Summary
I det kliniska sammanhanget kommer patienter med lokaliserad bukspottskörtelcancer att genomgå bukspottkörtelektomi följt av adjuvant behandling. Detta protokoll rapporteras här syftar till att fastställa en säker och effektiv metod för modellering detta kliniska scenario hos nakna möss, genom ortopic implantation av bukspottskörteln cancer följt av distala bukspottkörtelektomi och splenectomy.
Abstract
Det saknas tillfredsställande djurmodeller för att studera adjuvans och/eller neoadjuvant terapi hos patienter som övervägs för kirurgi av bukspottskörtelcancer (PC). För att ta itu med denna brist beskriver vi en mus modell som omfattar ortopic implantation av PC följt av distala bukspottkörtelektomi och splenectomy. Modellen har visat sig vara säker och lämpligt flexibel för studier av olika terapeutiska metoder i adjuvans och neo adjuvans inställningar.
I denna modell genereras först en bukspottskörteltumör genom att implantera en blandning av mänskliga bukspottskörtelcancerceller (luciferasmärkt AsPC-1) och human cancer associerade bukspottskörtel stellate celler i de distala bukspottkörteln av Balb/c athymic naken möss. Efter tre veckor, cancern resected av re-laparotomy, distala bukspottkörtelektomi och splenectomy. I denna modell kan bioluminescensavbildning användas för att följa utvecklingen av cancer och effekterna av samband/behandlingar. Efter samband kan adjuvansbehandling ges. Alternativt kan neoadjuvant behandling ges före samband.
Representativa data från 45 möss presenteras. Alla möss genomgick framgångsrika distala bukspottkörtelektomi/splenectomy med några problem med hemostas. En makroskopisk proximal bukspottskörtelmarginal större än 5 mm uppnåddes i 43 (96%) möss. Den tekniska framgångsgraden för bukspottskörteln samband var 100%, med 0% tidig dödlighet och sjuklighet. Inget av djuren dog under veckan efter sambandet.
Sammanfattningsvis beskriver vi en robust och reproducerbar teknik för en kirurgisk sambandsmodell av bukspottskörtelcancer hos möss som efterliknar det kliniska scenariot. Modellen kan vara användbar för testning av både adjuvanta och neoadjuvant behandlingar.
Introduction
Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (bukspottskörteln cancer [PC]) är associerad med en dålig prognos1. Kirurgiska samband är fortfarande den enda potentiellt botande behandlingen för PC och bör övervägas för patienter som presenterar med tidig sjukdom. Tyvärr, även med R0 samband (dvs. samband marginaler fri från tumör), är återkommande frekvensen (lokal eller från oupptäckt ögonbevarande sjukdom) hög2,3. Därför är systemisk adjuvansbehandling indicerad hos nästan alla patienter som genomgår samband4. Dessutom, medan neoadjuvant terapi nu rekommenderas endast för borderline-resectable cancer, dess indikationer expanderar så att dess rutinmässiga användning är i fokus för mycket klinisk forskning5,6,7,8. För att utveckla nya terapeutiska metoder för PC som involverar samband, dessa metoder måste först bedömas i prekliniska modeller som korrekt rekapitulera kliniska inställningar.
Ortopediska musmodeller av PC har använts ofta tidigare för att testa läkemedelsbehandlingar9,10. Många av dessa producerades genom injektion av cancerceller ensam i mus bukspottkörtel, vilket resulterar i tumörer som saknade den framträdande stroma som är karakteristisk för PC. Mer nyligen har ortopiska modeller med injektion, såsom den vi först utvecklade genom att injicera en blandning av mänskliga PC och mänskliga bukspottskörtel stellatceller (PSC, de primära producenterna av kollagenet stroma i PC), kommit i regelbunden användning11,12. Tumörer som produceras av sådan saminjektion av cancer och stromal celler uppvisar (i) både cancerelementen och den karakteristiska stromal (desmoplastiska) komponenten i PC, och (ii) förbättrad cancer cell spridning och metastasering11. Således liknar denna modell nära mänsklig DATOR. Medan ett antal sambandsmodeller av ortopisk PC harbeskrivits 13 , 14,15,16, ingen har återspeglat de kliniska realiteterna av bukspottskörteln samband hos människor så exakt som denna modell, och därför har varit suboptimal för att testa adjuvant eller neoadjuvant behandlingar.
