Summary
传统的光血栓中风 （PTS） 模型主要诱导对组织纤溶酶原激活剂 （tPA） 溶解治疗具有高耐药性的致密血小板聚集体。本文通过共注射凝血酶和光敏染料进行光活化，引入了改良的小鼠PTS模型。凝血酶增强的 PTS 模型产生混合血小板：纤维蛋白凝块，并且对 tPA 溶栓高度敏感。
Abstract
理想的血栓栓塞性卒中模型需要某些特性，包括相对简单的外科手术、死亡率低、梗死大小和位置一致、血小板：纤维蛋白混合血凝块的沉淀与患者相似，以及对纤溶治疗具有足够的敏感性。基于孟加拉玫瑰 （RB） 染料的光血栓中风模型满足前两个要求，但对 tPA 介导的裂解处理高度难治，这可能是由于其富含血小板但纤维蛋白贫乏的凝块组成。我们认为，RB染料（50mg / kg）和亚血栓形成剂量的凝血酶（80 U / kg）的组合用于针对大脑中动脉（MCA）近端分支的光活化，可能会产生富含纤维蛋白和tPA敏感的凝块。事实上，凝血酶和RB（T+RB）联合光血栓形成模型触发了混合血小板：纤维蛋白血凝块，如免疫染色和免疫印迹所示，并保持一致的梗死大小和位置以及低死亡率。此外，在光激活后 2 小时内静脉注射 tPA（阿替普酶，10 mg/kg）可显着减小 T+RB 光血栓形成的梗死面积。因此，凝血酶增强的光血栓中风模型可能是测试新型溶栓疗法的有用实验模型。
Introduction
血管内血栓切除术和 tPA 介导的溶栓是美国食品和药物管理局 （FDA） 批准的仅有的两种急性缺血性卒中疗法，美国每年有 ~700,000 名患者患病1。由于血栓切除术的应用仅限于大血管闭塞 （LVO），而 tPA 溶栓术可以缓解小血管闭塞，因此两者都是急性缺血性卒中2 的有价值的治疗方法。此外，两种疗法的联合使用（例如，在卒中发作后 4.5 小时内开始 tPA 溶栓，然后进行血栓切除术）可改善再灌注和功能结局3。因此，即使在血栓切除术时代，优化溶栓仍然是卒中研究的重要目标。
血栓栓塞模型是临床前卒中研究的重要工具，旨在改善溶栓治疗。这是因为机械血管闭塞模型（例如，腔内缝合 MCA 闭塞）不会产生血凝块，并且其在去除机械闭塞后脑血流的快速恢复被过度理想化 4,5。迄今为止，主要的血栓栓塞模型包括光血栓形成 6,7,8、局部氯化铁 （FeCl 3） 应用9、凝血酶显微注射到 MCA 分支 10,11、体外（微）栓子注射到 MCA 或颈总动脉 （CCA） 12、13、14 和短暂性缺氧缺血 （tHI）15,16，17,18.这些卒中模型在随后血栓的组织学组成和对tPA介导的裂解疗法的敏感性方面有所不同（表1）。它们在开颅手术要求（原位凝血酶注射和局部应用 FeCl3 需要）、梗死大小和位置的一致性（例如，CCA 输注微栓子产生非常可变的结果）以及对心血管系统的总体影响（例如，tHI 增加心率和心输出量以补偿缺氧诱导的外周血管舒张）方面也有所不同。
基于 RB 染料的光血栓卒中 （PTS） 模型具有许多吸引人的特征，包括简单的无开颅手术、低死亡率（通常< 5%）以及可预测的梗死大小和位置（在 MCA 供应区域），但它有两个主要局限性。8 首先需要注意的是，对 tPA 介导的溶栓治疗反应弱至零，这也是 FeCl3 模型7、19、20 的缺点。PTS 和 FeCl3 卒中模型的第二个警告是，随后的血栓由密集的血小板聚集体和少量纤维蛋白组成，这不仅导致其对 tPA 溶解治疗的弹性，而且还偏离了急性缺血性卒中患者中血小板：纤维蛋白血栓混合的模式21,22。相比之下，原位凝血酶显微注射模型主要包括聚合纤维蛋白和不确定含量的血小板10。
鉴于上述推理，我们假设 RB 和亚血栓形成剂量的凝血酶的混合物通过变薄的颅骨进行 MCA 靶向光活化可能会增加所得血栓中的纤维蛋白成分并提高对 tPA 介导的裂解治疗的敏感性。我们已经证实了这一假设，23 在此我们描述了改良 （T+RB） 光血栓中风模型的详细程序。
