Summary
기존의 광혈전제 뇌졸중(PTS) 모델은 주로 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 용해 치료에 대한 내성이 높은 고밀도 혈소판 응집체를 유도합니다. 여기서 변형된 쥐 PTS 모델은 광활성화를 위해 트롬빈과 감광성 염료를 함께 주입하여 도입됩니다. 트롬빈 강화 PTS 모델은 혼합 혈소판:피브린 응고를 생성하며 tPA 혈전용해에 매우 민감합니다.
Abstract
이상적인 혈전색전증 뇌졸중 모델은 사망률이 낮은 비교적 간단한 수술 절차, 일관된 경색 크기 및 위치, 환자와 유사한 혈소판:피브린 혼합 혈전의 침전, 섬유소 용해 치료에 대한 적절한 민감성 등 특정 특성을 필요로 합니다. 로즈 벵골(RB) 염료 기반 광혈전 뇌졸중 모델은 처음 두 가지 요구 사항을 충족하지만 혈소판은 풍부하지만 피브린이 부족한 혈전 구성으로 인해 tPA 매개 용해 처리에 매우 내화성이 있습니다. 우리는 중뇌동맥(MCA)의 근위 가지를 겨냥한 광활성화를 위한 RB 염료(50mg/kg)와 트롬빈(80U/kg)의 혈전 미만 용량의 조합이 피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 혈전을 생성할 수 있다고 추론합니다. 실제로, 트롬빈과 RB(T+RB)의 결합 광혈전증 모델은 면역염색 및 면역블롯에서 볼 수 있듯이 혼합혈소판:피브린 혈전을 유발하고 일관된 경색 크기와 위치와 낮은 사망률을 유지했습니다. 또한, 광활성화 후 2시간 이내에 tPA(Alteplase, 10mg/kg)를 정맥 주사하면 T+RB 광혈전증의 경색 크기가 유의하게 감소했습니다. 따라서, 트롬빈-강화 광혈전 뇌졸중 모델은 새로운 혈전용해 요법을 시험하기 위한 유용한 실험 모델이 될 수 있다.
Introduction
혈관 내 혈전제거술과 tPA 매개 혈전용해술은 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 급성 허혈성 뇌졸중 치료법 중 유일하게 두 가지로, 미국에서 매년 ~700,000명의 환자를 괴롭히고 있습니다1. 혈전절제술은 대혈관 폐색(LVO)으로 제한되기 때문에 tPA 혈전용해술은 소혈관 폐색을 완화할 수 있지만, 둘 다 급성 허혈성 뇌졸중의 중요한 치료법이다2. 또한, 두 치료법의 조합(예: 뇌졸중 발병 후 4.5시간 이내에 tPA-혈전용해술을 시작한 후 혈전절제술을 시행)은 재관류와 기능적 결과를 개선한다3. 따라서 혈전용해술을 최적화하는 것은 혈전제거술의 시대에도 뇌졸중 연구의 중요한 목표로 남아 있습니다.
혈전색전증 모델은 혈전용해 요법을 개선하는 것을 목표로 하는 전임상 뇌졸중 연구에 필수적인 도구입니다. 이는 기계적 혈관 폐색 모델(예: 내강 내 봉합사 MCA 폐색)은 혈전을 생성하지 않으며, 기계적 폐색 제거 후 대뇌 혈류의 빠른 회복이 지나치게 이상화되어 있기 때문이다 4,5. 현재까지 주요 혈전색전증 모델에는 광혈 전증 6,7,8, 국소 염화제2철(FeCl3) 적용9, MCA 분지(10,11)로의 트롬빈 미세주입, MCA 또는 총경동맥(CCA)에 체외(미세)색전증 주입(CCA)12,13,14 및 일과성 저산소증-허혈(tHI)15,16, 17,18. 이러한 뇌졸중 모델은 혈전의 조직학적 조성과 tPA 매개 용해 요법에 대한 민감도가 다릅니다(표 1). 또한 개두술의 외과적 요구 사항(제자리 트롬빈 주사 및 FeCl3의 국소 적용에 필요), 경색 크기 및 위치의 일관성(예: 미세색전의 CCA 주입은 매우 다양한 결과를 산출함) 및 심혈관계에 대한 전반적인 효과(예: tHI는 저산소증으로 인한 말초 혈관 확장을 보상하기 위해 심박수 및 심박출량을 증가시킴)에 따라 다릅니다.
