieprocedure
Om het klinische scenario te repliceren, zijn er verschillende uitdagingen in dit model die betrekking hebben op de implantatie- en resectieprocedures. Voor de implantatieprocedure zijn de belangrijkste uitdagingen die moeten worden overwonnen succesvolle implantatie en preventie van lekkage. Deze twee problemen zijn met elkaar verbonden omdat falen van de injectie zou leiden tot grove lekkage van de suspensie van de tumorcel in de buikholte. Dit zou een muismodel produceren met peritoneale metastase, dat zal vorderen ongeacht pancreasresectie. Dit weerspiegelt het bekende klinische scenario bij mensen waarbij pancreasresectie in gemetastaseerde pc geen invloed heeft op de uitkomst van de patiënt. Dit is de basis van de enscenering laparoscopie bij mensen29.
Het succes van implantatie van de tumor kan intraoperatief worden gezien als de succesvolle generatie van een "bubbel" van celsuspensie zonder duidelijke lekkage. Van het grootste belang bij het bereiken van een goed resultaat is de nauwkeurige plaatsing van de naald in het pancreasparenchym. Dit kon alleen worden bereikt door de alvleesklier "uit te rekken" zodat het peritoneale oppervlak strak is. Punctie moet optreden met de naaldafschuining naar boven gericht (ventrally). Zodra de naald het peritoneale oppervlak doorboort, moet deze worden geavanceerde terwijl de naaldpunt enigszins wordt opgetild, zodat het afgeschuinde oppervlak net onder het peritoneum glijdt. Dit voorkomt onbedoelde door-en-door punctie van de alvleesklier, een veel voorkomende valkuil vanwege de kleine afmetingen van de pancreaslobules van muizen. Zodra de hele schuine kant zich in de substantie van de alvleesklier bevindt, wordt de celsuspensie geïnjecteerd. Vergroting van het gezichtsvermogen met chirurgische loepen is zeer wenselijk om de diepte van de naaldpenetratie nauwkeurig te visualiseren.
Een aantal technieken kan worden gebruikt om het risico op onbedoelde lekkage verder te minimaliseren.
Selectie van een grote lobule voor injectie. Kleine lobules vereisen een hogere druk om op te blazen (volgens de wet van Laplace), waardoor het risico op lekkage rond de naald op de punctieplaats toeneemt.
Optimalisatie van de injectiesnelheid. Het gebruik van een injectieapparaat (figuur 1b) waarmee de celsuspensie gedurende 10-15 seconden kan worden geïnjecteerd, dient drie doeleinden. Ten eerste vermindert het de snelheid van drukverandering in de alvleesklier, waardoor de weefsels de tijd hebben om te vervormen en vermindert het risico op reflux van de suspensie. Ten tweede kan het injectieproces worden gecontroleerd en, indien nodig, worden gestopt en de naald opnieuw worden verplaatst. Elke lekkage kan worden gedweild door een met povidonjodium doordrenkt gaas. Ten derde bevrijdt het de operator van het in drukken van de zuiger, waardoor de operator zich kan concentreren op het houden van de naaldpunt in de alvleesklier terwijl de assistent de celsuspensie injecteert.
Gebruik van een dubbellaags tas-string gaas. Dit gaas vormt een kraag rond de alvleesklierstaart die eventuele lekkage van de celsuspensie absorbeert en daardoor verontreiniging in de buikholte minimaliseert.
