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Neuroscience

एक फाइब्रिन-समृद्ध और टीपीए-संवेदनशील फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/61740
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Anesthesiology, Taipei Veterans General Hospital, National Yang-Ming University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

Summary

पारंपरिक फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक (पीटीएस) मॉडल मुख्य रूप से ऊतक प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर (टीपीए) -लिटिक उपचार के लिए एक उच्च प्रतिरोध के घने प्लेटलेट समुच्चय को प्रेरित करते हैं। यहां फोटोएक्टिवेशन के लिए थ्रोम्बिन और फोटोसेंसिटिव डाई को सह-इंजेक्शन लगाकर एक संशोधित म्यूरिन पीटीएस मॉडल पेश किया गया है। थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड पीटीएस मॉडल मिश्रित प्लेटलेट का उत्पादन करता है: फाइब्रिन थक्के और टीपीए-थ्रोम्बोलिसिस के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है।

Abstract

एक आदर्श थ्रोम्बोम्बोलिक स्ट्रोक मॉडल के लिए कुछ गुणों की आवश्यकता होती है, जिसमें कम मृत्यु दर के साथ अपेक्षाकृत सरल सर्जिकल प्रक्रियाएं, एक सुसंगत रोधगलन आकार और स्थान, प्लेटलेट की वर्षा: रोगियों में उन लोगों के समान फाइब्रिन इंटरमिक्स्ड रक्त के थक्के, और फाइब्रिनोलिटिक उपचार के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता शामिल है। गुलाब बंगाल (आरबी) डाई-आधारित फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल पहली दो आवश्यकताओं को पूरा करता है, लेकिन टीपीए-मध्यस्थता वाले लिटिक उपचार के लिए अत्यधिक दुर्दम्य है, संभवतः इसके प्लेटलेट-समृद्ध, लेकिन फाइब्रिन-गरीब थक्के संरचना के कारण। हम तर्क देते हैं कि आरबी डाई (50 मिलीग्राम / किग्रा) और थ्रोम्बिन (80 यू / किग्रा) की एक उप-थ्रोम्बोटिक खुराक का संयोजन मध्य सेरेब्रल धमनी (एमसीए) की समीपस्थ शाखा के उद्देश्य से फोटोएक्टिवेशन के लिए फाइब्रिन-समृद्ध और टीपीए-संवेदनशील थक्के पैदा कर सकता है। दरअसल, थ्रोम्बिन और आरबी (टी + आरबी) -संयुक्त फोटोथ्रॉमोसिस मॉडल ने मिश्रित प्लेटलेट को ट्रिगर किया: फाइब्रिन रक्त के थक्के, जैसा कि इम्यूनोस्टेनिंग और इम्यूनोब्लोट्स द्वारा दिखाया गया है, और लगातार रोधगलितांश आकार और स्थानों और कम मृत्यु दर को बनाए रखा है। इसके अलावा, 2 घंटे के बाद फोटोएक्टिवेशन के भीतर टीपीए (अल्टेप्लेस, 10 मिलीग्राम / किग्रा) के अंतःशिरा इंजेक्शन ने टी + आरबी फोटोथ्रॉमोसिस में रोधगलितांश आकार को काफी कम कर दिया। इस प्रकार, थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल उपन्यास थ्रोम्बोलाइटिक उपचारों का परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक मॉडल हो सकता है।

Introduction

एंडोवास्कुलर थ्रोम्बेक्टोमी और टीपीए-मध्यस्थता थ्रोम्बोलिसिस केवल दो अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) हैं- तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक के अनुमोदित उपचार, जोसंयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना ~ 700,000 रोगियों को प्रभावित करते हैं। क्योंकि थ्रोम्बेक्टोमी का आवेदन बड़े पोत रोड़ा (एलवीओ) तक सीमित है, जबकि टीपीए-थ्रोम्बोलिसिस छोटे पोत रोड़ा को कम कर सकता है, दोनों तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक2 के मूल्यवान उपचार हैं। इसके अलावा, दोनों उपचारों का संयोजन (उदाहरण के लिए, स्ट्रोक की शुरुआत के 4.5 घंटे के भीतर टीपीए-थ्रोम्बोलिसिस की दीक्षा, थ्रोम्बेक्टोमी के बाद) रिपरफ्यूजन और कार्यात्मक परिणामों में सुधार करता है3. इस प्रकार, थ्रोम्बोलिसिस का अनुकूलन स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बना हुआ है, यहां तक कि थ्रोम्बेक्टोमी के युग में भी।

थ्रोम्बोम्बोलिक मॉडल थ्रोम्बोलाइटिक उपचारों में सुधार करने के उद्देश्य से प्रीक्लिनिकल स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक आवश्यक उपकरण हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि यांत्रिक संवहनी रोड़ा मॉडल (जैसे, इंट्राल्यूमिनल सिवनी एमसीए रोड़ा) रक्त के थक्के का उत्पादन नहीं करते हैं, और यांत्रिक रोड़ा को हटाने के बाद मस्तिष्क रक्त प्रवाह की इसकी तेजी से वसूली अत्यधिक आदर्श 4,5 है। तिथि करने के लिए, प्रमुख थ्रोम्बोम्बोलिक मॉडल में फोटोथ्रोमोसिस 6,7,8, सामयिक फेरिक क्लोराइड (FeCl3) आवेदन9, एमसीए शाखा10,11 में थ्रोम्बिन का माइक्रोइंजेक्शन, एमसीए या आम कैरोटिड धमनी (सीसीए)12,13,14में पूर्व विवो (सूक्ष्म) एम्बोली का इंजेक्शन, और क्षणिक हाइपोक्सिया-इस्किमिया (टीएचआई)15,16, 17,18. ये स्ट्रोक मॉडल आगामी थक्कों की ऊतकीय संरचना और टीपीए-मध्यस्थता वाले लिटिक उपचार(तालिका 1)के प्रति संवेदनशीलता में भिन्न होते हैं। वे क्रैनियोटॉमी की सर्जिकल आवश्यकता में भी भिन्न होते हैं (सीटू थ्रोम्बिन इंजेक्शन और FeCl3 के सामयिक अनुप्रयोग के लिए आवश्यक), रोधगलितांश आकार और स्थान की स्थिरता (उदाहरण के लिए, माइक्रोएम्बोली उपज के सीसीए-जलसेक बहुत परिवर्तनशील परिणाम), और हृदय प्रणाली पर वैश्विक प्रभाव (उदाहरण के लिए, टीएचआई हाइपोक्सिया-प्रेरित परिधीय वासोडिलेशन की भरपाई के लिए हृदय गति और हृदय उत्पादन को बढ़ाता है)।