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Protocol
该协议由弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准，并遵循美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。 图 1A 概述了该协议的外科手术顺序。
1. 手术设置
- 在手术前至少 15 分钟将温度设置为 37 °C 的加热垫放在小动物适配器上。为适配器准备一个鼻夹卷，允许动物头部旋转。准备麻醉剂氯胺酮 （60 mg/kg）/甲苯噻嗪 （10 mg/kg）。
- 用高压灭菌器（121°C，15psi，60分钟）对手术工具进行消毒，包括剪刀，镊子，微针架，止血器，棉签和缝合线。准备纸巾胶和眼膏。为外科医生准备 532 nm 激光防护镜。
注意：该协议描述了一种主要的生存手术程序，应使用无菌技术进行。 - 使用 532 nm 激光源设置照明系统。准备牙钻。
- 在盐水（10mg / mL）中制备Rose Bengal溶液。将等分试样的牛凝血酶（0.1U /μL）放在冰桶上。
- 在手术前 30 分钟皮下注射酮洛芬 （4.0 mg/kg） 作为镇痛剂，或使用当地机构指南推荐的镇痛方案。
2.同侧颈总动脉结扎术
- 通过肌肉注射氯胺酮（60mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）麻醉体重为22至30g的10-14周龄雄性C57BL / 6NCrl小鼠。
注意：整个外科手术，包括通过监测脑血流来结扎同侧颈总动脉，预计需要 ~120 分钟。麻醉方案通常在整个持续时间内有效，但应至少每 15 分钟重新评估一次麻醉深度。在学习这些程序时，可能需要重新给麻醉剂。 - 捏脚趾以确保动物完全麻醉。用脱毛膏去除左脖子上的毛发进行CCA结扎，去除头部的毛发以使头骨变薄。
- 将鼠标放在仰卧位的小动物适配器上。用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭皮肤，对手术区域进行消毒。
- 使用耳杆固定鼠标头。在解剖显微镜下，使用一把微型剪刀和直镊子在中线外侧约 0.2 厘米处做一个 0.5 厘米的左颈椎切口。
- 使用一对细锯齿状镊子拉开软组织和筋膜，露出左颈总动脉 （LCCA）。使用一把细光滑的镊子小心地将左侧CCA与迷走神经分开。
- 使用切成 20 毫米段的 5-0 丝线在 LCCA 周围放置永久性双结缝合线，然后使用无菌伤口夹闭合伤口。
3. MCA分支上方颅骨变薄和光活化
- 将鼠标翻转到小动物适配器上的俯卧位置。将鼻夹滚动 15°。通过用三次交替擦拭betadine和70%乙醇擦拭皮肤来消毒手术区域。
- 使用一把微型剪刀和直镊子沿着左眼和耳朵在头皮上做一个0.8厘米的切口，露出位于眼睛和耳朵之间的颞肌（图1B）。
- 在解剖显微镜下，用一对细锯齿镊子沿左顶骨颞肌边缘做一个0.5厘米的切口。用微型剪刀在颞肌上做第二个 0.3 厘米的垂直切口。缩回颞肌，露出顶骨和鳞状骨的边缘。确保可视化额骨和顶骨之间的冠状缝合标志（图1B，C）。
- 通过应用无菌生理盐水来润湿颅骨，以显示左侧MCA。用记号笔在鳞状骨上标记近端MCA分支。用气动牙钻轻轻在标记区域周围画一个直径约1毫米的圆圈（毛刺速度设置为速度控制器的50%），然后在不接触硬脑膜下方的情况下将颅骨深度变薄约0.2毫米。停止钻孔，直到留下一层非常薄的骨头。
- 根据小鼠的体重混合凝血酶（T，0.1U /μL，80U / kg）和孟加拉玫瑰（RB，10mg / mL，50mg / kg）溶液。例如，对于体重为 25 g 的小鼠，混合 20 μL 凝血酶 （0.1 U/μL） 和 125 μL RB （10 mg/mL）。
