Summary
En el contexto clínico, los pacientes con cáncer de páncreas localizado se someterán a pancreatectomía seguida de tratamiento adyuvante. Este protocolo divulgado aquí apunta establecer un método seguro y de manera efectiva de modelar este escenario clínico en ratones desnudos, con la implantación orthotopic del cáncer pancreático seguido por pancreatectomy y splenectomy distales.
Abstract
Hay una carencia de modelos animales satisfactorios para estudiar terapia ayudante y/o neoadjuvant en los pacientes que son considerados para la cirugía del cáncer pancreático (PC). Para tratar esta deficiencia, describimos un modelo del ratón que implica la implantación orthotopic de la PC seguida por pancreatectomy y el splenectomy distales. Se ha demostrado que el modelo es seguro y convenientemente flexible para el estudio de diversos enfoques terapéuticos en entornos adyuvante y neoadyuvante.
En este modelo, un tumor pancreático primero es generado implantando una mezcla de células cancerosas pancreáticas humanas (luciferasa-marcada AsPC-1) y de células radiadas pancreáticas asociadas cáncer humano en el páncreas distal de los ratones desnudos athymic de Balb/c. Después de tres semanas, el cáncer es resecado por re-laparotomía, pancreatectomía distal y esplenectomía. En este modelo, las imágenes de bioluminiscencia se pueden utilizar para seguir el progreso del desarrollo del cáncer y los efectos de la resección/tratamientos. Después de la resección, se puede administrar terapia adyuvante. Alternativamente, el tratamiento neoadyuvante se puede dar antes de la resección.
Los datos representativos a partir de 45 ratones se presentan. Todos los ratones experimentaron pancreatectomy/splenectomy distal acertado sin las ediciones del hemostasis. Un margen pancreático próximo macroscópico mayor de 5 milímetros fue alcanzado en 43 (el 96%) ratón. El índice de éxito técnico de la resección pancreática era el 100%, con la mortalidad y la morbosidad tempranas del 0%. Ningunos de los animales murieron durante la semana después de la resección.
En resumen, describimos una técnica robusta y reproducible para un modelo quirúrgico de la resección del cáncer pancreático en los ratones que mímico el escenario clínico. El modelo puede ser útil para la prueba de tratamientos adyuvantes y neoadyuvantes.
Introduction
El adenocarcinoma ductal pancreático (cáncer pancreático [PC]) se asocia a un pronóstico pobre1. La resección quirúrgica sigue siendo el único tratamiento potencialmente curativo para la PC y se debe considerar para los pacientes que presentan con enfermedad del primero tiempo. Desafortunadamente, incluso con la resección R0 (es decir, márgenes de la resección libres de tumor), la tarifa de la repetición (local o de la enfermedad metastática no detectada) es alta2,3. Por lo tanto, la terapia adyuvante sistémica está indicada en casi todos los pacientes que se someten a la resección4. Además, mientras que la terapia neoadyuvante ahora se recomienda solo para cánceres resecables limítrofes, sus indicaciones se están expandiendo de tal manera que su uso rutinario es el foco de mucha investigación clínica5,6,7,8. Para desarrollar los acercamientos terapéuticos nuevos para la PC que implica la resección, estos acercamientos necesitan primero ser evaluados en los modelos preclínicos que recapitulan exactamente ajustes clínicos.
Los modelos ortotópicos de ratón de PC se han utilizado con frecuencia en el pasado para probar tratamientos farmacológicos9,10. Muchos de éstos fueron producidos por la inyección de células cancerosas solamente en el páncreas del ratón, dando por resultado los tumores que carecían del tejido conectador prominente que es característico de la PC. Más recientemente, los modelos ortotópicos de coinyección, como el que desarrollamos por primera vez inyectando una mezcla de PC humana y células estrelladas pancreáticas humanas (PSC, los principales productores del estroma colagenoso en la PC), han entrado en uso regular11,12. Los tumores producidos por tal co-inyección del cáncer y de las células stromal exhiben (i) los elementos del cáncer y el componente (desmoplastic) stromal característico de la PC, y (ii) proliferación y metástasis de célula cancerosasaumentadas 11. Por lo tanto, este modelo se asemeja mucho a la PC humana. Mientras que un número de modelos reseccionales de la PC orthotopic se han descrito13,14,15,16,ningunos han reflejado las realidades clínicas de la resección pancreática en seres humanos tan exactos como este modelo, y por lo tanto han sido subóptimos para probar tratamientos ayudantes o neoadyuvantes.