आरबी डाई-आधारित फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक (पीटीएस) मॉडल में कई आकर्षक विशेषताएं हैं, जिनमें सरल क्रैनियोटॉमी-मुक्त सर्जिकल प्रक्रियाएं, कम मृत्यु दर (आमतौर पर < 5%), और एक अनुमानित आकार और रोधगलितांश का स्थान (एमसीए-आपूर्ति क्षेत्र में) शामिल हैं, लेकिन इसकी दो प्रमुख सीमाएं हैं। 8 पहली चेतावनी टीपीए-मध्यस्थता थ्रोम्बोलाइटिक उपचार के लिए कमजोर-से-शून्य प्रतिक्रिया है, जो कि FeCl3 मॉडल 7,19,20 का एक दोष भी है। पीटीएस और FeCl3 स्ट्रोक मॉडल की दूसरी चेतावनी यह है कि आगामी थ्रोम्बी में फाइब्रिन की एक छोटी मात्रा के साथ घनी-पैक प्लेटलेट समुच्चय होते हैं, जो न केवल टीपीए-लिटिक थेरेपी के लिए अपनी लचीलापन पैदा करते हैं, बल्कि इंटरमिक्स्ड प्लेटलेट के पैटर्न से भी विचलित होते हैं: फाइब्रिन थ्रोम्बी तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक रोगियोंमें 21,22। इसके विपरीत, स्वस्थानी थ्रोम्बिन-माइक्रोइंजेक्शन मॉडल में मुख्य रूप से बहुलक फाइब्रिन और प्लेटलेट्स10 की एक अनिश्चित सामग्री शामिल है।

उपरोक्त तर्क को देखते हुए, हमने अनुमान लगाया कि आरबी का मिश्रण और पतली खोपड़ी के माध्यम से एमसीए-लक्षित फोटोएक्टिवेशन के लिए थ्रोम्बिन की एक उप-थ्रोम्बोटिक खुराक परिणामी थ्रोम्बी में फाइब्रिन घटक को बढ़ा सकती है और टीपीए-मध्यस्थता वाले लिटिक उपचार के प्रति संवेदनशीलता को बढ़ा सकती है। हमने इस परिकल्पना की पुष्टि की है,23 और यहां हम संशोधित (टी + आरबी) फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल की विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल वर्जीनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित है और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देश संस्थान का पालन करता है। चित्रा 1 ए इस प्रोटोकॉल की शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के अनुक्रम की रूपरेखा.

1. सर्जरी सेटअप

  1. सर्जरी से कम से कम 15 मिनट पहले छोटे पशु एडाप्टर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान सेटिंग के साथ एक वार्मिंग पैड रखें। एडाप्टर के लिए एक नाक-क्लिप रोल तैयार करें जो पशु सिर रोटेशन की अनुमति देता है। एनेस्थेटिक्स केटामाइन (60 मिलीग्राम/किग्रा)/ज़ाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किग्रा) तैयार करें।
  2. कैंची, संदंश, सूक्ष्म सुई धारकों, hemostats, कपास झाड़ू और आटोक्लेव (60 मिनट के लिए 15 साई पर 121 डिग्री सेल्सियस) के साथ टांके सहित शल्य चिकित्सा उपकरण निष्फल करें. ऊतक गोंद और आंख मरहम तैयार करें। सर्जनों के लिए 532 एनएम लेजर सुरक्षा चश्मा तैयार करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल एक प्रमुख उत्तरजीविता सर्जरी प्रक्रिया का वर्णन करता है और सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके आयोजित किया जाना चाहिए।
  3. 532 एनएम लेजर स्रोत के साथ रोशनी प्रणाली स्थापित करें। एक डेंटल ड्रिल तैयार करें।
  4. गुलाब बंगाल समाधान खारा (10 मिलीग्राम / एमएल) में तैयार करें। बर्फ की बाल्टी पर एक विभाज्य गोजातीय थ्रोम्बिन (0.1 यू /
  5. केटोप्रोफेन इंजेक्ट (4.0 मिलीग्राम / किग्रा) सर्जरी से पहले 30 मिनट में एनाल्जेसिया के रूप में माउस को चमड़े के नीचे या स्थानीय संस्थागत दिशानिर्देशों द्वारा अनुशंसित एनाल्जेसिक आहार का उपयोग करें।

2. ipsilateral आम मन्या धमनी के बंधाव

  1. केटामाइन (60 मिलीग्राम/किग्रा) और ज़ाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किग्रा) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा 10-14 सप्ताह के पुरुष C57BL/6NCrl चूहों का वजन 22 से 30 ग्राम होता है।
    नोट: संपूर्ण शल्य प्रक्रिया, मस्तिष्क रक्त प्रवाह की निगरानी के माध्यम से ipsilateral आम मन्या धमनी के बंधाव को शामिल करते हुए, ~ 120 मिनट लेने की उम्मीद है। संवेदनाहारी आहार आम तौर पर इस पूरी अवधि के लिए प्रभावी होगा, लेकिन संवेदनाहारी गहराई कम से कम हर 15 मिनट पुनर्मूल्यांकन किया जाना चाहिए. इन प्रक्रियाओं को सीखते समय, संज्ञाहरण को फिर से खुराक देना आवश्यक हो सकता है।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए एक पैर की अंगुली-चुटकी करें कि जानवर पूरी तरह से संवेदनाहारी है। CCA बंधाव के लिए बाईं गर्दन पर बाल निकालें और बालों को हटाने क्रीम के साथ खोपड़ी thinning के लिए सिर.
  3. लापरवाह स्थिति में छोटे पशु एडाप्टर पर माउस रखें. पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक स्वाइप के साथ त्वचा पोंछते हुए शल्य चिकित्सा क्षेत्र बाँझ।
  4. कान सलाखों का उपयोग माउस सिर सुरक्षित. एक विदारक खुर्दबीन के तहत, midline के लिए के बारे में 0.2 सेमी पार्श्व पर सूक्ष्म कैंची और सीधे संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर एक 0.5 सेमी छोड़ दिया ग्रीवा चीरा बनाने.
  5. बाएं आम मन्या धमनी (एलसीसीए) को बेनकाब करने के लिए नरम ऊतक और प्रावरणी को अलग करने के लिए ठीक दाँतेदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। ध्यान से ठीक चिकनी संदंश की एक जोड़ी का उपयोग योनि तंत्रिका से छोड़ दिया सीसीए अलग.
  6. 20 मिमी खंडों में 5-0 रेशम सिवनी का उपयोग करके एलसीसीए के चारों ओर एक स्थायी डबल-गाँठ सिवनी रखें, और फिर बाँझ घाव क्लिप का उपयोग करके घाव को बंद करें।