- 用胰岛素注射器（#31G 针头）将 T+RB 溶液（每 25 g 体重 145 μL）缓慢注射到眶后窦中。
注：在试点实验中，检查增加剂量的凝血酶与标准剂量的RB染料（50mg / kg）混合的光活化死亡率。80 U/kg凝血酶（n=13）的死亡率为0%，120 U/kg凝血酶（n=7）的死亡率为43%，160 U/kg（n=5）和200 U/kg凝血酶（n=5）的死亡率均为100%。因此，该模型选择80 U/kg凝血酶的剂量。激光散斑收缩成像还用于排除眶后窦注射 T+RB 后眶腔附近猖睑性血液凝固的可能性（补充图 1），以及未接受激光照射的对侧半球广泛纤维蛋白沉积（补充图 2）。 - 在双眼上涂抹眼药膏以防止干燥。
- 用 532 nm 激光（能量为 0.5 mW）将照明器施加在距离 2 英寸的钻孔部位 20 分钟。通过激光防护镜可视化MCA近端分支上的照明（图1C，D）。
注意： 具有 532 nm 照明的 MCA 在护目镜下方显示红色荧光。远端 MCA 将在 10 分钟照明后消失。如果远端MCA血流在20分钟照明后仍然存在，则排除动物。 - 20分钟后停止激光照明。用无菌伤口夹闭合伤口。
4. 活体成像（可选）
注：为了表征体内血栓形成，通过带有光活化系统的旋转盘共聚焦使用病毒内成像23。
- 在颅骨顶骨上做一个直径~3毫米的颅窗。
- 将盖玻片放在颅窗上，并在20倍水浸物镜下定位远端MCA（直径~50μm）。
- 在成像前 5 分钟通过尾静脉注射 DyLight488 偶联的抗 GPIbβ 抗体 （0.1 mg/kg） 标记循环血小板。
- 在成像前5分钟通过眼眶后注射凝血酶（80U / kg）和孟加拉玫瑰（50mg / kg）的混合物溶液。
- 使用直径为10μm的激光束的561nm激光系统光激活MCA，并记录图像直至血栓形成。
5. tPA管理
- 将麻醉的动物放在37°C的温暖垫上。在选定的光活化后时间点，用~45°C温水润湿纱布，并将其包裹在尾巴上1分钟。
- 通过输液泵在30分钟内以50%推注和50%的推注通过尾静脉注射重组人tPA（10mg / kg）。
注：虽然用于急性缺血性中风治疗的重组人 tPA 的临床剂量为 0.9 mg/kg，但啮齿动物通常使用更高的剂量 （10 mg/kg） 来补偿降低的跨物种 tPA 反应性。我们还遵循临床前卒中模型中 tPA 给药的标准方案，使用 50% 作为推注，50% 通过尾静脉输注超过 30 分钟24。
6. 脑血流量监测（CBF）
注：要确认 tPA 治疗后 CBF 恢复，请使用二维激光散斑对比成像系统15 并在光血栓形成（步骤 3.9）后立即或在 tPA 治疗后 24 小时记录。
- 将麻醉的动物置于俯卧位，并在头皮上做一个中线切口，颅骨暴露在外。
- 用无菌生理盐水润湿颅骨，然后将超声波凝胶轻轻涂抹在颅骨上。避免凝胶中出现任何毛发和气泡，它们会干扰 CBF 信号。
- 在激光散斑对比成像仪下监测两个大脑半球的 CBF 10 分钟。
- 记录CBF图像后，用组织胶关闭头皮，然后将动物放回笼子。
- 分析所选区域的 CBF，并计算与对侧区域相比的 CBF 回收率百分比。
- 然后，将动物放回温暖的笼子中进行恢复。监测小鼠5-10分钟，直到它们从麻醉中恢复。将湿润的食物放入笼子中，然后将其送回动物护理机构。
注意：按照当地机构指南的建议提供术后镇痛。
7.三苯基氯化四氮唑（TTC）染色测量梗死体积
- 光血栓形成后 24 小时，根据当地非存活手术的机构指南对动物进行深度麻醉。
注：我们通过腹膜内（IP）注射给予三溴乙醇（avertin）250 mg / kg。 - 用PBS进行心内灌注，收集新鲜脑并嵌入3%琼脂凝胶中。