Sommige studies in de literatuur hebben een extracellulair matrixmengsel (Matrigel) gebruikt dat met de tijd na injectie13,15,24stolt . Dit kan het risico op lekkage na injectie verminderen. Een mogelijk nadeel van deze strategie is echter dat Matrigel of andere soortgelijke extracellulaire matrixoplossingen niet-fysiologische effecten op PSC's kunnen hebben30. Zo is aangetoond dat Matrigel psc 's rustgevend maakt , waardoor de effecten van PSC 's in model31,32mogelijk teniet wordengedaan . Een alternatief voor injectie van kankercellen is de orthotopische implantatie van tumorweefsel (rechtstreeks van patiënten of van subcutane muismodellen). Deze benaderingen hebben echter hun eigen nadelen. Ten eerste kan heterogeniteit het gevolg zijn van bemonsteringsfouten of van variaties in het volume van het geïmplanteerde weefsel. Een dergelijke heterogeniteit kan de kracht van latere behandelingsvergelijkingen verminderen. Ten tweede kan het doorgeven van tumorweefsel met een subcutaan muismodel leiden tot selectie van subklonen die een ander biologisch gedrag vertonen dan de oorspronkelijke patiënttumor.
Tumorresectieprocedure
In dit model hebben we een distale pancreatectomie / splenectomieprocedure gebruikt die vergelijkbaar is met die bij mensen. De uitdagingen met betrekking tot de resectiechirurgie zijn afhankelijk van pathologische en anatomische factoren.
De belangrijkste pathologische factor is tumorverspreiding. Lokale spreiding met een laag volume kan worden gereseceerd op het moment van pancreasresectie, hoewel het kan wijzen op de mogelijkheid van meer afstandelijke peritoneale en andere metastase. We verwijderen routinematig de hechtlijn van de eerste operatie omdat het een mogelijk gebied van lokale herhaling is. Als de tumor is bevestigd aan omliggende structuren, zoals de buikwand of de linkerkwab van de lever, kunnen deze en blocworden gereseceerd . Anatomisch gezien is de belangrijkste stap het ontleden van het dorsale vlak naar het lichaam van de alvleesklier. De miltader kan vaak achter de alvleesklier worden gevisualiseerd zodra de alvleesklier is buitengevel. Dit is een belangrijk herkenningspunt, omdat het embryologische bloedeloze vlak hier onmiddellijk dorsaal voor is.
Er zijn nog twee andere mogelijke anatomische valkuilen in het hier beschreven model. De dikke darm kan hechten aan het caudale aspect van het pancreaslichaam. Het niet mobiliseren van deze structuur kan leiden tot onbedoelde darmbeschadiging op het moment van alvleesklierdeling of ligatie. De gastrosplenic vaten zijn klein en kunnen gemakkelijk bloeden als avulsed of onvoldoende cauterized. Bovendien, zodra avulsed, trekt het bloedingspunt zich vaak diep in de buik achter de grotere kromming van de maag terug, makend verdere controle van het aftappen uitdagender. Daarom zijn zorgvuldige terugtrekking van de milt en cauterie van de gastrosplenic vaten vereist. Een benadering voor succesvolle hemostase is om deze vaten te cauteriseren op het hilarische aspect van de milt, waardoor het risico op onbedoeld thermisch letsel aan de omringende holle ingewanden wordt geminimaliseerd.
We hebben ontdekt dat het gebruik van een titanium ligatieclip, die veel wordt gebruikt in de menselijke chirurgie voor ligatie van bloedvaten, een snelle en effectieve manier is om de pancreasstomp te controleren, met als gevolg een vermindering van de totale operatietijd in vergelijking met het gebruik van ligaturen. Dit werd ook gebruikt door Giri et al.28.
Beperkingen van de techniek
Er zijn beperkingen aan dit resectiemodel van de alvleesklier. Een beperking heeft betrekking op de tijd die is toegestaan om recidief/metastase te veroorzaken. Aan de ene kant moet men de ontwikkeling van gemetastaseerde ziekte maximaliseren, maar aan de andere kant moet men de tumor reseceren voordat deze lokaal geavanceerd werd. De periode tussen implantatie en resectie moet daarom mogelijk worden aangepast aan het specifieke klinische scenario dat men wil repliceren. Een andere beperking heeft betrekking op het onbedoeld morsen en daaropvolgende peritoneale metastase van kankercellen, die hierboven wordt besproken.