Los objetivos del modelo del ratón presentado eran demostrar cómo: (i) implantar con éxito el cáncer pancreático orthotopic mientras que minimizaba la difusión peritoneal inadvertida y (ii) resecar posteriormente totalmente el cáncer. El documento destaca los consejos y posibles escollos de esta técnica.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Ética animal de la Universidad de Nueva Gales del Sur (17/109A). Los ratones desnudos athymic femeninos de Balb/c, envejecidos 8-10 semanas que pesaban 16-19 g, fueron utilizados para este protocolo. Los ratones fueron alojados en jaulas de micro-aisladores y alimentados con alimentos peletados disponibles en el comercio y agua ad libitum.
1. Implantación ortotópica de cáncer de páncreas
- Prepare las células para la implantación. Primero, calcule el número de células requeridas para el procedimiento (1 x 106 células Luciferase-marcadas AsPC-1 y 1 x 106 células radiarias pancreáticas humanas cáncer-asociadas [CAhPSCs] se requieren para cada animal).
- Mantenga estas células en una incubadora humidificada de CO2 con temperatura controlada y realice pruebas rutinarias de micoplasma. El medio de cultivo utilizado para AsPC-1 y CAhPSCs son RPMI 1640 (con L-glutamina de 300 mg/L, suero bovino fetal al 20%, penicilina/estreptomicina al 1% v/v) e IMDM (con L-glutamina de 4 mM, suero bovino fetal del 10%, penicilina/estreptomicina del 1%v/v).
- Utilice técnicas estándar de cultivo celular para tripinizar las células en una suspensión celular. Neutralice la tripsina utilizando el medio de cultivo completo respectivo a un volumen dos veces superior al de la solución de tripsina utilizada.
- Lave estas células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y resuspend en una mezcla que contenga 1 x 106 células AsPC-1 y 1 x 106 CAhPSCs en una suspensión celular de 50 μL.
- Mantenga esta suspensión sobre hielo hasta su uso.
- Prepare un gabinete de bioseguridad de clase II para el procedimiento. Use una estera de calefacción superpuesta por una cortina de plástico estéril. Para la magnificación durante el procedimiento, use un par de lupa quirúrgicas de aumento de 2.5x a 3.5x.
- Prepare hisopos de cadena de bolsa cortando un agujero, de 1 cm de diámetro, en un hisopo de gasa. Asegure este agujero con una sutura de cadena de monedero. Cualquier sutura trenzada fina se puede utilizar para esto (por ejemplo, sutura de ácido poliglicólico 5/0). Se recomienda el material de sutura trenzado, ya que permite que el nudo suelto permanezca en su lugar después del apriete. Esto se ilustra en la Figura 1a.
- Anestesiar el ratón con 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina mediante inyección intraperitoneal.
- Administrar 5 mg/kg de profilaxis antibiótica de enrofloxacina, 2,5 mg/kg de analgesia de flunixina y 1 mL de solución salina al 0,9% por vía subcutánea.
- Una vez anestesiado, coloque el ratón en el campo estéril en una posición supina y aplique povidona-yodo seguido de etanol al 70% para la preparación de la piel.
- Haga una incisión longitudinal en la piel del cuadrante craneal izquierdo del abdomen y luego ingrese al abdomen incisando la capa muscular entre los pórceps.