- 用振动切片机切开1mm厚的脑切片，并在2%TTC溶液中孵育10分钟。
- 通过 ImageJ 软件将 6 个脑切片的总梗死体积量化为绝对体积。
注意：由于两个原因，脑水肿未被用作结果测量。首先，TTC染色测量组织活力（通过线粒体还原活性），这是比水肿更严重的后果。其次，随着梗死的进行，血管源性和细胞毒性水肿都会发生，并且无法通过标准的脑水肿测量方法轻松区分。然而，我们使用抗免疫球蛋白 （IgG） 标记来评估血脑屏障 （BBB） 的完整性，并在 RB 和 T+RB 卒中模型中发现光激活后 6 小时的 IgG 外渗相当（补充图 3）。
8. 血栓形成测量
注：为了测量血栓形成，在光血栓形成后1小时和2小时收集大脑，分别通过免疫化学（IHC）测量MCA中的血栓，并通过免疫印迹测量脑半球的纤维蛋白。
- 进行 IHC 以表征凝块组成。用 4% 多聚甲醛固定大脑过夜，然后用 30% 蔗糖使大脑脱水以进行 OCT 包埋。
- 以20μm厚度的矢状方向切开大脑，并用针对纤维蛋白原，血小板（糖蛋白IIb），红细胞（TER119）和血管（异凝集素GS-IB4）的特异性抗体进行IHC。
- 通过免疫印迹和抗纤维蛋白原抗体测量脑半球中的纤维蛋白。
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Representative Results
首先，我们比较了RB与T+RB光血栓形成诱导的血凝块中的纤维蛋白含量。光活化后2 h通过心内灌注固定剂处死小鼠，取出脑进行纵横面MCA分支免疫荧光染色。在RB光血栓形成中，MCA分支密集地填充了CD41+血小板和少量纤维蛋白（图2A，C）。相比之下，T+RB光血栓形成中的MCA分支被随机混合的血小板：纤维蛋白凝块阻塞（图2B，D，n>3）。我们还使用免疫印迹比较了两种模型在光激活后 2 小时用生理盐水经心灌注后大脑皮层中的纤维蛋白 （ogen） 水平。该分析显示，与RB光血栓形成相比>T+RB中同侧半球纤维蛋白沉积增加两倍（图2E，p=0.027，通过不配对t检验;每组n=3）。在我们的原始报告中，我们还使用基于共聚焦显微镜的单血管光活化和活体成像来比较FITC偶联的抗GP1bβ标记血小板的行为。23 这些实验表明，即使在激光照射下，静脉注射 80 U/kg 凝血酶也未能诱导血小板聚集体（图 3A），并且血小板在 RB 光血栓形成模型中形成均匀的凝块（图 3B），但在 T+RB 光血栓形成中具有多个微弱区域的不均匀聚集体（图 3C）。这些结果表明，T+RB光血栓形成增加了随后血栓中的纤维蛋白含量。
接下来，我们比较了急性静脉注射tPA治疗（10 mg/kg阿替普酶，光活化后30分钟）对两种模型之间脑血流（CBF）恢复的影响。通过激光散斑对比成像测量同一只小鼠在tPA对抗载体治疗前和后24小时的CBF，并归一化到对侧半球（图4A，B）。在RB光血栓形成中，与载体治疗的小鼠相比，tPA治疗导致CBF恢复的趋势，特别是在缺血性边界区域（图4C，载体51±9%与tPA 65±7%，p=0.3通过不配对t检验，n=4）。在 T+RB 光血栓形成中，tPA 处理的小鼠中 CBF 的恢复更为突出，并且近端 MCA 分支通常在 24 小时时变得可见（图 4D，载体 55 ± 3% vs tPA 81 ± 7%，p=0.02 通过不配对 t 检验，每组 n=6）。这些结果表明，与RB光血栓形成相比，T+RB对tPA溶解治疗的敏感性更高。