Syftet med musmodellen som presenterades var att visa hur man: (i) framgångsrikt implantera ortopisk bukspottkörtelcancer samtidigt som oavsiktlig peritoneal spridning minimeras och (ii) därefter helt återförsluta cancern. Papperet belyser tips och potentiella fallgropar av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av Animal Care and Ethics Committee vid University of New South Wales (17/109A). Kvinnliga athymic Balb/c nakna möss, i åldern 8-10 veckor väger 16-19 g, användes för detta protokoll. Möss var inhyst i mikro-isolator burar och matas kommersiellt tillgängliga pelleterad mat och vatten ad libitum.
1. Ortopisk bukspottskörtelcancerimplantation
- Förbered cellerna för implantation. Beräkna först antalet celler som krävs för proceduren (1 x 106 luciferasmärkta AsPC-1-celler och 1 x 106 cancerrelaterade humana bukspottskörtelceller [CAhPSCs] krävs för varje djur).
- Underhåll dessa celler i en fuktad temperaturkontrollerad CO 2-inkubator och utför rutinmässig mykoplasmatestning. Odlingsmedium som används för AsPC-1 och CAhPSCs är RPMI 1640 (med 300 mg/L L-glutamin, 20% v/v fosterbovinserum, 1% v/v penicillin/streptomycin) och IMDM (med 4 mM L-glutamin, 10% v/v fosterbovinserum, 1% v/v penicillin/streptomi).
- Använd standardcellkulturtekniker för att försöka göra cellerna mer upphängna i en cellupphängning. Neutralisera trypsin med respektive komplett odlingsmedium med en volym som är dubbelt så stor som trypsinlösningen som används.
- Tvätta dessa celler två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och återanvänd till en blandning som innehåller 1 x 106 AsPC-1-celler och 1 x 106 CAhPSCs i en 50 μL cellupphängning.
- Håll suspensionen på isen tills den används.
- Förbered ett biosäkerhetsskåp av klass II för proceduren. Använd en värmematta överlagrad av ett sterilt plastdraperi. För förstoring under proceduren, använd ett par 2,5x till 3,5x förstoring kirurgiska luppar.
- Förbered svabbprover med handväska genom att skära ett hål, 1 cm i diameter, i en gasväv. Säkra hålet med en handväska. Alla fina flätade suturer kan användas för detta (t.ex. 5/0 polyglykolsyra sutur). Flätat suturmaterial rekommenderas eftersom det gör att den lösa knuten kan stanna kvar efter åtdragning. Detta illustreras i figur 1a.
- Söv musen med 80 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xyzin genom intraperitoneal injektion.
- Administrera 5 mg/kg enrofloxacinantibiotisk profylax, 2, 5 mg/kg flunixin analgesi och 1 ml 0, 9% saltlösning subkutant.
- När du har bedövats, placera musen på det sterila fältet i ett supinläge och applicera povidone-jod följt av 70% etanol för hudberedning.
- Gör ett längsgående snitt i huden på bukens vänstra hjärnkvadrant och gå sedan in i buken genom att incising det muskulösa skiktet mellan tång.
- Ladda en 29 G insulinspruta med 50 μL cellfjädring – detta motsvarar 1 x 106 CAhPSCs och 1 x 106 luciferasmärkta AsPC-1-celler per injicat. Montera den på injektionsapparaten. Injektionsanordningens utformning och funktion förklaras i detalj i figur 1b och dess förklaring.
- Placera handväskan-strängen svabbprovet över laparotomy snitt och sedan exteriörisera mjälte och bukspottskörteln svans genom öppningen av denna svabb. Dra åt handväskan för att försiktigt omringa bukspottkörtelns kropp och exponera bukspottskörtelns svans för injektion. Det är viktigt att vara tillräckligt tät för att gasväven kommer i kontakt med bukspottkörteln omkrets samtidigt som den inte stramar ihop den.
- Använd ett par tångar, greppa bukspottkörtelns svans och placera försiktigt sidospänningen på den. Punktera den ventrala peritonealytan med nålen i en grund vinkel och injicera sedan cellfjädringen i bukspottkörteln på ett långsamt och kontrollerat sätt (över 10−15 s) med injektionsanordningen.
- Under injektionsprocessen, observera noggrant för läckage - både runt injektionsstället (från reflux) och på andra sidan bukspottskörteln lobule (vid genom- och genom penetration). Om synligt läckage uppstår, stoppa injektionen och notera läckagevolymen genom att kontrollera volymen av återstående injicering i sprutan. Om läckaget är av liten volym (<10 μL) och absorbera sedan eventuellt läckage med gasväv och flytta nålen till en annan bukspottskörtellobul för att slutföra injektionen.