3. एमसीए शाखा और फोटोएक्टिवेशन के ऊपर खोपड़ी का पतला होना

  1. छोटे पशु एडाप्टर पर प्रवण स्थिति के लिए माउस फ्लिप. नोज-क्लिप रोल को 15° तक घुमाएं। betadine और 70% इथेनॉल के तीन वैकल्पिक swipes के साथ त्वचा पोंछते द्वारा शल्य चिकित्सा क्षेत्र बाँझ.
  2. आंख और कान(चित्रा 1बी)के बीच स्थित है जो temporalis मांसपेशी, बेनकाब करने के लिए बाईं आंख और कान के साथ सूक्ष्म कैंची और सीधे संदंश की एक जोड़ी का उपयोग खोपड़ी में एक 0.8 सेमी चीरा बनाओ.
  3. विदारक खुर्दबीन के तहत, ठीक दाँतेदार संदंश की एक जोड़ी द्वारा बाएं पार्श्विका हड्डी पर temporalis मांसपेशियों के किनारे के साथ एक 0.5 सेमी चीरा बनाने. एक सूक्ष्म कैंची द्वारा temporalis मांसपेशी पर एक दूसरे 0.3 सेमी ऊर्ध्वाधर चीरा बनाओ. पार्श्विका हड्डी और स्क्वैमोसल हड्डी के किनारे को उजागर करने के लिए लौकिक मांसपेशियों को वापस लें। ललाट और पार्श्विका हड्डियों (चित्रा 1बी, सी) के बीच कोरोनल सिवनी के मील का पत्थर कल्पना करने के लिए सुनिश्चित करें.
  4. बाँझ खारा लागू करने के द्वारा खोपड़ी नमी छोड़ दिया एमसीए प्रकट करने के लिए. एक मार्कर कलम के साथ स्क्वैमोसल हड्डी पर समीपस्थ एमसीए शाखा को चिह्नित करें। धीरे वायवीय दंत ड्रिल (गति नियंत्रक के 50% पर गड़गड़ाहट गति सेटिंग) के साथ चिह्नित क्षेत्र के आसपास व्यास में लगभग 1 मिमी के लिए एक सर्कल ड्रा करें, और फिर ड्यूरा के नीचे को छूने के बिना गहराई में 0.2 मिमी के बारे में खोपड़ी पतला. ड्रिलिंग को तब तक रोकें जब तक कि हड्डी की बहुत पतली परत न रह जाए।
  5. माउस के शरीर के वजन के आधार पर थ्रोम्बिन (टी, 0.1 यू/एल, 80 यू/किलोग्राम) और रोज बंगाल (आरबी, 10 मिलीग्राम/एमएल, 50 मिलीग्राम/किलोग्राम) घोल मिलाएं। उदाहरण के लिए, 25 ग्राम शरीर के वजन के माउस के लिए, थ्रोम्बिन के 20 माइक्रोन (0.1 यू /
  6. धीरे-धीरे टी + आरबी समाधान (145 माइक्रोन प्रति 25 ग्राम शरीर के वजन) को इंसुलिन सिरिंज (#31G सुई) के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस में इंजेक्ट करें।
    नोट: पायलट प्रयोगों में, आरबी डाई (50 मिलीग्राम / किग्रा) की मानक खुराक के साथ मिश्रित थ्रोम्बिन की बढ़ती खुराक की मृत्यु दर फोटोएक्टिवेशन के लिए जांच की गई थी। 80 U/kg थ्रोम्बिन (n=13) के लिए मृत्यु दर 0%, 120 U/kg थ्रोम्बिन (n=7) के लिए 43%, और 160 U/kg (n=5) और 200 U/kg थ्रोम्बिन (n=5) दोनों के लिए 100% थी। किग्रा थ्रोम्बिन की एक खुराक इसलिए इस मॉडल के लिए चुना गया था। लेजर धब्बेदार अनुबंध इमेजिंग भी टी + आरबी (अनुपूरक चित्रा 1) के रेट्रो-कक्षीय साइनस इंजेक्शन के बाद कक्षीय गुहा के पास बड़े पैमाने पर रक्त के थक्के की संभावना को बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, साथ ही, contralateral गोलार्द्ध में व्यापक फाइब्रिन जमाव कि लेजर रोशनी (अनुपूरक चित्रा 2) के अधीन नहीं था.
  7. सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर आंखों का मरहम लगाएं।
  8. 20 मिनट के लिए 2 इंच की दूरी के साथ ड्रिल की गई साइट पर 532 एनएम लेजर लाइट (0.5 मेगावाट ऊर्जा के साथ) के साथ प्रकाशक लागू करें। एक लेजर संरक्षण काले चश्मे (चित्रा 1सी, डी) के माध्यम से एमसीए के समीपस्थ शाखा पर रोशनी कल्पना.
    नोट: 532 एनएम रोशनी के साथ एमसीए काले चश्मे के नीचे लाल प्रतिदीप्ति से पता चलता है. बाहर का एमसीए 10 मिनट रोशनी के बाद गायब हो जाएगा. बाहर का एमसीए प्रवाह अभी भी 20 मिनट रोशनी के बाद मौजूद है अगर जानवर को छोड़ दें.
  9. 20 मिनट के बाद लेजर रोशनी बंद करो. बाँझ घाव क्लिप के साथ घाव को बंद करें।

4. इंट्रावाइटल इमेजिंग (वैकल्पिक)

नोट: थ्रोम्बस गठन इन-विवो को चिह्नित करने के लिए, फोटोएक्टिवेशन सिस्टम23 के साथ स्पिन-डिस्क कॉन्फोकल द्वारा इंट्रावायरल इमेजिंग का उपयोग करें।

  1. खोपड़ी की पार्श्विका हड्डी पर व्यास में ~ 3 मिमी एक कपाल खिड़की बनाओ.
  2. कपाल खिड़की पर एक कवरग्लास रखें और एक 20x पानी विसर्जन उद्देश्य के तहत बाहर का एमसीए (~ 50 माइक्रोन व्यास) का पता लगाने.
  3. इमेजिंग से पहले 5 मिनट पर DyLight488-संयुग्मित एंटी-GPIbβ एंटीबॉडी (0.1 मिलीग्राम/किग्रा) के टेल वेन इंजेक्शन द्वारा परिसंचारी प्लेटलेट को लेबल करें।
  4. इमेजिंग से पहले 5 मिनट में रेट्रो-ऑर्बिटल द्वारा थ्रोम्बिन (80 यू / किग्रा) और रोज बंगाल (50 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण समाधान को इंजेक्ट करें।
  5. लेजर बीम व्यास में 10 माइक्रोन के साथ एक 561 एनएम लेजर प्रणाली का उपयोग कर एमसीए photoactivate और थ्रोम्बस गठन तक छवि रिकॉर्ड.