- Cargue una jeringa de insulina de 29 G con 50 μL de suspensión celular, lo que equivale a 1 x10 6 CAhPSCs y 1 x 106 células AsPC-1 etiquetadas con luciferasa por inyección. Montarlo en el dispositivo de inyección. El diseño y la función de este dispositivo de inyección se explica en detalle en la Figura 1b y su leyenda.
- Coloque el hisopo de la cuerda del bolso sobre la incisión de laparotomía y después exteriorice el bazo y la cola pancreática a través de la abertura de este hisopo. Apriete la cadena del monedero para rodear suavemente el cuerpo del páncreas, exponiendo la cola pancreática para inyección. Es importante estar lo suficientemente apretado como para que la gasa entre en contacto con el páncreas circunferencialmente y al mismo tiempo no lo constricte.
- Usando un par de pórceps, agarre la cola del páncreas y coloque suavemente la tensión lateral sobre ella. Perfore la superficie peritoneal ventral con la aguja en un ángulo poco profundo y luego inyecte la suspensión celular en el páncreas de manera lenta y controlada (más de 10−15 s) con el dispositivo de inyección.
- Durante el proceso de inyección, observe cuidadosamente si hay fugas, tanto alrededor del sitio de inyección (por reflujo) como por el otro lado del lóbulo pancreático (en caso de penetración de paso a través). Si se produce una fuga visible, detenga la inyección y observe el volumen de fuga comprobando el volumen de inyección restante en la jeringa. Si la fuga es de pequeño volumen (<10 μL), y luego absorber cualquier fuga con gasa y reposicionar la aguja en un lóbulo pancreático diferente para completar la inyección.
- Reemplace el bazo y el páncreas y cierre la pared abdominal con 5/0 sutura de ácido poliglicólico de manera continua. Cierre la piel con clips.
- Monitoree al ratón en una jaula calentada hasta que se recupere del anestésico. Una vez despierto y alerta, mueva el ratón de nuevo a su jaula.
2. Cirugía de resección del cáncer: pancreatectomía distal y esplenectomía
- El momento de la resección en relación con la implantación puede variar dependiendo del protocolo experimental. En general, permita que los tumores crezcan al menos durante 3 semanas antes de la resección, pero optimice esto empíricamente para la línea celular de cáncer implantada en particular.
- El día anterior a la cirugía de resección, realice imágenes de bioluminiscencia en los animales para confirmar la presencia de un tumor primario localizado. Tenga en cuenta que este estudio por imágenes se utiliza simplemente para excluir ratones con enfermedad extracreática obvia de la resección. Ni el tamaño ni el flujo radiante deben utilizarse como umbrales para determinar la elegibilidad para la resección.
- Pesar ratones e inyectar con D-luciferina por vía intraperitoneal (150 mg/kg).
- Determinar el momento de la etapa de obtención de imágenes en relación con la inyección de luciferina para cada experimento mediante la realización de una curva cinética de luciferina. El período de tiempo en el que el flujo radiante está por encima del 90% de su máximo representa el tiempo óptimo para la obtención de imágenes de bioluminiscencia (en este experimento, de 18 a 26 minutos después de la inyección)
- Induzca anestesia y mantenga el uso de isoflurano (4% y 3% con oxígeno, respectivamente) y realice imágenes utilizando un dispositivo de imágenes bioluminiscente (por ejemplo, IVIS Lumina II). Utilice la configuración automática de exposición y binning (sin embargo, esto se puede optimizar para el flujo radiante esperado).
- Prepare el gabinete de bioseguridad de clase II para el procedimiento. Use una estera de calefacción superpuesta por una cortina de plástico estéril. Para la magnificación durante la disección, use un par de lupa quirúrgicas de aumento de 2.5x a 3.5x.
- Anestesiar el ratón con 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina mediante inyección intraperitoneal.
- Administrar 5 mg/kg de profilaxis antibiótica de enrofloxacina, 2,5 mg/kg de analgesia de flunixina y 1 mL de solución salina al 0,9% por vía subcutánea.