RB 염료 기반 광혈전 뇌졸중(PTS) 모델은 개두술이 필요 없는 간단한 수술 절차, 낮은 사망률(일반적으로 < 5%), 예측 가능한 경색의 크기 및 위치(MCA 공급 영역에서) 등 많은 매력적인 기능을 가지고 있지만 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 8 첫 번째 주의 사항은 tPA 매개 혈전용해 치료에 대한 반응이 약하거나 전무하다는 것인데, 이는 FeCl3 모델 7,19,20의 단점이기도 합니다. PTS 및 FeCl3 뇌졸중 모델의 두 번째 주의 사항은 이어지는 혈전이 소량의 피브린과 함께 조밀하게 포장된 혈소판 응집체로 구성되어 있어 tPA 용해 요법에 대한 회복력을 유발할 뿐만 아니라 급성 허혈성 뇌졸중 환자에서 혼합된 혈소판:피브린 혈전의 패턴에서 벗어난다는 것입니다21,22. 대조적으로, 제자리 트롬빈-미세주사 모델은 주로 중합된 피브린과 불확실한 혈소판 함량을 포함한다(10).
위와 같은 추론을 감안할 때, 얇아진 두개골을 통한 MCA 표적 광활성화를 위해 RB와 트롬빈의 아혈전 용량을 혼합하면 결과 혈전의 피브린 성분이 증가하고 tPA 매개 용해 치료에 대한 민감도가 높아질 수 있다는 가설을 세웠습니다. 우리는 이 가설을 확인했으며,23 여기에서 변형된(T+RB) 광혈전 뇌졸중 모델의 세부 절차를 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 버지니아 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립보건원(National Institutes of Health) 지침을 따릅니다. 그림 1A 는 이 프로토콜의 수술 절차를 간략하게 보여줍니다.
1. 수술 설정
- 수술 최소 15분 전에 온도를 37°C로 설정한 보온 패드를 작은 동물 어댑터에 놓습니다. 동물 머리를 회전할 수 있는 어댑터용 노즈 클립 롤을 준비합니다. 마취제 케타민(60mg/kg)/자일라진(10mg/kg)을 준비합니다.
- 가위, 집게, 마이크로 바늘 홀더, 지혈제, 면봉 및 봉합사를 포함한 수술 도구를 오토클레이브로 멸균합니다(121°C, 15psi에서 60분). 티슈 접착제와 눈 연고를 준비합니다. 외과 의사를 위한 532nm 레이저 보호 고글을 준비합니다.
참고: 이 프로토콜은 주요 생존 수술 절차를 설명하며 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다. - 532nm 레이저 소스로 조명 시스템을 설정합니다. 치과 드릴을 준비하십시오.
- 로즈 벵골 용액을 식염수(10mg/mL)로 준비합니다. 부분 표본 소 트롬빈(0.1U/μL)을 얼음 양동이에 놓습니다.
- 케토프로펜(4.0mg/kg)을 수술 30분 전에 진통제로 쥐에게 피하주사하거나 현지 기관 지침에서 권장하는 진통제 요법을 사용하십시오.
2. 동측 총경동맥의 결찰
- 10-14주 된 수컷 C57BL/6NCrl 마우스를 22-30g의 케타민(60mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 근육 주사로 마취시킵니다.
참고: 뇌혈류 모니터링을 통한 동측 총경동맥 결찰을 포함하는 전체 수술 절차는 ~120분이 소요될 것으로 예상됩니다. 마취 요법은 일반적으로 이 전체 기간 동안 효과적이지만 마취 깊이는 최소 15분마다 재평가해야 합니다. 이러한 절차를 배우는 동안 마취제를 다시 투여해야 할 수도 있습니다. - 동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 발가락 꼬집기를 수행합니다. CCA 결찰을 위해 왼쪽 목의 털을 제거하고 제모 크림으로 두개골을 얇게 하기 위해 머리를 제거합니다.
- 앙와위 자세의 작은 동물 어댑터에 마우스를 놓습니다. 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 세 번 문질러 수술 부위를 소독합니다.
- 이어 바를 사용하여 마우스 헤드를 고정합니다. 해부 현미경으로 정중선 측면 약 0.2cm에서 마이크로 가위와 직선 집게를 사용하여 0.5cm 왼쪽 경추를 절개합니다.
- 한 쌍의 미세한 톱니 모양의 집게를 사용하여 연조직과 근막을 떼어내어 왼쪽 총경동맥(LCCA)을 노출시킵니다. 한 쌍의 가늘고 부드러운 집게를 사용하여 왼쪽 CCA를 미주 신경에서 조심스럽게 분리합니다.
- 20mm 세그먼트로 자른 5-0 실크 봉합사를 사용하여 LCCA 주위에 영구적인 이중 매듭 봉합사를 배치한 다음 멸균 상처 클립을 사용하여 상처를 봉합합니다.
3. MCA 가지 위의 두개골이 얇아지고 광활성화
- 작은 동물 어댑터의 엎드린 자세로 마우스를 뒤집습니다. 노즈 클립 롤을 15° 돌립니다. 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 세 번 번갈아 가며 문질러 수술 부위를 소독합니다.