Een grote uitdaging van adjuvante behandelingsmodellen is het ontleden van het adjuvante behandelingseffect van het chirurgische behandelingseffect. Het is duidelijk dat een goed ontworpen studie nodig is die gerandomiseerd is, waarbij een controlegroep een resectieoperatie ondergaat. Om de beoordeling van de relatieve behandelingseffecten verder te verbeteren, stellen we voor om de tumorbelasting in vivo te beoordelen (bijvoorbeeld door luciferase-gelabelde kankercellen te gebruiken en in vivo bioluminescentiebeeldvorming uit te voeren). Ondanks het semi-kwantitatieve karakter van deze beoordeling in orthotopische modellen (aangezien het bioluminescentiesignaal wordt verzwakt door passage door de overlopende weefsels), maakt deze benadering een longitudinale beoordeling van de tumorlast mogelijk, inclusief de beoordeling van de postchirurgische restziekte.
Wijzigingen en toekomstige toepassingen
De geïmplanteerde cellijn en/of celnummers met of zonder pancreas stellate cellen kunnen worden aangepast om het beoogde klinische scenario weer te geven12. De duur tussen implantatie en resectie kan ook worden gewijzigd om het risico op metastasevorming te veranderen. Andere variaties kunnen implantatie van van patiënten of muizen afgeleide xenograften of organoïden omvatten33.
Neoadjuvante therapie kan ook worden getest binnen de basiskenmerken van het hier beschreven model. Het zou gewoon het begin van de medicamenteuze behandeling vereisen voorafgaand aan chirurgische resectie34. Evenzo konden zowel neoadjuvante als adjuvante therapie bij dezelfde muizen worden bestudeerd.
Ten slotte, hoewel we het gebruik van athymische Balb / c naaktmuizen hebben beschreven die een immunodeficiënt model vertegenwoordigen, kan een alternatief immunocompetent model KPC-tumorcellen omvatten die zijn geïmplanteerd in C57B6-muizen28. Dit kan een nuttig alternatief zijn voor het testen van adjuvante/neoadjuvante immuuntherapieën.
Samengevat beschrijven we een robuuste en reproduceerbare techniek voor een chirurgisch resectiemodel van alvleesklierkanker bij muizen dat het klinische scenario nabootst en geen gespecialiseerde apparatuur vereist. Dit model kan nuttig zijn voor het testen van zowel adjuvante als neoadjuvante behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen met betrekking tot dit project.
Acknowledgments
Auteurs hebben steun gekregen van de Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
- Noone, A. M., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute. , Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2015/ (2018).
- Sugiura, T., et al. Margin status, recurrence pattern, and prognosis after resection of pancreatic cancer. Surgery. 154 (5), 1078-1086 (2013).
- Hishinuma, S., et al. Patterns of recurrence after curative resection of pancreatic cancer, based on autopsy findings. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (4), 511-518 (2006).
- NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology - Pancreatic Adenocarcinoma (Version 3.2019). National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Breslin, T. M., et al. Neoadjuvant chemoradiotherapy for adenocarcinoma of the pancreas: treatment variables and survival duration. Annals of Surgical Oncology. 8 (2), 123-132 (2001).
- Mokdad, A. A., et al. Neoadjuvant Therapy Followed by Resection Versus Upfront Resection for Resectable Pancreatic Cancer: A Propensity Score Matched Analysis. Journal of Clinical Oncology. 35 (5), 515-522 (2017).
- Tachezy, M., et al. Sequential neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT) followed by curative surgery vs. primary surgery alone for resectable, non-metastasized pancreatic adenocarcinoma: NEOPA- a randomized multicenter phase III study (NCT01900327, DRKS00003893, ISRCTN82191749). BMC Cancer. 14, 411 (2014).
- Barbour, A. P., et al. The AGITG GAP Study: A Phase II Study of Perioperative Gemcitabine and Nab-Paclitaxel for Resectable Pancreas Cancer. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (12), 5645-5649 (1992).