- Coloque el ratón en el campo estéril en una posición supina y aplique povidona-yodo seguido de etanol al 70% para la preparación de la piel.
- Haga una incisión longitudinal en la piel del cuadrante craneal izquierdo del abdomen, preferiblemente a través del sitio de la incisión anterior.
- Diseccione embotadamente la piel de la pared abdominal muscular subyacente, y luego coloque un retractor de autocontención de Alm para mantener la herida de la piel abierta.
- Incise la capa muscular entre las autorórceps justo a un lado de la línea de sutura de la operación anterior, y luego extienda la incisión para eliminar toda la línea de sutura anterior.
- Exteriorizar el bazo y el páncreas distal y retraerlo cranealmente. En el aspecto caudal del páncreas, los dos puntos se pueden encontrar unidos por adherencias fílmicas. Si esto se encuentra, diseccione sin rodeos los dos puntos.
- Pase con cuidado un par de tórceps dorsales al cuerpo del páncreas y los vasos esplénicos y abra este espacio. Esto libera un segmento del páncreas para la ligadura posterior.
- Ligate el cuerpo del páncreas próximo al tumor con un clip titanium de la ligadura, y después transecte el páncreas distal a esto con cautery. Una forma alternativa de controlar el tocón pancreático es ligarlo en continuidad con la sutura de ácido poliglicólico 5/0 antes de la transección.
- Retraiga el páncreas caudalmente y cauterice los vasos gastroesplénicos entre el polo craneal del bazo y el estómago.
- Retire el espécimen y confirme la hemostasia.
- Cierre la pared abdominal con 5/0 de sutura de ácido poliglicólico de manera continua. Cierre la piel con clips.
3. Manejo postoperatorio
- En el período anestésico inmediatamente posterior (para los dos procedimientos anteriores), monitoree el ratón en una jaula calentada hasta que se recupere del anestésico. Una vez despierto y alerta, mueva el ratón de nuevo a su jaula. En el período postoperatorio, vigile a los animales para el dolor y las muestras de la señal de socorro. Administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por inyección subcutánea y observar de cerca a los animales durante 12 horas.
- Posteriormente, monitoree los ratones diariamente para el peso, la ingesta de alimentos y la actividad. Examine los sitios de la incisión y palpate para el tamaño del tumor. Retire los clips de la piel en el séptimo día postoperatorio.
- Eutanasiar el ratón si se alcanzan extremos humanos. Estos criterios de valoración humanos incluyen: pérdida de peso corporal >20%, características de sufrimiento intratable (incluida la postura encorvada, la falta de movimiento o el acicalamiento) y el tamaño del tumor superior a 1 cm3 según lo estimado por la palpación externa.
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Representative Results
Cincuenta y nueve ratones consecutivos se sometieron a cirugía de implantación. La fuga bruta ocurrió en ocho (14%) ratón. El grado de fuga en el momento de la inyección se estima como se describió anteriormente en la sección de protocolo. Después de tres semanas para permitir que estos tumores implantados crezcan, la proyección de imagen de la bioluminiscencia de la pre-resección fue realizada para excluir ratones con enfermedad metastática gruesa antes de la resección. Cuarenta y cinco (76%) los ratones experimentaron la resección quirúrgica.
Los 45 (100%) Los ratones experimentaron pancreatectomy/splenectomy distales acertados sin las ediciones de la hemostasia. Un margen pancreático próximo macroscópico mayor de 5 milímetros fue alcanzado en 43 (el 96%) ratón.
A la hora de la resección, la metástasis local fue encontrada en 9/45 (el 20%) ratones – sobre todo en la línea de sutura (discontinuo con el tumor primario) con tres de los nueve mostrando nódulos aislados adicionales en la curva mayor del estómago y uno mostrando un nódulo subcapsular en el hígado. El tumor pancreático primario era adherente a la línea de la sutura en cinco (el 11%) ratones y al hígado en uno (2%) ratón. Estas estructuras adherentes fueron suprimidas en bloque.