- 왼쪽 눈과 귀를 따라 마이크로 가위와 직선 집게를 사용하여 두피를 0.8cm 절개하여 눈과 귀 사이에 위치한 측두근을 노출시킵니다(그림 1B).
- 해부 현미경으로 한 쌍의 미세한 톱니 모양의 집게로 왼쪽 두정골의 측두근 가장자리를 따라 0.5cm를 절개합니다. 마이크로 가위로 측두근에 두 번째 0.3cm 수직 절개를 합니다. 측두근을 수축시켜 정수리골과 편평골의 가장자리를 노출시킵니다. 전두골과 두정골 사이의 관상동맥 봉합사의 랜드마크를 시각화해야 합니다(그림 1B,C).
- 멸균 식염수를 발라 두개골에 수분을 공급하여 왼쪽 MCA를 드러냅니다. 마커 펜으로 편평 뼈의 근위 MCA 가지를 표시합니다. 공압 치과용 드릴(속도 조절기의 50%로 버 속도 설정)로 표시된 부위를 둘러싸고 직경 약 1mm의 원을 부드럽게 그린 다음 경막 아래쪽을 건드리지 않고 두개골을 약 0.2mm 깊이로 얇게 만듭니다. 매우 얇은 뼈 층이 남을 때까지 드릴링을 중지하십시오.
- 쥐의 체중에 따라 트롬빈(T, 0.1 U/μL, 80 U/kg)과 로즈 벵골(RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) 용액을 혼합합니다. 예를 들어, 체중 25g의 마우스의 경우 20μL의 트롬빈(0.1U/μL)과 125μL의 RB(10mg/mL)를 혼합합니다.
- 인슐린 주사기(#31G 바늘)를 사용하여 T+RB 용액(체중 25g당 145μL)을 후안와 부비동에 천천히 주입합니다.
참고: 파일럿 실험에서 표준 용량의 RB 염료(50mg/kg)와 혼합된 트롬빈 용량 증가의 사망률은 광활성화를 위해 검사되었습니다. 사망률은 80 U/kg 트롬빈(n=13)의 경우 0%, 120 U/kg 트롬빈(n=7)의 경우 43%, 160 U/kg(n=5) 및 200 U/kg 트롬빈(n=5)의 경우 100%였다. 따라서 80 U/kg 트롬빈의 투여량이 이 모델에 선택되었습니다. 또한 레이저 스페클 수축 이미징을 사용하여 T+RB의 역안와 부비동 주입 후 안와강 근처에서 만연한 혈액 응고의 가능성(보충 그림 1)과 레이저 조명을 받지 않은 반대쪽 반구의 광범위한 피브린 침착(보충 그림 2)을 배제했습니다. - 건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 연고를 바릅니다.
- 532분 동안 2인치 거리의 천공 부위에 0.5nm 레이저 광(2mW 에너지 포함)으로 조명기를 적용합니다. 레이저 보호 고글을 통해 MCA의 근위 분기에 대한 조명을 시각화합니다(그림 1C,D).
알림: 532nm 조명의 MCA는 고글 아래에 적색 형광을 보여줍니다. 원위 MCA는 10분 조명 후에 사라집니다. 20분 조명 후에도 원위 MCA 흐름이 여전히 존재하는 경우 동물을 제외합니다. - 20분 후에 레이저 조명을 중지합니다. 멸균 상처 클립으로 상처를 봉합합니다.
4. 생체 내 이미징(옵션)
참고: 생체 내 혈전 형성을 특성화하려면 광활성화 시스템23이 있는 스핀 디스크 컨포칼에 의한 바이러스 내 이미징을 사용하십시오.
- 두개골의 두정골에 직경 ~ 3mm의 두개골 창을 만듭니다.
- 두개골 창에 커버글라스를 놓고 20x 침수 대물렌즈 아래에서 원위 MCA(직경 ~50μm)를 찾습니다.
- 이미징 전 5분에 DyLight488 접합 항 GPIbβ 항체(0.1mg/kg)의 꼬리 정맥 주사로 순환 혈소판을 라벨링합니다.
- 트롬빈(80U/kg)과 로즈 벵골(50mg/kg)의 혼합물 용액을 이미징 전 5분에 역궤도로 주입합니다.
- 직경 10μm의 레이저 빔이 있는 561nm 레이저 시스템을 사용하여 MCA를 광활성화하고 혈전이 형성될 때까지 이미지를 기록합니다.
5. tPA 관리
- 마취된 동물을 37°C의 따뜻한 패드에 놓습니다. 선택한 광활성화 후 시점에서 ~45°C의 따뜻한 물로 거즈를 적시고 1분 동안 꼬리에 감습니다.