- Byt ut mjälten och bukspottkörteln och stäng bukväggen med 5/0 polyglykolsyra sutur på ett kontinuerligt sätt. Stäng skalet med clips.
- Övervaka musen i en uppvärmd bur tills den återhämtar sig från bedövningen. När du är vaken och vaken, flytta musen tillbaka till buret.
2. Cancer samband kirurgi: Distala bukspottkörtelektomi och splenectomy
- Tidpunkten för samband i förhållande till implantation kan variera beroende på experimentprotokollet. I allmänhet, låt tumörerna växa åtminstone i 3 veckor före samband, men optimera detta empiriskt för den specifika implanterade cancercelllinjen.
- Dagen före sambandskirurgin, utför bioluminescens imaging på djuren för att bekräfta förekomsten av en lokaliserad primär tumör. Observera att denna avbildningsstudie helt enkelt används för att utesluta möss med uppenbar utom bukspottskörtelsjukdom från samband. Varken storlek eller strålningsflöde bör användas som trösklar för att fastställa berättigande till samband.
- Väg möss och injicera med D-luciferin intraperitoneally (150 mg/kg).
- Bestäm tidpunkten för bildbehandlingssteget i förhållande till luciferininjektionen för varje experiment genom prestanda för en luciferinkinetisk kurva. Den tidsperiod då strålningsflödet är över 90% av dess maximala representerar den optimala tiden för bioluminescensavbildning (i detta experiment 18 till 26 minuter efter injektionen)
- Inducera anestesi och underhåll med isofluran (4% respektive 3% med syre) och utför avbildning med hjälp av en bioluminescerande bildbehandlingsenhet (t.ex. IVIS Lumina II). Använd inställningar för automatisk exponering och binning (detta kan dock optimeras för det förväntade strålningsflödet).
- Förbered biosäkerhetsskåpet klass II för ingrepp. Använd en värmematta överlagrad av ett sterilt plastdraperi. För förstoring under dissekering, använd ett par 2,5x till 3,5x förstoring kirurgiska luppar.
- Söv musen med 80 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xyzin genom intraperitoneal injektion.
- Administrera 5 mg/kg enrofloxacinantibiotisk profylax, 2, 5 mg/kg flunixin analgesi och 1 ml 0, 9% saltlösning subkutant.
- Placera musen på det sterila fältet i ett supinläge och applicera povidone-jod följt av 70% etanol för hudberedning.
- Gör ett längsgående snitt i huden på bukens vänstra hjärnkvadrant, helst genom föregående snittplats.
- Dissekera huden från den underliggande muskulösa bukväggen och placera sedan en Alm självbehållande upprullningsdon för att hålla hudsåret öppet.
- Inklusionen av det muskulösa skiktet mellan tången bara till ena sidan av suturlinjen för den föregående operationen och utvidga sedan snittet till att punktskatta hela den tidigare suturlinjen.
- Exteriörisera mjälten och distala bukspottkörteln och dra tillbaka den kranialt. Vid den kaudala aspekten av bukspottkörteln kan tjocktarmen hittas fäst av filmiska vidhäftningar. Om detta hittas, dissekera av kolonet.
- Skicka försiktigt ett par tångdämpare till bukspottkörtelns och mjältkärlens kropp och öppna detta utrymme. Detta frigör ett segment av bukspottkörtel för efterföljande ligatur.
- Ligate kroppen av bukspottkörteln proximal till tumören med en titan ligatur klipp, och sedan transect bukspottkörteln distal till detta med cautery. Ett alternativt sätt att kontrollera bukspottskörtelstubbar är att ligate det i kontinuitet med 5/0 polyglykolsyra sutur före transection.
- Dra tillbaka bukspottkörteln kaudally och cauterize gastrosplenic kärlen mellan hjärnskålen pol av mjälte och magen.
- Ta bort provet och bekräfta hemostas.
- Stäng bukväggen med 5/0 polyglykolsyra sutur på ett kontinuerligt sätt. Stäng skalet med clips.
3. Postoperativ förvaltning
- Under den omedelbara anestesiperioden (för båda ovanstående procedurer), övervaka musen i en uppvärmd bur tills den återhämtar sig från bedövningen. När du är vaken och vaken, flytta musen tillbaka till buret. Under den postoperativa perioden, övervaka djuren för smärta och tecken på ångest. Administrera 0,05 mg/kg buprenorfin genom subkutan injektion och observera djuren noga i 12 timmar.