5. टीपीए प्रशासन

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पैड पर संवेदनाहारी जानवर रखें. चयनित पोस्ट-फोटोएक्टिवेशन समय-बिंदु पर, ~ 45 डिग्री सेल्सियस गर्म पानी के साथ एक धुंध गीला करें और इसे 1 मिनट के लिए पूंछ पर लपेटें।
  2. पुनः संयोजक मानव टीपीए (10 मिलीग्राम/किग्रा) को पूंछ की नस के माध्यम से 50% बोलस और 50% से अधिक 30 मिनट में जलसेक पंप द्वारा इंजेक्ट करें।
    नोट: हालांकि तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक उपचार के लिए पुनः संयोजक मानव टीपीए की नैदानिक खुराक 0.9 मिलीग्राम / किग्रा है, एक उच्च खुराक (10 मिलीग्राम / किग्रा) आमतौर पर कृन्तकों में कम क्रॉस-प्रजाति टीपीए प्रतिक्रियाशीलता की भरपाई के लिए उपयोग की जाती है। हमने प्रीक्लिनिकल स्ट्रोक मॉडल में टीपीए-प्रशासन के मानक प्रोटोकॉल का भी पालन किया, 50% का उपयोग बोलस के रूप में किया और 50% पूंछ नस के माध्यम से 30 मिनट.24 से अधिक का उपयोग किया

6. मस्तिष्क रक्त प्रवाह की निगरानी (सीबीएफ)

नोट: टीपीए उपचार के बाद सीबीएफ वसूली की पुष्टि करने के लिए, एक द्वि-आयामी लेजर धब्बेदार विपरीत इमेजिंग सिस्टम15 का उपयोग करें और फोटोथ्रोमोसिस (चरण 3.9) के तुरंत बाद या टीपीए उपचार के बाद 24 घंटे में रिकॉर्ड करें।

  1. प्रवण स्थिति में संवेदनाहारी जानवर प्लेस और खोपड़ी उजागर के साथ खोपड़ी पर एक midline चीरा बनाने.
  2. बाँझ खारा के साथ खोपड़ी moisturize और धीरे खोपड़ी पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू. जेल में किसी भी बाल और बुलबुले से बचें, जो सीबीएफ सिग्नल में हस्तक्षेप करेगा।
  3. 10 मिनट के लिए लेजर धब्बेदार विपरीत इमेजर के तहत दोनों सेरेब्रल गोलार्द्धों में सीबीएफ की निगरानी करें।
  4. सीबीएफ छवि रिकॉर्ड करने के बाद, ऊतक गोंद के साथ खोपड़ी को बंद करें और जानवर को पिंजरे में लौटा दें।
  5. चयनित क्षेत्रों में सीबीएफ का विश्लेषण करें और विपरीत क्षेत्र की तुलना में सीबीएफ रिकवरी प्रतिशत की गणना करें।
  6. फिर, वसूली के लिए एक गर्म पिंजरे के लिए पशु वापस जगह है. 5-10 मिनट के लिए चूहों की निगरानी करें जब तक कि वे संज्ञाहरण से ठीक न हो जाएं। गीले भोजन को पिंजरे में रखें और इसे पशु देखभाल सुविधा में लौटा दें।
    नोट: स्थानीय संस्थागत दिशानिर्देशों द्वारा अनुशंसित पोस्ट-ऑप एनाल्जेसिया प्रदान करें।

7. ट्राइफिनाइल टेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला द्वारा रोधगलितांश मात्रा माप

  1. फोटोथ्रोमोसिस के चौबीस घंटे बाद, गैर-जीवित सर्जरी के लिए स्थानीय संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार जानवर को गहराई से संवेदनाहारी करें।
    नोट: हम इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से ट्राइब्रोमोथेनॉल (एवर्टिन) 250 मिलीग्राम/किग्रा का प्रशासन करते हैं।
  2. पीबीएस के साथ transcardial छिड़काव प्रदर्शन, ताजा मस्तिष्क इकट्ठा करने और 3% अगर जेल में एम्बेड करें.
  3. अनुभाग vibratome द्वारा 1 मिमी मोटाई के साथ मस्तिष्क टुकड़ा और 10 मिनट के लिए 2% टीटीसी समाधान में सेते हैं.
  4. ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा निरपेक्ष मात्रा के रूप में 6 मस्तिष्क स्लाइस से कुल रोधगलितांश मात्रा quantify.
    नोट: मस्तिष्क शोफ दो कारणों के लिए एक परिणाम माप के रूप में इस्तेमाल नहीं किया गया था. सबसे पहले, टीटीसी दाग ऊतक व्यवहार्यता (माइटोकॉन्ड्रियल कमी गतिविधि के माध्यम से) को मापता है जो एडिमा की तुलना में अधिक गंभीर परिणाम है। दूसरा, रोधगलन आय के रूप में, दोनों वासोजेनिक और साइटोटॉक्सिक एडिमा होते हैं और मानक मस्तिष्क शोफ माप विधियों द्वारा आसानी से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। हालांकि, हमने रक्त-मस्तिष्क-बाधा (बीबीबी) की अखंडता का आकलन करने के लिए एंटी-इम्युनोग्लोबिन (आईजीजी) लेबलिंग का उपयोग किया है, और आरबी और टी + आरबी स्ट्रोक मॉडल (पूरक चित्रा 3) दोनों में फोटोएक्टिवेशन के बाद 6 घंटे में तुलनीय आईजीजी-एक्सट्रावेशन पाया है।

8. थ्रोम्बस गठन माप

नोट: थ्रोम्बस गठन को मापने के लिए, क्रमशः इम्यूनोकैमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा एमसीए में थ्रोम्बस माप के लिए फोटोथ्रोम्बोसिस के बाद 1 घंटे और 2 घंटे में मस्तिष्क को इकट्ठा करें और इम्यूनोब्लॉट द्वारा मस्तिष्क गोलार्ध में फाइब्रिन माप के लिए।

  1. थक्का संरचना के लक्षण वर्णन के लिए IHC प्रदर्शन करें। रात भर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ मस्तिष्क को ठीक करें और फिर अक्टूबर एम्बेडिंग के लिए 30% सुक्रोज के साथ मस्तिष्क को निर्जलित करें।
  2. 20 माइक्रोन मोटाई में धनु अभिविन्यास के साथ मस्तिष्क अनुभाग, और फाइब्रिनोजेन, प्लेटलेट (ग्लाइकोप्रोटीन IIb), लाल रक्त कोशिका (TER119) और रक्त वाहिका (आइसोलेक्टिन GS-IB4) के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ IHC प्रदर्शन करें।
  3. फाइब्रिनोजेन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लॉट द्वारा मस्तिष्क गोलार्द्ध में फाइब्रिन का माप करें।