- 재조합 인간 tPA(10mg/kg)를 꼬리 정맥을 통해 50% 볼루스로 주입하고 주입 펌프로 50분에 걸쳐 30%를 주입합니다.
참고: 급성 허혈성 뇌졸중 치료를 위한 재조합 인간 tPA의 임상 용량은 0.9mg/kg이지만, 종간 tPA 반응성 감소를 보상하기 위해 설치류에서 일반적으로 더 높은 용량(10mg/kg)이 사용됩니다. 또한 전임상 뇌졸중 모델에서 50%를 볼루스로 사용하고 50%를 꼬리 정맥을 통해 30분 동안 주입하는 tPA 투여의 표준 프로토콜을 따랐습니다.24
6. 뇌혈류(CBF) 모니터링
참고: tPA 치료 후 CBF 회복을 확인하려면 2차원 레이저 스페클 조영 이미징 시스템(15 )을 사용하고 광혈전증 직후(3.9단계) 또는 tPA 치료 후 24시간에 기록합니다.
- 마취된 동물을 엎드린 자세로 놓고 두개골이 노출된 상태에서 두피에 정중선을 절개합니다.
- 멸균 식염수로 두개골에 수분을 공급하고 초음파 젤을 두개골에 부드럽게 바릅니다. CBF 신호를 방해할 수 있는 젤의 머리카락과 기포를 피하십시오.
- 10분 동안 레이저 스페클 콘트라스트 이미저에서 양쪽 대뇌 반구의 CBF를 모니터링합니다.
- CBF 이미지를 기록한 후 티슈 접착제로 두피를 봉합하고 동물을 케이지로 되돌립니다.
- 선택한 영역의 CBF를 분석하고 반대측 영역과 비교하여 CBF 회수율을 계산합니다.
- 그런 다음 회복을 위해 동물을 따뜻한 케이지에 다시 넣으십시오. 쥐가 마취에서 회복될 때까지 5-10분 동안 쥐를 모니터링합니다. 젖은 사료는 케이지에 넣어 동물 보호 시설에 반납합니다.
알림: 현지 기관 지침에서 권장하는 대로 수술 후 진통제를 제공하십시오.
7. 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색에 의한 경색 부피 측정
- 광혈전증 24시간 후, 비생존 수술에 대한 현지 기관 지침에 따라 동물을 깊이 마취합니다.
참고: 복강내(IP) 주사를 통해 트리브로모에탄올(avertin) 250mg/kg을 투여합니다. - PBS로 심 경 관류를 수행하고 신선한 뇌를 수집하여 3 % 한천 젤에 포함시킵니다.
- 뇌 절편을 1mm 두께로 비브라톰으로 절단하고 2% TTC 용액에서 10분 동안 배양합니다.
- ImageJ 소프트웨어에 의해 6개의 뇌 절편에서 발생한 총 경색 부피를 절대 부피로 정량화합니다.
참고: 뇌부종은 두 가지 이유로 결과 측정으로 사용되지 않았습니다. 첫째, TTC 염색은 부종보다 더 심각한 결과인 조직 생존율(미토콘드리아 환원 활성을 통해)을 측정합니다. 둘째, 경색이 진행됨에 따라 혈관성 부종과 세포독성 부종이 모두 발생하여 일반적인 뇌부종 측정법으로는 쉽게 구별할 수 없다. 그러나 항면역글로빈(IgG) 표지를 사용하여 혈액뇌장벽(BBB)의 무결성을 평가했으며, RB 및 T+RB 뇌졸중 모델 모두에서 광활성화 후 6시간에 유사한 IgG-유출을 발견했습니다(보충 그림 3).
8. 혈전 형성 측정
참고: 혈전 형성을 측정하려면 광혈전증 후 1시간 및 2시간에 뇌를 수집하여 면역화학(IHC)에 의한 MCA의 혈전 측정과 면역블롯에 의한 뇌 반구의 피브린 측정을 각각 수행합니다.
- 응고 조성의 특성화를 위해 IHC를 수행합니다. 밤새 4% 파라포름알데히드로 뇌를 고정한 다음 OCT 임베딩을 위해 30% 자당으로 뇌를 탈수합니다.
- 20μm 두께의 시상 방향으로 뇌를 절편하고 피브리노겐, 혈소판(당단백질 IIb), 적혈구(TER119) 및 혈관(이솔렉틴 GS-IB4)에 대한 특이 항체로 IHC를 수행합니다.
- 피브리노겐에 대한 항체로 면역블롯에 의한 뇌 반구의 피브린 측정을 수행합니다.