- Därefter övervaka möss dagligen för vikt, matintag och aktivitet. Undersök snittplatser och palpat för tumörstorlek. Ta bort hudklämmor på den sjunde postoperativa dagen.
- Avliva musen om humana slutpunkter uppnås. Dessa humana effektmått inkluderar: förlust av kroppsvikt >20%, funktioner av obehandlad nöd (inklusive hunched hållning, brist på rörelse eller grooming) och tumör storlek större än 1 cm3 som uppskattas av extern palpation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Femtionio möss i följd genomgick implantationskirurgi. Bruttoläckage inträffade i åtta (14%) möss. Graden av läckage vid injektions tidpunkten uppskattas enligt beskrivningen ovan i protokollavsnittet. Efter tre veckor för att tillåta dessa implanterade tumörer att växa, utfördes pre-resection bioluminescens imaging för att utesluta möss med brutto ögonbevarande sjukdom före samband. Fyrtiofem (76 %) möss genomgick kirurgiska samband.
Alla 45 (100%) möss genomgick framgångsrika distala bukspottkörtelektomi/splenectomy med några problem med hemostas. En makroskopisk proximal bukspottskörtelmarginal större än 5 mm uppnåddes i 43 (96%) möss.
Vid tidpunkten för sambandet hittades lokal metastasering i 9/45 (20%) möss – mestadels i suturlinjen (diskontinuerlig med primärtumören) med tre av de nio som visar ytterligare isolerade härdarna på den större kurvan i magen och en som visar en subcapsular nodule på levern. Den primära bukspottskörteln tumör var vidhäftande sutur linjen i fem (11%) möss och levern i en (2%) mus. Dessa vidhäftande strukturer var strukna ett block.
Den genomsnittliga (SEM) kirurgi tid (induktion till stängning) var 22 (0,9) minuter. Inget av djuren dog inom 1 vecka efter samband.
En vecka efter samband genomgick möss bioluminescens imaging för att upptäcka kvarvarande sjukdom. Förhållandet mellan den maximala utstrålningen över musens ventrala yta jämfördes med bakgrundens. Trettiotvå (71 %) Möss hade ett maximalt utstrålningsförhållande (mus:bakgrund) på <10, vilket indikerar minimal eller ingen kvarvarande sjukdom.
Figur 1: Skräddarsydda enheter för att underlätta tumörimplantation. a)Gasväv med handväska: i) Centralt hål, ca 1 cm i diameter, genom vilket bukspottskörtelsvansen kommer att placeras vid injektionsstället. ii) Ringnotssträngssutur runt hålet. iii) Dubbelskiktad gasväv. iv) Enstaka knutkast. v) Ena delen av suturmaterialet är fastsatt i gasväven med steriliseringsindikatortejp. vi) Ett handtag, tillverkat av indikatortejp, är tillverkat i andra änden av suturmaterialet. b)Injektionsanordning: (I) Aktiverande spruta. Slitsar som skärs genom sprutans kropp gör det möjligt att montera injektionssprutan (med cellupphängningen injicerad; visas inte) på denna sprutkropp; II) Styrenhetsspruta. Den här är fylld med vatten. Kolvens fördjupning på den mindre styrsprutan av kirurgassistenten orsakar förskjutning av den större aktiverande sprutkolven. Förskjutningen av den aktiverande kolven är mindre, men med en mekanisk fördel som gör det möjligt för injektionen att övervinna motståndet i samband med injektionssprutans mekanism samt vävnadens motståndskraft mot expansion av injektatet. Detta möjliggör exakt och smidig injektion på 50 μL under 10–15 sekunder. (III) Polytetrafluoretylen (PTFE) anslutningsrör med innerdiameter på 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En sambandsbar ortopisk musmodell av bukspottskörtelcancer är viktig eftersom det möjliggör testning av adjuvans- och neoadjuvantbehandlingar. Detta är särskilt viktigt vid bukspottskörtelcancer där kirurgi fortfarande är den mest effektiva behandlingen men är förknippad med hög risk för återfall. Detta dokument beskriver en metod som på ett tillförlitligt sätt kommer att producera en bukspottskörtelcancer som kan botas med samband, replikera det kliniska scenariot där neoadjuvant/ adjuvant terapi krävs.
Betydelse för befintliga metoder
Trots vikten av adjuvant och neoadjuvant terapier i bukspottskörteln cancer, det finns få väl beskrivna ortopic samband mus modeller i litteraturen. Dessa beskrev sambandsmodeller varierade i deras trohet av replikering av den kliniska situationen hos människor. Dessa tidigare modeller kan i stort sett klassificeras i: (i) endast tumörexcision, med fluorescensvägledning; ii) Subtotal bukspottskörtelresektion utan splenektomi. iii) distala bukspottkörtelektomi/splenectomy.