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Representative Results

सबसे पहले, हमने आरबी बनाम टी + आरबी फोटोथ्रोमोसिस-प्रेरित रक्त के थक्कों में फाइब्रिन सामग्री की तुलना की। चूहों photoactivation के बाद 2 घंटे में जुड़नार के transcardial छिड़काव द्वारा बलिदान कर रहे थे, और मस्तिष्क अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ विमानों में एमसीए शाखा के immunofluorescence धुंधला के लिए हटा दिया गया. आरबी फोटोथ्रोमोसिस में, एमसीए शाखा घनी सीडी 41 + प्लेटलेट्स और थोड़ा फाइब्रिन (चित्रा 2ए, सी) के साथ पैक किया गया था। इसके विपरीत, टी + आरबी फोटोथ्रॉम्बोसिस में एमसीए शाखा को बेतरतीब ढंग से मिश्रित प्लेटलेट: फाइब्रिन थक्के (चित्रा 2बी, डी, एन>3 प्रत्येक के लिए) द्वारा रोक दिया गया था। हमने दो मॉडलों के बीच सेरेब्रल कॉर्टेक्स में फाइब्रिन (ओजेन) स्तर की तुलना करने के लिए इम्युनोब्लॉट्स का भी उपयोग किया, 2 घंटे के बाद फोटोएक्टिवेशन पर खारा के साथ ट्रांसकार्डियल छिड़काव के बाद। इस विश्लेषण ने आरबी फोटोथ्रोमोसिस की तुलना में टी + आरबी में आईपीसिलेटरल गोलार्ध में फाइब्रिन जमाव की > दो गुना वृद्धि दिखाई (चित्रा 2ई, पी = 0.027 अप्रकाशित टी-परीक्षण द्वारा; एन = 3 प्रत्येक समूह के लिए)। हमारी मूल रिपोर्ट में, हमने FITC-संयुग्मित एंटी-GP1bβ-लेबल प्लेटलेट्स के व्यवहार की तुलना करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप-आधारित एकल पोत फोटोएक्टिवेशन और इंट्रावाइटल इमेजिंग का भी उपयोग किया। 23 उन प्रयोगों से पता चला है कि 80 यू/किग्रा थ्रोम्बिन का अंतःशिरा इंजेक्शन लेजर रोशनी(चित्रा 3ए)के तहत भी प्लेटलेट समुच्चय को प्रेरित करने में विफल रहा, और प्लेटलेट्स आरबी फोटोथ्रोम्बोसिस मॉडल(चित्रा 3बी)में समरूप थक्के बनाते हैं, लेकिन टी + आरबी फोटोथ्रोमोसिस(चित्रा 3सी)में कई बेहोश क्षेत्रों के साथ असमान समुच्चय। इन परिणामों से पता चलता है कि टी + आरबी फोटोथ्रॉम्बोसिस आगामी थ्रोम्बी में फाइब्रिन सामग्री को बढ़ाता है।

इसके बाद, हमने दो मॉडलों के बीच सेरेब्रल रक्त प्रवाह (सीबीएफ) वसूली पर तीव्र अंतःशिरा टीपीए उपचार (10 मिलीग्राम / किग्रा अल्टेप्लेस, फोटोएक्टिवेशन के 30 मिनट बाद) के प्रभावों की तुलना की। पूर्व और 24 घंटे के बाद टीपीए-बनाम-वाहन उपचार में एक ही माउस के सीबीएफ को लेजर धब्बेदार विपरीत इमेजिंग द्वारा मापा गया था और विपरीत गोलार्ध(चित्रा4ए,बी)को सामान्यीकृत किया गया था। आरबी फोटोथ्रोमोसिस में, टीपीए उपचार ने सीबीएफ-रिकवरी की प्रवृत्ति का नेतृत्व किया, विशेष रूप से इस्केमिक सीमा क्षेत्र में, जब वाहन-उपचारित चूहों की तुलना में (चित्रा 4 सी, वाहन 51 ± 9% बनाम टीपीए 65 ± 7%, पी = 0.3 अयुग्मित टी-परीक्षण द्वारा, एन = 4 प्रत्येक के लिए)। टी + आरबी फोटोथ्रोमोसिस में, टीपीए-उपचारित चूहों में सीबीएफ की वसूली अधिक प्रमुख थी, और समीपस्थ एमसीए शाखाएं अक्सर 24 घंटे (चित्रा 4 डी, वाहन 55 ± 3% बनाम टीपीए 81 ± 7%, पी = 0.02 अनपेयर्ड टी-टेस्ट द्वारा, एन = 6 प्रत्येक समूह के लिए)। ये परिणाम आरबी फोटोथ्रॉमोसिस की तुलना में टी + आरबी द्वारा टीपीए-लाइटिक थेरेपी के लिए अधिक संवेदनशीलता का सुझाव देते हैं।