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Representative Results
먼저, RB와 T+RB 광혈전증 유발 혈전의 피브린 함량을 비교했습니다. 마우스는 광활성화 후 2시간에 고정제의 심경 관류에 의해 희생되었고, 뇌는 종평면 및 횡평면에서 MCA 가지의 면역형광 염색을 위해 제거되었습니다. RB 광혈전증에서 MCA 가지는 CD41+ 혈소판과 작은 피브린으로 조밀하게 채워져 있었습니다(그림 2A,C). 대조적으로, T+RB 광혈전증의 MCA 가지는 무작위로 혼합된 혈소판:피브린 응고에 의해 폐색되었습니다(그림 2B,D, 각각에 대한 n>3). 또한 면역블롯을 사용하여 광활성화 후 2시간에 식염수로 심 경관류를 한 후 두 모델 간의 대뇌 피질의 피브린(오겐) 수준을 비교했습니다. 이 분석은 RB 광혈전증> 비해 T+RB의 동측 반구에서 피브린 침착이 2배 증가했음을 보여주었습니다(그림 2E, 짝을 이루지 않은 t-검정에 의한 p=0.027, 각 그룹에 대해 n=3). 기존 보고서에서는 컨포칼 현미경 기반 단일 혈관 광활성화 및 생체 내 이미징을 사용하여 FITC 접합 항 GP1bβ 표지 혈소판의 거동을 비교했습니다. 23 이러한 실험은 80 U/kg 트롬빈의 정맥 주사가 레이저 조명 하에서도 혈소판 응집체를 유도하지 못하고(그림 3A), 혈소판이 RB 광혈전증 모델에서는 균일한 혈전을 형성하지만(그림 3B), T+RB 광혈전증에서는 여러 희미한 영역을 가진 고르지 않은 응집체를 형성한다는 것을 보여주었습니다(그림 3C). 이러한 결과는 T+RB 광혈전증이 혈전에서 피브린 함량을 증가시킨다는 것을 시사합니다.
다음으로, 급성 정맥 내 tPA 치료(10mg/kg 알테플라제, 광활성화 후 30분)가 뇌혈류(CBF) 회복에 미치는 영향을 두 모델 간에 비교했습니다. tPA 대 차량 치료 전 및 24시간 후 동일한 마우스의 CBF를 레이저 스페클 조영제 이미징으로 측정하고 반대쪽 반구로 정규화했습니다(그림 4A,B). RB 광혈전증에서, tPA 치료는 비히클 처리된 마우스와 비교할 때 특히 허혈성 경계 영역에서 CBF 회복 경향을 보였다(그림 4C, 비히클 51 ± 9% 대 tPA 65 ± 7%, 짝을 이루지 않은 t-검정에 의한 p=0.3, 각각에 대해 n=4). T+RB 광혈전증에서, tPA 처리된 마우스에서 CBF의 회복이 더 두드러졌고, 근위 MCA 가지는 종종 24시간에 가시화되었다(그림 4D, 비히클 55 ± 3% 대 tPA 81 ± 7%, 짝을 이루지 않은 t-검정에 의한 p=0.02, 각 그룹에 대해 n=6). 이러한 결과는 RB 광혈전증보다 T+RB에 의한 tPA 용해 요법에 대한 민감도가 더 높다는 것을 시사합니다.
마지막으로, TTC 염색을 사용하여 RB 및 T+RB 광혈전 뇌졸중 모델에서 tPA 치료가 경색 크기에 미치는 영향을 정량화했습니다. RB 광혈전증의 경우, 비히클 처리된 마우스(18 ± 2.80mm3, n=6)와 tPA 처리된 마우스(18 ± 1.95 mm3, n=10; 10 mg/kg tPA는 광활성화 후 30분에 주입됨)에서 유사한 경색 크기가 검출되었습니다(그림 5A). 대조적으로, tPA 용해 처리는 tPA를 0.5 h (7 ± 2.1 mm 3, n = 9), 1 h (4.6 ± 1 mm3, n = 10) 또는 2 h (6.4 ± 1.5 mm 3, n = 8)에서 주입 했으나 광활성화 후 6 시간 (15.2 ± 3.1 mm 3, n = 7)에서는 주입하지 않았을 때, 비히클 처리 마우스 (14.8 ± 2 mm 3, n=7), n=19) (그림 5B, 짝을 이루지 않은 t-검정에 의해 결정된 p-값). 이러한 결과는 T+RB 광혈전 뇌졸중 모델이 tPA-용해 치료에 민감함을 나타낸다.