Tumör excision med fluorescens vägledning har beskrivits i det största antalet rapporter15,17,18,19,20,21. Många av dessa artiklar härstammar från samma forskargrupp. Tyvärr utförs inte lokal excision av tumören ensam (enucleation) hos människor för bukspottskörteladoarcinom (PC) på grund av den höga sannolikheten för lokal upprepning, liksom oförmågan att bedöma lymfkörtelstatus22,23. Därför fördunklar användningen av en icke-kliniskt relevant jämförelsegrupp (icke-fluorescensstyrd enucleation) rapporteringen av onkologiska resultat i papper som beskriver denna teknik. Inte överraskande hade de icke-fluorescensen enucleation grupper alltid överdriven frekvens av lokala återkommande15,20,21. Torgenson et al.14 beskrev däremot en liknande fluorescensstyrd sambandsteknik och rapporterade en någorlunda låg återkommande frekvens på 58% (vid åtta veckor efter samband). Sammantaget verkar dessa studier visa nyttan av fluorescens vägledning för visualisering av resterande sjukdom under kirurgi. Detta är dock ännu inte standarden för vård hos människor, vilket är en begränsning när det gäller dess användning i en musmodell som syftar till att replikera det kliniska scenariot. Naturligtvis kan detta förändras om fluorescens-guidad kirurgi skulle antas allmänt i klinisk praxis.
En annan sambandsmodell baserades på subtotal bukspottkörtelektomi utan splenektomi för en tumör implanterad i bukspottkörtelns kropp13, 24. Den kliniska relevansen av detta ifrågasätts också eftersom den beskrivna operationen varken var en bukspottkörtelicoduodenektomi eller distala bukspottkörtelektomi som utförs hos människor. Inte överraskande led dessa möss också av höga frekvenser av tumör återkommer, både avlägsna och lokala. Av särskild anmärkning är att mjältniska återkommande var vanligt, vilket tyder på antingen otillräcklig samband eller eventuell peritoneal tumör sådd vid implantation24.
Ni et al.16 beskrivs en distala bukspottkörtelektomi/splenectomy modell utförs med fluorescens imaging vägledning. Tyvärr, trots användningen av en kliniskt relevant operation (med fluorescensvägledning), var överlevnaden mycket kort (genomsnittlig överlevnad på 18 dagar), även i den distala bukspottkörtelektomigruppen. Denna grad av progressiv sjukdom verkar vara ännu värre än palliativ behandling modeller25,26,27, vilket tyder på att det är möjligt att vara förekomst av brutto kvarvarande sjukdom efter samband. Senast rapporterade Giri et al.28 en distala bukspottkörtelektomi och partiell splenectomy mus modell. Denna studie är anmärkningsvärd genom att den representerar en immunkompetent musmodell av cancer. Denna studie rapporterade dock nästan universella lokala och andra intraperitoneal tumör återkommande, eventuellt anger ockulta iatrogena metastasering vid implantation.
Användning av musmodeller där det finns brutto kvarvarande sjukdom post samband för testning adjuvant behandlingar kan vara olämpligt. Problemet är att behandling av grov kvarvarande sjukdom inte riktigt kan klassificeras som adjuvansbehandling utan snarare bör betraktas som behandling med palliativt uppsåt. I så fall erbjuder sådana musmodeller ingen fördel jämfört med icke-sambandsmodeller med låg volymsjukdom.
Tips och fallgropar av kritiska steg
Tumör implantation förfarande
För att replikera det kliniska scenariot finns det distinkta utmaningar i denna modell som rör implantation och sambandsförfaranden. För implantationsförfarandet är de stora utmaningarna som måste övervinnas framgångsrik implantation och förebyggande av läckage. Dessa två frågor är relaterade som misslyckande av injektion skulle resultera i brutto läckage av tumör cell suspension i bukhålan. Detta skulle producera en musmodell med peritoneal metastasering, som kommer att utvecklas oavsett bukspottskörtelresektion. Detta återspeglar det välkända kliniska scenariot hos människor där bukspottskörteln samband i ögonbevarande PC inte påverkar patientens resultat. Detta är basen av iscensätta laparoskopi i människor29.