अंत में, हमने आरबी और टी + आरबी फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल में रोधगलितांश आकार पर टीपीए उपचार के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए टीटीसी दाग का उपयोग किया। आरबी फोटोथ्रोमोसिस में, वाहन-उपचारित (18 ± 2.80 मिमी 3, एन = 6) और टीपीए-उपचारित चूहों (18 ± 1.95 मिमी3, एन = 10; 10 मिलीग्राम/किग्रा टीपीए को 30 मिनट के बाद फोटोएक्टिवेशन) (चित्रा 5ए) में एक समान रोधगलितांश आकार का पता चला था। इसके विपरीत, टीपीए-लिटिक उपचार ने रोधगलन को काफी कम कर दिया जब टीपीए को 0.5 घंटे (7 ± 2.1 मिमी 3, एन = 9), 1 एच (4.6 ± 1 मिमी 3, एन = 10), या 2 एच (6.4 ± 1.5 मिमी 3, एन = 8), लेकिन वाहन-उपचारित चूहों (14.8 ± 2 मिमी 3, 3, 7) की तुलना में 6 घंटे के बाद फोटोएक्टिवेशन (15.2 ± 3.1 मिमी 3, एन = 7) पर नहीं, एन = 19) (चित्रा 5 बी, अयुग्मित टी-परीक्षण द्वारा निर्धारित पी-मान)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि टी + आरबी फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल में टीपीए-लिटिक उपचार के प्रति संवेदनशीलता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रियाओं की रूपरेखा। (ए) टी + आरबी फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल में मुख्य शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का प्रवाह चार्ट। ipsilateral आम मन्या धमनी के बंधाव वैकल्पिक है, लेकिन हमने पाया कि यह रोधगलितांश आकार अधिक सुसंगत बनाता है, संभवतः कम संपार्श्विक परिसंचरण के कारण. (बी) खोपड़ी के संबंध में माउस मस्तिष्क के शीर्ष और पार्श्व दृश्य। आंखें, कान, टेम्पोरालिस मांसपेशी, मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) और शाखाएं, कोरोनल सिवनी और लेजर रोशनी साइट भी संकेत दिया गया है। (सी)पतली खोपड़ी (सी 1) के नीचे और लेजर रोशनी (सी 2) के दौरान लक्षित एमसीए शाखा का दृश्य, और फोटोएक्टिवेशन (सी 3) के बाद रक्त प्रवाह की समाप्ति। कोरोनल सिवनी के लिए एमसीए शाखा के संबंध पर ध्यान दें। (डी) बाईं एमसीए शाखा पर लेजर रोशनी के दौरान एक माउस की स्थापना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रक्त के थक्कों में विभिन्न फाइब्रिन सामग्री। (ए-डी) एंटी-फाइब्रिन (हरा), एंटी-सीडी 41 / प्लेटलेट (लाल), और आइसोलेक्टिन बी 4 / एंडोथेलियल सेल (नीला) मार्करों का उपयोग करके या तो अनुदैर्ध्य (ए, बी) या अनुप्रस्थ विमान (सी, डी) में डिस्टल एमसीए शाखा में आरबी और टी + आरबी फोटोथ्रोम्बोसिस-प्रेरित थ्रोम्बी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग। टी + आरबी फोटोथ्रॉमोसिस-प्रेरित रक्त के थक्कों (बी, डी, एन = 3) में एंटी-फाइब्रिन इम्यूनोसिग्नल्स की उल्लेखनीय वृद्धि पर ध्यान दें। (ई) इम्यूनोब्लोटिंग ने आरबी फोटोथ्रॉमोसिस की तुलना में टी + आरबी में आईपीसीलेटरल सेरेब्रल कॉर्टेक्स में 2 घंटे पोस्ट-फोटोएक्टिवेशन (एन = 3) पर अधिक फाइब्रिन जमाव का संकेत दिया। संयुक्त राष्ट्र: घायल चूहों; जारी: contralateral प्रांतस्था; इप्सी: ipsilateral प्रांतस्था। स्केल बार: 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा [23] से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्लेटलेट प्रतिक्रियाओं की इंट्रावाइटल इमेजिंग। एकल-पोत लेजर रोशनी के तहत FITC-संयुग्मित एंटी-GP1bβ-लेबल प्लेटलेट्स की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप-आधारित इंट्रावाइटल इमेजिंग (सफेद तीर द्वारा इंगित साइट पर)। प्रायोगिक समूह हैं: (ए) अकेले थ्रोम्बिन, (बी) अकेले रोज बंगाल, और (सी) थ्रोम्बिन प्लस रोज बंगाल। लेजर रोशनी के बाद के समय को लेबल किया जाता है। इस पांडुलिपि के लिए JoVE वेबसाइट में वीडियो देखें। स्केल बार: 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा [23] से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सीबीएफ वसूली पर टीपीए-उपचार के प्रभाव। पुनः संयोजक मानव टीपीए (अल्टेप्लेस, 10 मिलीग्राम / किग्रा) या वाहन को पूंछ नस के माध्यम से आरबी और टी + आरबी फोटोथ्रोमोसिस-चुनौती वाले माउस को 30 मिनट के बाद लेजर रोशनी में प्रशासित किया गया था, और सेरेब्रल रक्त प्रवाह (सीबीएफ) एक ही माउस में पूर्व और 24 घंटे के बाद उपचार लेजर धब्बेदार विपरीत इमेजिंग के साथ तुलना की गई थी। दोनों गोलार्द्धों पर 3 x 4.8 मिमी क्षेत्र में सीबीएफ मापा गया था। प्रयोगात्मक समूह हैं: (ए, सी) आरबी फोटोथ्रॉम्बिसिस; (बी, डी) टी + आरबी फोटोथ्रॉमोसिस। टी + आरबी फोटोथ्रॉमोसिस समूह में टीपीए उपचार द्वारा सीबीएफ की महत्वपूर्ण वसूली पर ध्यान दें (पी = 0.02 अनपेयर्ड टी-टेस्ट द्वारा, एन = 4 वाहन के लिए और एन = 6 टीपीए-उपचार के लिए) और समीपस्थ एमसीए शाखा के लगातार दृश्य। आरबी फोटोथ्रोमोसिस में, टीपीए उपचार ने बेहतर सीबीएफ की प्रवृत्ति का नेतृत्व किया, मुख्य रूप से परिधीय इस्केमिक क्षेत्र में (पी = 0.3 अनपेयर्ड टी-टेस्ट द्वारा, एन = 4 वाहन के लिए और एन = 5 टीपीए-उपचार के लिए)। सफेद तीर एमसीए-फोटोएक्टिवेशन की साइट को इंगित करते हैं। यह आंकड़ा [23] से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: रोधगलितांश आकार पर टीपीए-उपचार के प्रभाव। (ए) आरबी फोटोथ्रॉम्बोसिस के बाद 30 मिनट में अंतःशिरा टीपीए उपचार (अल्टेप्लेस, 10 मिलीग्राम / किग्रा) रोधगलितांश आकार (वाहन-उपचारित चूहों में एन = 6 और टीपीए-उपचारित चूहों में एन = 10) को कम करने में विफल रहा। (बी) इसके विपरीत, टी + आरबी फोटोथ्रोमोसिस में, अंतःशिरा 10 मिलीग्राम / किग्रा अल्टेप्लेस उपचार या तो 0.5, 1, या 2 घंटे में, लेकिन 6 घंटे के बाद फोटोएक्टिवेशन पर नहीं, जिससे रोधगलितांश आकार में महत्वपूर्ण कमी आई। पी-मान टुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरफा एनोवा द्वारा निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा [23] से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

को गढ़ना शल्य प्रक्रिया खून के थक्के प्लेटलेटों फ़िब्रिन टीपीए-प्रतिक्रियाशीलता मुख्य विशेषताएं/उपयोगिता मुख्य संदर्भ
इंट्राल्यूमिनल सिवनी MCAO एंडोवास्कुलर एमसीए रोड़ा नहीं एन/ए एन/ए नहीं तेजी से reperfusion; न्यूरोप्रेक्शन अध्ययन; टीपीए प्रेरित बीबीबी चोट लोंगा एट अल 1989 (रेफरी # 5)
फोटोथ्रॉम्बोसिस खोपड़ी का पतला होना और फोटोएक्टिवेशन हाँ कमजोर उच्च प्रजनन क्षमता; कम मृत्यु दर वाटसन एट अल 1985 (रेफरी # 6)
थ्रोम्बिन-फोटोथ्रॉम्बोसिस UCCAO, खोपड़ी का पतला होना और फोटोएक्टिवेशन हाँ हाँ उच्च प्रजनन क्षमता; कम मृत्यु दर सन एट अल 2020 (रेफरी #23)
FeCl3 (MCA मा) खोपड़ी का पतला होना और रासायनिक सक्रियण हाँ नहीं उच्च प्रजनन क्षमता; कम मृत्यु दर करातास एट अल 2011 (रेफरी # 69)
स्वस्थानी थ्रोम्बिन इंजेक्शन में क्रैनियोटॉमी और एमसीए माइक्रोइंजेक्शन हाँ हाँ उच्च प्रजनन क्षमता; कम मृत्यु दर; टीपीए-लिटिक उपचार Orset एट अल 2007 (रेफरी #10)
एम्बोली-मकाओ एंडोवास्कुलर एमसीए रोड़ा हाँ हाँ टीपीए-लिटिक उपचार; चर थक्का कठोरता बुश एट अल 1997 (रेफरी #13)
क्षणिक हाइपोक्सिया-इस्केमिया (tHI) UCCAO प्लस हाइपोक्सिया हाँ हाँ एमसीए क्षेत्र > रोधगलन; प्रणालीगत सीवी प्रभाव सन एट अल 2014 (रेफरी # 15)