그림 1: 절차 개요. (A) T+RB 광혈전 뇌졸중 모델의 주요 수술 절차의 흐름도. 동측 총경동맥(CCA)의 결찰술은 선택 사항이지만, 경색 크기를 더 일정하게 만드는 것으로 확인되었는데, 이는 아마도 측부 순환 감소로 인한 것으로 추정됩니다. (B) 두개골과 관련된 쥐 뇌의 상단 및 측면도. 또한 눈, 귀, 측두근, 중뇌동맥(MCA) 및 가지, 관상 봉합사 및 레이저 조명 부위가 표시됩니다. (C) 얇아진 두개골 아래(C1) 및 레이저 조명(C2) 중 표적 MCA 가지의 시각화 및 광활성화 후 혈류 중단(C3). MCA 가지와 관상 봉합사의 관계에 주목하십시오. (D) 왼쪽 MCA 분기에서 레이저 조명 중 마우스 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 혈전의 다양한 피브린 함량. (서기-인도) 항 피브린(녹색), 항-CD41/혈소판(빨간색) 및 이솔렉틴 B4/내피 세포(파란색) 마커를 사용하여 종면(A, B) 또는 횡면(C, D)의 원위 MCA 가지에서 RB 및 T+RB 광혈전증 유발 혈전의 면역형광 표지. T+RB 광혈전증 유발 혈전에서 항피브린 면역신호의 현저한 증가에 주목하십시오(각 그룹에서 B, D, n=3). (E) 면역블로팅은 광활성화 후 2시간(각각 n=3)에 RB 광혈전증보다 T+RB의 동측 대뇌피질에 더 큰 피브린 침착을 나타냈습니다. UN: 다치지 않은 쥐; 계속: 반대측 피질; 입시: 동측 피질. 기준자: 50 μm. 이 그림은 [23]의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혈소판 반응의 생체 내 영상. 단일 용기 레이저 조명 하에서 FITC 복합 항-GP1bβ 표지 혈소판의 컨포칼 현미경 기반 생체 내 이미징(흰색 화살표로 표시된 부위). 실험군은 (A) 트롬빈 단독, (B) 로즈 벵골 단독, (C) 트롬빈과 로즈 벵갈이다. 레이저 조명 이후의 시간은 레이블이 지정되어 있습니다. 이 원고는 JoVE 웹 사이트의 비디오를 참조하십시오. 기준자: 50 μm. 이 그림은 [23]의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: CBF 회복에 대한 tPA 처리의 효과. 재조합 인간 tPA(Alteplase, 10mg/kg) 또는 비히클을 레이저 조명 후 30분에 RB 및 T+RB 광혈전증 유발 마우스에 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 동일한 마우스에서 치료 전 및 24시간 후의 뇌혈류(CBF)를 레이저 스페클 콘트라스트 이미징과 비교했습니다. 양쪽 반구의 3 x 4.8mm 영역에서 CBF를 측정했습니다. 실험군은 다음과 같다: (A, C) RB 광혈전증; (나, 디) T+RB 광혈전증. T+RB 광혈전증 그룹에서 tPA 치료에 의한 CBF의 유의미한 회복(짝을 이루지 않은 t-검정에 의한 p=0.02, 비히클의 경우 n=4, tPA 처리의 경우 n=6)과 근위 MCA 가지의 빈번한 시각화에 유의하십시오. RB 광혈전증에서 tPA 치료는 주로 말초 허혈 영역에서 더 나은 CBF의 경향을 보였습니다(짝을 이루지 않은 t-검정에 의한 p=0.3, 비히클의 경우 n=4, tPA 치료의 경우 n=5). 흰색 화살표는 MCA-광활성화 부위를 나타냅니다. 이 그림은 [23]의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: tPA 치료가 경색 크기에 미치는 영향. (A) RB 광혈전증 후 30분에 tPA 정맥 주사(Alteplase, 10mg/kg)는 경색 크기를 줄이지 못했습니다(비히클 처리된 마우스에서 n=6 및 tPA 처리된 마우스에서 n=10). (B) 대조적으로, T+RB 광혈전증의 경우, 광활성화 후 6시간이 아닌 0.5, 1 또는 2시간에 10mg/kg 알테플라제 정맥 투여가 경색 크기를 현저히 감소시켰다. p-값은 Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석으로 결정되었습니다. 이 그림은 [23]의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 모델 | 수술 | 혈전 | 혈소판 | 피브린 | tPA 반응성 | 주요기능/유틸리티 | 주요 참조 |
| 내강 봉합사 MCAO | 혈관내 MCA 폐색 | 아니요 | 해당 없음 | 해당 없음 | 아니요 | 빠른 재관류; 신경 연구 ; tPA로 인한 BBB 손상 | Longa 외. 1989 (참고 문헌 # 5) |
| 광혈전증 | 두개골 얇아짐 및 광활성화 | 예 | 약한 | 높은 재현성; 낮은 사망률 | Watson et al. 1985 (참고 문헌 #6) | ||
| 혈전-광혈전증 | UCCAO, 두개골 얇아짐 및 광활성화 | 예 | 예 | 높은 재현성; 낮은 사망률 | Sun 외. 2020 (참조 # 23) | ||
| FeCl3 (MCA에서) | 두개골 얇아짐 및 화학적 활성화 | 예 | 아니요 | 높은 재현성; 낮은 사망률 | Karatas 외. 2011 (참조 # 69) | ||
| 현장 트롬빈 주사 | 개두술 및 MCA 미세주입 | 예 | 예 | 높은 재현성; 낮은 사망률; tPA 용해 처리 | Orset 외. 2007 (참고 문헌 # 10) | ||
| 엠볼리-MCAO | 혈관내 MCA 폐색 | 예 | 예 | tPA 용해 처리; 가변 응고 경도 | Busch 외. 1997 (참조 #13) | ||
| 일과성 저산소증-허혈(tHI) | UCCAO 플러스 저산소증 | 예 | 예 | MCA 부위> 경색; 체계적인 CV 효과 | Sun 외. 2014 (참조 # 15) |
표 1: 선택된 전임상 뇌졸중 모델의 비교. 채워진 상자는 양성(혈전, 혈소판 및 섬유소의 존재) 또는 상당한 tPA 반응성을 나타냅니다.