El tiempo medio (SEM) de la cirugía (inducción al encierro) era 22 (0,9) minutos. Ningunos de los animales murieron en el plazo de 1 semana después de la resección.
Después de una semana de resección, los ratones se sometieron a imágenes de bioluminiscencia para detectar la enfermedad residual. La relación de la luminosidad máxima sobre la superficie ventral del ratón se comparó con la del fondo. Treinta y dos (71%) los ratones tenían un ratio máximo de la luminosidad (ratón: fondo) de <10, indicando mínimo o ninguna enfermedad residual.
Figura 1: Dispositivos a medida para facilitar la implantación tumoral. a) Hisopo de gasa de cuerda de monedero: i) orificio central, de aproximadamente 1 cm de diámetro, a través del cual se colocará la cola pancreática en el momento de la inyección; ii) Sutura de cuerda de monedero alrededor del agujero; iii) Gasa de doble capa; iv) Nudo de un solo tiro; v) Una extremidad del material de sutura se fija a la gasa con cinta indicadora de esterilización; vi) En el otro extremo del material de sutura se forma un mango, hecho de cinta indicadora. b)Dispositivo de inyección: (I) Jeringa de accionamiento. Las ranuras cortadas a través del cuerpo de esta jeringa permiten que la jeringa de inyección (con la suspensión celular inyectada; no se muestra) se monte en este cuerpo de la jeringa; (II) Jeringa controladora. Esto está lleno de agua. La depresión del émbolo en la jeringa controladora más pequeña por el asistente quirúrgico causa el desplazamiento del émbolo de la jeringa de accionamiento más grande. El desplazamiento del émbolo de accionamiento es menor, pero con una ventaja mecánica que permite a la inyección superar la resistencia asociada con el mecanismo de la jeringa de inyección, así como la resistencia del tejido a la expansión por el inyector. Esto permite una inyección precisa y suave de 50 μL durante 10-15 segundos; (III) Tubo de conexión de politetrafluoroetileno (PTFE) con diámetro interno de 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
Un modelo orthotopic resectional del ratón del cáncer pancreático es importante porque permite la prueba de tratamientos ayudantes y neoadjuvant. Esto es particularmente importante en el cáncer de páncreas, donde la cirugía sigue siendo el tratamiento más eficaz, pero se asocia con un alto riesgo de recurrencia. Este papel describe un método que produzca confiablemente un cáncer pancreático que sea potencialmente curable con la resección, replicando el escenario clínico donde se requiere la terapia neoadjuvant/ayudante.
Importancia con respecto a los métodos existentes
A pesar de la importancia de terapias ayudantes y neoadyuvante en cáncer pancreático, hay pocos modelos orthotopic bien-descritos del ratón resectional en la literatura. Estos modelos reseccionales descritos variaron en su fidelidad de la réplica de la situación clínica en seres humanos. Estos modelos anteriores se pueden clasificar ampliamente en: (i) supresión del tumor solamente, con la dirección de la fluorescencia; (ii) resección pancreática subtotal sin splenectomy; (iii) pancreatectomía/esplenectomía distal.
La escisión tumoral con guía de fluorescencia se ha descrito en el mayor número de informes15,17,18,19,20,21. Muchos de estos trabajos se originaron en el mismo grupo de investigación. Desafortunadamente, en los seres humanos, la escisión local del tumor solo (enucleación) no se realiza para el adenocarcinoma pancreático (PC) debido a la alta probabilidad de recurrencia local, así como a la incapacidad de evaluar el estado de los ganglios linfáticos22,23. Por lo tanto, el uso de un grupo comparador no clínicamente relevante (enucleación guiada por no fluorescencia) nubla el reporte de los resultados oncológicos en los artículos que describen esta técnica. No en vano, los grupos de enucleación sin fluorescencia invariablemente tenían tasas excesivas de recurrencia local15,20,21. En contraste, Torgenson et al.14 describieron una técnica de resección guiada por fluorescencia similar, e informaron una tasa de recurrencia razonablemente baja del 58% (a las ocho semanas después de la resección). En general, estos estudios parecen demostrar la utilidad de la guía de fluorescencia para la visualización de la enfermedad residual durante la cirugía. Sin embargo, este aún no es el estándar de atención en humanos, lo que es una limitación en cuanto a su uso en un modelo de ratón con el objetivo de replicar el escenario clínico. Por supuesto, esto puede cambiar si la cirugía guiada por fluorescencia fuera ampliamente adoptada en la práctica clínica.