तालिका 1: चयनित प्रीक्लिनिकल स्ट्रोक मॉडल की तुलना। भरे हुए बक्से सकारात्मकता (रक्त के थक्के, प्लेटलेट्स और फाइब्रिन की उपस्थिति) या महत्वपूर्ण टीपीए प्रतिक्रियाशीलता का संकेत देते हैं।

पूरक चित्रा 1: थ्रोम्बिन के रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन के बाद सीबीएफ मॉनिटर। (ए) रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस (ऊपरी पैनल) की प्रतिनिधि तस्वीरें और लेजर धब्बेदार विपरीत इमेजिंग (निचले पैनल) द्वारा रक्त प्रवाह। तीन संवहनी साइटों (लेबल के रूप में 1 ~ 3) रेट्रो-कक्षीय साइनस में थ्रोम्बिन इंजेक्शन (80 यू / किग्रा) के बाद निगरानी की गई थी। (बी)थ्रोम्बिन इंजेक्शन (तीर) के बाद 15 मिनट के लिए रक्त प्रवाह के प्रतिनिधि अनुरेखण ग्राफ. (सी) लेजर धब्बेदार आधारित मात्रा का ठहराव थ्रोम्बिन इंजेक्शन (एन = 4, अयुग्मित टी-परीक्षण द्वारा निर्धारित पी-मान) के बाद 15 मिनट के भीतर रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस के पास रक्त प्रवाह में कोई कमी नहीं दिखाई। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: फोटोएक्टिवेशन के बाद 6 घंटे में विपरीत गोलार्ध में फाइब्रिन जमाव की कमी। एंटी-फाइब्रिनोजेन (हरा) के इम्यूनोस्टेनिंग ने आरबी और टी + आरबी फोटोथ्रोमोसिस के बाद 6 घंटे में ipsilateral प्रांतस्था में फाइब्रिन जमाव दिखाया। इसके विपरीत, थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रोमोसिस के बाद कॉन्ट्रालेटरल कॉर्टेक्स में कोई स्पष्ट फाइब्रिन जमाव नहीं था। प्रत्येक समूह के लिए एन = 4। स्केल बार: 50 माइक्रोन। डीएपीआई-नाभिक धुंधला के रूप में नीला प्रतिदीप्ति। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 3: फोटोथ्रॉमोसिस के बाद इम्युनोग्लोबुलिन (आईजीजी) एक्सट्रावेशन की कमी। एकतरफा एमसीए-लक्षित फोटोएक्टिवेशन के बाद 6 घंटे में, इम्यूनोस्टेनिंग ने आईपीसिलेटरल गोलार्ध में आईजीजी का एक्सट्रावेशन दिखाया, लेकिन कॉन्ट्रालेटरल गोलार्ध में नहीं, थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रॉमोसिस के बाद प्रतिबंधित बीबीबी क्षति का सुझाव दिया। प्रत्येक के लिए एन = 4। स्केल बार: 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

1985 में पेश किया गया पारंपरिक आरबी फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक, सरल सर्जिकल प्रक्रियाओं, कम मृत्यु दर और मस्तिष्क रोधगलन की उच्च प्रजनन क्षमता के लिए फोकल सेरेब्रल इस्किमिया का एक आकर्षक मॉडल है। 5 इस मॉडल में, फोटोडायनामिक डाई आरबी तेजी से प्रकाश उत्तेजना पर प्लेटलेट्स को सक्रिय करता है, जिससे घने समुच्चय होते हैं जो रक्त वाहिका 5,8,23 को रोकते हैं। हालांकि, आरबी प्रेरित रक्त के थक्कों (चित्रा 2) में फाइब्रिन की छोटी राशि प्रमुख प्लेटलेट से विचलित होती है: इस्केमिक स्ट्रोकरोगियों 21,22 में तीव्रता से प्राप्त थ्रोम्बी के फाइब्रिन इंटरमिक्स्ड पैटर्न। आरबी प्रेरित थ्रोम्बी में कम फाइब्रिन सामग्री की संभावना भी टीपीए-लिटिक उपचार 7,8,19 के लिए अपनी लचीलापन के लिए योगदान देता है. हालांकि पराबैंगनी लेजर विकिरण आरबी photothrombosis में संवहनी recanalization लाती है, इस प्रयोगात्मक चिकित्सा चिकित्सकीय7 इस्तेमाल किया जा करने की संभावना नहीं है. इस प्रकार, पारंपरिक आरबी फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक का उपयोग मुख्य रूप से एक स्थायी रोड़ा मॉडल के रूप में किया गया है, जो थ्रोम्बोलिसिस और न्यूरोप्रोटेक्शन अनुसंधान के लिए कम अनुकूल है (उत्तरार्द्ध अक्सर इंट्राल्यूमिनल सिवनी एमसीएओ मॉडल का उपयोग करता है जिसमें यांत्रिक रोड़ा को हटाने पर तेजी से संवहनी पुनरावृत्ति होती है)।

हमने अनुमान लगाया कि आरबी के मिश्रण और फोटोएक्टिवेशन के लिए थ्रोम्बिन की एक उप-थ्रोम्बोटिक खुराक का उपयोग करने से आगामी थ्रोम्बी में फाइब्रिन सामग्री बढ़ सकती है और वास्तविक दुनिया के स्ट्रोक थेरेपी टीपीए थ्रोम्बोलिसिस की प्रतिक्रियाओं में वृद्धि हो सकती है। यह परिकल्पना यहां और हमारी मूल रिपोर्ट में प्रस्तुत परिणामों द्वारा समर्थित है। थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल भी कम मृत्यु दर, सरल शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और रोधगलन आकार और स्थान में उच्च स्थिरता के फायदे को बनाए रखता है, जैसा कि पारंपरिक आरबी फोटोथ्रोमोसिस मॉडल में होता है। इसलिए, हम मानते हैं कि थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रोमोसिस थ्रोम्बोम्बोलिक स्ट्रोक मॉडल(तालिका 1)के प्रदर्शनों की सूची के लिए एक मूल्यवान अतिरिक्त है। थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रॉम्बोसिस मॉडल के दो प्रक्रियात्मक विवरण चर्चा की गारंटी देते हैं। सबसे पहले, अंतःशिरा थ्रोम्बिन की अधिक खुराक तीव्र फुफ्फुसीय थ्रोम्बोम्बोलिज़्म और पशु मृत्यु दर25को भड़काने कर सकती है। हमने आरबी फोटोथ्रोमोसिस के साथ संयोजन के लिए थ्रोम्बिन खुराक की एक श्रृंखला की जांच की, और चुनी गई 80 यू / किग्रा खुराक ने अब तक >100 प्रयोग किए गए वयस्क पुरुष C57Bl/6 चूहों में मृत्यु दर को प्रेरित नहीं किया है। यह संभावना है कि थ्रोम्बिन खुराक हाइपरकोएग्यूलेशन राज्यों26 के साथ चूहों के लिए समायोजन की आवश्यकता है। दूसरा, हमने अपनी प्रक्रियाओं में एमसीए-लक्षित फोटोथ्रॉम्बोसिस के अलावा नियमित रूप से ipsilateral CCA को लिगेट किया। हमने पाया कि ipsilateral सीसीए के बंधाव आगे रोधगलितांश आकार में स्थिरता बढ़ जाती है, जो एमसीए और पूर्वकाल प्लस पीछे मस्तिष्क धमनियों के बीच कम संपार्श्विक परिसंचरण के कारण हो सकता है.