보충 그림 1: 트롬빈의 역궤도 주입 후 CBF 모니터. (A) 레이저 스페클 콘트라스트 이미징(하단 패널)에 의한 후안와 부비동(상단 패널)과 혈류의 대표 사진. 3개의 혈관 부위(표시된 대로 1~3개)는 후안와 부비동에 트롬빈 주사(80U/kg) 후 모니터링되었습니다. (B) 트롬빈 주사 후 15분 동안의 혈류량을 추적한 대표적인 그래프(화살표). (C) 레이저 스페클 기반 정량화는 트롬빈 주입 후 15분 이내에 후안와 부비동 근처의 혈류가 감소하지 않는 것으로 나타났습니다(n=4, 짝을 이루지 않은 t-검정에 의해 결정된 p-값). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 광활성화 후 6시간에 반대쪽 반구에서 피브린 침착 부족. 항-피브리노겐(녹색)의 면역염색은 RB 및 T+RB 광혈전증 후 6시간에 동측 피질에 피브린 침착을 보여주었습니다. 대조적으로, 트롬빈 강화 광혈전증 후 반대측 피질에는 분별할 수 있는 피브린 침착이 없었습니다. 각 그룹에 대해 N=4입니다. 기준자: 50 μm. DAPI-핵 염색으로서의 청색 형광. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 광혈전증 후 면역글로불린(IgG) 유출 부족. 편측 MCA 표적 광활성화 후 6시간에, 면역염색은 동측 반구에서는 IgG의 유출을 보였지만 반대쪽 반구에서는 그렇지 않았으며, 이는 트롬빈 강화 광혈전증 후 BBB 손상이 제한적임을 시사합니다. 각각에 대해 N=4입니다. 기준자: 50 μm. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
1985년에 도입된 전통적인 RB 광혈전 뇌졸중은 간단한 수술 절차, 낮은 사망률 및 높은 뇌경색 재현성을 위한 국소 뇌허혈의 매력적인 모델입니다. 5 이 모델에서, 광역학적 염료 RB는 광 여기시 혈소판을 빠르게 활성화하여 혈관을 막는 조밀 한 응집체를 유도합니다 5,8,23. 그러나, RB 유도 혈전 내 소량의 피브린(그림 2)은 허혈성 뇌졸중 환자에서 급성으로 회수된 혈전의 우성 혈소판:피브린 혼입 패턴에서 벗어난다21,22. RB 유도 혈전의 낮은 피브린 함량은 tPA 용해 치료에 대한 회복력에도 기여할 수 있습니다 7,8,19. 자외선 레이저 조사는 RB 광혈전증에서 혈관 재개통을 유도하지만, 이 실험적 치료법은 임상적으로 사용될 가능성은 낮다7. 따라서 전통적인 RB 광혈전 뇌졸중은 주로 영구 폐합 모델로 사용되어 혈전용해 및 신경 보호 연구에 적합하지 않습니다(후자는 종종 기계적 폐색 제거 시 빠른 혈관 재관류를 특징으로 하는 내강 내 봉합사 MCAO 모델을 사용합니다).