最后，我们使用 TTC 染色来量化 tPA 治疗对 RB 和 T+RB 光血栓性卒中模型梗死面积的影响。在RB光血栓形成中，在载体处理的小鼠（18±2.80mm 3，n = 6）和tPA处理的小鼠（18±1.95mm3，n = 10;在光激活后30分钟注射10mg / kg tPA）中检测到相似的梗死大小（图5A）。相比之下，与载体处理的小鼠（14.8 ±± 2 mm3，n = 8）相比，在0.5小时（7 ± 2.1 mm 3，n = 9），1 小时（4.6 ± 1 mm 3，n = 10）或2小时（6.4 1.5 mm 3，n = 8）注射tPA时，tPA溶解治疗显着降低梗死，但在光活化后6小时（15.2±3.1 mm 3，n = 7） n=19）（图5B，由非配对t检验确定的p值）。这些结果表明，T+RB光血栓形成卒中模型对tPA溶解治疗具有敏感性。
图 1：程序概述。 （A） T+RB光血栓性卒中模型中主要外科手术流程图。同侧颈总动脉 （CCA） 结扎术是可选的，但我们发现它使梗死大小更加一致，这可能是由于侧支循环减少。（B）小鼠大脑与头骨关系的顶部和侧面视图。同时指示的眼睛、耳朵、颞肌、大脑中动脉 （MCA） 和分支、冠状缝合线和激光照明部位。（C） 在变薄的头骨下方 （C1） 和激光照射 （C2） 期间目标 MCA 分支的可视化，以及光激活后血流停止 （C3）。注意MCA分支与冠状缝合线的关系。（D） 在左侧 MCA 分支上进行激光照明期间设置鼠标。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：血凝块中纤维蛋白含量不同。 （A-D）使用抗纤维蛋白（绿色）、抗 CD41/血小板（红色）和异凝集素 B4/内皮细胞（蓝色）标记物对远端 MCA 分支中远端 MCA 分支中 RB 和 T+RB 光血栓形成诱导的血栓进行免疫荧光标记。注意 T+RB 光血栓形成诱导的血凝块中抗纤维蛋白免疫信号的显着增加（每组 B、D、n=3）。（E） 免疫印迹表明，在光激活后 2 小时，T+RB 同侧大脑皮层中的纤维蛋白沉积大于 RB 光血栓形成（每个 n=3）。UN：未受伤的小鼠;续：对侧皮层;Ipsi：同侧皮层。比例尺：50μm。该图经[23]许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：血小板反应的活体成像。 在单血管激光照射下（在白色箭头指示的部位）对FITC偶联的抗GP1bβ标记的血小板进行基于共聚焦显微镜的活体成像。实验组为：（A）单独凝血酶，（B）单独使用孟加拉玫瑰，以及（C）凝血酶加孟加拉玫瑰。激光照明后的时间被标记出来。有关此手稿，请参阅JoVE网站上的视频。比例尺：50μm。该图经[23]许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：tPA 处理对 CBF 恢复的影响。 在激光照射后 30 分钟通过尾静脉将重组人 tPA（阿替普酶，10 mg/kg）或载体给予 RB 和 T+RB 光血栓形成攻击的小鼠，并将同一小鼠治疗前和治疗后 24 小时的脑血流量 （CBF） 与激光散斑对比成像进行比较。测量了两个半球 3 x 4.8 mm 区域内的 CBF。实验组为：（A、C）RB光血栓形成;（乙，D）T+RB 光血栓形成。注意 T+RB 光血栓形成组通过 tPA 治疗 CBF 的显着恢复（通过非配对 t 检验 p=0.02，载体 n=4，tPA 治疗 n=6）和近端 MCA 分支的频繁可视化。在RB光血栓形成中，tPA治疗导致CBF有更好的趋势，主要在外周缺血区（p=0.3，载体为n=4，tPA治疗为n=5）。白色箭头表示MCA光活化的部位。该图经[23]许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：tPA 治疗对梗死面积的影响。 （A） RB 光血栓形成后 30 分钟静脉内 tPA 治疗（阿替普酶，10 mg/kg）未能减小梗死面积（载体治疗的小鼠 n=6，tPA 治疗的小鼠 n=10）。（B） 相反，在 T+RB 光血栓形成中，在光活化后 0.5、1 或 2 小时静脉注射 10 mg/kg 阿替普酶治疗，但在光活化后 6 小时不静脉注射 10 mg/kg 导致梗死面积显着减小。p 值由单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验确定。该图经[23]许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 型 | 手术 | 血栓 | 血小板 | 纤维素 | tPA反应性 | 主要特点/效用 | 主要参考文献 |