Framgången med implantation av tumör kan ses intraoperatively som den framgångsrika generationen av en "bubbla" av cell suspension utan uppenbart läckage. Av största vikt för att uppnå ett bra resultat är den exakta placeringen av nålen i bukspottskörteln parenkym. Detta kunde endast uppnås genom att "sträcka ut" bukspottkörteln så att den peritoneala ytan är spänd. Punktering bör ske med nålen vänd uppåt (ventrally). När nålen punkterar peritonealytan bör den föras framåt medan nålspetsen lyfts upp något så att den fasade ytan glider precis under peritoneum. Detta förhindrar oavsiktlig genom-och-genom punktering av bukspottkörteln, en vanlig fallgrop på grund av de små dimensionerna av mus bukspottskörtellobuler. När hela avfasningen är inom bukspottkörteln injiceras cellfjädringen. Förstoring av synen med kirurgiska luppar är mycket önskvärt att noggrant visualisera djupet av nålpenetrationen.
Ett antal tekniker kan användas för att ytterligare minimera risken för oavsiktligt läckage.
Val av en stor lobule för injektion. Små lobules kräver högre tryck för att blåsa upp (enligt Laplaces lag), vilket ökar risken för läckage runt nålen på punkteringsstället.
Optimering av injektionshastigheten. Användningen av en injektionsanordning (figur 1b) som gör det möjligt att injicera cellfjädringen under 10-15 sekunder tjänar tre syften. För det första minskar det tryckförändringshastigheten i bukspottkörteln, vilket ger vävnaderna tid att deformera och minskar risken för reflux av suspensionen. För det andra tillåter det injektionsprocessen att övervakas och vid behov stoppas och nålen flyttas. Alla läckage kan moppas upp av en povidone-jod-blöt gasväv. För det tredje befriar det operatören från att behöva trycka ner kolven, så att operatören kan fokusera på att hålla nålspetsen i bukspottkörteln medan assistenten injicerar cellupphängningen.
Användning av en dubbelskiktad plånböcker gasväv. Denna gasväv bildar en krage runt bukspottskörteln svans som absorberar eventuellt läckage av cell suspension och därför minimera förorening i bukhålan.
Vissa studier i litteraturen har använt en extracellulär matrisblandning (Matrigel) som stelnar med tiden efter injektion13,15,24. Detta kan minska risken för läckage efter injektionen. En potentiell nackdel med denna strategi är dock att Matrigel eller andra liknande extracellulära matrislösningar kan utöva icke-fysiologiska effekter på psc30. Matrigel har till exempel visat sig göra pscs quiescent och därmed potentiellt förneka effekterna av pscs i modellen31,32. Ett alternativ till injektion av cancerceller är ortopisk implantation av tumörvävnad (antingen direkt från patienter eller från subkutana musmodeller). Dessa tillvägagångssätt har dock sina egna nackdelar. För det första kan heterogenitet uppstå till följd av provtagningsfel eller variationer i volymen av vävnad som implanterats. Sådan heterogenitet kan minska kraften i efterföljande behandlingsjämförelser. För det andra kan passaging av tumörvävnad med en subkutan mus modell leda till val av subkloner som har olika biologiska beteenden till den ursprungliga patienten tumör.
Tumör samband förfarande
I denna modell har vi använt en distala bukspottkörtelektomi/splenectomy förfarande liknar den som utförs hos människor. Utmaningarna med samband med sambandskirurgi beror på patologiska och anatomiska faktorer.
Den viktigaste patologiska faktorn är tumör spridning. Låg volym lokal spridning kan återförslutas vid tidpunkten för bukspottskörteln samband, även om det kan indikera möjligheten till mer avlägsna peritoneal och andra metastasering. Vi tar rutinmässigt bort suturlinjen från den första operationen eftersom det är ett möjligt område med lokal upprepning. Om tumören är fäst vid omgivande strukturer, såsom bukväggen eller leverns vänstra lob, kan dessa resected ett block. Anatomiskt är det viktigaste steget att dissekera planets dorsala till bukspottkörtelkroppen. Den mjälte venen kan ofta visualiseras bakom bukspottkörteln när bukspottkörteln är exteriöriserad. Detta är ett viktigt landmärke, eftersom det embryologiska blodlösa planet omedelbart är dorsalt för detta.