우리는 광활성화를 위해 RB와 혈전하 용량의 트롬빈을 혼합하여 사용하면 혈전에서 피브린 함량이 증가하고 실제 뇌졸중 치료인 tPA 혈전용해에 대한 반응을 향상시킬 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 가설은 여기와 원본 보고서에 제시된 결과에 의해 뒷받침됩니다. 23 트롬빈 강화 광혈전 뇌졸중 모델은 또한 전통적인 RB 광혈전증 모델에서와 같이 낮은 사망률, 간단한 수술 절차, 경색 크기 및 위치의 높은 일관성이라는 장점을 유지합니다. 따라서 우리는 트롬빈 강화 광혈전증이 혈전색전증 뇌졸중 모델의 레퍼토리에 가치 있는 추가라고 믿습니다(표 1). 트롬빈 강화 광혈전증 모델의 두 가지 절차적 세부 사항에 대한 논의가 필요합니다. 첫째, 트롬빈 정맥 주사의 과다 투여는 급성 폐혈전색전증과 동물 폐사를 유발할 수 있다25. 우리는 RB 광혈전증과 병용하기 위해 다양한 트롬빈 용량을 조사했으며, 선택한 80 U/kg 용량은 지금까지 >100마리의 실험된 성인 남성 C57Bl/6 마우스에서 사망률을 유도하지 않았습니다. 트롬빈 용량은 과응고 상태를 가진 마우스에 대한 조절이 필요할 가능성이 있다26. 둘째, 시술에서 MCA 표적 광혈전증 외에 동측 CCA를 일상적으로 결찰했습니다. 동측 CCA의 결찰술은 경색 크기의 일관성을 더욱 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 MCA와 전방 및 후방 대뇌동맥 사이의 측부 순환이 감소했기 때문일 수 있습니다.
고유한 특성을 가진 트롬빈 강화 광혈전 뇌졸중 모델은 적어도 세 가지 연구 주제에 특히 유용할 수 있습니다. 첫째, 이 새로운 모델은 tPA와 Tenecteplase(TNKase)27와 같은 기타 섬유소 용해제의 일대일 비교에 이상적입니다. TNKase는 생체 외 실험에서 피브린 특이성이 증가하고 의인성 출혈 위험이 낮은 조작된 tPA 돌연변이 변이체입니다. 그러나 tPA에 대한 우월성은 미세 색전증 뇌졸중 모델과 이진 신경학적 결과 분석을 통해서만 테스트되었습니다14. 높은 재현성과 정량적 경색 크기 분석을 감안할 때, 트롬빈 강화 광혈전 뇌졸중 모델은 여러 측면(예: 용량 반응, 치료 기간, 동반 질환 영향 및 지연 치료의 잠재적 부작용)에서 tPA-대 TNKase의 이점과 부작용을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 둘째, 트롬빈-강화 광혈전증 모델은 급성 허혈성 뇌졸중에서 tPA와 항혈소판 병용요법의 효과를 조사하는 데 유용할 수 있다28. 허혈성 뇌졸중에서의 혈관 내 시술의 최근 발전으로 연구자들은 급성 혈전의 조직학적 조성을 분석하고 우세하고 혼합된 혈소판:피브린 패턴을 확인할 수 있게 되었다21,22. 따라서 섬유소 용해제(tPA)와 항혈소판제의 조합은 혈전용해술의 전반적인 효능을 높일 수 있지만, 이러한 연구에는 혈전의 임상 혈소판:피브린 조성을 시뮬레이션하는 뇌졸중 모델이 중요합니다. tHI 및 색전-MCAO 모델과 함께 트롬빈-광혈전증은 이러한 요구 사항을 충족하며 낮은 사망률, 간단한 수술 절차 및 전신 심혈관 영향이 없다는 점에서 두드러집니다(표 1).
마지막으로, 트롬빈 강화 광혈전증은 MCA 공급 영역에서 예측 가능한 경색 주위 위치를 감안할 때 뇌졸중 유발 부수적 순환을 조사하는 데 특히 유용할 수 있습니다. 경색 성장을 상쇄하기 위해 반그림자를 유지함으로써, 급성 혈관 폐쇄가 측부 네트워크를 가로지르는 혈류를 촉진하고, 그 후 신측 측부 혈관을 형성하기 위한 리모델링 및 혈관신생이 뒤따르기 때문에 측부 순환은 허혈성 뇌졸중 결과의 중요한 예측 인자로 점점 더 인식되고 있다 29,30. 그 결과, tPA는 근위 MCA의 재개통을 촉진할 뿐만 아니라 MCA 공급 부위의 말초에서 부수적 순환을 증가시킨다는 것을 시사합니다(그림 4). 담보 순환의 가소성을 조절하는 메커니즘을 더 잘 이해하면 새로운 치료법을 제안할 수 있습니다. 트롬빈 강화 광혈전 뇌졸중 모델은 예측 가능한 경색 주위 영역과 용해 치료에 대한 민감도의 이점을 제공하기 때문에 뇌졸중 후 부수적 순환 연구에 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금(NS108763, NS100419, NS095064 및 HD080429 C.Y. K.; 및 NS106592 Y.Y.S.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
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