| 腔内缝合 MCAO | 血管内 MCA 闭塞 | 不 | 不适用 | 不适用 | 不 | 快速再灌注;神经衰竭研究;tPA 诱导的 BBB 损伤 | Longa 等人，1989 年（参考文献 #5） |
| 光血栓形成 | 颅骨变薄和光活化 | 是的 | 弱 | 重现性高;低死亡率 | Watson 等人，1985 年（参考文献 #6） | ||
| 凝血酶-光血栓形成 | UCCAO，颅骨变薄和光活化 | 是的 | 是的 | 重现性高;低死亡率 | Sun 等人，2020 年（参考文献 #23） | ||
| FeCl3 （在 MCA 上） | 颅骨变薄和化学活化 | 是的 | 不 | 重现性高;低死亡率 | Karatas 等人，2011 （参考文献 #69） | ||
| 原位凝血酶注射 | 开颅手术和MCA显微注射 | 是的 | 是的 | 重现性高;死亡率低;tPA裂解处理 | Orset 等人，2007 年（参考文献 #10） | ||
| 栓子-MCAO | 血管内 MCA 闭塞 | 是的 | 是的 | tPA裂解处理;可变凝块硬度 | Busch 等人，1997 年（参考文献 #13） | ||
| 短暂性缺氧缺血 （tHI） | UCCAO加缺氧 | 是的 | 是的 | MCA区域>梗死;全身性心血管效应 | Sun 等人，2014 （参考文献 #15） |
表1：所选临床前卒中模型的比较。 填充框表示阳性（存在血凝块、血小板和纤维蛋白）或显著的 tPA 反应性。
补充图1：眶后注射凝血酶后的CBF监测仪。 （A）眶后窦（上图）和激光散斑造影成像的血流的代表性照片（下图）。凝血酶（80 U/kg）注入眶后窦后监测3个血管部位（标示1~3个）。（B） 凝血酶注射后 15 分钟的血流代表性示踪图（箭头）。（C） 基于激光散斑的定量显示凝血酶注射后 15 分钟内眶后窦附近的血流量没有减少（n=4，p 值由不配对 t 检验确定）。 请点击这里下载此图。
补充图 2：光激活后 6 小时对侧半球缺乏纤维蛋白沉积。 抗纤维蛋白原（绿色）的免疫染色显示纤维蛋白在RB和T+RB光血栓形成后6小时在同侧皮层中沉积。相比之下，凝血酶增强光血栓形成后，对侧皮层中没有可识别的纤维蛋白沉积。每组 N=4。比例尺：50μm。蓝色荧光作为DAPI细胞核染色。 请点击这里下载此图。
补充图3：光血栓形成后缺乏免疫球蛋白（IgG）外渗。 单侧 MCA 靶向光激活后 6 小时，免疫染色显示 IgG 在同侧半球外渗，但在对侧半球未外渗，提示凝血酶增强光血栓形成后 BBB 损伤有限。每个 N=4。比例尺：50μm。 请点击这里下载此图。
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Discussion
1985 年引入的传统 RB 光血栓性卒中是一种有吸引力的局灶性脑缺血模型，适用于简单的外科手术、低死亡率和高可重复性脑梗死。5 在该模型中，光动力染料 RB 在光激发下迅速激活血小板，导致致密的聚集体阻塞血管 5,8,23。然而，RB诱导的血凝块中的少量纤维蛋白（图2）偏离了缺血性卒中患者中急性检索的血栓的主要血小板：纤维蛋白混合模式21,22。RB诱导的血栓中纤维蛋白含量低，也可能有助于其对tPA裂解治疗的恢复力7,8,19。尽管紫外激光照射可诱导 RB 光血栓形成的血管再通，但这种实验性疗法不太可能用于临床7.因此，传统的RB光血栓性卒中主要用作永久性闭塞模型，不太适合溶栓和神经保护研究（后者通常使用腔内缝合MCAO模型，其特点是去除机械闭塞后快速血管再灌注）。