Det finns två andra potentiella anatomiska fallgropar i modellen som beskrivs här. Tjocktarmen kan vara vidhäftande till den kaudala aspekten av bukspottskörteln kroppen. Underlåtenhet att mobilisera denna struktur bort kan leda till oavsiktlig colonic skada vid tidpunkten för bukspottskörteln uppdelning eller ligatur. Gastrosplenic kärlen är små och kan lätt blöda om de avulsed eller otillräckligt cauterized. Dessutom, när avulsed, avskyr blödningspunkten ofta djupt in i buken bakom den större kurvan i magen, vilket gör efterföljande kontroll av blödning mer utmanande. Därför krävs noggrann tillbakadragning av mjälten och cautery av gastrosplenic fartyg. Ett tillvägagångssätt för framgångsrik hemostas är att cauterize dessa fartyg på hilar aspekten av mjälten som minimerar risken för oavsiktlig termisk skada på omgivande ihåliga inälvor.
Vi har funnit att använda en titan ligatur klipp, som ofta används i mänsklig kirurgi för ligatur av fartyg, är ett snabbt och effektivt sätt att kontrollera bukspottskörteln stubbe, med därav följande minskning av den totala operativa tiden jämfört med användningen av ligaturer. Detta användes också av Giri et al.28.
Begränsningar av tekniken
Det finns begränsningar för denna sambandsmodell av bukspottkörteln. En begränsning gäller den tid som tillåts för att producera återkommande/metastasering. Å ena sidan måste man maximera utvecklingen av metastaserad sjukdom, men å andra sidan måste man resect tumören innan den blev lokalt avancerad. Perioden mellan implantation och samband kan därför behöva justeras för det specifika kliniska scenario man vill replikera. En annan begränsning gäller oavsiktligt spill och efterföljande peritoneal metastasering av cancerceller som diskuteras ovan.
En stor utmaning med adjuvant behandlingsmodeller är att dissekera adjuvant behandlingseffekten från den kirurgiska behandlingseffekten. Det är uppenbart att det krävs en väl utformad studie som randomiseras, med en kontrollgrupp som genomgår sambandskirurgi. För att ytterligare förbättra bedömningen av de relativa behandlingseffekterna föreslår vi att man bedömer tumörbördan in vivo (till exempel genom att använda luciferasmärkta cancerceller och utföra in vivo bioluminescenstomografi). Trots den semikvantitativa karaktären av denna bedömning i ortopediska modeller (eftersom bioluminescens signalen dämpas av passage genom de övergående vävnaderna), tillåter detta tillvägagångssätt longitudinell bedömning av tumör börda, inklusive bedömning av post-surgical återstående sjukdom.
Ändringar och framtida tillämpningar
Den implanterade cellinjen och/eller cellnummer med eller utan bukspottskörtel stellatceller kan ändras för att återspegla det kliniska målscenariot12. Varaktigheten mellan implantation och samband kan också ändras för att ändra risken för metastasering bildas. Andra variationer kan inkludera implantation av patient- eller möss-härledda xenografter eller organoider33.
Neoadjuvant terapi kan också testas inom de grundläggande funktionerna i den modell som beskrivs här. Det skulle helt enkelt kräva att läkemedelsbehandlingen påbörjas före kirurgiskt samband34. På samma sätt kan både neoadjuvant och adjuvant terapi studeras hos samma möss.
Slutligen, medan vi har beskrivit användningen av athymic Balb/c nakna möss som representerar en immunodeficient modell, en alternativ immunkompetent modell kan innebära KPC tumörceller implanteras i C57B6 möss28. Detta kan vara ett användbart alternativ för testning av adjuvant/neoadjuvant immunterapier.
Sammanfattningsvis beskriver vi en robust och reproducerbar teknik för en kirurgisk sambandsmodell av bukspottskörtelcancer hos möss som efterliknar det kliniska scenariot och inte kräver specialiserad utrustning. Denna modell kan vara användbar för testning av både adjuvant och neoadjuvant behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja med avseende på detta projekt.
Acknowledgments
Författare har fått stöd från Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
- Noone, A. M., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute. , Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2015/ (2018).
- Sugiura, T., et al. Margin status, recurrence pattern, and prognosis after resection of pancreatic cancer. Surgery. 154 (5), 1078-1086 (2013).
- Hishinuma, S., et al. Patterns of recurrence after curative resection of pancreatic cancer, based on autopsy findings. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (4), 511-518 (2006).
- NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology - Pancreatic Adenocarcinoma (Version 3.2019). National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Breslin, T. M., et al. Neoadjuvant chemoradiotherapy for adenocarcinoma of the pancreas: treatment variables and survival duration. Annals of Surgical Oncology. 8 (2), 123-132 (2001).
- Mokdad, A. A., et al. Neoadjuvant Therapy Followed by Resection Versus Upfront Resection for Resectable Pancreatic Cancer: A Propensity Score Matched Analysis. Journal of Clinical Oncology. 35 (5), 515-522 (2017).