- Marincola, F., Taylor-Edwards, C., Drucker, B., Holder, W. D. Orthotopic and heterotopic xenotransplantation of human pancreatic cancer in nude mice. Current Surgery. 44 (4), 294-297 (1987).
- Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Research. 68 (7), 2085-2093 (2008).
- Xu, Z., et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. American Journal of Pathology. 177 (5), 2585-2596 (2010).
- Tepel, J., et al. Adjuvant treatment of pancreatic carcinoma in a clinically adapted mouse resection model. Pancreatology. 6 (3), 240-247 (2006).
- Torgenson, M. J., et al. Natural history of pancreatic cancer recurrence following "curative" resection in athymic mice. Journal Surgical Research. 149 (1), 57-61 (2008).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models. Journal of the American College of Surgeons. 215 (1), 126-135 (2012).
- Ni, X., Yang, J., Li, M. Imaging-guided curative surgical resection of pancreatic cancer in a xenograft mouse model. Cancer Letters. 324 (2), 179-185 (2012).
- Hiroshima, Y., et al. Hand-held high-resolution fluorescence imaging system for fluorescence-guided surgery of patient and cell-line pancreatic tumors growing orthotopically in nude mice. Journal of Surgical Research. 187 (2), 510-517 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model is inhibited by neoadjuvant chemotherapy in combination with fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore. PLoS One. 9 (12), 114310 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. PLoS One. 9 (6), 99977 (2014).
- Metildi, C. A., et al. Ratiometric activatable cell-penetrating peptides label pancreatic cancer, enabling fluorescence-guided surgery, which reduces metastases and recurrence in orthotopic mouse models. Annals of Surgical Oncology. 22 (6), 2082-2087 (2015).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery with a fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA), that highlights the tumor, improves surgical resection and increases survival in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer. Annals of Surgical Oncology. 21 (4), 1405-1411 (2014).
- NCCN Guidelines: Pancreatic Adenocarcinoma. National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Maithel, S. K., Allen, P. J. Blumgart's Surgery of the Liver, Biliary Tract and Pancreas, 2-Volume Set (Sixth Edition). Jarnagin, W. R. , Content Repository Only 1007-1023 (2017).
- Egberts, J. H., et al. Dexamethasone reduces tumor recurrence and metastasis after pancreatic tumor resection in SCID mice. Cancer Biology & Therapy. 7 (7), 1044-1050 (2008).
- Xu, Z. H., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway in advanced pancreatic cancer: a key element of treatment that limits primary tumor growth and eliminates metastasis. British Journal of Cancer. , (2020).
- Pothula, S. P., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway: stromal remodelling in pancreatic cancer. Oncotarget. 8 (44), 76722-76739 (2017).
- Pothula, S. P., et al. Hepatocyte growth factor inhibition: a novel therapeutic approach in pancreatic cancer. British Journal of Cancer. 114 (3), 269-280 (2016).
- Giri, B., et al. An Immunocompetent Model of Pancreatic Cancer Resection and Recurrence. Journal of Gastrointestinal Surgery. , (2020).
- Allen, V. B., Gurusamy, K. S., Takwoingi, Y., Kalia, A., Davidson, B. R. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. (11), 009323 (2013).
- Vaillant, F., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Jekyll or Hyde: does Matrigel provide a more or less physiological environment in mammary repopulating assays. Breast Cancer Research. 13 (3), 108 (2011).
- Jesnowski, R., et al. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Laboratory Investigation. 85 (10), 1276-1291 (2005).
- Phillips, P. A., et al. Cell migration: a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut. 52 (5), 677-682 (2003).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Egberts, J. H., et al. Superiority of extended neoadjuvant chemotherapy with gemcitabine in pancreatic cancer: a comparative analysis in a clinically adapted orthotopic xenotransplantation model in SCID beige mice. Cancer Biology & Therapy. 6 (8), 1227-1232 (2007).