我们假设，使用 RB 和亚血栓形成剂量的凝血酶的混合物进行光活化可能会增加随后血栓中的纤维蛋白含量，并增强对 tPA 溶栓的反应，这是现实世界的中风疗法。这一假设得到了这里和我们原始报告中提供的结果的支持。23 凝血酶增强光血栓形成脑卒中模型还保持了与传统 RB 光血栓形成模型一样，死亡率低、外科手术简单、梗死大小和位置一致性高等优点。因此，我们认为凝血酶增强光血栓形成是对血栓栓塞性卒中模型库的宝贵补充（表 1）。凝血酶增强光血栓形成模型的两个程序细节值得讨论。首先，过量静脉注射凝血酶可能引起急性肺血栓栓塞和动物死亡25。我们检查了一系列凝血酶剂量与RB光血栓形成的联合使用，到目前为止，选择的80 U / kg剂量尚未在>100只实验的成年雄性C57Bl / 6小鼠中引起死亡。对于具有高凝状态的小鼠，凝血酶剂量可能需要调整26。其次，除了MCA靶向光血栓形成外，我们还在手术中常规结扎了同侧CCA。我们发现，同侧CCA结扎术进一步增加了梗死大小的一致性，这可能是由于MCA与大脑前动脉和后动脉之间的侧支循环减少。
凭借其独特的特性，凝血酶增强的光血栓中风模型可能对至少三个研究课题特别有用。首先，这种新模型非常适合 tPA 和其他纤溶剂（如替奈普酶 （TNKase））27 的头对头比较。TNKase 是一种工程化的 tPA 突变变体，在离体实验中具有更高的纤维蛋白特异性和更低的医源性出血风险。然而，它对 tPA 的优越性仅在微栓塞卒中模型和二元神经学结果分析中进行了测试14。鉴于其高重现性和定量梗死面积分析，凝血酶增强光血栓性卒中模型可用于比较 tPA 与 TNKase 在多个方面的益处和不良反应（例如，剂量反应、治疗窗口、合并症影响和延迟治疗的潜在不良反应）。其次，凝血酶增强光血栓形成模型可能有助于研究 tPA 和抗血小板联合治疗对急性缺血性卒中的影响28。缺血性卒中血管内手术的最新进展使研究人员能够分析急性血栓的组织学组成，并确定了一种显性的、混合的血小板：纤维蛋白模式21,22。因此，纤溶剂 （tPA） 和抗血小板药物的组合可能会提高溶栓的整体疗效，但模拟血栓临床血小板：纤维蛋白组成的卒中模型对于此类研究至关重要。与tHI和栓子-MCAO模型一样，凝血酶-光血栓形成也符合这一要求，并因其死亡率低、外科手术简单和无全身心血管效应而脱颖而出（表1）。
最后但并非最不重要的一点是，凝血酶增强光血栓形成可能对研究卒中诱发的侧支循环特别有用，因为它在 MCA 供应区域的梗死周围位置可预测。通过维持半影以抵消梗死生长，侧支循环越来越被认为是缺血性卒中结果的重要预测因子，因为急性血管阻塞促进了侧支网络的血流，随后重塑和血管生成以形成新侧支血管29,30。结果表明，tPA不仅促进近端MCA的再通，而且还增加了MCA供应区外周的侧支循环（图4）。更好地了解调节侧支循环可塑性的机制可能建议采用新的疗法。由于凝血酶增强光血栓形成脑卒中模型具有梗死周围区域可预测的优点和对溶解治疗的敏感性，因此将有助于脑卒中后侧支循环的研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（NS108763、NS100419、NS095064和HD080429给CYK和NS106592给YYS）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
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