- Tachezy, M., et al. Sequential neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT) followed by curative surgery vs. primary surgery alone for resectable, non-metastasized pancreatic adenocarcinoma: NEOPA- a randomized multicenter phase III study (NCT01900327, DRKS00003893, ISRCTN82191749). BMC Cancer. 14, 411 (2014).
- Barbour, A. P., et al. The AGITG GAP Study: A Phase II Study of Perioperative Gemcitabine and Nab-Paclitaxel for Resectable Pancreas Cancer. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
- Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (12), 5645-5649 (1992).
- Marincola, F., Taylor-Edwards, C., Drucker, B., Holder, W. D. Orthotopic and heterotopic xenotransplantation of human pancreatic cancer in nude mice. Current Surgery. 44 (4), 294-297 (1987).
- Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Research. 68 (7), 2085-2093 (2008).
- Xu, Z., et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. American Journal of Pathology. 177 (5), 2585-2596 (2010).
- Tepel, J., et al. Adjuvant treatment of pancreatic carcinoma in a clinically adapted mouse resection model. Pancreatology. 6 (3), 240-247 (2006).
- Torgenson, M. J., et al. Natural history of pancreatic cancer recurrence following "curative" resection in athymic mice. Journal Surgical Research. 149 (1), 57-61 (2008).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models. Journal of the American College of Surgeons. 215 (1), 126-135 (2012).
- Ni, X., Yang, J., Li, M. Imaging-guided curative surgical resection of pancreatic cancer in a xenograft mouse model. Cancer Letters. 324 (2), 179-185 (2012).
- Hiroshima, Y., et al. Hand-held high-resolution fluorescence imaging system for fluorescence-guided surgery of patient and cell-line pancreatic tumors growing orthotopically in nude mice. Journal of Surgical Research. 187 (2), 510-517 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model is inhibited by neoadjuvant chemotherapy in combination with fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore. PLoS One. 9 (12), 114310 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. PLoS One. 9 (6), 99977 (2014).
- Metildi, C. A., et al. Ratiometric activatable cell-penetrating peptides label pancreatic cancer, enabling fluorescence-guided surgery, which reduces metastases and recurrence in orthotopic mouse models. Annals of Surgical Oncology. 22 (6), 2082-2087 (2015).
- Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery with a fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA), that highlights the tumor, improves surgical resection and increases survival in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer. Annals of Surgical Oncology. 21 (4), 1405-1411 (2014).
- NCCN Guidelines: Pancreatic Adenocarcinoma. National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
- Maithel, S. K., Allen, P. J. Blumgart's Surgery of the Liver, Biliary Tract and Pancreas, 2-Volume Set (Sixth Edition). Jarnagin, W. R. , Content Repository Only 1007-1023 (2017).
- Egberts, J. H., et al. Dexamethasone reduces tumor recurrence and metastasis after pancreatic tumor resection in SCID mice. Cancer Biology & Therapy. 7 (7), 1044-1050 (2008).
- Xu, Z. H., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway in advanced pancreatic cancer: a key element of treatment that limits primary tumor growth and eliminates metastasis. British Journal of Cancer. , (2020).
- Pothula, S. P., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway: stromal remodelling in pancreatic cancer. Oncotarget. 8 (44), 76722-76739 (2017).
- Pothula, S. P., et al. Hepatocyte growth factor inhibition: a novel therapeutic approach in pancreatic cancer. British Journal of Cancer. 114 (3), 269-280 (2016).
- Giri, B., et al. An Immunocompetent Model of Pancreatic Cancer Resection and Recurrence. Journal of Gastrointestinal Surgery. , (2020).
- Allen, V. B., Gurusamy, K. S., Takwoingi, Y., Kalia, A., Davidson, B. R. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. (11), 009323 (2013).
- Vaillant, F., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Jekyll or Hyde: does Matrigel provide a more or less physiological environment in mammary repopulating assays. Breast Cancer Research. 13 (3), 108 (2011).
- Jesnowski, R., et al. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Laboratory Investigation. 85 (10), 1276-1291 (2005).
- Phillips, P. A., et al. Cell migration: a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut. 52 (5), 677-682 (2003).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Egberts, J. H., et al. Superiority of extended neoadjuvant chemotherapy with gemcitabine in pancreatic cancer: a comparative analysis in a clinically adapted orthotopic xenotransplantation model in SCID beige mice. Cancer Biology & Therapy. 6 (8), 1227-1232 (2007).