Otro modelo de resección se basó en pancreatectomía subtotal sin esplenectomía para un tumor implantado en el cuerpo del páncreas13,24. La importancia clínica de esto también se llama en la pregunta pues la operación descrita era ni un pancreaticoduodenectomy ni pancreatectomy distal según lo realizado en seres humanos. No en vano, estos ratones también sufrían altas tasas de recurrencia tumoral, tanto distantes como locales. Cabe destacar que la recurrencia esplénica fue frecuente, lo que sugiere una resección inadecuada o una posible siembra peritoneal del tumor en el momento de la implantación24.
Ni y col.16 describieron un modelo distal de pancreatectomía/esplenectomía realizado con guía por imágenes de fluorescencia. Decepcionantemente, a pesar del uso de una operación clínicamente relevante (con la dirección de la fluorescencia), la supervivencia era muy corta (supervivencia mala de 18 días), incluso en el grupo pancreatectomy distal. Este grado de enfermedad progresiva parece ser incluso peor que los modelos de tratamiento paliativo25,26,27,lo que sugiere la posible presencia de enfermedad residual gruesa después de la resección. Más recientemente, Giri et al.28 informaron un modelo de ratón pancreatectomía distal y esplenectomía parcial. Este estudio es notable en que representa un modelo inmunocompetente del ratón del cáncer. Sin embargo, este estudio divulgó la repetición local y otra intraperitoneal casi universal del tumor, indicando posiblemente la metástasis yatrogénica oculta en la implantación.
El uso de modelos de ratón donde hay una resección post enfermedad residual gruesa para probar tratamientos adyuvantes puede ser inapropiado. La cuestión es que el tratamiento para la enfermedad residual gruesa no se puede clasificar realmente como tratamiento ayudante sino que se debe considerar algo ser tratamiento con intención paliativa. En ese caso, tales modelos del ratón no ofrecen ninguna ventaja comparada a los modelos no-reseccionales con enfermedad de bajo volumen.
Consejos y trampas de pasos críticos
Procedimiento de implantación tumoral
Para replicar el escenario clínico, existen distintos desafíos en este modelo que se relacionan con los procedimientos de implantación y resección. Para el procedimiento de implantación, los principales retos que hay que superar son el éxito de la implantación y la prevención de fugas. Estas dos ediciones se interrelacionan pues la falta de la inyección daría lugar a la salida gruesa de la suspensión de la célula del tumor en la cavidad abdominal. Esto produciría un modelo del ratón con la metástasis peritoneal, que progresará sin importar la resección pancreática. Esto refleja el panorama clínico bien conocido en seres humanos donde la resección pancreática en la PC metastática no afecta al resultado paciente. Esta es la base de la laparoscopia estadificativa en humanos29.
El éxito de la implantación del tumor se puede considerar intraoperatively como la generación acertada de una "burbuja" de la suspensión de la célula sin salida obvia. De la mayoría de la importancia en el logro de un buen resultado es la colocación exacta de la aguja dentro de la parenquimia pancreática. Esto sólo podría lograrse "estirando" el páncreas para que la superficie peritoneal esté tensa. La punción debe ocurrir con el bisel de la aguja mirando hacia arriba (ventralmente). Una vez que la aguja perfora la superficie peritoneal, debe avanzar mientras la punta de la aguja se levanta ligeramente para que la superficie biselinada se deslice justo debajo del peritoneo. Esto evitará la punción inadvertida del páncreas, una trampa común debido a las pequeñas dimensiones de los lóbulos pancreáticos de ratón. Una vez que todo el bisel está dentro de la sustancia del páncreas, se inyecta la suspensión celular. La ampliación de la visión con lupa quirúrgicas es altamente deseable para visualizar con precisión la profundidad de la penetración de la aguja.