अपने अद्वितीय गुणों के साथ, थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल कम से कम तीन शोध विषयों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। सबसे पहले, यह नया मॉडल आदर्श रूप से टीपीए और टेनेक्टेप्लेस (टीएनकेस)27जैसे अन्य फाइब्रिनोलिटिक एजेंटों की सिर-टू-हेड तुलना के लिए अनुकूल है। TNKase एक इंजीनियर टीपीए-उत्परिवर्ती संस्करण है जिसमें फाइब्रिन-विशिष्टता में वृद्धि हुई है और पूर्व विवो प्रयोगों में आईट्रोजेनिक रक्तस्राव के लिए कम जोखिम है। फिर भी, टीपीए के लिए इसकी श्रेष्ठता केवल एक सूक्ष्म एम्बोलिक स्ट्रोक मॉडल में परीक्षण किया गया है और एक द्विआधारी न्यूरोलॉजिकल परिणाम विश्लेषण14 का उपयोग कर रहा है. इसकी उच्च प्रजनन क्षमता और मात्रात्मक रोधगलितांश आकार विश्लेषण को देखते हुए, थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल का उपयोग कई पहलुओं में टीपीए-बनाम-टीएनकेस के लाभों और प्रतिकूल प्रभावों की तुलना करने के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, खुराक प्रतिक्रियाएं, चिकित्सीय खिड़की, कॉमोरबिडिटी प्रभाव, और विलंबित उपचार में संभावित प्रतिकूल प्रभाव)। दूसरा, थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रोमोसिस मॉडल तीव्र इस्केमिक स्ट्रोक28 में संयुक्त टीपीए और एंटी-प्लेटलेट उपचार के प्रभावों की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है। इस्केमिक स्ट्रोक में एंडोवास्कुलर प्रक्रियाओं की हालिया प्रगति ने शोधकर्ताओं को तीव्र थ्रोम्बी की हिस्टोलॉजिकल संरचना का विश्लेषण करने में सक्षम बनाया है और एक प्रमुख, इंटरमिक्स्ड प्लेटलेट: फाइब्रिन पैटर्न21,22 की पहचान की है। तदनुसार, एक फाइब्रिनोलिटिक एजेंट (टीपीए) और एंटी-प्लेटलेट एजेंटों का संयोजन थ्रोम्बोलिसिस की समग्र प्रभावकारिता को बढ़ावा दे सकता है, लेकिन एक स्ट्रोक मॉडल जो नैदानिक प्लेटलेट का अनुकरण करता है: थ्रोम्बस की फाइब्रिन संरचना इस तरह के शोध के लिए महत्वपूर्ण है। टीएचआई और एम्बोली-एमसीएओ मॉडल के साथ, थ्रोम्बिन-फोटोथ्रॉम्बोसिस इस आवश्यकता को पूरा करता है और इसकी कम मृत्यु दर, सरल शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और प्रणालीगत हृदय प्रभावों की कमी (तालिका 1) के लिए खड़ा है।

अंतिम लेकिन कम से कम, थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रोमोसिस स्ट्रोक-प्रेरित संपार्श्विक परिसंचरण की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है, एमसीए-आपूर्ति क्षेत्र में इसके अनुमानित पेरी-रोधगलितांश स्थान को देखते हुए। रोधगलितांश विकास को ऑफसेट करने के लिए पेनम्ब्रा को बनाए रखने से, संपार्श्विक परिसंचरण तेजी से इस्केमिक स्ट्रोक परिणामों के एक महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता के रूप में पहचाना जाता है, क्योंकि तीव्र संवहनी रुकावट संपार्श्विक नेटवर्क में रक्त के प्रवाह को बढ़ावा देती है, इसके बाद नव-संपार्श्विक वाहिकाओं29,30 बनाने के लिए रीमॉडेलिंग और एंजियोजेनेसिस के बाद। परिणाम बताते हैं कि टीपीए न केवल समीपस्थ एमसीए के पुनर्नवीनीकरण को बढ़ावा देता है, बल्कि एमसीए-आपूर्ति क्षेत्र (चित्रा 4) के परिधीय में संपार्श्विक परिसंचरण को भी बढ़ाता है। संपार्श्विक परिसंचरण की प्लास्टिसिटी को नियंत्रित करने वाले तंत्र को बेहतर ढंग से समझना उपन्यास उपचारों का सुझाव दे सकता है। चूंकि थ्रोम्बिन-एन्हांस्ड फोटोथ्रॉम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल अनुमानित पेरी-रोधगलितांश क्षेत्र और लिटिक उपचार के प्रति संवेदनशीलता का लाभ प्रदान करता है, यह पोस्ट-स्ट्रोक संपार्श्विक परिसंचरण के अनुसंधान में सहायता करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान (NS108763, NS100419, NS095064, और सीवाई के HD080429; और वाईवाईएस को NS106592) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877 infarct
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
5-0 silk suture Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
543nm laser beam Melles Griot 25-LGP-193-249 photothrombosis
adult male mice Charles River C57BL/6 10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor machine shop, UVA surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Dental drill Dentamerica Rotex 782 surgical setup
Digital microscope Dino-Lite AM2111 brain imaging
Dissecting microscope Olympus SZ40 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
Heat pump with warming pad Gaymar TP700 surgical setup
infusion pump KD Scientific 200 thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle BD 328291 photothrombosis
Ketamine CCM, UVA anesthesia
Laser protective google 532nm Thorlabs LG3 photothrombosis
Ketoprofen CCM, UVA NSAID analgesia
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor RWD 68014 surgical setup
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063 eye dryness prevention
Retractor tips Kent Scientific Surgi-5014-2 surgical setup
Rose Bengal Sigma 198250 photothrombosis
Thrombin Sigma T7513 photothrombosis
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
tPA Genetech Cathflo activase 2mg thrombolytic treatment
Vibratome Stoelting 51425 TTC infacrt
Xylazine CCM, UVA anesthesia

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References

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  2. Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
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Kuo, Y. M., Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model. J. Vis. Exp. (172), e61740, doi:10.3791/61740 (2021).

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