Se pueden utilizar varias técnicas para minimizar aún más el riesgo de fugas inadvertidas.
Selección de un lóbulo grande para inyección. Los lóbulos pequeños requieren presiones más altas para inflarse (siguiendo la ley de Laplace), lo que aumenta el riesgo de fugas alrededor de la aguja en el sitio de punción.
Optimización de la velocidad de inyección. El uso de un dispositivo de inyección (Figura 1b) que permite inyectar la suspensión celular durante 10-15 segundos sirve para tres propósitos. En primer lugar, disminuye la tasa de cambio de presión en el páncreas, dando a los tejidos tiempo para deformarse y reduce el riesgo de reflujo de la suspensión. En segundo lugar, permite que el proceso de inyección sea monitoreado y, si es necesario, detenido y reposicionado con aguja. Cualquier fuga puede ser cortada por una gasa empapada de povidona-yodo. En tercer lugar, libera al operador de la necesidad de presionar el émbolo, lo que permite al operador centrarse en mantener la punta de la aguja dentro del páncreas mientras el asistente inyecta la suspensión celular.
Uso de una gasa de doble capa de cadena de bolsa. Esta gasa forma un collar alrededor de la cola pancreática que absorberá cualquier fuga de la suspensión celular y por lo tanto minimizará la contaminación en la cavidad abdominal.
Algunos estudios en la literatura han utilizado una mezcla de matriz extracelular (Matrigel) que se solidifica con el tiempo después de la inyección13,15,24. Esto puede reducir el riesgo de fugas después de la inyección. Sin embargo, una desventaja potencial de esta estrategia es que Matrigel u otras soluciones de matriz extracelular similares pueden ejercer efectos no fisiológicos sobre las PSC30. Por ejemplo, matrigel se ha demostrado para hacer PSCs quieto de tal modo potencialmente negando los efectos de PSCs en el modelo31,32. Una alternativa a la inyección de células cancerosas es la implantación ortotópica de tejido tumoral (ya sea directamente de pacientes o de modelos de ratón subcutáneos). Sin embargo, estos enfoques tienen sus propias desventajas. En primer lugar, la heterogeneidad puede surgir de un error de muestreo o de variaciones en el volumen de tejido implantado. Tal heterogeneidad puede reducir la energía de comparaciones subsecuentes del tratamiento. En segundo lugar, el passaging del tejido del tumor con un modelo subcutáneo del ratón puede llevar a la selección de los sub-clones que tienen diversos comportamientos biológicos al tumor paciente original.
Procedimiento de resección tumoral
En este modelo, hemos utilizado un procedimiento pancreatectomy/splenectomy distal similar a ése realizado en seres humanos. Los desafíos relacionados con la cirugía reseccional dependen de factores patológicos y anatómicos.
El factor patológico clave es la diseminación tumoral. La extensión local del volumen bajo se puede resecar a la hora de la resección pancreática, aunque pueda indicar la posibilidad de una metástasis peritoneal y otra más distante. Suprimimos rutinario la línea de la sutura de la primera operación pues es un área posible de la repetición local. Si el tumor está unido a estructuras circundantes, como la pared abdominal o el lóbulo izquierdo del hígado, estos pueden ser resecados en bloque. Anatómicamente, el paso clave es diseccionar el plano dorsal al cuerpo del páncreas. La vena esplénica a menudo se puede visualizar detrás del páncreas una vez que el páncreas está exteriorizado. Este es un hito clave, ya que el plano sin sangre embriológico es inmediatamente dorsal a este.
Hay otros dos posibles escollos anatómicos en el modelo descrito aquí. Los dos puntos pueden ser adherentes al aspecto caudal del cuerpo pancreático. La falta de movilizar esta estructura lejos podía llevar a lesión colónica inadvertida a la hora de la división o de la ligadura pancreática. Los recipientes gastrosplenic son pequeños y pueden sangrar fácilmente si avulsed o cauterized inadecuado. Además, una vez avulsed, el punto de la sangría retrae a menudo profundamente en el abdomen detrás de la curva mayor del estómago, haciendo el control subsecuente de la sangría más difícil. Por lo tanto, la contracción cuidadosa del bazo y de la cautería de los recipientes gastrosplenic se requiere. Un acercamiento para el hemostasis acertado es cauterizar estos recipientes en el aspecto hilar del bazo que reduce al mínimo el riesgo de lesión termal inadvertida a las vísceras huecas circundantes.
Hemos encontrado que usando un clip titanium de la ligadura, ampliamente utilizado en la cirugía humana para la ligadura de recipientes, es una manera rápida y eficaz de controlar el tocón pancreático, con la consiguiente reducción en el tiempo operativo total comparado al uso de ligaduras. Esto también fue utilizado por Giri et al.28.
Limitaciones de la técnica
Hay limitaciones a este modelo reseccional del páncreas. Una limitación se relaciona con el tiempo permitido para producir la repetición/la metástasis. Por un lado, uno necesita maximizar el desarrollo de la enfermedad metastásica, pero por otro lado, uno necesita resecar el tumor antes de que se volviera localmente avanzado. Por lo tanto, el período entre la implantación y la resección puede necesitar ser ajustado para el escenario clínico particular que uno desea replicar. Otra limitación se relaciona con el derramaje inadvertido y la metástasis peritoneal subsecuente de las células cancerosas que se discute arriba.
Un desafío importante de los modelos ayudantes del tratamiento es diseccionar el efecto ayudante del tratamiento del efecto quirúrgico del tratamiento. Claramente, se requiere un estudio bien diseñado que sea aleatorizado, con un grupo de control sometido a cirugía de resección. Para mejorar más lejos el gravamen de los efectos relativos del tratamiento, sugerimos evaluar la carga del tumor in vivo (por ejemplo, usando las células cancerosas luciferase-marcadas con etiqueta y realizando proyección de imagen in vivo de la bioluminiscencia). A pesar de la naturaleza semicuantitativa de esta evaluación en modelos ortotópicos (ya que la señal de bioluminiscencia se atenúa por el paso a través de los tejidos sobrebordantes), este enfoque permite la evaluación longitudinal de la carga tumoral, incluida la evaluación de la enfermedad residual postquirúrgica.
Modificaciones y aplicaciones futuras
La línea celular implantada y/o el número de células con o sin células estrelladas pancreáticas podrían modificarse para reflejar el escenario clínico objetivo12. La duración entre la implantación y la resección también podría modificarse para cambiar el riesgo de formación de metástasis. Otras variaciones podrían incluir la implantación de xenoinjertos u organoides derivados de pacientes o ratones33.
La terapia neoadyuvante también se puede probar dentro de las características básicas del modelo descrito aquí. Simplemente requeriría el inicio del tratamiento farmacológico antes de la resección quirúrgica34. Del mismo modo, tanto la terapia neoadyuvante como la adyuvante podrían estudiarse en los mismos ratones.
Finalmente, si bien hemos descrito el uso de ratones desnudos atrímicos Balb/c que representa un modelo inmunodeficiente, un modelo inmunocompetente alternativo puede involucrar células tumorales KPC implantadas en ratones C57B628. Ésta puede ser una alternativa útil para la prueba de terapias inmunes ayudantes/neoadjuvat.
En resumen, describimos una técnica robusta y reproducible para un modelo quirúrgico de la resección del cáncer pancreático en los ratones que mímico el escenario clínico y no requiere el equipo especializado. Este modelo puede ser útil para la prueba de tratamientos adyuvantes y neoadyuvantes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar con respecto a este proyecto.
Acknowledgments
Los autores han recibido apoyo de la Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
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